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1、(10)申请公布号 CN 103343162 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103343162 A *CN103343162A* (21)申请号 201310222451.5 (22)申请日 2013.06.06 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (71)申请人 深圳出入境检验检疫局动植物检验 检疫技术中心 地址 518045 广东省深圳市福强路 1011 号 (72)发明人 章桂明 向才玉 凌杏园 潘广 程颖慧 康林 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代。
2、理人 彭家恩 彭愿洁 (54) 发明名称 玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测 引物及检测方法 (57) 摘要 本申请公开了一种玉米泛素蛋白启动子基因 的 PCR-DHPLC 检测引物及检测方法， 该引物具有 较强的特异性， 能够用于 PCR， 并特异性的扩增出 玉米泛素蛋白启动子基因的 DNA 片段， 并且其扩 增产物能够适合于后续的 DHPLC 分析。该检测方 法提供了一种操作简便、 扩展性能好、 特异性强 的玉米泛素蛋白启动子基因的检测方法。利用 DHPLC对PCR扩增产物进行分析， 其片段大小区分 率可达数个碱基， 分辨率高。 本申请的引物和检测 方法为玉米泛素蛋白启动子。
3、基因的检测提供了一 种简单、 方便、 有效、 可靠的检测方法， 特别适合用 于口岸检验检疫等部门使用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103343162 A CN 103343162 A *CN103343162A* 1/1 页 2 1. 一种用于玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测的引物， 其特征在于 ： 所述引 物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物含有Seq ID No.1所示序。
4、列， 所述下游引物含有 Seq ID No.2 所示序列 ； Seq ID No.1 ： 5 -CAGAAATTGCGTGGCGGA-3 Seq ID No.2 ： 5 -GGGCGAGGAAGGGAAAGC-3 。 2. 一种玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测方法， 其特征在于 ： 所述检测方法 包括采用权利要求 1 所述的引物， 以待检测样品的 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 对 PCR 扩增的 产物进行变性高效液相色谱分析。 3. 根据权利要求 2 所述的检测方法， 其特征在于 ： 所述检测方法还包括以 DNA marker 为参考标准进行变性高效液相色谱分析， 将 。
5、PCR 扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与 DNA marker 的变性高效液相色谱分析结果进行比对。 权 利 要 求 书 CN 103343162 A 2 1/5 页 3 玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测引物及检测方 法 技术领域 0001 本申请涉及转基因产品的检测， 特别是涉及一种玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测引物及检测方法。 背景技术 0002 目前， 转基因棉花、 水稻、 小麦、 玉米、 大豆等转基因作物越来越多， 对转基因作物 的检测研究也成为各国的热点。 其中， 转基因作物中经常使用的启动子， 玉米泛素蛋白启动 子 ( 即筛选基因 ubiq。
6、uitin) 是检测转基因作物的一个重要靶标基因。目前对玉米泛素蛋 白启动子基因的检测方法主要采用常规 PCR、 实时荧光 PCR、 DNA 印迹法、 RNA 印迹法和基因 芯片法等。传统的常规 PCR 检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性， 随着待检目标的 增加， 需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化， 并且兼顾扩增效率等因素， 工 作量较大 ； 另一方面， 通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法， 区分效率不高， 检测结果 不理想。实时荧光 PCR 虽然在检测灵敏度等方面较多重常规 PCR 检测方法有优势， 但是由 于目前仪器自身及荧光染料研制的限制， 仅能同时提供互不干扰的 4。
7、 个荧光通道， 也限制 了该技术在检测通量扩展， 并且检测成本高。DNA 印迹法和 RNA 印迹法， 需要转膜、 杂交， 操 作繁琐、 费用高、 检测时间长， 实际应用也较少。基于常规的多套 PCR 的基因芯片检测方法， 需要多套引物进行扩增， 操作步骤繁琐， 并不适合大规模的高通量检测。 0003 变 性 高 效 液 相 色 谱 技 术 (Denaturing High-performance Liquid Chromatography， DHPLC) 是一种简单、 快速、 非凝胶的核酸分析方法， 具有分辨率好、 扩展 性强、 灵敏度高等优点。该方法在 50条件分析样品， 样品峰的洗脱只由碱。
8、基对的数量决 定， 样品的碱基对数量不同洗脱顺序也不同， 从而产生不同的样品峰。具体的， 当过柱的乙 腈浓度提高， 核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与 DNA marker 比较确定分子量大小， 从而判定样品中是否含有目标检测基因。PCR-DHPLC， 是将 PCR 与 DHPLC 相结合的技术， 即先采用 PCR 扩增出靶标序列， 然后再对扩增产物进行 DHPLC 分析， 从而提高检测的灵敏度和特异性。目前， 尚没有玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 的检测方法。 发明内容 0004 本申请的目的是提供一种新的用于玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DH。
9、PLC 检测 的引物， 以及基于该引物的玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测方法。 0005 为实现上述目的， 本申请采用了以下技术方案 ： 0006 本申请公开了一种用于玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测的引物， 该引 物的上游引物含有 Seq ID No.1 所示序列， 下游引物含有 Seq ID No.2 所示序列 ； 0007 Seq ID No.1 ： 5 -CAGAAATTGCGTGGCGGA-3 0008 Seq ID No.2 ： 5 -GGGCGAGGAAGGGAAAGC-3 。 说 明 书 CN 103343162 A 3 2/5 页 4 00。
10、09 需要说明的是， 本申请的引物是针对玉米泛素蛋白启动子基因而设计的特异性引 物， 能够对玉米泛素蛋白启动子基因进行特异性扩增， 因此， 可以理解， 该引物除了用于本 申请的 PCR-DHPLC 检测以外， 同样适用于常规的 PCR 检测， 以及其它的基于 PCR 扩增的检 测， 如实时荧光 PCR、 基因芯片等等。 0010 本申请的另一面还公开了一种玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测方法， 该检测方法包括采用本申请设计的引物， 以待检测样品的 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 对 PCR 扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。 0011 需要说明的是， 本申请设计的引物是。
11、针对玉米泛素蛋白启动子基因的特异性引 物， 因此， 可以理解， 如果待检测样品中含有足量的玉米泛素蛋白启动子基因成分， 即可扩 增出相应的靶标片段， 并在 DHPLC 分析时产生相应的洗脱峰。另外， 本申请的引物， 同时也 是根据 DHPLC 分析的特殊需求设计的， 该引物扩增出来的产物能够很好的适用于 DHPLC 分 析。还需要说明的是， 虽然本申请的引物能够从各种样品中检测出玉米泛素蛋白启动子基 因从而判断出检测样品中是否含有转基因成分， 但是， 可以理解， 这并不适用于含有玉米的 样品， 因为玉米种本身就含有该启动子， 无从判断该启动子是玉米本身具有的还是转基因 作物具有的。因此， 本申。
12、请的引物和方法只可用于不含玉米成分的转基因样品检测。 0012 进一步的， 本申请的检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相 色谱分析， 将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色 谱分析结果进行比对。 0013 优选的本申请的检测方法包括如下步骤 ： 0014 (A) 采用本申请的引物， 以待检测样品的 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增 ； 0015 (B) 以步骤 (A) 的 PCR 扩增产物为样品进行 DHPLC 分析， 同时以 DNA marker 为参 考标准进行 DHPLC 分析 ； 0016 (C) 将步骤 (B) 。
13、中 PCR 扩增产物的 DHPLC 分析结果与 DNA marker 的 DHPLC 分析结 果进行比较， 确定 PCR 扩增产物的分子量大小， 从而判断是否含有检测的靶标序列。 0017 需要说明的是， 理论上， 本申请的引物是根据玉米泛素蛋白启动子基因设计的特 异性引物， 能够对待检测样品中的玉米泛素蛋白启动子基因成分扩增出约 165bp 的片段， 因此， 能够通过 DHPLC 分析出 165bp 的洗脱峰 ； 而对其它成分不会有扩增， 即不会有其它洗 脱峰出现。 本申请中， 判断是否含有玉米泛素蛋白启动子基因的靶标序列的依据即， 是否有 165bp 的洗脱峰。 0018 由于采用以上技术。
14、方案， 本申请的有益效果在于 ： 0019 本申请的玉米泛素蛋白启动子基因检测引物具有较强的特异性， 能够用于后续的 多重 PCR 扩增以及 DHPLC 分析。本申请针对传统的电泳分析 PCR 扩增结果不理想的问题， 将 PCR 与 DHPLC 相结合， 提供了一种操作简便、 扩展性能好、 分辨率高的玉米泛素蛋白启动 子基因检测方法。利用 DHPLC 对 PCR 扩增产物进行分析， 对不同大小的 PCR 产物片段区分 率可达数个碱基， 甚至能够区分出 1 个碱基大小差异的片段。本申请的引物和检测方法为 玉米泛素蛋白启动子基因的检测提供了一种简单、 方便、 有效、 可靠的检测方法， 特别适合 用。
15、于口岸检验检疫等部门使用。 附图说明 说 明 书 CN 103343162 A 4 3/5 页 5 0020 图 1 ： 是本申请实施例中 PCR 扩增产物的 DHPLC 分析的部分结果图 ； 0021 其中， 自上而下的曲线分别为， M 代表 DNA marke、 1 代表转基因玉米 MON88017、 2 代表转基因玉米 T25、 3 代表转基因小麦、 4 代表非转基因大豆、 5 代表非转基因油菜、 6 代表 土豆 EH92-527-1、 7 代表非转基因水稻、 8 代表非转基因玉米、 9 代表木瓜、 10 代表空白水对 照。DNA marker 的各峰值从左至右依次为 80bp、 102。
16、bp、 174bp、 257bp、 267bp、 296bp、 434bp、 458bp、 587bp。 具体实施方式 0022 本申请提供了用于玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测的引物， 该引物针 对玉米泛素蛋白启动子基因的特异序列进行设计， 能够用于玉米泛素蛋白启动子基因的特 异性扩增检测。 在此基础上本申请还提供了基于本申请的引物的玉米泛素蛋白启动子基因 的 PCR-DHPLC 检测方法。 0023 需要说明的是， 本申请的引物是针对玉米泛素蛋白启动子基因的 PCR-DHPLC 检测 而设计的， 但是， 可以理解， 该引物本身也是作为 PCR 扩增使用的， 因此， 同样可。
17、以用于常规 的 PCR 扩增、 实时荧光 PCR 扩增、 与基因芯片结合的 PCR 扩增等。 0024 下面通过具体实验例并结合附图对本申请作进一步详细说明。 以下实验例仅仅对 本申请进行进一步的说明， 不应理解为对本申请的限制。 0025 实施例 1 DNA 提取 0026 (1)DNA 提取 ： 参照植物基因组 DNA 提取试剂盒 (QIAGEN， Cat.No.69104) 所提供的 方法稍作改进提取 DNA， 具体操作步骤如下 ： 0027 65预热的 AP1 溶液和 Buffer AE ； 0028 液氮研磨样品至粉末状后， 取适量样品入 1.5mL 的离心管中 ； 0029 向离心。
18、管中加入 400L 预热的 AP1 溶液和 4L100mg/mL 的 RNA 酶， 充分混匀 后， 65水浴 10min-15min， 期间振荡混匀 2-3 次 ； 0030 水浴完成后， 直接加入 130LAP2 溶液， 充分振荡混匀后冰浴 5min 冰浴时不可 震荡， 然后 14000r/min 离心 5min ； 0031 吸取上清加入到 QIA shredder Mini spin column 柱子中， 即试剂盒中的紫色 柱子， 14000rpm/min 离心 2min， 记录吸取的上清液的体积数 ； 0032 弃上面的柱子， 向过滤后的溶液中加入 1.5 倍体积的 Buffer A。
19、P3/E 溶液， 用移 液枪轻轻混匀 ； 0033 每次取 650L 步骤的混匀的溶液转移到 DNeasy Mini spin column 柱子 内， 即试剂盒中白色的柱子， 14000rpm/min 离心 1min， 弃滤液， 直至步骤的混匀的溶液完 全过滤完 ； 需要说明的是， 进行过滤时 DNeasy Mini spin column 柱所能容纳的体积约为 650L， 而步骤的溶液一般都是大于 650L 的， 因此， 每次只能取 650L 溶液， 过滤、 弃 滤液后才能再加入剩余的溶液 ； 0034 弃下面的收集管， 将 spin column 柱放入一个新的 2mL 收集管中， 加入。
20、 500L Buffer AW 溶液， 14000rpm/min 离心 1min 洗脱杂质， 重复洗脱杂质的操作一次， 弃滤液， 12000rpm/min 空管离心 1min ； 0035 弃下面的收集管， 换一新的 1.5mL 离心管， 加入 100L 预热后的 Buffer AE 溶 说 明 书 CN 103343162 A 5 4/5 页 6 解 DNA， 室温静置 5min 沉淀 DNA， 12000rpm/min 离心 1min， 收集的溶液即 DNA 溶液需要说明 的是 100L 预热后的 Buffer AE 可以分两次或多次加入 ； 0036 弃上面的柱子， -20保存 DNA 。
21、溶液。 0037 (2)DNA 纯化 ： 当 DNA 中含蛋白质等杂质的量较高时， 其纯度不能满足实验要求， 需 要对其进行纯化， 具体纯化步骤如下 ： 0038 将提取的 DNA 溶液稀释到 500L-700L 后， 加入等体积的酚和氯仿， 充分混 匀 ； 0039 14000rpm/min 离心 10min， 取上清液 ； 0040 在上清液中加入 0.6 倍体积的异丙醇， -20 C 静置 30min 以上 ； 0041 在 4 C 条件下 14000rpm/min 离心 10min， 弃上清 ； 0042 向步骤中弃上清液的沉淀中加入lmL4C预冷的70的乙醇， 14000rpm/mi。
22、n 离心 10min， 弃上清， 重复操作一次 ； 0043 将经过步骤的乙醇洗涤的沉淀在无菌条件下风干， 加适量 AE Buffer 溶解 DNA， 即获得纯度较高的DNA溶液。 需要说明的是， AE Buffer的加入量根据具体实验要求而 定， 如果希望获得 DNA 溶液的浓度较高， 则可以加入较少量的 AE Buffer， 如 10L-50L， 也可以直接再加入100L Buffer AE， 则DNA浓度与纯化前相当， 或者加入更多量的Buffer AE 以获得较低浓度的 DNA 溶液。 0044 实施例 2 DNA 浓度测定 0045 对提取的样品 DNA 进行浓度和纯度测定 ； 采用。
23、紫外分光光度计测定 260nm 和 280nm 处吸收值， 分别计算核酸的纯度和浓度， 计算公式如下 ： 0046 DNA 纯度 OD260/OD280 0047 DNA 浓度 50OD260mg/mL 0048 DNA 的纯度比值在 1.7 1.9 之间， 浓度大于 10ng/L。 0049 实施例 3 PCR 扩增 0050 根据玉米泛素蛋白启动子基因的 DNA 序列设计引物 ( 表 1)， 并提取以下样品的 DNA 进行特异性检测 ： 转基因玉米 MON88017、 转基因玉米 T25、 转基因小麦、 非转基因大豆、 非转基因油菜、 土豆 EH92-527-1、 非转基因水稻、 非转基因。
24、玉米、 木瓜等。 0051 表 1 玉米泛素蛋白启动子基因的检测引物 0052 名称序列 5 -3Seq ID No. ub-FCAGAAATTGCGTGGCGGA1 ub-RGGGCGAGGAAGGGAAAGC2 0053 PCR 反应体系总体积为 50L， 各成分分别为 ： PCR 反应液 10Buffer5L， 2.5mmol/L dNTP 5L， 10mol/L 的 上 游 引 物 和 下 游 引 物 各 1L， 5U/L Taq polymerase0.3L， DNA 溶液 1L， 然后用灭菌双蒸水补足为 50L。 0054 PCR反应条件 ： 94变性1min ； 然后进入35个循。
25、环 ： 9430s， 5890s， 7290s ； 循环结束后 72延伸 10min。 说 明 书 CN 103343162 A 6 5/5 页 7 0055 实施例 4 DHPLC 检测 0056 将 PCR 产物置于 DHPLC 的自动进样平台上 ； 打开 DHPLC 控制软件 Navigator， 在检 测方法中选择 Multiplex， 即多片段分析， 同时设定检测上限为 600bp， 下限为 70bp ； 运行 两个 blank， 即空针， 平衡色谱柱 ； 运行一个 marker， 用于参考对照， 检测样品的核酸片段大 小 ； 依次对待测样本进行分析， 部分结果见图1。 本申请所采用。
26、的DNA marker为SSR(pUC18/ MspI)DNA Marker， 可通过市售购买获得。 0057 图 1 中由上到下的曲线， 第一条曲线为 DNA marke 进行的 DHPLC 分析曲线， 第二条 曲线至倒数第二条曲线依序为转基因玉米 MON88017、 转基因玉米 T25、 转基因小麦、 非转基 因大豆、 非转基因油菜、 土豆 EH92-527-1、 非转基因水稻、 非转基因玉米和木瓜的 DNA 分别 进行 PCR 扩增后进行 DHPLC 分析的曲线， 最后一条曲线是采用水作为空白对照进行 DHPLC 分析的曲线。 0058 结果判断 ： 观察DHPLC得到的洗脱峰， 通过与。
27、marker比对及WAVE4500自动分析确 定洗脱峰位置的 DNA 片段大小， 据此进行判断。 0059 对以转基因和非转基因玉米的 DNA 为模板的 PCR 扩增产物为样本的 DHPLC 分析， 其分析结果显示， 这些样本中都含有165bp的洗脱峰 ； 以其它不是玉米的样品的DNA为模板 的 PCR 扩增产物为样本的 DHPLC 分析均没有洗脱峰。可见， 本例提供的引物具有良好的特 异性， 能够从众多样品中特异性的检测出玉米泛素蛋白启动子基因。 0060 以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明， 不能认定本申 请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本申请构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本申请的保护 范围。 说 明 书 CN 103343162 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 103343162 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103343162 A 9 。