说明书作为分拣蛋白抑制剂的N-取代的-5-取代的邻氨甲酰苯甲酸
发明领域
本发明涉及某些作为分拣蛋白受体抑制剂并且因此在治疗上有用的N-取代的-5-取代的邻氨甲酰苯甲酸并且涉及包括所述化合物的药物组合物。
发明背景
分拣蛋白(亦称NTR-3或GP95)是一种属于分拣受体的Vps10p(空泡蛋白分拣10蛋白)结构域家族的I型膜受体(Willnow(威尔诺)等人，Nat Rev Neurosci(自然评论神经科学)，12:899-909(2008))，该家族还包括SorLA、SorCS1、SorCS2以及SorCS3。Vps10p家族共用大约700个氨基酸的Vps10p细胞外结构域，该结构域最初在酿酒酵母中被鉴定为分拣受体，它在分拣蛋白中涵盖形成所谓的结构已经被报道的10叶β-螺旋桨(10-bladed beta-propeller)的整个细胞外部分(Quistgaard(奎斯特加德)等人，Nat Struct Mol Biol(自然结构与分子生物学)，1:96-8(2009))。分拣蛋白广泛表达于外周和中枢神经系统的神经元中以及其他组织和细胞中，包括肝脏、心脏、睾丸、子宫、肾脏、骨骼肌、T细胞、B细胞以及NK细胞(Petersen(彼得森)等人.，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，272:3599-3605(1997)；Herman-Borgmeyer(赫尔曼-柏格迈尔)等人.，Mol.Brain Res.(分子脑研究)，65:216-219(1999))。Herda(赫达)等人，Immunity(免疫)，37(5):854-66(2012)。尽管分拣蛋白的分布可以通过配体相互作用而调节，该蛋白只有一小部分表达于细胞表面并且估计90％位于细胞内。
已经显示，分拣蛋白介导神经营养素前体(包括pro-NGF、proNT3和pro-BDNF)的促凋亡作用，这些神经营养素前体通过结合至分拣蛋白-P75复合物而在许多神经退行性障碍的细胞和动物模型中诱导退行性变和细胞死亡(Nykjaer(历查亚)等人，Nature(自然)，427(6977):843-8(2004))。另外，分拣蛋白介导神经营养素受体的运输和分拣并且还是一种proBDNF分泌调节剂(Evans(埃文斯)等人，J Biol Chem(生物化学杂志)，86(34):29556-67(2011))。由此，分拣蛋白被认为是神经营养素的成熟形式与前体形式的通常相反的作用之间的平衡的关键调节剂。基于在与急性和慢性神经退行性病症相关的细胞和动物模型中的研究，靶向分拣蛋白-P75介导的凋亡已经被表明是神经退行性障碍中的保护性机制。确切地，分拣蛋白已经被表明在疼痛中具有有益作用，因为在保留神经损伤疼痛模型中发现分拣蛋白敲除小鼠受到保护(Nykjaer(历查亚)等人，WO 2009/155932 A2)。
除神经营养素前体之外，已经鉴定了若干分拣蛋白结合配偶体。已经显示，分拣蛋白是一种神经肽神经降压素受体(Mazella(马兹拉)等人，J Biol Chem.(生物化学杂志)，273(41):26273-6(1998))，并且最近，还显示作为颗粒蛋白前体(PGRN)受体起作用(Hu(胡)等人，Neuron(神经元)，68(4):654-67，(2010)，Carrasquillo(卡拉斯基罗)等人，Am J Hum Genet(美国人类遗传学杂志)，87(6):890-7(2010))。已经表征了神经降压素和颗粒蛋白前体的结合位点并且显示定位于相同氨基酸(Hu(胡)等人，Neuron(神经元)，68(4):654-67，(2010)，Quistgaard(奎斯特加德)等人，Nat Struct Mol Biol(自然结构与分子生物学)，1:96-8(2009)，Zheng(郑)等人，PLoS One.2011；6(6):e21023(2011))，而已经表明，神经营养素前体结合位点定位于与神经降压素结合位点分离的位点(Serup Andersen(瑟拉普安德森)等人，J Biol Chem.(生物化学杂志)285(16):12210-22(2010))，尽管神经营养素前体结合在功能测试中被神经降压素所抑制。
近来，已经显示了分拣蛋白通过结合，随后是细胞摄取和分布至溶酶体而介导PGRN的清除。PGRN具有神经营养特性并且已经与额颞叶退化(FTLD)相联系，额颞叶退化是一种由对于RNA结合蛋白TAR DNA-结合蛋白43(TDP-43)阳性的夹杂物表征的神经退行性障碍。在FTLD患者亚组中，PGRN表达由于GRN基因的突变而被降低。在小鼠中，据报道，分拣蛋白敲除可增加PGRN水平并且在分拣蛋白缺陷PGRN+/-小鼠中发现可将PGRN至少增加至野生型水平。因此，靶向分拣蛋白已经被表明可使PGRN表达水平缓和或正常化，以停止或减缓FTLD的神经退行性变(Prudencio(普鲁登西奥)等人，Proc Natl Acad Sci USA.(美国国家科学院院刊)109(52):21510-5(2012))。全基因组筛选将SORT1基因座附近的SNP与PGRN表达水平相关联并且此外，经由反义寡核苷酸在减少小鼠大脑中的TDP-43后改变的表达和剪接的研究将分拣蛋白鉴定为处于若干可变剪接的基因之中，支持分拣蛋白在ALS和TSDP-43病理学中发挥一定作用(Polymenidou(保利梅尼朵)等人，Nat Neurosci.(自然神经科学)14(4):459-68(2011)，Carrasquillo(卡拉斯基罗)等人，Am J Hum Genet.(美国人类遗传学杂志)；87(6):890-7(2010))。
除TDP-43-病理学之外，PGRN已经被归于其他功能，包括在炎症和组织修复中。据报道，PGRN以高亲和性结合TNF受体(Tang(唐)等人，Science(科学)，332(6028):478-84(2011))，由此调节TNF-α结合并显示在小鼠类风湿性关节炎模型中的促炎作用。因此，靶向分拣蛋白已经被表明通过抑制PGRN清除而发挥抗炎作用(Nykjaer(历查亚)和Willnow(威尔诺)，Trends Neurosci.(神经科学趋势)，35(4):261-70(2012))
分拣蛋白表达于免疫细胞中并且已经牵涉于炎性障碍中，因为近来报道了分拣蛋白损耗可减少由CTL和TH1T-细胞以及NK细胞释放IFN-γ。表明分拣蛋白通过调节IFN-γ分泌而调节适应性和先天性免疫反应并且表明分拣蛋白在炎性肠病和其他IFN-γ依赖性炎性障碍中可以是一种靶标(Herda(赫达)等人，Immunity(免疫)，37(5):854-66(2012))。
已经报道了分拣蛋白的多种其他结合配偶体。显示生长因子CNTF以高亲和性结合分拣蛋白并且显示通过细胞摄取而被清除(Larsen(拉森)等人，Mol Cell Biol.(分子与细胞生物学)(17):4175-87(2010))，凭此分拣蛋白通过GP103/LIFRβ受体复合物大概经由与LIFRβ直接相互作用而调节信号转导。对于相关细胞因子CT-1、LIF、OSM以及IL-6观察到类似作用。因此，表明分拣蛋白促进LIFRβ依赖性信号转导，这样使得分拣蛋白的调节在CNTF和相关细胞因子重要的障碍中可以是有益的。而且，据报道，分拣蛋白介导κ阿片受体的内化(Liu-Chen(刘-晨)，2012，poster(海报)，Society for Neuroscience annual meeting(神经科学学会年会)，2012)并且据报道了一种由分拣蛋白前体(pro-sortilin)切割而来的肽spadin结合TREK-1钾通道(Mazella(马兹拉)等人，PLoS Biol.8(4):e1000355，(2010))。
另外，分拣蛋白是包含葡萄糖转运蛋白4的囊泡的一种主要组分(Morris(莫里斯)等人，J Biol Chem.(生物化学杂志)273(6):3582-7(1998))并且据信，作为一种货物衔接蛋白而涉及于来自反面高尔基网的细胞内胰岛素反应性囊泡的形成中(Bogan(博根)等人，Curr Opin Cell Biol.(细胞生物学新观点)(4):506-12(2010))。分拣蛋白在细胞内与载脂蛋白B100(apoB100，Kjolby(科约贝)等人，Cell Metab(细胞代谢)，12(3):213-23(2010))相互作用。近来，据报道，分拣蛋白-apoB100相互作用受胰岛素刺激(Chamberlain(张伯伦)，Biochem Biophys Res Commun.(生物化学与生物物理学研究通讯)S0006-291X(12)02182-1(2012)Epub提前出版)。分拣蛋白还涉及于将鞘脂激活蛋白原、酸性鞘磷脂酶以及组织蛋白酶H和D运输到溶酶体中。近来，据报道分拣蛋白结合作为阿尔茨海默病的一种主要风险因子的APOE以及原代海马神经元中的可溶性APP(Carlo(卡洛)等人，J Neurosci(神经科学杂志)，33(1):358-70(2013)；Gustafsen(格斯塔森)等人，神经科学杂志)，33(1):64-71(2013))。
染色体1p13上的基因多态性已经将Sort1与低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的代谢和人类患者的心肌梗塞或冠状动脉疾病的风险相联系(Linsel-Nitschke(林赛尔-尼奇克)等人，Atherosclerosis.(动脉粥样硬化)，208(1):183-9(2010)，Musunuru(慕苏努鲁)等人，Nature(自然)，466(7307):714-9(2010))。在一项研究中，发现与多态性rs599839相关的分拣蛋白的表达增加与较低的血浆LDL-胆固醇水平和降低的冠状动脉疾病风险有关(Linsel- Nitschke(林赛尔-尼奇克)等人，Atherosclerosis.(动脉粥样硬化)，208(1):183-9(2010))。然而，其他研究表明不存在分拣蛋白在LDL受体缺陷小鼠中导致血浆胆固醇水平降低并且导致主动脉中斑块形成减少(Kjolby(科约贝)等人，Cell Metab(细胞代谢)，12(3):213-23(2010))。因此，尽管一致认为分拣蛋白与循环胆固醇/LDL水平相关并且分拣蛋白功能的调节可以代表减少循环LDL水平并缓和心血管风险的策略，但是将分拣蛋白与LDL代谢和改变的分拣蛋白表达的净效应联系起来的机制仍是一个见仁见智的问题(Dubé(杜贝)等人，Bioessays.(生物短评)，33(6):430-7(2011)，Strong(斯特朗)等人，Curr Atheroscler Rep.(最新动脉硬化报告)，14(3):211-8(2012))。
归因于将分拣蛋白功能与疾病相关和分拣蛋白结合至牵涉于中枢神经系统以及外周神经系统的病理学的若干蛋白质的研究，分拣蛋白可以代表一种有吸引力的治疗靶标。然而，尽管已经鉴定了分拣蛋白配体神经降压素和颗粒蛋白前体的结合位点，但是迄今尚未披露分拣蛋白功能的特异性小分子调节剂。
本发明旨在提供作为分拣蛋白抑制剂并且因此有用于治疗与分拣蛋白相关的疾病的化合物。
发明概述
诸位发明人已经出人意料地发现了某些作为分拣蛋白抑制剂的化合物。因此，在一个实施例中，本发明提供了具有以下化学式A的化合物，
其中
R1表示H或F，
R2表示卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C1-C6卤代烷基，
R3表示卤素、H、C1-C6烷基或C1-C6卤代烷基，
L是一个直接键或表示CH2，
R4表示一个具有1或2个杂原子的5-6元杂芳香族单环的环或一个具有1或2个杂原子的8-10元二环的杂环，所述杂芳香族环或二环的环可以被C≡N、1或2个C1-C3烷基、1或2个C1-C3烷氧基或1或2个卤素取代，
及其药学上可接受的盐或前药
其条件是该化合物不是5-甲基-2-[[(4-甲基-2-噻唑基)氨基]羰基]。
在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括一种具有以上化学式A的化合物及其药学上可接受的盐连同一种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施例中，本发明提供了用于在治疗中使用的具有以上化学式A的化合物及其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，本发明提供了用于在神经退行性疾病、精神疾病、运动神经元疾病、外周神经病、疼痛、神经炎症或动脉粥样硬化的治疗中使用的具有以上化学式A的化合物及其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，本发明涉及具有以上化学式A的化合物及其药学上可接受的盐在生产用于在神经退行性疾病、精神疾病、运动神经元疾病、外周神经病、疼痛、神经炎症或动脉粥样硬化的治疗中使用的药剂的用途。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于治疗神经退行性疾病、精神疾病、运动神经元疾病、外周神经病、疼痛、神经炎症或动脉粥样硬化的方法，该方法包括向对其有需要的患者给予治疗有效量的具有以上化学式A的化合物及其药学上可接受的盐。
附图简要说明
图1，示出了在PGRN的存在下添加神经降压素(NT)或来自实例1的化合物阻断与分拣蛋白的相互作用，如通过PGRN水平的增加在该图中所见的。
图2，示出了添加神经降压素或来自实例1的化合物阻断PGRN结合或胞吞至表达分拣蛋白的细胞。
发明详述
在另外的实施例中，上文的化学式A中的所述R4基团可以选自下组，该组包括
*表示连接点。
这些基团可任选地被C≡N、1或2个C1-C3烷基、1或2个卤代烷基、1或2个C1-C3烷氧基或1或2个卤素取代，其中X表示C或N并且N存在于1或2个位置处。
在另一个实施例中，R4可以是
其中M表示C、N或CC≡N，
A和B各自独立地表示H、C1-C3烷基，或
A和B连同它们附接的碳原子一起形成一个5、6或7元饱和的或不饱和的碳环，并且
*表示连接点。
在又另一个实施例中，化学式A的R2和R3中的卤代的C1-C6卤代烷基可以各自独立地是CF3。在另一个实施例中，R2可以是Cl、Br或CF3并且R3可以是H或Cl。
在仍另外的实施例中，根据上文的化学式A的化合物可以具有一个选自下组的R4基团，该组包括
*表示连接点
这些基团可任选地被C≡N、1或2个C1-C3烷基、1或2个卤代烷基、1或2个C1-C3烷氧基或1或2个卤素取代。
在一个具体实施例中，根据化学式A的化合物可以选自下组，该组包括，
N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-甲基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
4,5-二氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(3-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-2基)-邻氨甲酰苯甲酸
N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-(4-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-(2-甲基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
4,5-二氯-N-(4-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
4,5-二氯-N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
4,5-二氯-N-(2-甲基-吡啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
4,5-二氯-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-氯-6-氟-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
4,5-二甲基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
2-((3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
2-((5,6-二甲基吡嗪-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
5-溴-N-(5-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(5-氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-吡啶-2-基-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(6-氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(4-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(2-甲基-吡啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-吡啶-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(3-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(4-甲基-噻唑-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-喹啉-2-基-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(5,6-二氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(6-甲基-吡啶-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(6-甲基-哒嗪-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(4,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
5-溴-N-(6-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
N-(2-甲氧基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-吡啶-2-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-吡啶-4-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-吡啶-3-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-丙基-邻氨甲酰苯甲酸
N5-异丙烯基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
N5-异丙基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
2-((2-甲基嘧啶-4-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
2-((4,5-二甲基嘧啶-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
2-((5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
2-((6-甲基吡啶-2-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
2-((5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
2-((5,6-二甲基吡啶-2-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
2-((2-甲基嘧啶-4-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
或其药学上可接受的盐或前药。
上述化合物可以在一种组合物中作为唯一的活性成分或与其他活性成分组合。另外地，一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂可以存在于该组合物中。
在某些方面中，本发明还涉及具有化学式A的前药，并且因此涉及某些化合物(特别是具有下面披露的化学式B和C的那些)作为治疗中产品的用 途。
“前药”旨在意指最初以无活性或低于完全活性形式给予至体内，通过身体的正常代谢过程而被转化成其活性形式的药剂。
因此，本发明还涉及具有化学式B的前药以及这些化合物在治疗中作为前药的用途：
其中
R5表示H或F，
R6表示卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C1-C6卤代烷基，
R7表示卤素、H、C1-C6烷基或C1-C6卤代烷基，
R8表示一个具有1或2个杂原子的5-6元杂芳香族单环的环或一个具有1或2个杂原子的8-10元二环的杂环，所述杂芳香族环或二环的环可以被C≡N、1或2个C1-C3烷基、1或2个卤代烷基、1或2个C1-C3烷氧基或1或2个卤素取代
及其药学上可接受的盐
在某些实施例中，R6可以表示CH3、Br、Cl或CF3并且R7可以表示H或Cl。此外，具有化学式B的前药可以具有作为H的R5以及相同的R6和R7。
在某些实施例中，R8可以选自下组，该组包括
在一个具体实施例中，根据化学式B的前药可以选自下组，该组包括
2-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
5-溴-2-(6-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
5-甲基-2-(6-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
5-氯-2-(6-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
5,6-二氯-2-(6-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
2-(5-溴-1,3-二氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-3-甲腈
2-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
2-(4-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
2-(2-甲基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
5,6-二氯-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
5,6-二氯-2-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
5,6-二氯-2-(2-甲基-吡啶-4-基)-异吲哚-1,3-二酮
5,6-二氯-2-(2-甲基-嘧啶-4-基)-异吲哚-1,3-二酮
5-氯-4-氟-2-(6-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
5,6-二甲基-2-(6-甲基-吡啶-2-基)-异吲哚-1,3-二酮
2-(3-氯-5-三氟甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
2-(4-甲基-嘧啶-2-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
2-(5,6-二甲基-吡嗪-2-基)-5-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
2-(6-甲基-吡啶-2-基)-5,6-双-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
2-(5,6,7,8-四氢-喹啉-2-基)-5,6-双-三氟甲基-异吲哚-1,3-二酮
或其药学上可接受的盐。
在一个甚至另外的方面中，本发明涉及一种根据化学式C的前药以及这些化合物在治疗中的用途：
其中
R9表示C1-C6烷基
R10表示卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C1-C6卤代烷基，
R11表示卤素、H、C1-C6烷基或C1-C6卤代烷基，
n是0或1，
R12表示一个具有1或2个杂原子的5-6元杂芳香族单环的环或一个具有1或2个杂原子的8-10元二环的杂环，所述杂芳香族环或二环的环可以被C≡N、1或2个C1-C3烷基、1或2个卤代烷基、1或2个C1-C3烷氧基或1或2个卤素取代，
及其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，R9表示C1-C4烷基
在另一个实施例中，根据化学式C的前药可以具有表示CH3、CHCH2、Br、Cl、C≡N或CF3的R10和表示H、CF3或Cl的R7。
在某些实施例中，R12可以选自下组，该组包括
在一个具体实施例中，根据化学式C的前药可以选自下组，该组包括
5-溴-N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(5-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(2-甲基-吡啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-吡啶-3-基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(3-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(4-甲基-噻唑-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-喹啉-2-基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(5,6-二氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(6-甲基-吡啶-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(6-甲基-哒嗪-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(4,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-溴-N-(6-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(2-甲氧基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-吡啶-2-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-吡啶-4-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-吡啶-3-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
不适用-不是一种前药
5-异丙烯基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-丙基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(4,5-二甲基-嘧啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(5,6,7,8-四氢-喹啉-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
5-异丙基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
N-(2,6-二甲基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
4,5-二氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸叔丁酯
4,5-二氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸异丙酯
4,5-二氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸甲酯
4,5-二氯-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸异丙酯
4,5-二氯-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸乙酯
N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-4,5-双-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸甲酯
或其药学上可接受的盐。
设想的是，具有化学式C或B的前药可以按药物配制品形式与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂一起给予。设想这些前药的用途是针对与具有化学式A的那些化合物相同的医学病症。
本发明的化合物可以具有一个或多个不对称中心并且意图在于，作为分离的、纯的或部分纯化的光学异构体的任何光学异构体(即对映异构体或非对映异构体)及其任何混合物(包括外消旋混合物)(即立体异构体的混合物)都被包括在本发明的范围内。
在此上下文中，应该理解的是，当指明非对映异构体形式时，则该化合物处于非对映异构体过量，例如基本处于纯的形式。因此，本发明的一个实施例涉及具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少96％、优选至少98％的非对映异构体过量的本发明的化合物。
可以通过已知方法将外消旋形式拆分为旋光对映体，例如通过用光学活 性酸分离其非对映异构盐并且通过用碱处理来离析光学活性胺化合物。另一种用于将外消旋体拆分为旋光对映体的方法是基于在光学活性基质上的层析。还可以通过形成非对映异构体衍生物来拆分本发明的化合物。可以使用本领域的普通技术人员已知的用于拆分光学异构体的另外的方法。此类方法包括由J.Jaques(杰奎斯)，A.Collet(科勒特)和S.Wilen(维伦)在“Enantiomers,Racemates,and Resolutions(对映异构体，外消旋体与拆分)”，John Wiley and Sons(约翰威利父子)，纽约(1981)中讨论的那些。光学活性化合物还可以制备自光学活性起始材料。
此外，当在该分子中存在一个双键或一个完全或部分饱和的环系统时，可以形成几何异构体。意图在于，作为分离的、纯的或部分纯化的几何异构体的任何几何异构体或其混合物都被包括在本发明的范围内。同样，具有一个限制旋转的键的分子可以形成几何异构体。这些也被意图包括在本发明的范围内。
此外，本发明的一些化合物能以不同的互变异构形式存在并且意图在于，这些化合物能够形成的任何互变异构形式都被包括在本发明的范围内。
在此上下文中，“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐以及烷基化的铵盐。酸加成盐包括无机酸和有机酸的盐。
金属盐的实例包括锂、钠、钾、镁盐等。
铵盐以及烷基化的铵盐的实例包括铵、甲基-、二甲基-、三甲基-、乙基-、羟乙基-、二乙基-、正丁基-、仲丁基-、叔丁基-、四甲基铵盐等。
在此上下文中，“烷基”和“烯基”旨在指示一种直链的或支链的饱和烃。术语“烯基”包含具有至少一个碳-碳双键的基团。具体而言，C1-6-烷基或C2-6-烯基旨在指示分别具有1、2、3、4、5或6个碳原子或2、3、4、5或6个碳原子的这样的烃，并且同样地，C1-3-烷基或C2-3-烯基旨在指示分别具有1、2或3个碳原子或2或3个碳原子的烃。
典型的烷基基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基以及类似物。“烷基”基团可以被一个或多个(如1、2或3个)卤素取代，因而构成一个卤代烷基，如氟乙基、三氟甲基或三氟乙基。
如在此使用的术语“烷氧基”是指具有化学式-O-烷基的基团，其中烷基是如上所定义的。具体而言，C1-C3-烷氧基旨在指示具有1、2或3个碳原子的这样的烃。烷氧基基团的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基以及异丙氧基。
在此上下文中，“卤素”旨在指示元素周期表的第7主族的成员，如氟、氯、溴以及碘。
“杂原子”旨在意指硫、氧或氮。
术语“芳香族的”是指具有一个共轭的不饱和(4n+2)π电子系统(其中n是一个正整数)(有时被称作非定域π电子系统)的环状或多环部分。
如在此使用的术语“杂环的”单独地或组合地是指包含从5至6个环原子的饱和的或不饱和的芳香族的或非芳香族的环，其中这些环原子中的1或2个是杂原子。
如在此使用的术语“杂芳香族的”单独地或组合地是指包含从5至6个环原子的芳香族环，其中这些环原子中的1或2个是杂原子。
术语“二环的杂环”是指2个稠合的环状环，其中每个环都可以是饱和的或不饱和的，以形成总共8-10个成员的“二环的杂环”。这个二环的杂环可以在这些环的一个或两个中具有1或2个杂原子。在一个实施例中，该二环的环构成一个稠合至饱和的或不饱和的碳环(即，其中的所有环成员均为碳原子的环状环)或杂环的杂芳香族环。
如在此使用的术语“取代基”或“取代的”单独地或组合地是指可以被用于替换氢的基团。在本发明的一些实施例中，该经取代的分子自身可以进一步被取代。
在此上下文中，术语化合物的“治疗有效量”意图指示足以在包括给予所述化合物的治疗性干预中治愈、缓解或部分阻滞给定疾病及其并发症的临床表现的量。将足以实现以上的量定义为“治疗有效量”。用于各目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重及一般状态。将理解的是，可以使用常规实验确定适当剂量，例如通过构建值矩阵并测试矩阵中的不同点来实现，这均在受训医师的普通技术内。
在此上下文中，术语“治疗(treatment和treating)”意指管理并护理患者用于抗击疾病的目的。该术语意图包括对患者所患的给定疾病的治疗的完整范围，例如给予活性化合物以缓解症状或并发症、以延迟疾病的进展、以缓解或减轻症状及并发症、和/或以治愈或消除疾病。欲治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人类。在此上下文中，“疾病”可以与障碍(disorder)、病症(condition)、功能障碍(malfunction)、功能异常(dysfunction)等同义使用。
如上所述，分拣蛋白抑制剂可以用于治疗神经退行性疾病、精神疾病、运动神经元疾病、外周神经病、疼痛、神经炎症或动脉粥样硬化。
因此，如在化学式A中概述的化合物、作为前药的具有化学式B和C的化合物或包括所述化合物的组合物可以用于治疗选自下组的疾病的方法中，该组包括阿尔茨海默病、帕金森病、中风、创伤性脑损伤、视网膜变性、光诱导的感光细胞退化(light-induced photoreceptor degeneration)、癫痫、双相障碍、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶退化(FTLD)、脊髓性肌萎缩、外 周神经病、糖尿病性神经病、急性和慢性疼痛、预防和治疗已确立的疼痛、神经性疼痛、下腰痛、手术后疼痛、炎性疼痛、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化以及动脉粥样硬化。
在一个实施例中，每天以从约0.001mg/kg体重至约100mg/kg体重的量给予本发明的化合物。具体而言，每日剂量可以处于每天0.01mg/kg体重至约50mg/kg体重的范围内。精确剂量将取决于给予频率及模式，欲治疗的受试者的性别、年龄、体重及一般状况，欲治疗的病症、任何欲治疗的伴随疾病的性质及严重程度，治疗的所希望的效果以及本领域的普通技术人员已知的其他因素。
一种典型的成人用口服剂量将处于1–1000mg/天的本发明的化合物的范围内，例如1–500mg/天。
本发明的化合物能以单剂量或多剂量形式单独作为纯化合物给予或与药学上可接受的载体或赋形剂组合给予。根据本发明的药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如以下披露的技术：Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践)，第21版，宾夕法尼亚，2005。在此上下文中，“赋形剂”、“载体”、“稀释剂”、“佐剂”等同义地使用并且旨在意指相同内容。
药物组合物可以被具体配制以通过任何适合途径给予，例如经口、经直肠、经鼻、经肺、局部(包括经颊及舌下)、经皮、脑池内、腹膜内、经阴道及非经肠(包括皮下、肌肉内、鞘内、静脉内及皮内)途径。将领会的是，优选途径将取决于欲治疗的受试者的一般状况及年龄、欲治疗的病症的性质以及所选活性成分。
用于经口给予的药物组合物包括固体剂型，例如胶囊、片剂、糖衣丸、丸剂、锭剂、粉剂以及颗粒剂。适当时，可以用包衣制备它们。
用于经口给予的液体剂型包括溶液、乳液、悬浮液、糖浆以及酏剂。
用于非经肠给予的药物组合物包括无菌水性及非水性可注射溶液、分散液、悬浮液或乳液以及欲在使用之前在无菌可注射溶液或分散液中复水的无菌粉剂。
其他适合的给予形式包括栓剂、喷雾剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、吸入剂、皮肤贴片、植入物等。
方便地，将本发明的化合物以单位剂型给予，该单位剂型以约0.1至500mg，例如10mg、50mg、100mg、150mg、200mg或250mg的本发明的化合物的量包含所述化合物。
对于非经肠给予，可以采用本发明的化合物在无菌水溶液、水性丙二醇、水性维生素E或芝麻油或花生油中的溶液。必要时应该适当缓冲此类水溶 液并且首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下及腹膜内给予。采用的无菌水性介质通过本领域的普通技术人员已知的标准技术都是容易可得的。
适合的药物载体包括惰性固体稀释剂或填料、无菌水溶液以及不同有机溶剂。固体载体的实例是乳糖、白土、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸以及纤维素的低级烷基醚。液体载体的实例是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧化乙烯以及水。通过组合本发明的化合物与药学上可接受的载体而形成的药物组合物接着以多种适于所披露的给予途径的剂型容易地给予。
适于经口给予的本发明的配制品能以离散单位呈现，例如各自包含预定量的活性成分并且可以包括一种适合的赋形剂的胶囊或片剂。此外，经口可用配制品可以呈粉剂或颗粒剂、水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或水包油或油包水液体乳液的形式。
若将一种固体载体用于经口给予，则该制剂可以是片剂，例如以粉剂或丸粒形式置于硬明胶胶囊中或呈糖锭或锭剂形式。固体载体的量可以变化，但是将通常从约25mg至约1g。
若使用一种液体载体，则该制剂可以呈糖浆、乳液、软明胶胶囊或无菌可注射液体(例如水性或非水性液体悬浮液或溶液)形式。
可以通过混合活性成分与普通佐剂和/或稀释剂，随后在常规压片机中压紧该混合物来制备片剂。佐剂或稀释剂的实例包括：玉米淀粉、马铃薯淀粉、滑石、硬脂酸镁、明胶、乳糖、树胶以及类似物。可以使用通常用于此类目的的任何其他佐剂或添加剂，例如着色剂、调味剂、防腐剂等，其条件是它们与活性成分兼容。
在此所引用的所有文献(包括出版物、专利申请、以及专利)均通过引用以其全部内容由此结合，并且引用的程度如同每个文献被个别地并且明确地指示通过引用结合并且以其全部内容在此阐述(至法律允许的最大程度)，而不考虑在此其他地方做出的特定文件的任何单独提供的结合。
除非在此另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中，术语“一个/种”和“该”以及类似指称对象的使用应解释为包括单数和复数二者。例如，除非另外指示，否则短语“该化合物”应理解为是指本发明的多种“化合物”或具体描述的方面。
除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在此使用涉及一种或多种要素的术语如“包括(comprising)”、“具有”、“包括(including)”或“包含”的本发明的任何一方面或多方面的描述，旨在提供对“由那一种或多种特定要素组成”、“基本上由那一种或多种特定要素组成”或“基本上包含那一种或多种特定要素”的本发明的类似一方面或多方面的支持(例如，除 非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在此所述的包含特定要素的组合物应理解为也描述由那个要素组成的组合物)。
实验
缩写与使用的化学品
aq＝水性的。盐水＝氯化钠的饱和水溶液(例如西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)S7653)。CDCl3＝氘化的氯仿(例如奥德里奇(Aldrich)225789)。DCM＝二氯甲烷(methylene chloride/dichloromethane)(例如西格玛-奥德里奇270997)。DIPEA＝二异丙基乙胺(例如西格玛-奥德里奇387649)。DMF＝二甲基甲酰胺(例如西格玛-奥德里奇227056)。DMSO-d6＝氘化的二甲亚砜(例如奥德里奇296147)。Et3N＝三乙胺(例如西格玛-奥德里奇T0886)。Et2O＝二乙醚(例如西格玛-奥德里奇346136)。EtOAc＝乙酸乙酯(例如福鲁卡(Fluka)34972)。EtOH＝乙醇(例如西格玛-奥德里奇459844)。h＝小时。HATU＝O-(氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯。庚烷(例如西格玛-奥德里奇730491)。K3PO4(例如西格玛-奥德里奇P5629)。LCMS＝液相色谱/质谱法。LiOH＝氢氧化锂(例如西格玛-奥德里奇545856)。MeOH＝甲醇(例如西格玛-奥德里奇34860)。MgSO4(例如西格玛-奥德里奇M7506)。微波炉＝一种Biotage引发微波反应器。Min＝分钟。NaHCO3(例如西格玛-奥德里奇S6014)。NaOt-Bu＝叔丁醇钠(例如奥德里奇359270)。Na2SO4＝硫酸钠(例如西格玛-奥德里奇238597)。NMP＝1-甲基-2-吡咯烷酮(例如西格玛-奥德里奇443778)。NMR＝核磁共振。PDA＝光电二极管阵列。Pd(OAc)2＝乙酸钯(II)(例如奥德里奇683124)。Pd(PPh3)2Cl2＝双(三苯基膦)二氯化钯(II)(例如奥德里奇208671)。石油醚(例如西格玛-奥德里奇77379)。POCl3＝磷酰氯(例如奥德里奇262099)。Prep.HPLC＝制备型高效液相色谱法。吡啶(例如西格玛-奥德里奇270970)。Rt＝室温。硅胶＝粒度100-200目(75-150μm)。SFC＝超临界流体色谱法。SOCl2＝亚硫酰氯(例如西格玛-奥德里奇320536)。TFA＝三氟乙酸(例如西格玛-奥德里奇T6508)。THF＝四氢呋喃(例如西格玛-奥德里奇401757)。TLC＝薄层色谱法。甲苯(例如西格玛-奥德里奇244511)。tR＝保留时间。
名称
使用来自MDL信息系统的软件MDL ISIS/DRAW 2.5获得化学名。
可以根据方案1制备具有通式1的化合物，其中用一种碱(例如像氢氧化锂)水解对应的邻苯二甲酰亚胺中间体X。
出于说明性目的，在以下方案中使用A和B基团。
将领会的是，其中取代基A≠B时，可以获得两种异构体1和1a的混合物(方案1)，可以经由例如制备型HPLC分离这些异构体，以提供纯的化合物。
其中B＝H时，仅仅异构体1是本发明的主题，并且可以丢弃替代性异构体1a。
其中A＝B时，将仅仅获得单个化合物，即1和1a是相同的。毫无疑义地，可以通过NMR技术表征单独的异构体1和1a。
方案1
可以进而通过在例如乙酸中在回流下用对应的氨基化合物V处理对应的邻苯二甲酸酐W制备具有通式X的邻苯二甲酰亚胺中间体(方案2)。
方案2
可替代地，还可以通过使氨基化合物V与对应的邻苯二甲酸酐W在例如丙酮中直接反应而制备具有通式1(和1a)的化合物(方案3)。
方案3
可替代地，可以根据方案4的化学过程制备具有通式1的化合物。使用例如偶联剂(如HATU)将氨基化合物V偶联至具有通式Z的中间体提供中间体 Y，可以通过使用例如TFA将酯脱丁基化而从中间体Y获得具有通式1的化合物。
方案4
可以经由用例如醇盐在水中醇解对应的邻苯二甲酸酐W，并且经由超临界流体色谱法(SFC)分离异构体Z和Za而制备Z(和Za)型中间体(方案5)。
方案5
还可以通过修饰或官能化另一Y型中间体(例如Y’型中间体)的取代基之一而制备Y型中间体(方案6)。例如，在Y’型中间体中，其中取代基A’包含烯或炔，可以用例如氢和钯碳催化剂将取代基A’还原为替代性取代基A(方案6)，以提供中间体Y。
方案6
此外，还可以通过修饰或官能化另一Z型中间体(例如Z’型中间体)的取代基之一而制备Z型中间体(方案7)。例如，其中Z’型中间体的取代基A’是一个溴原子，可以使用例如过渡金属催化的偶联将溴转化为另一取代基A(方案7)，以提供Z型中间体。
方案7
另外，可以根据方案8的化学过程制备具有通式1的化合物。使用例如偶联剂(如HATU)将氨基化合物V偶联至具有通式T的对称中间体(即A＝B)可以直接提供具有通式1的化合物。
方案8
另外，可以根据方案9的化学过程制备具有通式1的化合物。使用例如三甲基铝将氨基化合物V偶联至具有通式R的对称中间体(即A＝B)提供中间体S。现在可以通过使用例如氢氧化锂水解酯而获得具有通式1的化合物。
方案9
实例
将通过以下非限制性实例说明本发明。
分析方法
LC-MS
方法A：
在沃特斯(Waters)Aquity UPLC-MS上运行LC-MS，其由以下各项组成：包括柱管理器的沃特斯Aquity、二元溶剂管理器、样品组织器、PDA检测器(在254nM下操作)、ELS检测器以及配备有以正离子模式操作的APPI源的SQ-MS。
LC-条件：柱为Acquity UPLC BEH C181.7μm；2.1x 50mm，在60℃下操作，其中二元梯度为1.2ml/min，该二元梯度由水+0.1％甲酸(A)和乙腈+5％水+0.1％甲酸组成。
梯度：0.00min 10％B
1.00min 99.9％B
1.01min 10％B
1.15min 10％B
总运行时间：1.15min
方法B：
在沃特斯Aquity UPLC-MS上运行LC-MS，其由以下各项组成：包括柱管理器的沃特斯Aquity、二元溶剂管理器、样品组织器、PDA检测器(在254nM下操作)、ELS检测器以及配备有以正离子模式操作的APPI源的TQ-MS。
LC-条件：柱为Acquity UPLC BEH C18 1.7μm；2.1x 50mm，在55℃下操作，其中二元梯度为0.4ml/min，该二元梯度由水+0.1％甲酸(A)和乙腈+ 0.1％甲酸(B)组成。
梯度：0.00min 3％B
0.50min 3％B
1.50min 90％B
1.80min 90％B
2.20min 95％B
3.20min 95％B
4.00min 3％B
总运行时间：4.00min
方法C：
在沃特斯Aquity UPLC-MS上运行LC-MS，其由以下各项组成：包括柱管理器的沃特斯Aquity、二元溶剂管理器、样品组织器、PDA检测器(在254nM下操作)、ELS检测器以及配备有以正离子模式操作的APPI源的TQ-MS。
LC-条件：柱为ZORBAX RX C18 1.8μ；2.1x 50mm，在55℃下操作，其中二元梯度为0.4ml/min，该二元梯度由水+0.01％甲酸(A)和乙腈+0.01甲酸(B)组成。
梯度：0.00min 5％B
1.00min 5％B
4.00min 95％B
6.00min 95％B
6.10min 5％B
总运行时间：6.10min
方法D：
在沃特斯Aquity UPLC-MS上运行LC-MS，其由以下各项组成：包括柱管理器的沃特斯Aquity、二元溶剂管理器、样品组织器、PDA检测器(在254nM下操作)、ELS检测器以及配备有以正离子模式操作的APPI源的TQ-MS。
LC-条件：柱为BEH C18 1.7μ；2.1x 100mm，在55℃下操作，其中二元梯度为0.4ml/min，该二元梯度由水+0.1％甲酸(A)和乙腈+0.1甲酸(B)组成。
梯度：0.00min 5％B
0.60min 5％B
3.00min 95％B
5.00min 100％B
6.00min 100％B
6.10min 5％B
总运行时间：6.10min
基于在254nm下的UV-痕迹以分钟表示保留时间(tR)。
SFC
在Thar SFC-80系统上运行SFC，该系统由以下各项组成：样品管理器、 注射器和采集器、用于CO2和共溶剂的P-50泵以及吉尔森(Gilson)UV-可见光检测器(型号151，在235nm下操作)。将Lux Cellulose-2(250x 30mm)柱与作为共溶剂的乙醇中的25％的0.5％DEA在160巴下一起使用，其中总流速为80g/min。以50mg/次注射装载样品。
制备型HPLC
方法1：
在吉尔森GX-281纯化系统上运行制备型HPLC，该系统由以下各项组成：样品管理器、注射器和采集器、二元溶剂泵(型号334)以及吉尔森UV-可见光检测器(型号155，在254nm和215nm下操作)。使用用己烷/乙醇(70:30)以25mL/min流速洗脱的CHIRALPAK IC 5μ:250x 30mm柱。
方法2：
在吉尔森GX-281纯化系统上运行制备HPLC，该系统由以下各项组成：样品管理器、注射器和采集器、二元溶剂泵(型号334)以及吉尔森UV-可见光检测器(型号155，在254nm和215nm下操作)。使用用己烷/乙醇(90:10)中的0.1％DEA以25mL/min流速洗脱的CHIRALPAK IC 5μ:250x 30mm柱。
NMR
在Varian-VNMRS-400或Varian MR-400仪器上在400MHz下或在Bruker Avance AV-III-600仪器上在600MHz下记录1H NMR波谱。除非另外说明，否则以ppm值表示相对于四甲基硅烷的化学位移值。以下缩写或其组合用于NMR信号的多重性：br＝宽峰，d＝双重峰，m＝多重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，s＝单峰并且t＝三重峰。
中间体
中间体X1
将乙酸(10mL)中的三氟甲基邻苯二甲酸酐(1.5g，6.9mmol)和2-氨基-6-甲基吡啶(0.75g，6.9mmol)的溶液在回流下加热5h。冷却至室温下，将反应内含物倾倒进冰冷的水中并搅拌10min，在此期间沉淀出固体。通过过滤收集此固体，并用二乙醚(25mL)洗涤，以提供呈灰白色固体的中间体X1(1.0g，3.3mmol，48％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.32-8.30(2H,m),8.20-8.18(1H,d,J＝7.2Hz),7.96-7.92(1H,t,J＝7.6Hz),7.42-7.41(1H,d,J＝7.2Hz)。7.37-7.35(1H,d,J＝8.0Hz),2.52(3H,s)。
通过类似于中间体X1的方式由对应的邻苯二甲酸酐制备中间体X2至 X18。
中间体X14
根据方案10合成。
将发烟硫酸(30％，4mL)添加至3-氯-2-氟-6-(三氟甲基)苯甲酸(G1，0.294g，1.21mmol)中并且将所得棕色溶液加热至150℃持续2h。冷却至0℃后，添加冷MeOH(5ml)并将混合物在室温下搅拌0.5h。通过快速柱色谱法纯化(溶剂梯度：庚烷中的0-100％EtOAc，经20mins)提供4-氯-3-氟-邻苯二甲酸1-甲酯和3-氯-2-氟-邻苯二甲酸1-甲酯的不可分的大约1:1混合物(G2+G3，0.210g，0.91mmol，75％)。
1H NMR(异构体的大约1:1混合物,CDCl3,600MHz)δ:10.67(2H,br s),7.85-7.81(1H,d,J＝7.8Hz),7.74-7.71(1H,d,J＝8.6Hz),7.57-7.50(2H,m),3.96(3H,s),3.91(3H,s)。
在0℃下，将磷酰氯(0.060mL，0.64mmol)添加至吡啶(4mL)中的4-氯-3-氟-邻苯二甲酸1-甲酯(0.050g，0.21mmol)、3-氯-2-氟-邻苯二甲酸1-甲酯(0.050g，0.21mmol)和2-氨基-6-甲基吡啶(0.046g，0.43mmol)的溶液中。允许将反应加温至室温并搅拌1h。添加甲醇(2mL)并在真空中除去溶剂，以给出橙色粗产物，将其通过快速柱色谱法进行纯化(溶剂梯度：庚烷中的0-100％EtOAc，经16min，然后是100％EtOAc 5mins)。分离呈白色固体的中间体X15(0.0198g，0.068mmol，33％)。
1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:7.81-7.78(1H,dd,J＝7.6,8.7Hz),7.72- 7.70(1H,dd,J＝1.1,8.5Hz),7.56-7.54(1H,d,J＝8.7Hz),7.45-7.41(1H,dd,J＝7.1,8.4Hz),6.89-6.86(1H,d,J＝7.6Hz),2.60(3H,s)。
方案10
中间体X19
根据方案11合成。
向DMF(40.0mL)中的4,5-二碘邻苯二甲酸二甲酯(H1，4.0g，8.96mmol)的溶液里添加CuI(5.1g，26.9mmol)和FSO2CF2CO2Me(13.77g，71.74mmol)并且将混合物在80℃下搅拌18h。然后，将混合物用冰冷的水稀释并用EtOAc(100mL)萃取，用无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以提供呈白色固体的中间体R2(1.8g，61％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.18(2H,s),3.95(6H,s)。
将三甲基铝溶液(0.45mL，0.909mmol，2.0M甲苯)添加至甲苯(2.0mL)中的中间体R2(150mg，0.45mmol)和6-甲基吡啶-2-胺(53.9mg，0.49mmol)的溶液中并且将反应在110℃下搅拌3h。然后，将溶液分配在EtOAc与水之间，分离有机层并在减压下除去溶剂。通过柱色谱法纯化提供呈淡黄色固体的中间体X19(100mg，59％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.45(2H,s),7.84-7.80(1H,t,J＝7.6Hz),7.31-7.29(1H,d,J＝7.6Hz),7.23-7.21(1H,d,J＝8.0Hz),2.64(3H,s)。
方案11
中间体X20
根据方案12合成
将LiOH.H2O(50mg，1.212mmol)添加至THF/H2O(1:1，6.0mL)中的中间体R2(200mg，0.606mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌16h。然后，在减压下除去THF，用1N HCl酸化粗产物并将所得固体过滤并干燥，以提供呈白色固体的中间体T1(140mg，77％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.50(2H,br),8.29(2H,s)。
在0℃下，将HATU(283mg，0.746mmol)和DIPEA(0.27mL，1.49mmol)添加至DCM(5.0mL)中的中间体T1(150mg，0.496mmol)和5,6,7,8-四氢喹啉-2-胺(73mg，0.496mmol)的溶液中。然后，在用水(50mL)淬灭，萃取EtOAc(50mL)，用无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩之前，将反应混合物在室温下搅拌18h。通过柱色谱法纯化粗产物，以提供呈淡黄色固体的中间体X20(85mg，41％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.53(2H,s),7.74-7.72(1H,d,J＝8.4Hz),7.28-7.26(1H,d,J＝8.0Hz),2.84-2.83(4H,m),1.86-1.79(4H,m)。
方案12
中间体Y21
在0℃下，将DIPEA(0.257g，1.99mmol)添加至DCM(15mL)中的中间体Z48(0.20g，0.66mmol)、5,6-二甲基吡啶-2-胺(0.097g，0.80mmol)和HATU(0.38g，1.00mmol)的悬浮液中。在用水淬灭，用DCM萃取(2×40mL)，用盐水洗涤并用无水Na2SO4干燥之前，允许将反应加温至室温并搅拌18h。在真空中除去溶剂并通过快速柱色谱法纯化粗产物(己烷中的10％乙酸乙酯)，以提供呈白色固体的中间体Y21(0.091g，0.22mmol，34％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:10.86(1H,s),7.95-7.93(1H,d,J＝8.4Hz),7.89-7.88(1H,d,J＝2.0Hz),7.81-7.79(1H,dd,J＝8.4Hz,2.0Hz),7.56-7.54(1H,d,J＝8.4Hz),7.47-7.45(1H,d,J＝8.0Hz),2.35(3H,s),2.22(3H,s),1.36(9H,s)。
通过类似于中间体Y21的方式由中间体Z49-Z51制备以下中间体Y22-42、Y44-Y46以及Y48。
中间体Y43
在室温下，向在EtOH(2.5mL)中的中间体Y41(250mg，0.71mmol)的溶液中添加10％钯碳(250mg)。允许将反应混合物在H2(气囊压力)下，在室温下搅拌8h。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土过滤并将滤液在减压下浓缩，以提供中间体Y43(100mg，0.28mmol，40％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:8.18-8.16(1H,d,J＝7.6Hz),8.06(1H,br s),7.72-7.71(1H,d,J＝1.6Hz),7.65-7.61(1H,t,J＝8.0Hz),7.45-7.43(1H,d,J＝7.6Hz),7.35-7.32(1H,dd,J＝1.6,8.0Hz),6.92-6.90(1H,d,J＝7.6Hz),2.67-2.63(2H,t,J＝7.6Hz),2.43(3H,s),1.72-1.64(2H,m),1.57(9H,s),0.96-0.93(3H,t,J＝7.2Hz)。
通过类似于中间体Y43的方式制备以下中间体Y47。
中间体Y47
在H2气氛下(60磅/平方英寸)由MeOH中的中间体Y42合成。
LCMS方法D:tR＝3.47min,m/z＝355.10[M+H]+
中间体Z48
在室温下，将DMAP(10.8g，88mmol)添加至DCM(200mL)中的4-溴邻苯二甲酸酐(20g，88mmol)和t-BuOH(8.4mL，88mmol)的溶液中。搅拌2h后，将反应混合物用DCM(200mL)稀释并用2M HCl洗涤(150mL x 2)。在减压下除去溶剂，以提供包含中间体Z48及其异构体的白色固体。通过SFC分离此混合物，以提供呈白色固体的中间体Z48(3.0g，10mmol，12％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:7.76-7.74(2H,m),7.67-7.65(1H,dd J＝1.6,8.0Hz),1.57(9H,s)。
通过类似于中间体Z48的方式制备以下中间体Z49。
中间体Z49
由4-三氟甲基邻苯二甲酸酐开始合成。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.72(1H,s),8.01-7.98(2H,m),7.83-7.81(1H,d,J＝8.0Hz),1.52(9H,s)。
中间体Z50
在室温下，向DMF(5mL)中的中间体Z48(500mg，1.7mmol)的溶液中添加DIPA(2mL)、Pd(PPh3)2Cl2(58mg，0.083mmol)和CuI(31mg，0.17mmol)。在将反应混合物加热至80℃并搅拌16h之前，将反应混合物冷却至-78℃并吹扫丙炔气体持续20min。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用EtOAc(20mL)稀释，用水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并在减压下蒸发。通过快速柱色谱法纯化(石油醚中的20％EtOAc)提供呈白色固体的中间体Z50(300mg，1.2mmol，68％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.30(1H,s),7.64-7.55(3H,m),2.08(3H,s),1.51(9H,s)。
中间体Z51
在室温下，向在DMF/水(10.0mL，4:1)中的中间体Z48(1.0g，3.3mmol)和2-异丙烯基-4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二噁硼烷(0.80mL，6.66mmol)的溶液中添加K3PO4(1.55mg，7.32mmol)和S-Phos(34mg，0.83mmol) 并将反应混合物用氩吹扫30min。添加Pd(OAc)2(93mg，0.42mmol)并将混合物加热至85℃并搅拌22h。反应完成后(通过TLC监测)，将混合物冷却至室温，用EtOAc(30mL)稀释并用水(20mL)洗涤。将有机层用盐水溶液(20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并在减压下蒸发溶剂。通过快速柱色谱法纯化(石油醚中的50％EtOAc)提供呈白色固体的中间体Z51(700mg，2.7mmol，81％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)□:13.15(1H,br s),7.69-7.68(2H,d,J＝0.8Hz),7.62(1H,s),5.56(1H,s),5.25(1H,s),2.13(3H,s),1.50(9H,s)。
LCMS方法C:tR＝3.34min,m/z＝263.16[M-H]+
中间体Z52
在0℃下，将t-BuOH(0.170g，2.30mmol)添加至DCM(10mL)中的5,6-二氯异苯并呋喃-1,3-二酮(0.500g，2.30mmol)和DMAP(0.281g，2.304mmol)的溶液中。在真空中浓缩之前，将反应温度在室温下搅拌12h，以提供中间体Z52(0.631g，94％)。粗产物无需进一步纯化而使用。
中间体Z53
将2-丙醇(5ml)中的5,6-二氯异苯并呋喃-1,3-二酮(500mg，2.3mmol)的溶液加热至回流，持续18h。将反应在真空中浓缩，以提供呈白色固体的中间体Z3(500mg，79％)。
1H NMR(DMSO,400MHz)δ:13.73(1H,s,br),7.97(1H,s),7.92(1H,s),5.12-5.06(1H,m),1.29(6H,d,J＝4.0Hz)。
中间体Z54
将MeOH(2mL)中的5,6-二氯异苯并呋喃-1,3-二酮(200mg，0.921mmol)的溶液加热至回流，持续18h。将反应混合物在真空中浓缩，以提供呈白色固体的中间体Z54(200mg，87％)。
1H NMR(DMSO,400MHz)δ:13.77(1H,s,br),8.00(1H,s),7.96(1H,s),3.81(3H,s)。
中间体Z55
将EtOH(20.0mL)中的5,6-二氯异苯并呋喃-1,3-二酮(600mg，2.76mmol)的混合物在100℃下加热16h。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物在真空中浓缩，以提供中间体Z55(600mg，83％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.73(1H,br),7.99(1H,s),7.94(1H,s),4.30-4.25(2H,q,J＝7.0Hz),1.30-1.26(3H,t,J＝7.2Hz)。
中间体S52
在0℃下，向在甲苯(2.0mL)中的中间体R2(100mg，0.303mmol)和5,6-二甲基吡啶-2-胺(43mg，0.333mmol)的溶液中添加三甲基铝(2.0M在甲苯中，0.29mL，0.606mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌3h。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用水淬灭，萃取EtOAc(50mL)，用无水Na2SO4干燥并在减压下蒸发溶剂。通过柱色谱法纯化粗产物，以提供呈淡黄色固体的中间体S52(60mg，47％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:11.12(1H,s),8.35(1H,s),8.29(1H,s),7.91-7.89(1H,d,J＝8.0Hz),7.59-7.57(1H,d,J＝7.6Hz),3.82(3H,s),2.38(3H,s),2.23(3H,s)。
前药
将领会的是，X型中间体可以作为具有化学式[A]的化合物的前药起作用，因为给予后，X型中间体将在体内发生转化，以提供具有化学式A的化合物，的确在类似于根据方案1合成具有化学式A和1型化合物的过程中。将领会的是，其中取代基A≠B时，可以获得两种异构体1和1a的混合物。其中B＝H时，仅仅异构体1是本发明的主题，并且替代性异构体1a不是这样的主题。其中A＝B时，将仅仅获得单个化合物。
例如，中间体X1可以按能够通过体内转化的精确条件确定的比例提供实例1和不是本发明的主题的对应的区域异构体(regiosomer)。对称取代的中间体X10、11、12、13、15、19以及20可以对应地提供单产物实例10、11、12、13、15、47以及48。
具有化学式A的分子的类似简单的酯可能充当具有化学式A的化合物在体 内自其释放的前药。这样的酯可以包括但不限于Y和S型中间体。
实例
实例1：N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
将一水合氢氧化锂(0.27g，6.5mmol)添加至THF/H2O(1:1，10ml)中的中间体X1(1.0g，3.3mmol)的悬浮液中并且将混合物在室温下搅拌1h。然后，将反应用饱和柠檬酸溶液酸化，并且将所得沉淀过滤并用二乙醚(20mL)洗涤。将固体在真空下干燥，以提供呈白色固体的产物异构体的混合物。通过制备型HPLC分离异构体(方法1)提供呈白色固体的标题化合物(0.075g，0.23mmol，7％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.51(1H,s),10.96(1H,s),8.12(1H,s),8.01-7.98(2H,m),7.75-7.69(2H,m),7.02-7.00(1H,d,J＝7.6Hz),2.40(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.46min,m/z＝325.1[M+H]+
以类似于中间体的实例1的制备的方式，由中间体X2-20制备实例2-18、47以及48。
实例2：5-溴-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X2
使用乙醇/水(2:1)中的氢氧化钠合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:10.80(1H,br s),7.95-7.94(2H,m),7.83-7.80(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz),7.72-7.68(1H,t,J＝7.8Hz),7.48-7.46(1H,d,J＝8.0Hz),7.00-6.98(1H,d,J＝7.2Hz),2.39(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.41min,m/z＝335.0[M+H]+
实例3：5-甲基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X3
使用MeOH/水(2:1)中的氢氧化钠合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.87(1H,br s),10.70(1H,s),7.97-7.95(1H,d,J＝8.4Hz),7.70-7.66(1H,t,J＝7.8Hz),7.63(1H,s),7.40(2H,s),6.98-6.97(1H,d,J＝7.2Hz),2.39(6H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.36min,m/z＝271.2[M+H]+
实例4：5-氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X4
使用MeOH/水(2:1)中的氢氧化钠合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.32(1H,br s),10.89(1H,s),7.97-7.95(1H,d,J＝7.2Hz),7.82-7.81(1H,d,J＝2.0Hz)7.72-7.67(2H,m),7.55-7.53(1H,d,J＝8.4Hz),7.00-6.98(1H,d,J＝7.6Hz),2.40(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.39min,m/z＝291.1[M+H]+
实例5：4,5-二氯-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X5
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.48(1H,s),10.97(1H,s),8.00(1H,s),7.97-7.95(1H,d,J＝8.0Hz),7.85(1H,s),7.72-7.68(1H,t,J＝8.0Hz),7.01-6.99(1H,d,J＝7.6Hz),2.40(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.51min,m/z＝325.0[M+H]+
实例6：5-溴-N-(3-甲基-4,5,6,7-四氢-苯并[b]噻吩-2基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X6
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.55(1H,br s),12.19(1H,br s),8.06-8.04(1H,d,J＝2.1Hz),7.91-7.88(1H,dd,J＝8.2,2.1Hz),7.51-7.49(1H,d,J＝8.2Hz),2.65-2.61(2H,m),2.53-2.49(2H,m),1.80-1.74(4H,m)。
LCMS方法B:tR＝1.71min,m/z＝403.3[M-H]+
实例7：N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X7
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.48(1H,br s),10.87(1H,s),8.10(1H,s),8.00-7.98(1H,d,J＝7.6Hz),7.91-7.89(1H,d,J＝8.4Hz),7.74-7.72(1H,d,J＝7.6Hz),7.56-7.54(1H,d,J＝8.4Hz),2.35(3H,s),2.22(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.46min,m/z＝339.1[M+H]+
实例8：N-(4-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X8
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.53(1H,br s),10.94(1H,s),8.19-8.17(1H,d,J＝4.8Hz),8.13(1H,s),8.03-8.01(2H,m),7.76-7.74(1H,d,J＝7.6Hz),7.00-6.98(1H,d,J＝4.8Hz),2.35(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.42min,m/z＝325.1[M+H]+
实例9：N-(2-甲基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X9
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.80(1H,br,s),10.89(1H,s),8.34-8.33(1H,d,J＝6.0Hz),8.17(1H,s),8.08-8.06(1H,d,J＝8.0Hz),7.83-7.81(1H,d,J＝8.0Hz),7.54(1H,s),7.42-7.41(1H,d,J＝4.4Hz),2.44(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.40min,m/z＝325.1[M+H]+
实例10：4,5-二氯-N-(4-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X10
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.50(1H,s),10.93(1H,s),8.19-8.17(1H,d,J＝4.8Hz),8.02(2H,s),7.86(1H,s),6.99-6.98(1H,d,J＝4.8Hz),2.40(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.46min,m/z＝325.0[M+H]+
实例11：4,5-二氯-N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X11
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.46(1H,br s),10.84(1H,s),7.99(1H,s),7.89-7.87(1H,d,J＝8.4Hz),7.83(1H,s),7.55-7.53(1H,d,J＝8.4Hz),2.35(3H,s),2.22(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.50min,m/z＝339.1[M+H]+
实例12：4,5-二氯-N-(2-甲基-吡啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X12
使用THF/H2O(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.66(1H,br s),10.96(1H,s),8.34-8.33(1H,d,J＝6.0Hz),8.06(1H,s),7.95(1H,s),7.52(1H,s),7.41-7.40(1H,d,J＝4.4Hz),2.49(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.45min,m/z＝325.0[M+H]+
实例13：4,5-二氯-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X13
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.61(1H,s),11.38(1H,s),8.61-8.59(1H,d,J＝5.6Hz),8.04(1H,s),7.95-7.93(1H,d,J＝5.2Hz),7.91(1H,s),2.51(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.46min,m/z＝326.0[M+H]+
实例14：5-氯-6-氟-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X14
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,600MHz)□:11.11(1H,s),7.92-7.89(1H,d,J＝8.6Hz),7.82-7.78(1H,t,J＝7.5Hz),7.74-7.70(1H,t,J＝7.5Hz),7.63-7.59(1H,d,J＝9.7Hz),7.06-7.03(1H,d,J＝7.5Hz),2.43(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.37min,m/z＝309.1[M+H]+
实例15：4,5-二甲基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体X15
使用THF/水(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:12.77(1H,br s),10.67(1H,s),8.00-7.95(1H,br d,J＝7.0Hz),7.71-7.67(1H,t,J＝7.0Hz),7.62(1H,s),7.28(1H,s),6.99-6.96(1H,d,J＝7.0Hz),2.40(3H,s),2.29(6H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.41min,m/z＝285.2[M+H]+
实例16：2-((3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体X16
使用THF/H2O(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.65(1H,s),11.20(1H,s),8.79(1H,s),8.55-8.54(1H,d,J＝1.6Hz),8.14(1H,s),8.07-8.05(1H,dd,J＝8.0,1.2Hz),7.81-7.79(1H,d,J＝8.0Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.69min,m/z＝413.0[M+H]+
实例17：2-((4-甲基嘧啶-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体X17
使用THF/H2O(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.51(1H,br s),11.10(1H,s),8.39-8.38(1H,d,J＝3.2Hz),8.13(1H,s)7.99-7.97(1H,d,J＝8.0Hz),7.64-7.62(1H,d,J＝8.0Hz),7.00-6.99(1H,d,J＝4.4Hz),2.22(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.48min,m/z＝326.1[M+H]+
实例18：2-((5,6-二甲基吡嗪-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体X18
使用THF/H2O(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.58(1H,br s),11.17(1H,s),9.09(1H,s),8.13(1H,s),8.04-8.02(1H,d,J＝8.0Hz),7.79-7.77(1H,d,J＝8.0Hz),2.46(3H,s),2.43(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.54min,m/z＝340.1[M+H]+
实例19：5-溴-N-(5-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
将丙酮(140mL)中的5-溴-异苯并呋喃-1,3-二酮(1.0g，4.42mmol)和2-氨基-5-甲基吡啶(0.41g，4.42mmol)的溶液在回流下加热2h。冷却至室温后，除在减压下去溶剂并通过制备型HPLC分离异构体的所得混合物(方法2)，以提供呈白色固体的标题化合物(0.060g，0.18mmol，4％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.33(1H,br s),10.85(1H,s),8.15(1H,br,s),8.06-8.04(1H,d,J＝8.0Hz),7.96-7.95(1H,d,J＝1.6Hz),7.83-7.81(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz)7.65-7.63(1H,d,J＝6.0Hz),7.49-7.47(1H,d,J＝8.4),2.26(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.40min,m/z＝335.0[M+H]+
以类似于实例19的方式由5-溴-异苯并呋喃-1,3-二酮开始制备以下实例20-22。
实例20：5-溴-N-(5-氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
使用2-氨基-5-氯吡啶合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.40(1H,br s),11.19(1H,br s),8.39-8.38(1H,d,J＝2.4Hz),8.20-8.18(1H,d,J＝8.4Hz),7.98-7.93(2H,m),7.85-7.83(1H,d,J＝8.0Hz),7.52-7.50(1H,d,J＝8.4Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.59min,m/z＝354.9[M+H]+
实例21：5-溴-N-吡啶-2-基-邻氨甲酰苯甲酸
使用2-氨基-吡啶合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.36(1H,br s),10.92(1H,s),8.33-8.32(1H,d,J＝3.6Hz),8.16-8.14(1H,d,J＝8.0Hz),7.98-7.97(1H,d,J＝2.0Hz),7.85-7.80(2H,m),7.50-7.48(1H,d,J＝8.0Hz),7.15-7.12(1H,dd,J＝4.8,6.4Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.38min,m/z＝321.0[M+H]+
实例22：5-溴-N-(6-氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
使用2-氨基-6-氯吡啶合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.41(1H,br s),11.25(1H,s),8.15-8.13(1H,d,J＝7.6Hz),7.98-7.98(1H,d,J＝1.6Hz),7.91-7.79(2H,m),7.51-7.49(1H,d,J＝8.0Hz),7.25-7.23(1H,d,J＝7.6Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.60min,m/z＝354.9[M+H]+
实例23：5-溴-N-(5,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
将TFA/DCM(1:1，2mL)中的中间体Y21(0.090g，0.22mmol)的溶液在室温下搅拌4h。完成反应后(通过TLC监测)，将反应混合物在真空中浓缩，以提供一种固体，将其用二乙醚洗涤(6x 9mL)，以给出呈白色固体的标题化合物(0.045g，0.13mmol，59％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.29(1H,br s),10.75(1H,s),7.95-7.94(1H,d,J＝2.0Hz),7.89-7.87(1H,d,J＝8.4Hz),7.82-7.79(1H,dd,J＝8.0,1.6Hz),7.54-7.52(1H,d,J＝8.0Hz),7.47-7.45(1H,d,J＝8.4Hz),2.35(3H,s),2.21(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.41min,m/z＝348.9[M+H]+
以类似于实例23的方式由适当的中间体Y22-48制备以下实例1、2、24-46以及51。
实例1：N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y22
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.51(1H,s),10.96(1H,s),8.12(1H,s),8.01-7.98(2H,m),7.75-7.69(2H,m),7.02-7.00(1H,d,J＝7.6Hz),2.40(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.46min,m/z＝325.1[M+H]+
实例2：5-溴-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y23
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.31(1H,br s),10.86(1H,s),7.95(2H,m),7.82-7.70(2H,m),7.48-7.46(1H,d,J＝8.0Hz),7.00-6.98(1H,d,J＝6.8Hz),2.39(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.41min,m/z＝335.0[M+H]+
实例24：5-溴-N-(4-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y24
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.34(1H,br s),10.84(1H,s),8.18-8.17(1H,d,J＝4.8Hz),8.01(1H,s),7.97-7.96(1H,d,J＝2.0Hz),7.84-7.82(1H,dd,J＝2.0,8.4Hz)7.48-7.46(1H,d,J＝8.4Hz),6.98-6.97(1H,d,J＝4.8),2.34(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.37min,m/z＝335.0[M+H]+
实例25：5-溴-N-(2-甲基-吡啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y25
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:14.20(1H,br s),11.33(1H,s),8.52-8.50(1H,d,J＝6.4Hz),8.07-8.07(1H,d,J＝1.6Hz),7.96-7.94(1H,dd,J＝1.6,8.0Hz),7.83(1H,s),7.72-7.70(1H,d,J＝8.4Hz),7.60-7.57(1H,d,J＝8.0Hz),2.58(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.36min,m/z＝335.0[M+H]+
实例26：5-溴-N-吡啶-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y26
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.47(1H,br s),10.60(1H,s),8.81-8.80(1H,d,J＝2.4Hz),8.31-8.30(1H,dd,J＝4.8,1.2Hz),8.11-8.09(1H,d,J＝8.8Hz),8.02-8.01(1H,d,J＝2.0Hz),7.91-7.88(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz),7.57-7.55(1H,d,J＝8.0Hz),7.41-7.38(1H,dd,J＝8.4,4.8Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.33min,m/z＝321.0[M+H]+
实例27：5-溴-N-(3-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y27
1H NMR(DMSO,400MHz)δ:10.63(1H,br s),8.28(1H,s),7.96-7.95(1H,d,J＝1.6Hz),7.88-7.86(1H,dd,J＝1.6,8.0Hz),7.79-7.77(1H,d,J＝6.8Hz),7.57-7.55(1H,d,J＝8.4Hz),7.29-7.26(1H,t,J＝5.2Hz),2.30(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.36min,m/z＝335.0[M+H]+
实例28：5-溴-N-(4-甲基-噻唑-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y28
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.43(1H,br s),12.66(1H,s),7.99-7.98(1H,d,J＝2.0Hz),7.87-7.84(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz),7.56-7.54(1H,d,J＝8.4Hz),6.81-6.81(1H,d,J＝0.8Hz),2.27(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.52min,m/z＝341.0[M+H]+
实例29：5-溴-N-喹啉-2-基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y29
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.40(1H,br s),11.27(1H,s),8.39(2H,m),7.99-7.92(2H,m),7.87-7.84(1H,dd,J＝2.0,8.4Hz),7.80-7.50(4H,m)。
LCMS方法A:tR＝0.51min,m/z＝370.9[M+H]+
实例30：5-溴-N-(5,6-二氯-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y30
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.40(1H,br s),11.6(1H,s),8.17-8.12(2H,m),7.98-7.97(1H,d,J＝2.0Hz),7.85-7.83(1H,dd,J＝1.6,8.0Hz),7.53-7.50(1H,d,J＝8.4Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.68min,m/z＝388.8[M+H]+
实例31：5-溴-N-(6-甲基-吡啶-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y31
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:10.49(1H,s),8.67-8.66(1H,d,J＝2.4Hz),8.00-7.95(2H,m),7.89-7.87(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz)7.55-7.53(1H,d,J＝8.0Hz),7.24-7.22(1H,d,J＝8.4Hz),2.49(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.34min,m/z＝335.0M+H]+
实例32：5-溴-N-(6-甲基-哒嗪-3-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y32
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.42(1H,br s),11.45(1H,s),8.27-8.25(1H,d,J＝9.2Hz),8.00-7.99(1H,d,J＝2.0Hz),7.87-7.85(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz),7.61-7.59(1H,d,J＝8.8Hz),7.54-7.52(1H,d,J＝8.4Hz),2.49(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.39min,m/z＝336.0[M+H]+
实例33：5-溴-N-(4,6-二甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y33
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.29(1H,br,s),10.79(1H,s),7.94(1H,s),7.82-7.80(2H,d,J＝8.4Hz),7.46-7.44(1H,d,J＝7.6Hz),6.84(1H,s),2.34(3H,s),2.29(3H,s)
LCMS方法A:tR＝0.40min,m/z＝348.9[M+H]+
实例34：5-溴-N-(2-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y34
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.40(1H,br s),11.41(1H,s),8.59-8.58(1H,d,J＝5.6Hz),7.98-7.94(2H,m),7.85-7.83(1H,dd,J＝1.6,8.0Hz),7.51-7.49(1H,d,J＝8.0Hz),2.51(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.38min,m/z＝336.0[M+H]+
实例35：5-溴-N-(6-甲基-嘧啶-4-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y35
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.46(1H,s),11.28(1H,s),8.74(1H,s),8.04(1H,s),8.00(1H,s),7.87-8.85(1H,d,J＝7.6Hz),7.51-7.49(1H,d,J＝8.0Hz),2.46(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.41min,m/z＝336.0[M+H]+
实例36：N-(2-甲氧基-吡啶-4-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y36
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.69(1H,br s),10.78(1H,s),8.18(1H,s),8.09-8.05(2H,t,J＝7.2Hz),7.82-7.80(1H,d,J＝8.0Hz),7.17(1H,s),7.15-7.14(1H,d,J＝5.6Hz),3.83(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.45min,m/z＝341.1[M+H]+
实例37：N-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y37
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.55(1H,br s),10.84(1H,s),8.14(1H,s),8.01-8.03(1H,d,J＝8.0Hz),7.76-7.72(3H,m),6.56-6.55(1H,d,J＝6.8Hz),3.81(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.62min,m/z＝341.1[M+H]+
实例38：N-吡啶-2-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y38
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.55(1H,br s),9.11-9.08(1H,t,J＝6.0Hz),8.51-8.50(1H,d,J＝4.0Hz),8.07(1H,s),8.02-8.00(1H,d,J＝8.0Hz),7.79-7.73(2H,m),7.53-7.51(1H,d,J＝7.6Hz),7.29-7.26(1H,q,J＝4.0Hz),4.54-4.53(2H,d,J＝6.4Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.35min m/z＝325.1[M+H]+
实例39：N-吡啶-4-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y39
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.62(1H,s),9.10-9.07(1H,t,J＝6.0Hz),8.52-8.51(2H,d,J＝5.6Hz),8.08(1H,s),8.02-8.00(1H,d,J＝8.0Hz),7.74-7.72(1H,d,J＝8.0Hz),7.43-7.41(2H,d,J＝5.6Hz),4.49-4.47(2H,d,J＝6.0Hz)。
LCMS方法450:tR＝0.34min,m/z＝325.1[M+H]+
实例40：N-吡啶-3-基甲基-5-三氟甲基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y40
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:9.12-9.10(1H,t,J＝5.8Hz),8.72(1H,s),8.64-8.62(1H,d,J＝4.4Hz),8.14-8.12(1H,d,J＝8.0Hz),8.08(1H,s),8.02-8.00(1H,d,J＝7.6Hz),7.73-7.71(1H,d,J＝8.0Hz),7.67-7.63(1H,q,J＝4.4Hz),4.56-4.54(2H,d,J＝6.0Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.34min,m/z＝325.1[M+H]+
实例41：N-(6-甲基-吡啶-2-基)-5-丙基-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y43
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.88(1H,br s),10.70(1H,s),7.97-7.95(1H,d,J＝8.0Hz),7.70-7.66(1H,t,J＝7.8Hz),7.63(1H,s),7.42(2H,s),6.98-6.97(1H,d,J＝7.6Hz),2.66-2.62(2H,t,J＝7.8Hz),2.39(3H,s),1.66-1.57(2H,m),0.92-0.89(3H,t,J＝7.2Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.48min,m/z＝299.1[M+H]+
实例42：N5-异丙烯基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y42
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:10.81(1H,s),7.96-7.95(1H,m),7.90(1H,s),7.74-7.69(2H,m),7.51-7.49(1H,d,J＝8Hz),7.01-6.99(1H,d,J＝6.8Hz),5.55(1H,s),5.23(1H,s),2.40(3H,s),2.15(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.45min,m/z＝297.2[M+H]+
实例43：N5-异丙基-N-(6-甲基-吡啶-2-基)-邻氨甲酰苯甲酸
由中间体Y47
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.90(1H,br s),10.70(1H,s),7.96-7.94(1H,d,J＝8.0Hz),7.70-7.66(2H,t,J＝7.8Hz),7.49-7.43(2H,m),6.98-6.96(1h,d,J＝7.6Hz),3.17-2.96(1H,m),2.39(3H,s),1.24(6H,d,J＝8.8Hz)。
LCMS方法A:tR＝0.47min,m/z＝299.2[M+H]+
实例44：2-((2-甲基嘧啶-4-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体Y44
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:11.52(1H,s),8.65-8.63(1H,d,J＝5.6Hz),8.15(1H,s),8.06-8.04(1H,d,J＝8.0Hz),8.01-8.00(1H,d,J＝5.2Hz),7.79-7.77(1H,d,J＝7.6Hz),2.53(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.43min,m/z＝326.1[M+H]+
实例45：2-((4,5-二甲基嘧啶-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体Y45
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.44(1H,br s),10.97(1H,s),8.21(1H,s),8.12(1H,s),7.97-7.96(1H,d,J＝7.2Hz),7.62-7.60(1H,d,J＝8.0Hz),2.17(3H,br s),2.10(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.51min,m/z＝340.1[M+H]+
实例46：2-((5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体Y46
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.49-13.46(1H,d,J＝10Hz),10.92(1H,s),8.10(1H,s),8.00-7.98(1H,d,J＝7.6Hz),7.92-7.90(1H,d,J＝7.6Hz),7.74-7.72(1H,d,J＝7.6Hz),7.50-7.48(1H,d,J＝8.0Hz),2.72-2.60(4H,m),1.81-1.73(4H,m)。
LCMS方法A:tR＝0.51min,m/z＝365.1[M+H]+
实例47：2-((6-甲基吡啶-2-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
由中间体X19
使用THF/H2O(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:14.0(1H,s,br),11.29(1H,s),8.33(1H,s),8.23(1H,s),7.98(1H,s)7.75-7.71(1H,t,J＝8.0Hz),7.039-7.021(1H,d,J＝7.2Hz),2.41(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.61min,m/z＝392.9[M+H]+
实例48：2-((5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
由中间体X20
使用THF/H2O(1:1)中的一水合氢氧化锂合成
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:13.90(1H,br),11.05(1H,s),8.33(1H,s),8.20(1H,s),7.92-7.90(1H,d,J＝8.4Hz),7.52-7.50(1H,d,J＝8.0Hz),2.72-2.71(4H,m),1.76-1.74(4H,m)。
LCMS方法A:tR＝0.66min,m/z＝433.1[M+H]+
实例49：2-((5,6-二甲基吡啶-2-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
由中间体S52
将LiOH.H2O(12mg，0.285mmol)添加至THF/H2O(1:1)(3.0mL)中的中间体S52(60mg，0.142mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌1h。然后，在真空中除去THF并用1N HCl酸化粗材料。将所得固体过滤，用戊烷洗涤并在减压下干燥，以提供呈白色固体的标题化合物(45mg，78％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:11.41(1H,s),8.30(1H,s),8.23(1H,s),7.92-7.90(1H,d,J＝7.2Hz),7.57-7.55(1H,d,J＝8.4Hz),2.36(3H,s),2.22(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.61min,m/z＝407.0[M+H]+
实例50：2-((2-甲基嘧啶-4-基)氨基甲酰基)-4,5-双(三氟甲基)苯甲酸
由中间体T1
在0℃下，向在DCM(3.0mL)中的中间体T1(100mg，0.331mmol)和2-甲基嘧啶-4-胺(36mg，0.331mmol)的溶液中添加HATU(188mg，0.496mmol)和DIPEA(0.18mL，0.993mmol)。将反应混合物在室温下搅 拌18h。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用水(50mL)稀释，用EtOAc(50mL)萃取并用无水Na2SO4干燥。将粗产物通过柱色谱法纯化，以提供呈白色固体的标题化合物(100mg，77％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:14.07(1H,br),11.61(1H,s),8.63-8.62(1H,d,J＝6.0Hz),8.36(1H,s),8.30(1H,s),7.95(1H,s),2.49(3H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.55min,m/z＝393.9[M+H]+
实例51：2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氨基甲酰基)-5-(三氟甲基)苯甲酸
由中间体Y48
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:14.0(1H,br),11.56(1H,s),8.23(1H,s),8.16-8.14(1H,d,J＝8.0Hz),7.87-7.85(1H,d,J＝8.0Hz),7.73(2H,s),2.61(6H,s)。
LCMS方法A:tR＝0.42min,m/z＝339.0[M+H]+
蛋白质的表达与纯化
使用游离型表达载体pCEP-PU在HEK 293细胞中表达包括Q99425的前肽(34-77)和C-末端6xHis标签的人类分拣蛋白细胞外结构域(78-755)。根据制造商的说明书，在Ni2+NTA–琼脂糖(凯杰公司(Qiagen))柱上从培养基中纯化表达的分拣蛋白-细胞外结构域。
使用pcDNA 3.1(-)表达载体在HEK 293F细胞中表达人类颗粒蛋白前体(P28799；18-593)。通过在capto-Q(GE医疗集团(GE-healthcare))上进行捕获而从培养基中纯化。用2M硫酸铵沉淀从柱上洗脱的级分并离心。将沉淀溶解于PBS中并在S200大小排阻色谱柱上分离。通过SDS-PAGE鉴定具有颗粒蛋白前体的级分并相应地合并。
使用pGEX表达质粒在大肠杆菌BL21细胞中表达作为至GST的C-末端融合的人类β-神经生长因子的原始部分(propart)(P01138；19-121)。通过添加1mM IPTG而启动诱导并继续4小时。通过离心收获细胞并使用来自诺瓦基公司(Novagen)的“重磅蛋白质提取(block buster protein extraction)”试剂盒溶解。根据来自制造商的说明书，使用GSTtrap柱(GE医疗集团)纯化澄清裂解液。
小鼠his-分拣蛋白购自R&D系统公司(R&D Systems)。
hSortilin亲和性测定
使用基于SPA的测定形式，通过测量3H-神经降压素结合至hSortilin的置换而确定化合物亲和性。
在总体积为40ul的50mM HEPES(pH 7.4)测定缓冲液中进行分拣蛋白测定，该测定缓冲液包含100mM NaCl、2.0mM CaCl2、0.1％BSA以及0.1％Tween-20。改变化合物的浓度，其中这些化合物已在室温下用150nM的6his-分拣蛋白预孵育30min。添加作为放射性配体的5nM[3H]-神经降压素并将非特异性结合定义为存在20μM的神经降压素下的结合。添加Ni螯合成像珠(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))并将板在黑暗中缓慢振荡60min。在将板在ViewLux上以360sec暴露时间读板之前，允许成像珠的沉降时间最低为6小时。用10个药物浓度(包括3个十倍程)进行化合物的剂量-反应评价。使用Xlfit 4(IDBS，英国)使用S形浓度-反应(可变斜率)通过非线性回归计算IC50值。将结果作为衍生自使用Cheng-Prusoff方程(Ki＝IC50/(1+(L/Kd)))而转化为Ki值的计算机拟合的IC50值的Ki值(nM)而给出。确定神经降压素的Kd为100nM
实例编号hSortilin NTS结合IC50(nM)hSortilin Ki
1450429
212001143
364006095
414001333
5830790
64000
7170162
81000952
9700667
1022002095
11480457
1218001714
13480457
1442004000
1534003238
16360343
17360343
18240229
1917001619
20990943
2136003429
2216001524
23570543
2424002286
2518001714
2655005238
2764％*
2836003429
2913001238
3021002000
3170％*
3232003048
33970924
34490467
3520001905
36750714
3713001238
3816001524
3975007143
4048004571
4136003429
4252004952
4311001048
44300286
45200190
468884
4712001144
48760721
49750734
50620599
51640614
*50μM处的抑制
mSortilin亲和性测定
使用基于SPA的测定形式，通过测量3H-神经降压素结合至msortilin的置换而确定化合物亲和性。
在总体积为40ul的50mM HEPES(pH 7.4)测定缓冲液中进行分拣蛋白测定，该测定缓冲液包含100mM NaCl、2.0mM CaCl2、0.1％BSA以及0.1％Tween-20。改变化合物的浓度，其中这些化合物已在室温下用50nM的6his-分拣蛋白预孵育30min。添加作为放射性配体的5nM[3H]-神经降压素并将非特异性结合定义为存在20μM的神经降压素下的结合。添加Ni螯合成像珠(珀金埃尔默公司)并将板在黑暗中缓慢振荡60min。在将板在ViewLux上以360sec暴露时间读板之前，允许成像珠的沉降时间最低为6小时。用10个药物浓度(包括3个十倍程)进行化合物的剂量-反应评价。使用Xlfit 4(IDBS，英国)使用S形浓度-反应(可变斜率)通过非线性回归计算IC50值。将结果作为衍生自使用Cheng-Prusoff方程(Ki＝IC50/(1+(L/Kd)))而转化为Ki值的计算机拟合的IC50值的Ki值(nM)而给出。确定神经降压素的Kd为100nM。
实例编号mSortilin NTS结合IC50(nM)mSortilin Ki(nM)
1220210
ProNGF的原始部分至hSortilin的抑制
使用均相时间分辨荧光技术通过测量proNGF的原始部分至分拣蛋白的结合而确定proNGF至分拣蛋白的抑制。proNGF的原始部分融合至GST标签并用His标记分拣蛋白。使用铕标记GST抗体和XL665标记His抗体检测pro-GST至his-分拣蛋白的结合。一旦这些蛋白质彼此相互作用以将标记的抗体拉近，便产生信号。
在总体积为20ul的50mM HEPES(pH 7.4)测定缓冲液中进行分拣蛋白前体测定，该测定缓冲液包含100mM NaCl、2.0mM CaCl2、0.1％BSA以及0.1％Tween-20。改变化合物的浓度，其中这些化合物已在室温下用50nM的6his-分拣蛋白和6nM的pro-GST孵育15min。与KF一起添加4nM的抗-GST-Eu和25nM的抗-His-XL665(终浓度200mM)并且在室温下在黑暗中孵育150min后，在易美逊(envision)阅读器(珀金埃尔默公司)上在320nm的激发以及665和615nm的双发射下测量荧光。以HTRF比率为单位表示信号(665nm下的荧光强度/615nm x 10,000下的荧光强度)。将proGST至分拣蛋白的结合的抑制表示为相对于缓冲液基础对照(0％抑制)响应于20μM的神经降压素(100％抑制)的对照的百分比抑制。使用Xlfit 4(IDBS，英国)使用S形浓度-反应(可变斜率)通过非线性回归计算IC50值。
实例编号IC50(nM)
1260
hProgranulin至hSortilin的抑制
使用均相时间分辨荧光技术通过测量proNGF的颗粒蛋白前体至his-分拣蛋白的结合而确定颗粒蛋白前体至分拣蛋白的抑制。使用铕标记颗粒蛋白前体抗体和XL665标记His抗体检测颗粒蛋白前体至his-分拣蛋白的结合。一旦这些蛋白质彼此相互作用以将标记的抗体拉近，便产生信号。
在包含0.1％BSA的总体积为20ul的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)测定缓冲液中进行颗粒蛋白前体分拣蛋白测定。改变化合物的浓度，其中这些化合物已在室温下用50nM的6his-Sortilina和4nM的颗粒蛋白前体孵育15min。与KF一起添加0.7nM的抗-颗粒蛋白前体-Eu和7nM的抗-His-XL665(终浓度200mM)并且在室温下在黑暗中孵育120min后，将板在4℃下保存过夜并且第二天，在易美逊阅读器(珀金埃尔默公司)上在320nm的激发以及665和615nm的双发射下测量荧光。以HTRF比率为单位表示信号(665nm下的荧光强度/615nm x 10,000下的荧光强度)。将颗粒蛋白前体至分拣蛋白的结合的抑制表示为相对于缓冲液基础对照(0％抑制)响应于20μM的神经降压素(100％抑制)的对照的百分比抑制。使用Xlfit 4(IDBS，英国)使用S形浓度-反应(可变斜率)通过非线性回归计算IC50值。
实例编号IC50(nM)
11800
内源PGRN胞吞测定
通过用人类分拣蛋白表达载体转染HEK293细胞，随后用适当的选择剂进行几轮传代而产生表达人类分拣蛋白的稳定细胞系(S-18)。
发现HEK293细胞和S-18细胞在没有任何刺激的情况下将PGRN连续地分泌进培养基中。颗粒蛋白前体结合至分拣蛋白并被胞吞(Hu(胡)等人2010)。阻断分拣蛋白和颗粒蛋白前体相互作用导致培养基中积累PGRN。不阻断分拣蛋白和颗粒蛋白前体相互作用的化合物对培养基中的PGRN水平没有影响。
在第1天，将S-18细胞接种在96孔板中。24hr后，将培养基完全用培养基亦或测试化合物之一替换。除非另外说明，否则在10uM下测试所有化合物。在第3天收集培养基并使用PGRN ELIS(R&D)进行分析。通过Cell TiterGlo(普洛麦格公司(Pro Mega))评估细胞活力，以评价化合物的细胞毒效应。
将不同化合物添加至S-18细胞中，以评价对颗粒蛋白前体的作用。神经降压素是一种天然分拣蛋白配体并阻断分拣蛋白结合至颗粒蛋白前体，从而导致在培养基中积累颗粒蛋白前体。将神经降压素或实例1添加至S-18细胞中与对照孔相比，显示出培养基中的PGRN增加了85％-100％。
另一方面，合成的神经降压素(LIYPRNEYELRKP)或标准物1不结合至分拣蛋白并且培养基中的PGRN水平类似于未经处理的孔。
在一个类似的但略微不同的实验范例中，允许PGRN积累24hr，所以化合物可以与PGRN竞争结合至分拣蛋白。在第2天，将化合物添加至细胞中并且再孵育24hr，当收获培养基时，使用ELISA试剂盒分析PGRN水平。
神经降压素和实例1，与培养基中的PGRN竞争，增加细胞培养基中的PGRN水平。如图1所示，Scr.NT和标准物1对PGRN胞吞没有任何作用。
Cellomics颗粒蛋白前体测定
在此测定中使用转染的HEK 293细胞(具有对照或分拣蛋白表达质粒)或表达人类分拣蛋白的稳定的HEK293细胞(S-18)。将细胞胰酶消化并铺在96孔板中。在瞬时转染的细胞的情况下，在转染后将它们在96孔板中铺板24hr。第二天，完全换掉培养基并且将测试化合物添加至细胞中持续30min，随后添加PGRN持续60min。在研究结束时(1.5hr后)，将细胞固定并针对分拣蛋白和颗粒蛋白前体染色。通过Cellomics阵列扫描(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))分析所有染色板并计算每个孔中的每个细胞的平均PGRN和分拣蛋白染色强度。
在HEK 293细胞中瞬间转染颗粒蛋白前体表达质粒之后，从培养基中收获在此测定中使用的颗粒蛋白前体。使用PGRN ELISA试剂盒(R&D)测量PGRN水平。
将PGRN添加至孔中被容易地胞吞并导致分拣蛋白转染的孔中的荧光信号增加。添加神经降压素或来自实例1的化合物阻止分拣蛋白结合至颗粒蛋白前体(图2)。因此，PGRN不被胞吞并且PGRN荧光强度类似于对照孔。
合成的神经降压素不结合至分拣蛋白并且被用作阴性对照。在用合成的神经降压素或标准物1处理的孔中，PGRN结合分拣蛋白并被胞吞并且荧光强度显著增加，如在仅仅用PGRN处理的孔中所见。
合成的神经降压素具有以下序列：LIYPRNEYELRKP