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1、(10)申请公布号 CN 103344755 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103344755 A *CN103344755A* (21)申请号 201310305454.5 (22)申请日 2013.07.19 G01N 33/531(2006.01) G01N 33/555(2006.01) (71)申请人 中国科学院苏州生物医学工程技术 研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城科 灵路 88 号 (72)发明人 王红梅 李勇 田晶晶 丁少华 段生宝 陈烨洲 史素霞 李冬 (74)专利代理机构 苏州广正知识产权代理有限 公司 32234 代理人 刘述生 (。
2、54) 发明名称 一种磁化醛化羊红细胞的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种磁化醛化羊红细胞的制备 方法， 包括步骤为 ： 纳米磁珠制备 ； 醛化羊红细胞 制备 ； 磁化醛化羊红细胞制备 ； 磁化醛化羊红细 胞包被蛋白 ； 样品检测 ； 结果观察。制得的磁化醛 化羊红细胞用于凝集试验的指示细胞、 抗原抗体 凝集试验的载体以及酶、 化学发光物或者荧光物 质标记试验中检测载体。本发明制备的磁化醛化 羊红细胞， 保存期较长， 同时具备顺磁性， 能够实 现迅速聚集和再分散， 避免传统凝集试验中繁琐 的离心过程， 同时可用来制备成尺寸大小均一的 人工型颗粒性抗原抗体 ； 代替固相载体后包被和 检测。
3、反应都在匀相中进行， 反应充分敏感性更高， 且比酶标板成本低廉， 主要可用于特殊红细胞血 型抗体以及其他可溶性抗原抗体筛检或定量检测 试验。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103344755 A CN 103344755 A *CN103344755A* 1/1 页 2 1. 一种磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 纳米磁珠制备 ； （2） 醛化羊红细胞制备 ； （3） 磁化醛化羊红细胞制备 ；。
4、 （4） 磁化醛化羊红细胞包被蛋白 ； （5） 样品检测 ； （6） 结果观察。 2. 根据权利要求 1 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 纳 米磁珠制备的具体步骤为 ： 配制铁盐溶液和氨水溶液， 在配制好的铁盐溶液中加入表面活 性剂并搅拌， 然后加入配制好的氨水溶液得到纳米磁珠。 3. 根据权利要求 1 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 醛 化羊红细胞制备的具体步骤为 ： 用生理盐水将羊红细胞洗涤后稀释， 加入戊二醛， 混匀后静 置， 洗涤除去多余戊二醛， 制成悬液备用。 4. 根据权利要求 1 所述的磁化醛化羊红细胞的制备。
5、方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 磁 化醛化羊红细胞制备的具体步骤为 ： 通过预实验确定磁化条件， 醛化羊红细胞和纳米磁珠 混匀振荡， 然后磁力吸附洗涤， 将未被磁化的红细胞洗去。 5. 根据权利要求 1 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 磁 化醛化羊红细胞包被蛋白的具体步骤为 ： 将磁化醛化羊红细胞和蛋白两者混合后静置， 再 用滚轴仪混合， 然后再静置洗涤， 制成悬液备用。 6. 根据权利要求 2 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述的纳米磁 珠粒径为 10-500 nm。 7. 根据权利要求 3 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 。
6、其特征在于， 所述羊红细胞 的压积百分比浓度为 2-5%， 戊二醛的质量百分比浓度为 1-2%， 两者按 1:1 的反应体积比混 合。 8. 根据权利要求 4 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述醛化羊红 细胞和纳米磁珠的压积比为 15:1。 9. 根据权利要求 5 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白的 质量浓度为 1-5 mg/mL， 磁化醛化羊红细胞的压积百分比浓度为 20-50%， 两者体的积比为 3:1。 10. 根据权利要求 1 所述的磁化醛化羊红细胞的制备方法， 其特征在于， 所述磁化醛化 羊红细胞能作为凝集试验的指示细胞、 抗原抗体筛检凝。
7、集试验的载体以及抗原抗体的酶、 化学发光物或者荧光物质标记试验中定性或定量检测的载体。 权 利 要 求 书 CN 103344755 A 2 1/5 页 3 一种磁化醛化羊红细胞的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种磁化醛化羊红细胞的制备方法。 背景技术 0002 凝集反应是一种血清学反应， 过程为颗粒性抗原 （完整的病原微生物或红细胞等） 与相应抗体结合， 在有电解质存在的条件下， 经过一定时间， 出现肉眼可见的凝集小块， 凝 集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。 0003 直接凝集反应是颗粒状抗原 （如细菌、 红细胞等） 与相应抗体直接结合所出现的。
8、凝 集现象， 主要分为玻片法和试管法。 玻片法是一种定性试验方法， 可用已知抗体来检测未知 抗原。试管法是一种定量试验的经典方法， 可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及 抗体的含量， 用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。 0004 间接凝集反应是将可溶性抗原 （或抗体） 先吸附于一种与免疫无关的、 一定大小的 颗粒状载体的表面， 制成人工型颗粒性抗原， 然后与相应抗体 （或抗原） 作用， 在有电介质存 在的适宜条件下， 即可发生凝集。用做载体的微球可用天然的微粒性物质， 如人 （O 型） 和动 物 （绵羊、 家兔等） 的红细胞、 活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等， 也可用人工合成或天然高分子材 。
9、料制成， 如聚苯乙烯胶乳微球等。 由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积， 当颗粒上的 抗原与微量抗体结合后， 就足以出现肉眼可见的反应， 敏感性比直接凝集反应高得多。 0005 凝集反应中的颗粒型抗原， 使用的是新鲜细胞或者细菌， 都存在不宜长期保存， 以 及操作繁琐等缺陷， 虽然凝集试验检测结果比较直观， 但存在灵敏度低和准确性差的问题， 且实验结果不易标准化， 这对凝集反应在常规抗原抗体反应的免疫学检测的应用推广使用 造成了一定的障碍。因此， 在凝集试验基础上发展出酶、 化学发光或者荧光标记等检测技 术， 利用人工型颗粒性物质增大可溶性抗原的反应面积和敏感的检测手段， 使可溶性抗原 抗体。
10、检测更加准确、 快捷。目前采用人工合成或天然高分子材料制成一些微球， 用于可溶 性抗原抗体的检测， 但这种类型的微球合成过程比较繁琐， 实验条件要求苛刻， 购买成品价 格高， 且存在大小颗粒不均一， 以及蛋白标记效率低等缺点， 所以至今在临床上未被广泛使 用。 发明内容 0006 本发明主要解决的技术问题是提供一种磁化醛化羊红细胞的制备方法， 本发明制 备的复合物颗粒既具备指示颗粒的特性， 又具备固相载体的特性而能被制成人工型颗粒性 抗原抗体， 保存期较长， 同时又具有顺磁性， 能够实现迅速聚集和再分散， 避免传统凝集试 验中繁琐的离心过程， 十分便捷， 其可用于作为传统凝集试验的指示细胞、 。
11、抗原抗体筛检凝 集试验的载体以及抗原抗体的酶、 化学发光物或者荧光物质标记试验中定性或定量检测的 载体， 这种载体能够代替固相载体而制备成尺寸大小均一的人工型颗粒性抗原抗体， 其中 包被和检测反应都在匀相中进行， 不仅比普通酶标板成本低廉， 更使得反应更充分， 敏感性 更高。 说 明 书 CN 103344755 A 3 2/5 页 4 0007 为解决上述技术问题， 本发明采用的一个技术方案是 ： 提供一种磁化醛化羊红细 胞的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 纳米磁珠制备 ； （2） 醛化羊红细胞制备 ； （3） 磁化醛化羊红细胞制备 ； （4） 磁化醛化羊红细胞包被蛋白 ； （5） 样。
12、品检测 ； （6） 结果观察。 0008 在本发明一个较佳实施例中， 所述步骤 （1） 纳米磁珠制备的具体步骤为 ： 配制铁 盐溶液和氨水溶液， 在配制好的铁盐溶液中加入表面活性剂并搅拌， 然后加入配制好的氨 水溶液得到纳米磁珠。 0009 在本发明一个较佳实施例中， 所述步骤 （2） 醛化羊红细胞制备的具体步骤为 ： 用 生理盐水将羊红细胞稀释， 加入戊二醛， 混匀后静置， 洗涤除去多余戊二醛， 制成悬液备用。 0010 在本发明一个较佳实施例中， 所述步骤 （3） 磁化醛化羊红细胞制备的具体步骤为 ： 通过预实验确定磁化条件， 醛化羊红细胞和纳米磁珠混匀振荡， 然后磁力吸附洗涤， 将未被 。
13、磁化的红细胞洗去。 0011 在本发明一个较佳实施例中， 所述步骤 （4） 磁化醛化羊红细胞包被蛋白的具体步 骤为 ： 将磁化醛化羊红细胞和蛋白两者混合后静置， 再用滚轴仪混合， 然后再静置洗涤， 制 成悬液备用。 0012 在本发明一个较佳实施例中， 所述的纳米磁珠粒径为 10-500 nm。 0013 在本发明一个较佳实施例中， 所述羊红细胞的压积百分比浓度为 2-5%， 戊二醛的 质量百分比浓度为 1-2%， 两者按 1:1 的反应体积比混合。 0014 在本发明一个较佳实施例中， 所述醛化羊红细胞和纳米磁珠的压积比为 15:1。 0015 在本发明一个较佳实施例中， 所述蛋白的质量浓度。
14、为 1-5 mg/mL， 磁化醛化羊红细 胞的压积百分比浓度为 20-50%， 两者体的积比为 3:1。 0016 在本发明一个较佳实施例中， 所述磁化醛化羊红细胞能作为凝集试验的指示细 胞、 抗原抗体筛检凝集试验的载体以及抗原抗体的酶、 化学发光物或者荧光物质标记试验 中定性或定量检测的载体。 0017 本发明的有益效果是 ： 1、 本发明涉及的羊红细胞来源广泛， 成本低廉， 尺寸大小均一， 醛化后的羊红细胞不易 溶血， 可以保存 3 个月以上的时间， 因而是一种很好的指示颗粒， 在传统的凝集试验中有很 广泛的应用。 0018 2、 本发明创新性地将纳米磁珠引入到醛化羊红细胞表面， 形成磁化。
15、醛化羊红细 胞， 这样一种复合物颗粒既具备指示颗粒的特性， 又具备固相载体的特性而能被制备成人 工型颗粒性抗原， 保存期较长， 同时又具有顺磁性， 能够实现迅速聚集和再分散， 避免传统 凝集试验中繁琐的离心过程， 十分便捷。 0019 3、 不仅能够用于传统的凝集试验的指示细胞， 也能够作为抗原抗体筛检凝集试验 的载体以及抗原抗体的的酶、 化学发光物或者荧光物质标记试验中定性或定量检测的载 体， 代替固相载体后其中包被和检测反应都在匀相中进行， 不仅比普通酶标板成本低廉， 还 说 明 书 CN 103344755 A 4 3/5 页 5 能使得反应更充分， 敏感性更高， 主要可以用于特殊红细胞。
16、血型抗体以及其他可溶性抗原 抗体筛检或定量检测试验。 附图说明 0020 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案， 下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例， 对于 本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其它 的附图， 其中 ： 图 1 是本发明磁化醛化羊红细胞的制备方法一较佳实施例得到的磁化醛化羊红细胞 的扫描电镜的图。 具体实施方式 0021 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发。
17、明中的实施例， 本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例， 都属于本发明保护的范 围。 0022 实施例一 ： 提供一种应用醛化磁化羊红细胞对可溶性抗体检测凝集试验模型， 检测其他特异性抗 体， 将其对应的特异性抗原包被到醛化磁化羊红细胞上， 能够应用与抗体检测。 包括如下步 骤 ： 1、 纳米磁珠的制备 0.85g FeCl36H2O和0.30g FeCl24H2O在氮气保护下溶在200 mL蒸馏水中。 加入适量 表面活性剂， 在强力搅拌下， 将1.5 mol/L氨水溶液缓慢加入到上述溶液中， 当溶液的pH升 高至 67 时， 溶液中产生大量的黑色 Fe3O4粒子。
18、 ； 继续加氨水至 pH=8， 使水解完全。在 80 下陈化 0.5 h。将生成的固体分离， 用蒸馏水洗 3 次， 然后在超声作用下将其分散在 100 mL 蒸馏水中， 得到 Fe3O4的胶体溶液收集备用。 0023 2、 羊红细胞制备 将10 mL新鲜羊血在1500 rpm下离心10 min， 收集红细胞， 再用生理盐水洗涤3次， 制 成 2 mL 红细胞悬液备用。 0024 3、 戊二醛配置 用生理盐水配置 2% 浓度戊二醛 10 mL， 备用。 0025 4、 羊红细胞醛化 （1） 用生理盐水将羊红细胞稀释成 5% 浓度， 取 5 mL， 加入等体积的 2% 浓度戊二醛， 轻 轻混匀后，。
19、 4静置 30 min ； （2） 用生理盐水洗涤 3 次， 洗去多余戊二醛， 用生理盐水制成悬液备用。 0026 5、 醛化羊红细胞磁化 （1） 通过预实验确定磁化条件， 醛化红细胞和磁珠压积比为 15:1， 各取 1 mL 混匀振荡 2min ； （2） 磁力吸附洗涤， 将未被磁化的红细胞洗去。 说 明 书 CN 103344755 A 5 4/5 页 6 0027 6、 醛化磁化羊红细胞包被血型多肽抗原 （1） 血型多肽抗原的质量浓度为 2 mg/mL， 用 0.15M 的 pH 值为 7.2 的 PBS 稀释 ； （2） 磁化醛化羊红细胞用 0.15M 的 pH 值为 7.2 的 PB。
20、S 置换并稀释至质量百分比浓度 50% ； （3） 磁化醛化羊红细胞和血型多肽抗原体积比 3:1， 两者混合， 室温静置 30 min ； （4） 用滚轴仪混合 5 h， 转速 100 r/min ； （5） 室温静置 30 min 后用 0.15 M PH7.2 PBS 洗涤 3 次， 制成悬液备用。 0028 7、 样品检测 （1） 将包被血型多肽抗原的醛化磁化羊红细胞悬液100l于96孔酶标板孔中， 加入正 常人样本 / 阴性样本 / 空白样本各 50l， 振荡 1 min ； （2） 37水浴孵育 30 min 后， 期间振荡混匀， 用程控磁化振荡器吸附洗涤 3 次 ； （3） 加入羊。
21、抗人 IgM, 37水浴孵育 30 min 后， 振荡混匀观察结果 ； （4） 阳性结果出现凝集现象， 阴性及空白对照则无凝集现象。 0029 8、 检测及结果判读。 0030 实施例二 ： 提供一种应用醛化磁化羊红细胞用于抗体荧光检测试验模型， 将特异性抗原包被到醛 化磁化羊红细胞上， 用于抗体检测。包括如下步骤 ： 1、 纳米磁珠制备 0.85g FeCl36H2O和0.30g FeCl24H2O在氮气保护下溶在200 mL蒸馏水中。 加入适量 表面活性剂， 在强力搅拌下， 将1.5 mol/L氨水溶液缓慢加入到上述溶液中， 当溶液的pH升 高至 67 时， 溶液中产生大量的黑色 Fe3O。
22、4粒子 ； 继续加氨水至 pH=8， 使水解完全。在 80 下陈化 0.5 h。将生成的固体分离， 用蒸馏水洗 3 次， 然后在超声作用下将其分散在 100 mL 蒸馏水中， 得到 Fe3O4的胶体溶液收集备用。 0031 2、 羊红细胞制备 将10 mL新鲜羊血在1500 rpm离心10 min， 收集红细胞， 再用生理盐水洗涤3次， 制成 2 mL 红细胞悬液备用。 0032 3、 戊二醛配置 用生理盐水配置 2% 浓度戊二醛 10 mL， 备用。 0033 4、 羊红细胞醛化 （1） 用生理盐水将羊红细胞稀释成 5% 浓度， 取 5 mL， 加入等体积的 2% 浓度戊二醛， 轻 轻混匀后。
23、， 4静置 30 min ； （2） 用生理盐水洗涤 3 次， 洗去多余戊二醛， 用生理盐水制成悬液备用。 0034 5、 醛化羊红细胞磁化 （1） 通过预实验确定磁化条件， 醛化红细胞和纳米磁珠压积比为 15:1， 各取 1 mL 混匀 振荡 2min， （2） 磁力吸附洗涤， 将未被磁化的红细胞洗去。 0035 6、 醛化磁化羊红细胞包被人 IgG （1） IgG 的质量浓度为 2mg/mL， 用 0.15M 的 pH 值为 7.2 的 PBS 稀释 ； （2） 醛化磁化羊红细胞用 0.15M 的 pH 值为 7.2 的 PBS 置换并稀释至质量百分比浓度 说 明 书 CN 1033447。
24、55 A 6 5/5 页 7 为 50% 浓 ； （3） 醛化磁化羊红细胞和 IgG 体积比 3:1， 两者混合， 室温静置 30 min ； （4） 用滚轴仪混合 5 h， 转速 100rpm ； （5） 室温静置 30 min 后用 0.15M 的 pH 值为 7.2 的 PBS 洗涤 3 次， 制成悬液备用。 0036 7、 样品检测 （1） 将包被人 IgG 的醛化磁化羊红细胞悬液于 96 孔酶标板孔中 ； （2） 加入 FITC 标记的羊抗人 IgG， 37水浴孵育 30 min， 洗涤 2 次 ； （3） 流式细胞仪或者荧光检测仪读取荧光信号值。 0037 本发明的有益效果是 ： 。
25、本发明涉及的羊红细胞来源广泛， 成本低廉， 尺寸大小均 一， 醛化后的羊红细胞不易溶血， 可以保存 3 个月以上的时间， 因而是一种很好的指示颗 粒， 在传统的凝集试验中有很广泛的应用。本发明创新性地将纳米磁珠引入到醛化羊红细 胞表面， 形成磁化醛化羊红细胞， 这样一种复合物颗粒既具备指示颗粒的特性， 又具备固相 载体的特性而能被制备成人工型颗粒性抗原， 能够显著延长保存期， 同时在磁场作用下又 具备磁性， 能够实现迅速聚集和再分散， 避免传统凝集试验中繁琐的离心过程， 十分便捷。 不仅能够用于传统的凝集试验中的指示细胞， 也能作为抗原抗体筛检凝集试验的载体以及 抗原抗体的酶、 化学发光物或者荧光物质标记试验中定性或定量检测的载体， 代替固相载 体后其中包被和检测反应都在匀相中进行， 不仅比普通酶标板成本低廉， 还能使得反应更 充分， 敏感性更高， 主要可以用于特殊红细胞血型抗体以及其他可溶性抗原抗体筛检或定 量检测试验。 0038 以上所述仅为本发明的实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换， 或直接或间接运用在其它相关的技术领 域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。 说 明 书 CN 103344755 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103344755 A 8 。