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1、(10)申请公布号 CN 103344633 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103344633 A *CN103344633A* (21)申请号 201310300623.6 (22)申请日 2013.07.17 G01N 21/76(2006.01) G01N 33/52(2006.01) (71)申请人 江阴泽成生物技术有限公司 地址 214434 江苏省无锡市江阴市澄江中路 159 号 D405 室 (72)发明人 夏振伟 丁建华 余卫国 杨旻 (74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 11401 代理人 巴晓艳 (54) 发明名称 一种碱性磷酸酶的。
2、化学发光底物液 (57) 摘要 本发明公开了一种可应用于免疫检测领 域的化学发光底物液， 所述的发光底物液中含 有 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲 基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐和N， N二甲基吖啶 硝酸盐、 三羟甲基氨基甲烷、 亚硫酸钠、 十二烷基 硫酸钠、 TWEEN-20。 本发明的化学发光底物液灵敏 高、 达到平台时间短、 平台稳定期长、 稳定性高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103344633。
3、 A CN 103344633 A *CN103344633A* 1/1 页 2 1. 一种化学发光底物液， 包含 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲基 -9,10- 二 氢化吖啶 - 二钠盐和 N， N 二甲基吖啶硝酸盐以及缓冲液。 2. 根据权利要求 1 所述的化学发光底物液， 其特征在于， 其中的发光底物液中含有 ： 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐 100 160mg/L N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.03.5 mg/L 十二烷基硫酸钠 0.56-1.20g/L 亚硫酸钠 7-13mg/L TWEEN-20 0。
4、.15-0.33g/L 0.26mol/L 的 Tris 缓冲体系 PH 8.9-9.6。 3. 根据权利要求 1 所述的化学发光底物液， 其特征在于， 其中的发光底物液中含有 ： 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐 120mg/L N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg/L 十二烷基硫酸钠 1g/L 亚硫酸钠 10mg/L TWEEN-20 0.31g/L 0.26mol/L 的 Tris 缓冲体系 PH 9.35。 4. 根据权利要求 1 所述的化学发光底物液， 其特征在于， 其中的发光底物液中含有 ： 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚。
5、甲基） -10- 甲基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐 120mg/L N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg/L 十二烷基硫酸钠 1g/L 亚硫酸钠 10mg/L TWEEN-20 0.15g/L 0.26mol/L 的 Tris 缓冲体系 PH 9.10。 5. 根据权利要求 1 所述的化学发光底物液， 其特征在于， 其中的发光底物液中含有 ： 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐 120mg/L N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg/L 十二烷基硫酸钠 1g/L 亚硫酸钠 10mg/L TWEEN-20 0.15g/L 0.2。
6、mol/L 的硼酸 - 硼砂缓冲体系 PH 9.35。 权 利 要 求 书 CN 103344633 A 2 1/7 页 3 一种碱性磷酸酶的化学发光底物液 技术领域 0001 本发明涉及免疫分析领域， 可应用于免疫检测领域的化学发光底物液。 背景技术 0002 化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。 一些物质在进行 化学反应时， 吸收了反应过程中的所产生的化学能， 使反应产物分子激发到电子激发态。 当 电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时产生辐射， 多余的能量以光子的 形式释放出来， 这一现象称为化学发光。化学发光免疫分析 (chemiluminescence。
7、immunoa ssay,CLIA), 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合， 用于 各种抗原、 半抗原、 抗体、 激素、 酶、 脂肪酸、 维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分 析、 酶免分析、 荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定 技术。化学发光具有灵敏度高、 特异性强、 无放射危害等优点。 0003 根据化学发光反应的不同体系和标记物及标记方法的不同， 发光免疫分析大 体可分为化学发光免疫分析、 化学发光酶免疫分析及生物发光免疫分析三种类型。其 中化学发光酶免疫技术是用与某一反应的酶来标记抗原或抗体， 免疫反应后， 加入发光 试剂， 。
8、测定发光体系的发光强度进行抗原或抗体测定。碱性磷酸酶 -9,10- 二氢吖啶 （alkalinephosphatase， ALP） 系统就是其中一个重要发展方向。 0004 以碱性磷酸酶催化 9-10- 二氢吖啶的化学发光反应具有以下特点 ： 0005 超高的灵敏度可以检测到小于 10-19mol 的碱性磷酸酶。 0006 能迅速达到峰值以减少检测时间， 增加通过量。 0007 持续发光对测定时间要求并不高。 发光强度可以在任何时间从产生的线性校准 曲线上读取。 0008 分析结果对温度在 22 -35范围内不敏感， 降低控制温度所需的精度。 0009 通常， 把参与酶反应， 被酶作用的物质称。
9、为底物， 含有该底物的溶液， 称为底物液。 碱性磷酸酶发光底物液主要由发光剂 （9,10- 二氢吖啶或其衍生物） 、 N， N 二甲基吖啶硝酸 盐 （增强剂） 、 缓冲液组成。 发明内容 0010 本发明需要解决的技术问题在于提供一种稳定的， 发光值高， 进入平台期快， 发光 时间长、 灵敏度高、 成本低的化学发光底物液。 0011 为了解决上述技术问题， 本发明提供可一种化学发光底物液， 其中发光液中含有 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐和 N， N 二甲基吖 啶硝酸盐以及缓冲液。 0012 本发明的化学发光底物液成本低， 发光强度与。
10、进口发光底物无明显差异， 在免疫 分析领域完全可以替代进口底物液， 适用于半自动化学发光测定仪， 也可用于全自动的测 量系统。 说 明 书 CN 103344633 A 3 2/7 页 4 0013 在上述技术方案的基础上， 本发明还可以做如下改进 ： 0014 化学发光底物液的发光底物液中含有 ： 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲 基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐 100 160mg/L， N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.0 3.5mg/L， 十二烷基硫酸钠 0.56-1.20g/L， 亚硫酸钠 7-13mg/L， TWEEN-200.15-0.33g/L， 0.2。
11、6mol/ L 的 Tris 缓冲体系 PH8.9-9.6。 0015 采用上述进一步的方案有益效果是发光强度增高， 进入平台时间短， 平台时间长， 灵敏度强。 0016 在上述进一步方案的基础上， 所有化学发光底物液的发光底物液中各组分优选浓 度为 ： 0017 9-（4- 氯苯基硫代苯酰氧亚甲基） -10- 甲基 -9,10- 二氢化吖啶 - 二钠盐 120mg/ L， N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg/L， 十二烷基硫酸钠 1g/L， 亚硫酸钠 10mg/L， TWEEN-20 0.31g/L， 0.26mol/L 的 Tris 缓冲体系 PH9.35 0018 以上所述的发光液中。
12、， 所有的缓冲液还可以采用其他常规的缓冲体系， 例如硼 酸 - 硼砂缓冲液等。 附图说明 0019 图 1 为癌胚抗原 （CEA） 浓度 - 发光值校准曲线图 （进口对照发光底物液） ； 0020 图 2 为癌胚抗原 （CEA） 浓度 - 发光值校准曲线图 （本发明发光底物液） ； 0021 图 3 为进口对照发光底物液和本发明发光底物液发光平台期比较图 ； 具体实施方式 0022 一下结合附图对本发明的原理和特征进行描述， 所举实施例只用于解释本发明， 并不限制本发明的范围。 0023 实施例 1 0024 配制 1000mL 化学发光底物液， 具体配方如下。化学发光底物发光底物液 ： 00。
13、25 0026 化学发光底物液的发光底物液 1000mL 配制采用以下方法 ： 取 Tris31.3g， 亚硫酸 钠 10mg， 十二烷基硫酸钠 1g， N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg， TWEEN-200.31g， 用纯化水溶解 定容至 1000mL， pH9.35。 0027 实施例 2 0028 比较上述实施例 1 中所述发光液与对照市售进口 Lumigen 公司生产的 APS-5 发光 说 明 书 CN 103344633 A 4 3/7 页 5 底物液在测定癌胚抗原 （CEA） 实验中的发光强度。 0029 实验步骤 ： 样本、 校准品各加30ul于平底试管， 加入60ul的。
14、抗试剂混匀， 37温浴 30min， 加入 30ul 磁微粒试剂 37 摄氏度温浴 5min。用洗液洗 3 遍， 放入半自动发光仪中， 每 管加入 200ul 发光底物测试发光值。 0030 分别用 Lumigen 公司生产的 APS-5 发光底物液和实施例 1 中的发光底物液分别对 校准品进行实验， 结果如下 ： 0031 表 1 进口对照发光底物液与本发明发光底物液不同校准品浓度发光值表 0032 0033 以上述进口对照发光底物测定癌胚抗原 （CEA） 浓度 - 发光值进行线性拟合 ： 0034 四参数 Logistic 方程 （新） 0035 拟合方程 ： 0036 Y=66100.8。
15、677+(2289796.8575-66100.8677)(1+(X/126.5474) 1.2478) 0037 相关系数 ： 0.999766。 0038 绘制图 1， 进口对照发光底物液癌胚抗原 （CEA） 浓度 - 发光值校准曲线图。 0039 以上述进本发明发光底物胚抗原 （CEA） 浓度 - 发光值进行线性拟合 ： 0040 四参数 Logistic 方程 （新） 0041 拟合方程 ： 0042 Y=67512.5872+(2870339.4817-67512.5872)(1+(X/174.6378) 1.0773) 0043 相关系数 ： 0.999539。 0044 绘制图 。
16、2， 进口对照发光底物液癌胚抗原 （CEA） 浓度 - 发光值校准曲线图。 0045 参见图 1 和图 2 可看出， 本发明化学发光底物液发光强度与进口对照发光底物液 比较差别不大。 0046 分别用 Lumigen 公司生产的 APS-5 发光底物液和实施例 1 中的发光底物液分别对 说 明 书 CN 103344633 A 5 4/7 页 6 校准品进行实验， 结果如下 ： 0047 表 2 进口发光底物液与本发明底物液对比样本检测浓度和发光值 0048 0049 0050 实施例 3 0051 比较上述实施例 1 中所述发光底物液与市售进口 Lumigen 公司生产的 APS-5 发光 。
17、底物液测定癌胚抗原 （CEA） 实验中的发光平台期。 0052 样本、 校准品各加 30ul 于平底试管， 加入 60ul 的抗试剂混匀， 37温浴 30min， 加 入 30ul 磁微粒试剂 37 摄氏度温浴 5min。用洗液洗 3 遍， 放入半自动发光仪中， 每管加入 200ul 发光底物后， 每 30 秒测量 1 次， 连续测试 10 分钟， 统计相同样本的发光值在 10 分钟 说 明 书 CN 103344633 A 6 5/7 页 7 内的变化情况。 0053 分别使用进口发光底物与实施例 1 所述发光底物液进行实验。 0054 结果如下 ： 0055 表 3 进口对照发光底物液与本。
18、发明发光底物液发光平台测定实验相对发光值表 0056 0057 说 明 书 CN 103344633 A 7 6/7 页 8 0058 以上表数据绘制反应时间 - 发光计数值图， 见图 3。 0059 参见图 3， 从实验结果可看出， 本发明化学发光底物液与进口对照发光底物液发光 平台期数据对照， 差别不大。 0060 实施例 4 0061 配制 1000mL 化学发光底物液， 具体配方如下。化学发光底物发光底物液 ： 0062 说 明 书 CN 103344633 A 8 7/7 页 9 0063 化学发光底物液的发光底物液 1000mL 配制采用以下方法 ： 取 Tris31.3g， 亚硫。
19、酸 钠 10mg， 十二烷基硫酸钠 1g， N， N 二甲基吖啶硝酸盐 3.4mg， TWEEN-200.15g， 用纯化水溶 解定容至 1000mL， pH9.35。 0064 实施例 5 0065 配制 1000mL 化学发光底物液， 具体配方如下。化学发光底物发光底物液 ： 0066 0067 化学发光底物液的发光底物液 1000mL 配制采用以下方法 ： 取硼酸 11.4g， 硼砂 4.9g， 亚硫酸钠10mg， 十二烷基硫酸钠1g， N， N二甲基吖啶硝酸盐3.268mg， TWEEN-200.15g， 用纯化水溶解定容至 1000mL， pH9.35。 0068 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103344633 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103344633 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103344633 A 11 。