防治棉铃虫的两种BT蛋白最佳浓度配比的筛选方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310298222.1	申请日：	2013.07.16
公开号：	CN103412129A	公开日：	2013.11.27
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/68申请公布日:20131127\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20130716\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N33/68	主分类号：	G01N33/68
申请人：	中国农业科学院植物保护研究所
发明人：	魏纪珍; 梁革梅; 张丽丽; 王英丽; 钟丰
地址：	100193 北京市海淀区圆明园西路2号
优先权：
专利代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司 11002	代理人：	王朋飞
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内容摘要

本发明涉及防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的筛选方法，所述方法为：（1）选择两种用于防治棉铃虫的Bt蛋白；（2）接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，计算出防治不同抗性水平棉铃虫幼虫时两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围；（3）根据最佳浓度范围设定两种Bt蛋白的不同浓度梯度配比，接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，进行生物测定；（4）观察幼虫死亡情况，计算死亡率、LC50和共毒系数CTC，确定两种Bt蛋白不同浓度配比的防治效果。本发明所述方法可操作性强，准确高效，可针对不同地区、不同抗性水平的棉铃虫，明确两种Bt蛋白的浓度配比，可在转双价棉花中Bt蛋白或其他蛋白配比的选择中广泛应用，增加杀虫效果，延缓抗性。

权利要求书

权利要求书
1.  防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）选择两种用于防治棉铃虫的Bt蛋白；
（2）接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，计算出防治不同抗性水平棉铃虫幼虫时两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围；
（3）根据最佳浓度范围设定两种Bt蛋白的不同浓度梯度配比，接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，进行生物测定；
（4）观察幼虫死亡情况，计算死亡率、LC50和共毒系数CTC，确定两种Bt蛋白不同浓度配比的防治效果。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述Bt蛋白为Cry2Ab蛋白、Cry1Ab蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和Cry1Ac蛋白中的任意两种。

3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述Bt蛋白为Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，计算两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围的方法包括如下步骤：
a、选择两种用于防治棉铃虫的Bt蛋白；
b、接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫；
c、观察幼虫死亡情况，计算死亡率；
d、利用二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种Bt蛋白的防治效果，获得两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，不同抗性水平的棉铃虫幼虫为敏感品系棉铃虫初孵幼虫或抗性品系棉铃虫初孵幼虫。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，在最佳浓度范围内，设定两种Bt蛋白的不同浓度梯度配比为1:1、1:2、 1:3、2:1、3:1，进行生物测定。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用表面涂抹法对不同抗性水平的棉铃虫幼虫分别进行生物测定，所述棉铃虫幼虫的接种量为24头以上棉铃虫幼虫/单位体积药物；所述棉铃虫幼虫培养的条件为温度27±2℃，湿度75±10%，光照14:10h。

8.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，根据如下标准判断是否增效：80<CTC<120，为相加作用；CTC>120，为增效作用，CTC数目越大，增效作用越大；CTC<80，为拮抗作用。

9.  根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，对于敏感品系棉铃虫，所述两种Bt蛋白为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白时，Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白治理棉铃虫的最佳浓度均为1.75-3.65μg/cm2；
Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:1时，CTC=261.38>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:2时，CTC=208.71>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:3时，CTC=69.40<80，为拮抗作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为2:1时，CTC=170.90>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为3:1时，CTC=183.54>120，为增效作用。

10.  根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，对于BtR1品系Cry1Ac抗性棉铃虫，所述两种Bt蛋白为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白时，Cry1Ac蛋白治理棉铃虫的最佳浓度为0.64-3.79μg/cm2，Cry2Ab蛋白治理棉铃虫的最佳浓度为3.44-4.76μg/cm2；
Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:1时，CTC=129.65>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:2时，80<CTC=83.92<120，为相加作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:3时，80<CTC=82.37<120，为相加作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为2:1时，CTC=108.68>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为3:1时，CTC=141.05>120，为增效作用。

说明书

说明书防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种筛选防治不同抗性水平棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的方法。
背景技术
棉花是关系国计民生的战略物资，也是仅次于粮食的第二大农作物。棉铃虫是危害棉田的主要害虫之一，上世纪90年代初棉铃虫的大爆发给我国的国民经济造成了巨大的经济损失。为了有效的防治棉铃虫，1996年转基因棉花在美国商业化种植，之后其种植面积在世界范围内快速增长，我国1997年由河北省开始引种美国Bt-Cry1Ac抗虫棉，1999年国产抗虫棉开始商业化种植，2011年中国的转基因棉花种植比例达到71.5%。
Bt棉花的广泛种植在带来巨大收益的同时，害虫对Bt的抗药性也成为影响转基因棉花持续发展的关键因素。Tabashnik等2008年报道美国的东南部棉铃虫在田间对Bt棉产生了抗性；2010报道印度从2002年开始使用第一代转基因棉花，到2009年田间的红铃虫已对Cry1Ac产生了抗性。因此，很多国际育种公司先后开发了第二代转基因棉花，如Monsanto公司的BollgardⅡ（表达Cry2Ab和Cry1Ac蛋白），Dow AgroSciences公司的WideStrike（表达CrylF和CrylAc蛋白），Syngenta公司的VipCot（表达Vip3A和Cry1Ab蛋白）等。
转双价基因抗虫棉花除扩大杀虫谱外，还可以起到延缓靶标害虫抗性发展的作用。因此，如果表达的两种蛋白在转双价基因抗虫棉花中达到最佳的浓度配比，那么这样的转基因棉花不仅可以更加有效的杀死靶标害虫，而且对可能产生的抗性害虫具有明显的治理作用。转基因植物的制备过程是一个复杂漫长的过程，受多种因素的影响，转基因植物由于基因突变等影响，其效果具有不确定性，需要进行大量筛选工作。因此，在新基因转入棉花前，在室内对其新型蛋白的效果进行评价，确定最佳浓度配比，可以节省大量的人力、物力、财力。
发明人前期确定了“一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法（专利申请号：201210480447.4）”，可以基本确定两种蛋白混用时的最佳浓度范围，因此，在此基础上，根据两种蛋白的最佳浓度范围进行不同浓度配比的混配试验，进一步确定出针对不同抗性、敏感棉铃虫的最佳浓度配比，对实际生产具有重大意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的筛选方法，针对具有不同抗性水平的棉铃虫，来确定两种Bt蛋白的最佳浓度配比。
本发明提供的防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
（1）选择两种用于防治棉铃虫的Bt蛋白；
（2）接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，计算出防治不同抗性水平棉铃虫幼虫时两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围；
（3）根据最佳浓度范围设定两种Bt蛋白的不同浓度梯度配比，接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，进行生物测定；
（4）观察幼虫死亡情况，计算死亡率、LC50和共毒系数（CTC），确定两种Bt蛋白不同浓度配比的防治效果。
步骤（1）中，所述两种Bt蛋白为Cry2Ab蛋白、Cry1Ab蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和Cry1Ac蛋白或其他新型Bt蛋白中的任意两种。
优选地，所述两种Bt蛋白为Cry2Ab蛋白和Cry1Ac蛋白。
步骤（2）中，计算两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围的方法包括如下步骤：
a、选择两种用于防治棉铃虫的Bt蛋白；
b、接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫；
c、观察幼虫死亡情况，计算死亡率；
d、利用二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种Bt蛋白的防治效果，获得两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围。
两种Bt蛋白混用的最佳浓度范围的计算方法，具体参照申请公布号为CN102981001A的发明专利申请（申请号为201210480447.4，发明名称为一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法）的方法。
步骤（2）和（3）中，不同抗性水平的棉铃虫幼虫为敏感品系棉铃虫初孵幼虫或抗性品系棉铃虫初孵幼虫。优选地，所述敏感品系棉铃虫为96S；所述抗性品系棉铃虫为BtR1品系Cry1Ac抗性棉铃虫。所述BtR1品系Cry1Ac抗性棉铃虫是通过在棉铃虫人工饲料中加入剂量逐渐增加的Cry1Ac蛋白的方法筛选得到，已经筛选125代，对Cry1Ac的抗性倍数为敏感品系的2199.83倍。
步骤（3）中，在最佳浓度范围内，设定两种Bt蛋白的不同浓度梯度配比进行生物测定；优选地，在最佳浓度范围内，设定两种Bt蛋白不同浓度梯度配比为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1，进行生物测定。
其中，采用表面涂抹法对不同抗性水平的棉铃虫幼虫分别进行生物测定，所述棉铃虫幼虫的接种量为24头以上棉铃虫幼虫/单位体积药物。所述棉铃虫幼虫培养的人工饲料为改进的棉铃虫饲料，饲料组成包括玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素（具体配方参照《人工饲养棉铃虫技术的改进》中的配方4，植物保护，梁革梅等，1999）；所述棉铃虫幼虫培养的条件为温度27±2℃，湿度75±10%，光照14:10(L:D)h。
步骤（4）中，利用DPS软件计算毒力回归方程，得到LC50值。
步骤（4）中，根据Sun和Johnson(1960)年提出的表示增效作用的计算方法，计算共毒系数（CTC）：
根据公式：CTC=（实际的ＴＩ／理论的ＴＩ）×100
ＴＩ（Toxicity Index）为毒性指数。
假定A为校准剂，其TI=100；B的TI值为：A的LC50/B的LC50×100;
两种Bt蛋白混合的实际TI为A的LC50/混合物的LC50×100；两种Bt蛋白混合的理论TI=ＴＩA×混合物中A%+ＴＩB×混合物中B%。
其中，A%、B%分别为混合物中两种Bt蛋白A、B的质量百分比。
根据如下标准判断是否增效：80<CTC<120，为相加作用；CTC>120，为增效作用，CTC数目越大，增效作用越大；CTC<80，为拮抗作用。
其中，对于敏感品系棉铃虫96S，依据申请公布号为CN102981001A的发明专利申请的方法，计算最佳浓度范围为：Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白治理棉铃虫的浓度均为1.75-3.65μg/cm2，则设定Cry2Ab和Cry1Ac蛋白不同浓度梯度配比分别为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1，进行生物测定；利用DPS软件计算LC50；根据Sun和Johnson(1960)年提出的表示增效作用的计算方法计算CTC。
当Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:1时，CTC=261.38>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:2时，CTC=208.71>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:3时，CTC=69.40<80，为拮抗作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为2:1时，CTC=170.90>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为3:1时，CTC=183.54>120，为增效作用。所以对于敏感品系棉铃虫96S，两种Bt蛋白浓度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、1:2、2:1和3:1时均有增效作用；但Cry1Ac:Cry2Ab=1:1时增效最明显。
其中，对于抗性品系棉铃虫BtR1品系Cry1Ac抗性棉铃虫，依据申请公布号为CN102981001A的发明专利申请的方法，计算得到最佳浓度范围为：Cry1Ac蛋白:0.64-3.79μg/cm2，Cry2Ab蛋白:3.44-4.76μg/cm2，则设定Cry2Ab和Cry1Ac蛋白不同浓度梯度配比分别为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1，进行生物测定。利用DPS软件计算LC50；根据Sun和Johnson(1960)年提出的表示增效作用的计算方法计算CTC。
当Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:1时，CTC=129.65>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:2时，80<CTC=83.92<120，为相加作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:3时，80<CTC=82.37<120，为相加作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为2:1时，CTC=108.68>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为3:1时，CTC=141.05>120，为增效作用。所以对于抗性品系棉铃虫两种药物浓度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、2:1和3:1时均有增效作用，而Cry1Ac:Cry2Ab=3:1时效果最好。
本发明的筛选防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的方法具有如下技术效果：
本发明所述筛选防治棉铃虫的两种Bt蛋白最佳浓度配比的方法，可操作性强，准确高效，可针对不同地区、不同抗性水平的棉铃虫，明确Bt蛋白的浓度配比，可在转双价棉花中Bt蛋白或其他蛋白配比的选择中广泛应用，增加杀虫效果，延缓抗性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1对敏感棉铃虫两种Bt蛋白的最佳浓度配比
1.1供试棉铃虫
敏感品系棉铃虫96S的初孵幼虫。
1.2Cry1Ac、Cry2Ab蛋白的浓度配比
根据申请公布号为CN102981001A的发明专利申请的方法计算最佳浓度范围，Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白治理敏感品系棉铃虫96S的浓度均为1.75-3.65μg/cm2，针对两种蛋白因素，按浓度梯度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、1:2、1:3、2:1、和3:1，进行生物测定，3次重复。
1.3生物测定方法
采用表面涂抹方法进行生物测定。所述方法如下：在24孔板中先加入1ml未凝固的人工饲料（人工饲料组成主要有玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素等，配方参照梁革梅等（1999）中配方4（梁革梅,谭维嘉,郭予元,1999.人工饲养棉铃虫技术的改进.植物保护,25(2):15–17）），待饲料凝固后，再按浓度梯度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、1:2、1:3、2:1、和3:1比例加入所述混合蛋白。混合蛋白为60μl/孔，加入后轻轻晃动24孔板，使混合蛋白均匀的平铺在饲料表面上。每个处理接24头初孵幼虫，设三次重复，第7天检查幼虫死亡率。棉铃虫幼虫培养的条件为温度27℃，湿度75%，光照14:10(L:D)h。
1.4数据分析
根据不同配比下的死亡率，利用DPS软件计算出LC50。
根据Sun和Johnson(1960)年提出的表示增效作用的计算方法，根据公式：CTC=（实际的ＴＩ／理论的ＴＩ）×100
ＴＩ（Toxicity Index）为毒性指数
假定A为校准剂，其TI=100；B的TI值为：A的LC50/B的LC50×100;
两种药剂混合的实际TI为A的LC50/混合物的LC50×100；两种药剂理论TI=ＴＩA×混合物中A%+ＴＩB×混合物中B%。
其中，A%、B%分别为混合物中A、B的质量百分比。
计算出CTC，然后根据如下标准判断是否增效：80<CTC<120，为相加作用；CTC>120，为增效作用，CTC数目越大，增效作用越大；CTC<80，为拮抗作用。
1.5对于敏感品系棉铃虫96S的LC50
对于敏感品系棉铃虫96S，通过统计死亡率，利用DPS计算得到Cry1Ac的LC50=0.93μg/ml;Cry2Ab的LC50=16.26μg/ml（表1）;
1.6增效作用筛选
所述Bt蛋白为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白，当Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:1时，CTC=261.38>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:2时，CTC=208.71>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:3时，CTC=69.40<80，为拮抗作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为2:1时，CTC=170.90>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为3:1时，CTC=183.54>120，为增效作用。所以对于敏感品系棉铃虫96S，两种Bt蛋白浓度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、1:2、2:1和3:1时均有增效作用；但Cry1Ac:Cry2Ab=1:1时增效最明显。
表1两种Bt蛋白混用不同浓度配比的LC50

注：95%CL为95%的置信限。
实施例2对抗性棉铃虫两种Bt蛋白的最佳浓度配比
1.1供试棉铃虫
抗性品系棉铃虫的初孵幼虫-BtR1品系Cry1Ac抗性棉铃虫幼虫。
1.2Cry1Ac、Cry2Ab蛋白的浓度配比
依据申请公布号为CN102981001A的发明专利申请的方法，计算最佳浓度范围，Cry1Ac蛋白：0.64-3.79μg/cm2，Cry2Ab蛋白：3.44-4.76μg/cm2，针对两种蛋白因素，按浓度梯度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、1:2、1:3、2:1、和3:1，进行生物测定，3次重复。
1.3生物测定方法
采用表面涂抹方法进行生物测定。所述方法如下：在24孔板中先加入1ml未凝固的人工饲料（人工饲料组成主要有玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素等，配方参照梁革梅等（1999）中配方4），待饲料凝固后，再按浓度梯度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、1:2、1:3、2:1、和3:1比例加入所述混合蛋白。混合蛋白为60μl/孔，加入后轻轻晃动24孔板，使混合蛋白药液均匀的平铺在饲料表面上。每个处理接24头初孵幼虫，设三次重复，第7天检查幼虫死亡率。棉铃虫幼虫培养的条件为温度27℃，湿度75%，光照14:10(L:D)h。
1.4数据分析
根据不同配比下的死亡率，利用DPS软件计算出LC50，根据Sun和Johnson(1960)年提出的表示增效作用的计算方法，计算出CTC，然后根据如下标准判断是否增效：80<CTC<120，为相加作用；CTC>120，为增效作用，CTC数目越大，增效作用越大；CTC<80，为拮抗作用。
1.5对于抗性品系棉铃虫的LC50
对于抗性BtR1品系棉铃虫，通过统计死亡率，利用DPS计算得到Cry1Ac的LC50=2045.84μg/ml;Cry2Ab的LC50=79.06μg/ml（表1）。
1.6增效作用筛选
所述Bt蛋白为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白，当Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:1时，CTC=129.65>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为1:2时，80<CTC=83.92<120，为相加作用；Cry1Ac与Cry2Ab 浓度比为1:3时，80<CTC=82.37<120，为相加作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为2:1时，CTC=108.68>120，为增效作用；Cry1Ac与Cry2Ab浓度比为3:1时，CTC=141.05>120，为增效作用。所以对于抗性品系棉铃虫两种药物浓度Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、2:1和3:1时均有增效作用，而Cry1Ac:Cry2Ab=3:1时效果最好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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1、(10)申请公布号 CN 103412129 A (43)申请公布日 2013.11.27 CN 103412129 A *CN103412129A* (21)申请号 201310298222.1 (22)申请日 2013.07.16 G01N 33/68(2006.01) (71)申请人中国农业科学院植物保护研究所地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人魏纪珍梁革梅张丽丽王英丽钟丰 (74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司 11002 代理人王朋飞 (54) 发明名称防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的筛选方法 (57) 摘要。

2、本发明涉及防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的筛选方法，所述方法为：（1）选择两种用于防治棉铃虫的 Bt 蛋白；（2）接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，计算出防治不同抗性水平棉铃虫幼虫时两种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围；（3）根据最佳浓度范围设定两种 Bt 蛋白的不同浓度梯度配比，接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，进行生物测定；（4）观察幼虫死亡情况，计算死亡率、 LC50和共毒系数CTC，确定两种Bt蛋白不同浓度配比的防治效果。本发明所述方法可操作性强，准确高效，可针对不同地区、不同抗性水平的棉铃虫，明确两种 Bt 蛋白的浓度配比，可在。

3、转双价棉花中 Bt 蛋白或其他蛋白配比的选择中广泛应用，增加杀虫效果，延缓抗性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书6页 (10)申请公布号 CN 103412129 A CN 103412129 A *CN103412129A* 1/2 页 2 1. 防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）选择两种用于防治棉铃虫的 Bt 蛋白；（2）接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，计算出防治不同抗性水平棉铃虫幼虫时两种 Bt 。

4、蛋白混用的最佳浓度范围；（3）根据最佳浓度范围设定两种 Bt 蛋白的不同浓度梯度配比，接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，进行生物测定；（4）观察幼虫死亡情况，计算死亡率、 LC50和共毒系数 CTC，确定两种 Bt 蛋白不同浓度配比的防治效果。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述 Bt 蛋白为 Cry2Ab 蛋白、 Cry1Ab 蛋白、 CrylF 蛋白、 Vip3A 蛋白和 Cry1Ac 蛋白中的任意两种。 3. 根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述 Bt 蛋白为 Cry2Ab 蛋白和 Cry1。

5、Ac 蛋白。 4. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，计算两种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围的方法包括如下步骤： a、选择两种用于防治棉铃虫的 Bt 蛋白； b、接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫； c、观察幼虫死亡情况，计算死亡率； d、利用二因素 D- 饱和方法建立回归方程，评价两种 Bt 蛋白的防治效果，获得两种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围。 5. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，不同抗性水平的棉铃虫幼虫为敏感品系棉铃虫初孵幼虫或抗性品系棉铃虫初孵幼虫。 6. 根据权利要求 1 所述的方法。

6、，其特征在于，步骤（3）中，在最佳浓度范围内，设定两种 Bt 蛋白的不同浓度梯度配比为 1:1、 1:2、 1:3、 2:1、 3:1，进行生物测定。 7. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用表面涂抹法对不同抗性水平的棉铃虫幼虫分别进行生物测定，所述棉铃虫幼虫的接种量为 24 头以上棉铃虫幼虫 / 单位体积药物；所述棉铃虫幼虫培养的条件为温度 272，湿度 7510%，光照 14:10h。 8. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，根据如下标准判断是否增效： 80120，为增效作用， CTC 数目越。

7、大，增效作用越大； CTC120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:2 时， CTC=208.71120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:3 时， CTC=69.40120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 3:1 时， CTC=183.54120，为增效作用。 10. 根据权利要求 1-8 任一项所述的方法，其特征在于，对于 BtR1品系 Cry1Ac 抗性棉铃虫，所述两种 Bt 蛋白为 Cry1Ac 蛋白和 Cry2Ab 蛋白时， Cry1Ac 蛋白治理棉铃虫的最佳浓。

8、权利要求书 CN 103412129 A 2 2/2 页 3 度为 0.64-3.79g/cm2， Cry2Ab 蛋白治理棉铃虫的最佳浓度为 3.44-4.76g/cm2； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:1 时， CTC=129.65120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:2 时， 80120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 3:1 时， CTC=141.05120，为增效作用。权利要求书 CN 103412129 A 3 1/6 页 4 防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的筛选方法技术。

9、领域 0001 本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种筛选防治不同抗性水平棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的方法。背景技术 0002 棉花是关系国计民生的战略物资，也是仅次于粮食的第二大农作物。棉铃虫是危害棉田的主要害虫之一，上世纪 90 年代初棉铃虫的大爆发给我国的国民经济造成了巨大的经济损失。为了有效的防治棉铃虫， 1996年转基因棉花在美国商业化种植，之后其种植面积在世界范围内快速增长，我国 1997 年由河北省开始引种美国 Bt-Cry1Ac 抗虫棉， 1999 年国产抗虫棉开始商业化种植， 2011 年中国的转基因棉花种植比例达到 71.5%。 0003。

10、 Bt 棉花的广泛种植在带来巨大收益的同时，害虫对 Bt 的抗药性也成为影响转基因棉花持续发展的关键因素。Tabashnik 等 2008 年报道美国的东南部棉铃虫在田间对 Bt 棉产生了抗性； 2010 报道印度从 2002 年开始使用第一代转基因棉花，到 2009 年田间的红铃虫已对 Cry1Ac 产生了抗性。因此，很多国际育种公司先后开发了第二代转基因棉花，如 Monsanto 公司的 Bollgard （表达 Cry2Ab 和 Cry1Ac 蛋白）， Dow AgroSciences 公司的 WideStrike（表达 CrylF 和 CrylAc 蛋白）， Syng。

11、enta 公司的 VipCot（表达 Vip3A 和 Cry1Ab 蛋白）等。 0004 转双价基因抗虫棉花除扩大杀虫谱外，还可以起到延缓靶标害虫抗性发展的作用。因此，如果表达的两种蛋白在转双价基因抗虫棉花中达到最佳的浓度配比，那么这样的转基因棉花不仅可以更加有效的杀死靶标害虫，而且对可能产生的抗性害虫具有明显的治理作用。转基因植物的制备过程是一个复杂漫长的过程，受多种因素的影响，转基因植物由于基因突变等影响，其效果具有不确定性，需要进行大量筛选工作。因此，在新基因转入棉花前，在室内对其新型蛋白的效果进行评价，确定最佳浓度配比，可以节省大量的人力、物。

12、力、财力。 0005 发明人前期确定了 “一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法（专利申请号： 201210480447.4） ” ，可以基本确定两种蛋白混用时的最佳浓度范围，因此，在此基础上，根据两种蛋白的最佳浓度范围进行不同浓度配比的混配试验，进一步确定出针对不同抗性、敏感棉铃虫的最佳浓度配比，对实际生产具有重大意义。发明内容 0006 为解决上述问题，本发明的目的是提供防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的筛选方法，针对具有不同抗性水平的棉铃虫，来确定两种 Bt 蛋白的最佳浓度配比。 0007 本发明提供的防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的筛选方法，。

13、所述方法包括以下步骤： 0008 （1）选择两种用于防治棉铃虫的 Bt 蛋白； 0009 （2）接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，计算出防治不同抗性水平棉铃虫幼虫时两说明书 CN 103412129 A 4 2/6 页 5 种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围； 0010 （3）根据最佳浓度范围设定两种 Bt 蛋白的不同浓度梯度配比，接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫，进行生物测定； 0011 （4）观察幼虫死亡情况，计算死亡率、 LC50和共毒系数（CTC），确定两种 Bt 蛋白不同浓度配比的防治效果。 0012 步骤（1）中，所述两种 Bt 蛋白为 Cr。

14、y2Ab 蛋白、 Cry1Ab 蛋白、 CrylF 蛋白、 Vip3A 蛋白和 Cry1Ac 蛋白或其他新型 Bt 蛋白中的任意两种。 0013 优选地，所述两种 Bt 蛋白为 Cry2Ab 蛋白和 Cry1Ac 蛋白。 0014 步骤（2）中，计算两种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围的方法包括如下步骤： 0015 a、选择两种用于防治棉铃虫的 Bt 蛋白； 0016 b、接种不同抗性水平的棉铃虫幼虫； 0017 c、观察幼虫死亡情况，计算死亡率； 0018 d、利用二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种Bt蛋白的防治效果，获得两种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围。

15、。 0019 两种 Bt 蛋白混用的最佳浓度范围的计算方法，具体参照申请公布号为 CN102981001A 的发明专利申请（申请号为 201210480447.4，发明名称为一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法）的方法。 0020 步骤（2）和（3）中，不同抗性水平的棉铃虫幼虫为敏感品系棉铃虫初孵幼虫或抗性品系棉铃虫初孵幼虫。优选地，所述敏感品系棉铃虫为 96S ；所述抗性品系棉铃虫为 BtR1 品系 Cry1Ac 抗性棉铃虫。所述 BtR1品系 Cry1Ac 抗性棉铃虫是通过在棉铃虫人工饲料中加入剂量逐渐增加的 Cry1Ac 蛋白的方法筛选得到，已经筛选 125 代。

16、，对 Cry1Ac 的抗性倍数为敏感品系的 2199.83 倍。 0021 步骤（3）中，在最佳浓度范围内，设定两种 Bt 蛋白的不同浓度梯度配比进行生物测定；优选地，在最佳浓度范围内，设定两种 Bt 蛋白不同浓度梯度配比为 1:1、 1:2、 1:3、 2:1、 3:1，进行生物测定。 0022 其中，采用表面涂抹法对不同抗性水平的棉铃虫幼虫分别进行生物测定，所述棉铃虫幼虫的接种量为 24 头以上棉铃虫幼虫 / 单位体积药物。所述棉铃虫幼虫培养的人工饲料为改进的棉铃虫饲料，饲料组成包括玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素（具体配方参照人工饲养棉。

17、铃虫技术的改进中的配方 4，植物保护，梁革梅等， 1999）；所述棉铃虫幼虫培养的条件为温度 272，湿度 7510%，光照 14:10(L:D)h。 0023 步骤（4）中，利用 DPS 软件计算毒力回归方程，得到 LC50值。 0024 步骤（4）中，根据 Sun 和 Johnson(1960) 年提出的表示增效作用的计算方法，计算共毒系数（CTC）： 0025 根据公式： CTC=（实际的理论的） 100 0026 （Toxicity Index）为毒性指数。 0027 假定 A 为校准剂，其 TI=100 ； B 的 TI 值为： A 的。

18、LC50/B 的 LC50100; 0028 两种 Bt 蛋白混合的实际 TI 为 A 的 LC50/ 混合物的 LC50100 ；两种 Bt 蛋白混合的理论 TI= A 混合物中 A%+ B 混合物中 B%。 0029 其中， A%、 B% 分别为混合物中两种 Bt 蛋白 A、 B 的质量百分比。说明书 CN 103412129 A 5 3/6 页 6 0030 根据如下标准判断是否增效： 80120，为增效作用， CTC 数目越大，增效作用越大； CTC120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:2 时， CTC=208.71120，为增效作。

19、用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:3 时， CTC=69.40120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 3:1 时， CTC=183.54120，为增效作用。所以对于敏感品系棉铃虫 96S，两种 Bt 蛋白浓度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 1:2、 2:1 和 3:1 时均有增效作用；但 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1 时增效最明显。 0033 其中，对于抗性品系棉铃虫 BtR1 品系 Cry1Ac 抗性棉铃虫，依据申请公布号为 CN102981001A 的发明专利申请的方法，计算得到最佳浓度范围为： Cry1A。

20、c 蛋白 :0.64-3.79g/cm2， Cry2Ab 蛋白 :3.44-4.76g/cm2，则设定 Cry2Ab 和 Cry1Ac 蛋白不同浓度梯度配比分别为 1:1、 1:2、 1:3、 2:1、 3:1，进行生物测定。利用 DPS 软件计算 LC50；根据 Sun 和 Johnson(1960) 年提出的表示增效作用的计算方法计算 CTC。 0034 当 Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:1 时， CTC=129.65120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:2 时， 80120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓。

21、度比为 3:1 时， CTC=141.05120，为增效作用。所以对于抗性品系棉铃虫两种药物浓度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 2:1 和 3:1 时均有增效作用，而 Cry1Ac:Cry2Ab=3:1 时效果最好。 0035 本发明的筛选防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的方法具有如下技术效果： 0036 本发明所述筛选防治棉铃虫的两种 Bt 蛋白最佳浓度配比的方法，可操作性强，准确高效，可针对不同地区、不同抗性水平的棉铃虫，明确 Bt 蛋白的浓度配比，可在转双价棉花中 Bt 蛋白或其他蛋白配比的选择中广泛应用，增加杀虫效果，延缓抗性。具体实施方。

22、式 0037 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 0038 若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0039 实施例 1 对敏感棉铃虫两种 Bt 蛋白的最佳浓度配比 0040 1.1 供试棉铃虫 0041 敏感品系棉铃虫 96S 的初孵幼虫。 0042 1.2Cry1Ac、 Cry2Ab 蛋白的浓度配比说明书 CN 103412129 A 6 4/6 页。

23、 7 0043 根据申请公布号为 CN102981001A 的发明专利申请的方法计算最佳浓度范围， Cry1Ac 蛋白和 Cry2Ab 蛋白治理敏感品系棉铃虫 96S 的浓度均为 1.75-3.65g/cm2，针对两种蛋白因素，按浓度梯度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 1:2、 1:3、 2:1、和 3:1，进行生物测定， 3 次重复。 0044 1.3 生物测定方法 0045 采用表面涂抹方法进行生物测定。所述方法如下：在 24 孔板中先加入 1ml 未凝固的人工饲料（人工饲料组成主要有玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素等，配方参照梁革梅等（199。

24、9）中配方 4 （梁革梅 , 谭维嘉 , 郭予元 ,1999. 人工饲养棉铃虫技术的改进 . 植物保护 ,25(2):1517）），待饲料凝固后，再按浓度梯度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 1:2、 1:3、 2:1、和 3:1 比例加入所述混合蛋白。混合蛋白为 60l/ 孔，加入后轻轻晃动 24 孔板，使混合蛋白均匀的平铺在饲料表面上。每个处理接 24 头初孵幼虫，设三次重复，第 7 天检查幼虫死亡率。棉铃虫幼虫培养的条件为温度 27，湿度 75%，光照 14:10(L:D)h。 0046 1.4 数据分析 0047 根据不同配比下的死亡率，利用 DP。

25、S 软件计算出 LC50。 0048 根据 Sun 和 Johnson(1960) 年提出的表示增效作用的计算方法，根据公式： CTC= （实际的理论的） 100 0049 （Toxicity Index）为毒性指数 0050 假定 A 为校准剂，其 TI=100 ； B 的 TI 值为： A 的 LC50/B 的 LC50100; 0051 两种药剂混合的实际 TI 为 A 的 LC50/ 混合物的 LC50100 ；两种药剂理论 TI= A 混合物中 A%+ B 混合物中 B%。 0052 其中， A%、 B% 分别为混合物中 A、 B 的质量百分比。 0053 计算出 CTC。

26、，然后根据如下标准判断是否增效： 80120，为增效作用， CTC 数目越大，增效作用越大； CTC120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:2 时， CTC=208.71120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:3 时， CTC=69.40120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 3:1 时， CTC=183.54120，为增效作用。所以对于敏感品系棉铃虫 96S，两种 Bt 蛋白浓度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 1:2、 2:1 和 3:1 时均有增效作用；但 Cry1Ac:C。

27、ry2Ab=1:1 时增效最明显。 0058 表 1 两种 Bt 蛋白混用不同浓度配比的 LC50 说明书 CN 103412129 A 7 5/6 页 8 0059 0060 注： 95%CL 为 95% 的置信限。 0061 实施例 2 对抗性棉铃虫两种 Bt 蛋白的最佳浓度配比 0062 1.1 供试棉铃虫 0063 抗性品系棉铃虫的初孵幼虫 -BtR1品系 Cry1Ac 抗性棉铃虫幼虫。 0064 1.2Cry1Ac、 Cry2Ab 蛋白的浓度配比 0065 依据申请公布号为 CN102981001A 的发明专利申请的方法，计算最佳浓度范围， Cry1Ac 蛋白： 0.64。

28、-3.79g/cm2， Cry2Ab 蛋白： 3.44-4.76g/cm2，针对两种蛋白因素，按浓度梯度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 1:2、 1:3、 2:1、和 3:1，进行生物测定， 3 次重复。 0066 1.3 生物测定方法 0067 采用表面涂抹方法进行生物测定。所述方法如下：在 24 孔板中先加入 1ml 未凝固的人工饲料（人工饲料组成主要有玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素等，配方参照梁革梅等（1999）中配方 4），待饲料凝固后，再按浓度梯度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 1:2、 1:3、 2:1、和 3:1 。

29、比例加入所述混合蛋白。混合蛋白为 60l/ 孔，加入后轻轻晃动 24 孔板，使混合蛋白药液均匀的平铺在饲料表面上。每个处理接 24 头初孵幼虫，设三次重复，第 7 天检查幼虫死亡率。棉铃虫幼虫培养的条件为温度 27，湿度 75%，光照 14:10(L:D)h。 0068 1.4 数据分析 0069 根据不同配比下的死亡率，利用 DPS 软件计算出 LC50，根据 Sun 和 Johnson(1960) 年提出的表示增效作用的计算方法，计算出 CTC，然后根据如下标准判断是否增效： 80120，为增效作用， CTC 数目越大，增效作用越大； CTC120，为增效。

30、作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓度比为 1:2 时， 80120，为增效作用； Cry1Ac 与 Cry2Ab 浓说明书 CN 103412129 A 8 6/6 页 9 度比为 3:1 时， CTC=141.05120，为增效作用。所以对于抗性品系棉铃虫两种药物浓度 Cry1Ac:Cry2Ab=1:1、 2:1 和 3:1 时均有增效作用，而 Cry1Ac:Cry2Ab=3:1 时效果最好。 0074 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书 CN 103412129 A 9 。

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