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1、(10)申请公布号 CN 103529224 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103529224 A (21)申请号 201310524436.6 (22)申请日 2013.10.17 G01N 33/68(2006.01) (71)申请人 天津中新科炬生物制药有限公司 地址 300457 天津市天津开发区第6大街65 号 (72)发明人 李洲 杨发青 周鸿锐 (54) 发明名称 同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快 速定量检测装置及检测方法 (57) 摘要 一种同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体 的快速定量检测装置及检测方法， 其特征在于装 置由相互独立的人脑钠。
2、肽 (BNP) 和 N 末端脑钠肽 前体 (NT-ProBNP) 检测试纸、 双联卡壳和内置了 相应标准曲线和判定方法的免疫层析判读结果记 录仪组成。免疫层析结果判读记录仪是一种光 学检测系统， 用于对检测结果的定量判定， 对 BNP 和 NT-ProBNP 检测范围分别为 0.1-10ng/mL 和 0.2-20ng/mL。检测在 15-20 分钟内完成。具有联 合检测、 操作简便、 反应快速、 结果准确、 适合现场 检测等优点， 适合临床对更为准确、 简便检测的需 要。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103529224 A CN 103529224 A 1/1 页 2 1. 一种同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快速定量检测装置及检测方法， 其特 征在于装置由相互独立的人脑钠肽 (BNP) 和 N 末端脑钠肽前体 (NT-ProBNP) 检测试纸、 双 联卡壳和内置了相应标准曲线和判定方法的免疫层析判读结果记录仪组成。 2. 根据权利要求 1 所述的检测装置， 其特征在于 BNP 检测试剂试纸由含有胶体金标记 的抗人 BNP 抗体的胶体金垫、 包被有配对 BNP 抗体 (T 线 ) 和抗鼠 IgG(C 线 。
4、) 的 NC 膜、 样品 垫、 吸样垫和塑料底板组成。NT-ProBNP 检测试剂试纸由含有胶体金标记的抗人 NT-ProBNP 抗体的胶体金垫、 包被有配对 NT-ProBNP 抗体 (T 线 ) 和抗鼠 IgG(C 线 ) 的 NC 膜、 样品垫、 吸样垫和塑料底板组成。每个试纸的宽度为 3-5mm， 长度为 7-8cm。样品垫、 胶体金垫、 NC 膜 和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端。 3. 根据权利要求 1 所述的检测装置， 其特征在于双联卡壳包含上盖和下盖两个部分， 内部可平行放置两条检测试纸。卡壳上盖的下部对应样品垫部分设置了样品孔和稀释液 孔， 用于加入样本和稀释液， 卡壳。
5、上盖的中间部分应对试纸 NC 膜中部设置了视窗口， 用于 观察 NC 膜上的 C、 T 线， 判定结果。 4. 根据权利要求 1 和 2 所述的检测装置， 其特征在于所述 NC 膜是一种由硝酸纤维素 构成的多孔结构的膜， 孔径为 8-15umm。稀释液垫为玻璃纤维膜或无纺布， 吸样垫为吸水滤 纸。 5. 根据权利要求 1 所述的检测装置， 其特征在于包被有配对抗体的 NC 膜制备过程为 ： 以0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将配对的BNP或NT-ProBNP抗体配制成合适的浓度， 在 喷膜仪在NC膜上以1.2-1.4ul/cm的参数进行划线， 包被T线， 同时在NC膜上部包被1-2。
6、mg/ ml 的抗鼠 IgG 作为 C 线。干燥， 备用。 6.根据权利要求1和2所述检测装置， 其特征在于胶体金垫的制备过程为 ： 取100ml胶 体金液放在烧杯内， 用 0.2M K2C03 调至 pH7.0-8.0， 再加入 1-2mg 标记用 BNP 或 NT-ProBNP 抗体， 室温搅拌 1 小时， 封闭， 12000rpm 离心 30 分钟， 弃上清， 用工作液复溶至 60ml， 然后用 喷金机分别均匀地喷涂在胶体金垫上， 干燥备用。 7. 根据权利要求 1 和 2 所述的检测装置， 其特征在检测卡装配方法为 ： 在相对湿度小 于 30的条件下， 取塑料底板， 将已包被 BNP 。
7、或 NT-ProBNP 的 NC 膜粘贴在底板的中部， 在 NC膜T线一侧粘贴胶体金垫， 在胶体金垫另一侧粘贴样品垫 ； 在NC膜C线一侧粘贴吸样垫 ； 各粘贴组分接口相互叠压 1-2mm， 粘贴好的大板切成 3-5mmm 宽的试纸条。然后将两种试纸 条分别放置于卡壳下盖的槽中， 然后盖上上盖， 压紧， 完成装配。 8. 根据权利要求 1 所述的检测装置， 其特征在于免疫层析结果判读记录仪是一种光学 检测系统， 内置了对BNP和NT-ProBNP试纸的标准曲线和判定方法， 用于对检测结果的定量 判定， 对 BNP 和 NT-ProBNP 检测范围分别为 0.1-10ng/mL 和 0.2-20。
8、ng/mL。 9. 根据权利要求 1 所述的检测装置， 其特征在于检测方法为 ： 检测时将 50ul 的被检样 本如血清、 血浆、 全血加入到样本孔中， 然后在稀释液孔中加入 50ul 样品稀释液， 在 15-20 分钟内， 用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。 权 利 要 求 书 CN 103529224 A 2 1/4 页 3 同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快速定量检测装 置及检测方法 技术领域 0001 本发明专利是涉及医学临床诊断技术领域， 特别是涉及一种以免疫胶体金快速检 测方法制备的同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快速定量检测装置及检测方法。 背景技术 0。
9、002 脑钠肽 (BNP) 首先是由日本学者 Sudoh 等于 1988 年从猪脑中分离出来因而得名， 也称 B 型利钠肽。人类脑钠肽 (BNP) 广泛分布于脑、 心脏、 肺脏、 消化道、 泌尿生殖道等组织 中， 其中以心脏的水平最高。心肌细胞不是直接合成 BNP， 而是先合成 pro-BNP， pro-BNP 具 有108个氨基酸， 在血液中会分解， 分解下来的片段是其N端的76个氨基酸， 即NT-ProBNP， 剩下的 32 个氨基酸， 即 BNP。 0003 研究发现， BNP 对心衰的早期诊断、 早期干预以及预后有很大帮助。在 2001 年修 订的欧洲心脏病学会心衰诊疗指南中， 已经把。
10、脑钠肽作为心衰诊断的工具。2005 年欧洲和 美国的指南， 均进一步肯定了脑钠肽在心衰诊断中的作用。由于 BNP 和 NT-ProBNP 来自于 同一个前体， 两者之间具有密切的联系。美国 临床化学 杂志在 2007 年发表了一篇论文 ： BNP和NT-proBNP在急慢性HF中的诊断精确性比较 ， 经过大量的文献统计得出如下结论 ： BNP和NT-proBNP化验在急性和慢性HF的诊断上具有较高的诊断精确性并具有较高的相关 性。 0004 从临床诊断角度分析， BNP和NT-proBNP主要的区别如下 ： 1)在体内的清除途径不 同 ： BNP 的清除主要通过与钠尿肽清除受体结合继而被胞吞和。
11、溶酶体降解， 只有少量的 BNP 通过肾脏清除， 当肾功能缺失时， 中性肽链内切酶(NEP)也可打开BNP的环状结构而对它进 行清除 ； NT-proBNP 清除的唯一途径是肾小球滤过， 肾功能出现缺失对 NT-proBNP 的代谢影 响极大。2) 半衰期不同 ： BNP 的半衰期是 22 分钟， 而 NT-proBNP 的半衰期为 120 分钟。从 临床检验的角度考虑， NT-proBNP 在体外相对较为稳定， 给检测带来方便， 但从临床应用的 角度考虑， BNP 更短的半衰期更能及时反应患者病情变化， 利于临床监测治疗效果， 从而给 临床带来更好的应用价值。3)BNP 和 NT-proBN。
12、P 的 cutoff 值有很大区别， BNP 公认的有临 床诊断价值的 cutoff 值是 0.1ng/mL， NT-proBNP 是 0.3ng/mL。 0005 目前 BNP 和 NT-ProBNP 检测试剂在临床都有应用， 但尚未有同时检测这两种指标 的快速检测试剂 / 装置出现。同时检测可以实现两个试剂的优势互补， 对检测结果更加确 信， 可以排除因某些交叉反应造成的假阳性或分子异构造成的假阴性 ； 可以分析出是否是 肾功能代谢障碍造成的 NT-ProBNP 的假阳性， 可以提高对心衰快速检测的灵敏度。 发明内容 0006 本发明目的是提供一种同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快。
13、速定量检测 装置及检测方法， 用来检测血清、 血浆和全血样本中的BNP和NT-ProBNP。 具有操作简便、 反 应快速、 结果准确、 可信、 适合现场检测等优点。发明内容如下 ： 说 明 书 CN 103529224 A 3 2/4 页 4 0007 一种同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快速定量检测装置及检测方法， 其 特征在于装置由相互独立的人脑钠肽 (BNP) 和 N 末端脑钠肽前体 (NT-ProBNP) 检测试纸、 双联卡壳和内置了相应标准曲线和判定方法的免疫层析判读结果记录仪组成。 0008 所述的检测装置， 其特征在于 BNP 检测试剂试纸由含有胶体金标记的抗人 BNP 。
14、抗 体的胶体金垫、 包被有配对 BNP 抗体 (T 线 ) 和抗鼠 IgG(C 线 ) 的 NC 膜、 样品垫、 吸样垫和 塑料底板组成。NT-ProBNP 检测试剂试纸由含有胶体金标记的抗人 NT-ProBNP 抗体的胶体 金垫、 包被有配对 NT-ProBNP 抗体 (T 线 ) 和抗鼠 IgG(C 线 ) 的 NC 膜、 样品垫、 吸样垫和塑 料底板组成。每个试纸的宽度为 3-5mm， 长度为 7-8cm。样品垫、 胶体金垫、 NC 膜和吸样垫 从塑料底板一端依次排列至另一端。 0009 所述的检测装置， 其特征在于双联卡壳包含上盖和下盖两个部分， 内部可平行放 置两条检测试纸。卡壳上盖。
15、的下部对应样品垫部分设置了样品孔和稀释液孔， 用于加入样 本和稀释液， 卡壳上盖的中间部分应对试纸NC膜中部设置了视窗口， 用于观察NC膜上的C、 T 线， 判定结果。 0010 所述的检测装置， 其特征在于所述 NC 膜是一种由硝酸纤维素构成的多孔结构的 膜， 孔径为 8-15um。稀释液垫为玻璃纤维膜或无纺布， 吸样垫为吸水滤纸。 0011 所述的检测装置， 其特征在于包被有配对抗体的 NC 膜制备过程为 ： 以 0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将配对的BNP或NT-ProBNP抗体配制成合适的浓度， 在喷膜仪在 NC 膜上以 1.2-1.4ul/cm 的参数进行划线， 包被 。
16、T 线， 同时在 NC 膜上部包被 1-2mg/ml 的抗 鼠 IgG 作为 C 线。干燥， 备用。 0012 所述检测装置， 其特征在于胶体金垫的制备过程为 ： 取 100ml 胶体金液放在烧杯 内， 用 0.2M K2C03 调至 pH7.0-8.0， 再加入 1-2mg 标记用 BNP 或 NT-ProBNP 抗体， 室温搅拌 1小时， 封闭， 12000rpm离心30分钟， 弃上清， 用工作液复溶至60ml， 然后用喷金机分别均匀 地喷涂在胶体金垫上， 干燥备用。 0013 所述的检测装置， 其特征在检测卡装配方法为 ： 在相对湿度小于 30的条件下， 取塑料底板， 将已包被 BNP 。
17、或 NT-ProBNP 的 NC 膜粘贴在底板的中部， 在 NC 膜 T 线一侧粘贴 胶体金垫， 在胶体金垫另一侧粘贴样品垫 ； 在 NC 膜 C 线一侧粘贴吸样垫 ； 各粘贴组分接口 相互叠压1-2mm， 粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条。 然后将两种试纸条分别放置于卡壳 下盖的槽中， 然后盖上上盖， 压紧， 完成装配。 0014 所述的检测装置， 其特征在于免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测系统， 内 置了对 BNP 和 NT-ProBNP 试纸的标准曲线和判定方法， 用于对检测结果的定量判定， 对 BNP 和 NT-ProBNP 检测范围分别为 0.1-10ng/mL 和 0.2-。
18、20ng/mL。 0015 所述的检测装置， 其特征在于检测方法为 ： 检测时将 50ul 的被检样本如血清、 血 浆、 全血加入到样本孔中， 然后在稀释液孔中加入 50ul 样品稀释液， 在 15-20 分钟内， 用免 疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。 0016 本发明的有益效果是 ： 提供一种同时检测人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快速定 量检测装置及检测方法， 用来检测血清、 血浆和全血样本中的 BNP 和 NT-ProBNP。具有操作 简便、 反应快速、 结果准确、 可信、 适合现场检测等优点。 附图说明 ： 说 明 书 CN 103529224 A 4 3/4 页 5 001。
19、7 图 1 是检测试纸结构图 0018 图 2 是双联卡壳结构图 具体实施方式 0019 实施例 ： 人脑钠肽和 N 末端脑钠肽前体的快速定量检测装置制备及运用 0020 1 主要材料 0021 1.1生物原料BNP和NT-ProBNP配对抗体， 从芬兰HYTEST公司购买 ； 鼠抗人IgG抗 体， 羊抗鼠 IgG ： 自制 ； 氯金酸 ： Sigma 公司产品 ； NC 膜 ： Sartorius 公司产品 ； 水解酪蛋白， 聚乙二醇 PEG20000 ： Sigma 产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。 0022 1.2 临床样本由公司在相关医院获得， 共 120 份， 其中确诊为心衰的病人。
20、血清样本 60 份， BNP 检测值从 0.2-8ng/mL， NT-ProBNP 检测值从 0.2-20ng/mL。正常人血清样本 60 份， BNP 和 NT-ProBNP 值未检测。 0023 1.3 双联卡壳 ： 由本公司设计， 相关公司按要求生产、 提供。 0024 1.4 免疫层析结果结判读记录仪 ： 型号 ： NS3001， 天津中新科炬生物制药有限公司 产品。 0025 2 方法 0026 2.1BNP 和 NT-ProBNP 抗体胶体金标记采用氯金酸 - 柠檬酸三钠法制备直径为 405nm的胶体金溶液， 取三份胶体金溶液， 分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、 p。
21、H7.5和 pH8.0， 然后将胶体金缓慢搅拌， 按每 ml 溶液加入 5ug、 10ug、 20ug 将 BNP 标记抗体加入到溶 液中， 继续搅拌 30 分钟， 再加入到终浓度为 0.5的 PEG2000 和 0.5的水解酪蛋白进行封 闭， 标记结束后以 12000g 离心， 弃上清， 沉淀按 60原体积复溶至不同配比的胶体金工作 液中(pH8.0， 含水解酪蛋白， 羊血清， 蔗糖和表面活性剂)。 然后将标记胶体金溶液按1ml溶 液铺 20cm2的比例加样于无纺布上， 在温度 20-25， 相对湿度在 30的干燥间干燥 3-5 小时， 制成胶体金垫。NT-ProBNP 抗体标记方法和 BN。
22、P 一致， 只是加入的抗体为 NT-ProBNP 抗体。 0027 2.2NC 膜包被用 0.01M pH7.4PBS 将配对的 BNP 抗体配制成 0.8， 1.0 和 1.2mg/mL， 羊抗鼠 IgG 分别稀释成 1mg/ml、 2mg/ml， 然后用喷膜仪在 NC 膜上按 1.4ul/cm 进行分别划 线包被， 包被完成后将 NC 膜在在温度 20-25， 相对湿度在 30的干燥间干燥 3-5 小时。 NT-ProBNP 抗体包被方法和 BNP 一致， 只是配制的为 NT-ProBNP 抗体。 0028 2.3在相对湿度小于30的条件下， 取塑料底板， 将已包被BNP或NT-ProBN。
23、P的NC 膜粘贴在底板的中部， 在 NC 膜 T 线一侧粘贴胶体金垫， 在胶体金垫另一侧粘贴样品垫 ； 在 NC膜C线一侧粘贴吸样垫 ； 各粘贴组分接口相互叠压1-2mm， 粘贴好的大板切成3-5mm宽的 试纸条。然后将两种试纸条分别放置于卡壳下盖的槽中， 然后盖上上盖， 压紧， 完成装配。 0029 2.4 检测卡工艺参数调试将浓度不同标记、 包被的试剂进行组合配对， 制备小样， 利用质控品对试剂进行测试， 寻找最佳组合。 0030 2.5 内置标准曲线曲线和参数设置确定好试纸工艺参数后， 分别用 0， 0.1， 0.5， 1.5、 4、 8ng/mL 的 BNP 标准品对试剂进行测定， 不。
24、同浓度的标准品显示出不同强度色带， 用 免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后， 计算出标准曲线， 并输入免疫层析结果 判读记录仪中， 完成 BNP 标准曲线参数设置 ； 分别用 0， 0.2， 0.5， 2、 8、 20ng/mL 的 NT-ProBNP 说 明 书 CN 103529224 A 5 4/4 页 6 标准品对试剂进行测定， 不同浓度的标准品显示出不同强度色带， 用免疫层析判读记录仪 将相应强度的色带数字化后， 计算出标准曲线， 并输入免疫层析结果判读记录仪中， 完成 NT-ProBNP 标准曲线参数设置。将 BNP 的 Cutoff 值设为 0.1ng/mL， NT-Pr。
25、oBNP 的 Cutoff 值 设为 0.3ng/mL， 若两种检测均为阴性， 综合结果判定为阴性， 若两种结果检测为阳性， 综合 结果判定为阳性。若两种结果检测为不一致， 判定为结果可疑， 完成结果判定参数设置。 0031 2.6检测方法1)将检测试剂及样本平衡至室温， 取出试纸卡， 平放 ； 2)分别精确吸 取 50l 血清、 血浆或全血样本， 加入到两个样本孔中， 立即分别在下部的稀释液孔中加入 50L 样本稀释液 (PBS)， 15-20 分钟内用免疫层析结果判读记录定量判定结果 ； 3) 设置好 仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测， 仪器将显示分别出 BNP 和 NT-ProBN。
26、P 样品浓 度的定量测定结果 ； 以及对心衰的综合检测结果。 0032 2.7 临床样本检测试剂制备完成后， 按检测方法对所有临床样本进行检测， 并分析 检测结果。 0033 3 结果 0034 3.1 试纸参数确定根据小样的检测结果， 确定了 BNP 和 NT-ProBNP 抗体标记 pH 值 为 7.0-8.0， 无明显差异 ； 最佳标记量为 5-10ug/ml 胶体金溶液 ； 最佳的胶体金工作液为 0.1MTris.Cl 缓冲液， pH7.5， 含 0.2水解酪蛋白、 6蔗糖， 0.5 Tween20 ； 最佳包抗原的 浓度为 BNP 为 0.8mg/mL， NT-ProBNP 为 1.。
27、2mg/mL。检测结果的最佳判定时间为 15-20 分钟。 但以上参数在制备不同批次产品时因生物原料活性变化可能需要适当调整。 0035 3.2临床样本检测对120份临床样本进行检测， 两种检测均为阳性的为58例， 均为 阴性的为 57 例， 和临床相比， 阳性、 阴性预期值均为 100。别 5 例为可疑结果。综合结果 的一致率为 95.8。和单独检测相比， 一致率相当， 但阳性、 阴性预期值明显上升。在定量 检测方面， 相关系数 r 均大于 0.95， t 检验 P 0.05， 不一致的检测离群值 2。定量检 测效果较好。通过以上结果可以判定检测装置的性能良好， 具有操作简便、 反应快速、 结果 准确、 可信、 适合现场检测等优点， 适合临床对更为准确、 简便检测的需要。 说 明 书 CN 103529224 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103529224 A 7 。