作为双重活性H1反向激动剂/5HT2A拮抗剂的噻吩并2,3B1,5苯并氧杂氮杂4基哌嗪1基化合物.pdf

描述了下式的双重H1反向激动剂/5-HT2A受体拮抗剂：其用途及其制备方法。

权利要求书
1.  下式的化合物

或其药学上可接受的盐。

2.  权利要求1的化合物，其是HCl盐。

3.  药物组合物，其包含权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

4.  治疗哺乳动物失眠的方法，其包括给需要这类治疗的哺乳动物施用有效量的权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐。

5.  权利要求4的方法，其中所述的哺乳动物是人。

6.  权利要求4的方法，其中所述的失眠以睡眠开始困难或睡眠维持困难或这二者为特征。

7.  权利要求6的方法，其中所述的哺乳动物是人。

8.  权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其用在疗法中。

9.  权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗失眠。

10.  权利要求9的具有所述用途的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的失眠以睡眠开始困难或睡眠维持困难或这二者为特征。

11.  权利要求9或10的具有所述用途的化合物，其用于人。

12.  权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗失眠的药剂中的用途。

13.  权利要求12的用途，其中所述的失眠以哺乳动物的睡眠开始困难 或睡眠维持困难或这二者为特征。

说明书作为双重活性H1反向激动剂/5-HT2A拮抗剂的(噻吩并[2,3-b][1,5]苯并氧杂氮杂*-4-基)哌嗪-1-基化合物
组胺在各种生理学过程中通过与至少4种不同的G-蛋白偶联受体、即H1-H4受体发生相互作用起重要作用。在中枢神经系统中，H1受体在睡眠调节周期中起关键作用，并且已知H1拮抗剂/反向激动剂诱发嗜睡。
同样，血清素在各种生理学过程中通过与至少14种不同的G-蛋白偶联受体发生相互作用起重要作用。调节中枢神经系统中的5-HT2A受体在睡眠调节周期中起关键作用，并且已经证实5-HT2A拮抗剂改善患有失眠的患者的慢波睡眠和睡眠维持。
具有H1或5-HT2A反向激动剂或拮抗剂活性的化合物已经被用于治疗失眠(例如分别为多塞平和曲唑酮)，并且已经在动物睡眠研究中显示出显著的药理学作用。然而，目前选择性双重活性H1/5-HT2A反向激动剂/拮抗剂是无法商购获得的。
WO 2007/022068描述了一些用于治疗睡眠障碍的被取代的(噻吩并[2，3-b][1，5]苯并二氮杂-4-基)哌嗪-1-基和(噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂(benzoxazepin)-4-基)哌嗪-1-基化合物。
本发明提供了3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸和其药学上可接受的盐，其对H1受体具有高反向激动剂效能、对5-HT2A受体具有高拮抗剂效能，并且对这些受体具有良好的选择性，特别针对其它组胺受体、血清素受体和其它生理学相关受体，特别是针对5-HT2C受体、GABAA受体、毒蕈碱受体、多巴胺能受体、肾上腺素能受体和hERG通道。这些化合物还通过动物模型显示它们可用于治疗以睡眠维持差为特征的睡眠障碍。照此，认为这些化合物可用于治疗以差的睡眠潜伏期或差的维持睡眠或这二者为特征的睡眠障碍，例如治疗失眠，例如慢性或暂时性原发性失眠、或者慢性或暂时性继发性失眠、或者这二者。继发性失眠的实例包括、但不限于与抑郁性障碍(例如重 症抑郁性障碍、精神抑郁症和/或循环性气质)相关的失眠、与焦虑性障碍(例如广泛性焦虑(generalized anxiety disorder)和/或社交恐怖)相关的失眠、与疼痛(例如纤维肌痛、慢性骨或关节痛，例如与炎症性关节炎或骨关节炎相关的慢性骨或关节痛，或糖尿病性神经病性疼痛(diabetic neuropathic pain))相关的失眠、与变态反应(例如变应性哮喘、瘙痒、鼻炎、充血等)相关的失眠、与肺或气道障碍(例如阻塞性睡眠呼吸暂停、反应性气道疾病等)相关的失眠、与精神病学障碍、痴呆和/或神经变性疾病相关的失眠、和/或与昼夜节律睡眠障碍(例如轮班工作睡眠障碍、时差障碍(jet lag disorder)、睡眠相位后移综合征(delayed sleep phase disorder)、睡眠相位前移综合征(advanced phase sleep disorder)和非24小时睡眠-醒觉综合征(non-24hr.sleep-wake syndrome)等)相关的失眠。
本发明提供L式I的化合物

或其药学上可接受的盐。即，3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸或其药学上可接受的盐。
在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含式I的化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此外，本发明的该方面提供了药物组合物，其用于治疗失眠，例如以延长的睡眠潜伏期或差的维持睡眠或这二者为特征的失眠，例如原发性失眠、时差综合征(iet lag)、轮班工作睡眠障碍、睡眠相位后移综合征、睡眠相位前移综合征和/或非24小时睡眠-醒觉综合征，该药物组合物包含式I的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明的该方面的另一个实施方案提供了药物组合物，其包含式I的化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，并且任选包含另外的治疗成分。
本发明还提供了在哺乳动物中治疗失眠、例如以延长的睡眠潜伏期或差的维持睡眠或这二者为特征的失眠、例如原发性失眠、时差综合征、轮班工作睡眠障碍、睡眠相位后移综合征、睡眠相位前移综合征和/或非24小时睡眠-醒觉综合征的方法，该方法包括给需要这类治疗的哺乳动物施用有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐。在这些方法的一个特定的实施方案中，所述哺乳动物是人。
本发明还提供了用在疗法中的式I的化合物或其药学上可接受的盐。在该方面内，本发明提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗失眠。在另一些实施方案中，所述失眠以延长的睡眠潜伏期或差的维持睡眠或这二者为特征，例如原发性失眠、时差综合征、轮班工作睡眠障碍、睡眠相位后移综合征、睡眠相位前移综合征和/或非24小时睡眠-醒觉综合征。在本发明的该方面的一个特定的实施方案中，所述应用是在哺乳动物、特别是人中。
本发明的另一个方面提供了式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗失眠，例如以延长的睡眠潜伏期或差的维持睡眠或这二者为特征的原发性失眠，例如原发性失眠、时差综合征、轮班工作睡眠障碍、睡眠相位后移综合征、睡眠相位前移综合征和/或非24小时睡眠-醒觉综合征。
为了清楚，在本申请中通篇将使用下面的三环结构编号：

本发明的化合物具有碱性和酸性原子团，因此与许多有机和无机酸和 碱反应，从而形成药学上可接受的盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐在本发明的范围内。本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指对活的生物体基本上无毒的本发明的化合物的任意盐。这类盐包括Journal of Pharmaceutical Science，66，2-19(1977)中列出的那些，它们是本领域技术人员已知的。
本文所用的缩写定义如下：
“盐水”意指饱和NaCl水溶液。
“DMEM”意指达尔伯克极限伊格尔培养基(Dulbecco’s Minimum Eagle’s Medium)。
“DMSO”意指二甲亚砜。
“EDTA”意指乙二胺四乙酸。
“Equiv”意指当量。
“FBS”意指胎牛血清。
“HEPES”意指4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
“HPLC”意指高压液相色谱法。
“hr.”意指小时。
“IC50”意指实现50％最大抑制的浓度。
“LC-MS”意指HPLC-质谱法。
“MeOH”意指甲醇。
“min.”意指分钟。
“MS”意指质谱法。
“MS(ES+)”意指使用电喷雾电离的质谱法。
“NMR”意指核磁共振。
“RO”意指受体占位(receptor occupancy)。
“THF”意指四氢呋喃。
通用化学
本发明的化合物可以根据以下合成实施例制备。
制备1. 2，5-二氯噻吩-3-甲酰氯

向2，5-二氯-噻吩-3-甲酸(49.7g；252.23mmol；1.00equiv)在二氯甲烷(500mL)中的混悬液中加入二甲基甲酰胺(0.5mL；6.47mmol)，然后历经1.5hr加入2M草酰氯的二氯甲烷溶液(138.73mL；277.45mmol；1.1equiv)(将放出的气体通过苛性碱溶液排出)。将得到的澄清溶液在室温下搅拌1hr，直到气体放出停止并且通过LCMS证实反应完全(将样品猝灭入7M NH3/MeOH中以进行反应监测)。对于相应的伯酰胺，MS(m/z)：＝195.9，197.9(M+H)+。蒸发至干，得到标题中间体，为棕色油状物(55g，252mmol，定量收率)。
制备2. 2，5-二氯-N-(2-羟基-4-甲基-苯基)噻吩-3-甲酰胺

向6-氨基-间-甲酚(34.14g；277.20mmol；1.1equiv)在THF(450mL)中的溶液中加入吡啶(40.76mL；504.00mmol；2equiv)，然后历经30min加入2，5-二氯噻吩-3-甲酰氯(54.30g，252mmol，1.00equiv)在THF(250mL)中的溶液，使用冰浴维持15-20℃的温度。将得到的浓稠混合物在室温下搅拌1hr，通过LCMS证实氨基苯酚完全耗尽。在搅拌下倾倒在2M HCl水溶液(500ml)和冰(250ml)的混合物上。通过过滤收集得到的米黄色固体，用水充分洗涤，风干。MS(m/z)：＝301.84，303.94(M+H)+。在真空烘箱中于40℃用P2O5干燥过夜，得到标题中间体(84.5g，推定为定量收率)。
制备3. 2.氯-8-甲基-5H-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-酮

向充分搅拌的2，5-二氯-N-(2-羟基-4-甲基-苯基)噻吩-3-甲酰胺(76.15g；252mmol；1.00equiv)在二甲亚砜(450mL)中的混悬液中加入碳酸钾(38.31g；277.20mmol；1.1equiv)，将该混合物加热至100-110℃达4.5hr，通过LCMS证实基本上完全转化。使其冷却至室温，缓慢地加入到两个单独的含有1M盐酸水溶液(500ml)的烧杯中，观察到气体放出。在室温搅拌0.5hr，通过过滤收集得到的深灰色固体。依次用水、然后用少量乙醇、然后用少量乙醚洗涤。在真空烘箱中于45℃干燥过夜，得到标题中间体(58.5g，87％)。MS(m/z)：＝265.99(M+H)+。
制备4. 2，4-二氯-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂

向1L圆底烧瓶中装入甲氧基苯(225mL，5V)、2-氯-8-甲基-5H-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-酮(45g；169.4mmol；1equiv)和N，N-二甲基苯胺(47.2g；389.5mmol；2.3equiv)。加热至60℃，历经0.5hr滴加磷酰氯(85.7g；558.9mmols；3.3equiv)。升温至100℃，搅拌2hr，直到通过TLC分析证实反应完全。冷却至40-60℃，蒸发，得到标题中间体，为深棕色固体(123.1g，433.2mmol，256％收率，未通过测定校正)。MS(m/z)：283.8(M+H)。
制备5. 3-[4-(2-氯-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸甲酯

向1L圆底烧瓶中装入2，4-二氯-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂(121.1g；169.4mmol；1.0equiv)，然后加入乙腈(600mL，12.5V)，然后一次性加入碳酸钾(119.4g；863.9mmols)。搅拌10-20min，然后一次性加入2，2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯二盐酸盐(55.54g；203.3mmol；1.2equiv)。加热至80℃，搅拌30hr。将该混合物真空浓缩至干，然后将乙酸乙酯(1920mL，40V)和水(1920mL，40V)加入该混合物中。搅拌，过滤，然后分离水相，用乙酸乙酯(960mL，20V)萃取。合并有机相，用水(960mL×2)和盐水(200mL，4V)洗涤。浓缩，通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯(0-10％))纯化，得到标题中间体，为黄色固体(55.4g，123.7mmol，95.8％纯度，73.0％收率，未通过测定校正)。MS(m/z)：448.2(M+H).1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.03(d，J＝8.8Hz，1H)，6.91(d，J＝1.6Hz，1H)，6.81(s，1H)，6.50(s，1H)，3.67(s，3H)，3.47(t，J＝4.4Hz，4H)，2.58-2.54(q，6H)，2.28(s，3H)，1.19(s，6H).
制备6. 3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸甲酯

用氮气将3-[4-(2-氯-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸甲酯(30.00g，66.97mmol)、环丙基硼酸(7.48g， 87.06mmol)、磷酸钾n-水合物(49.75g，234.38mmol)、三环己基膦四氟硼酸盐(2.47g，6.7mmol)、水(13.39mL，13.39g，743.4mmol)和甲苯(267.87mL，233.36g，2.53mol)的混合物脱气10min。加入乙酸钯(II)(0.751g，3.35mmol)，于100℃搅拌过夜。使反应混合物冷却至室温，加入水，用乙酸乙酯萃取反应混合物。干燥乙酸乙酯萃取物(Na2SO4)，浓缩，用硅胶(ISCO)进行色谱处理，用乙酸乙酯/异己烷(0％∶100％-20％∶80％)梯度洗脱。收集合有产物的级分，浓缩。使用超临界流体(CO2)色谱法与25％乙醇和0.2％二甲胺进一步进行色谱处理。收集合有产物的级分，浓缩，将得到的固体于40℃真空干燥6hr，得到3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸甲酯(23.73g，82.93％)。MS(m/z)：454.25(M+H).1H NMR(300.11MHz，CDCl3)：6.98(d，J＝7.9Hz，1H)，6.88(dd，J＝1.4，8.0Hz，1H)，6.81(d，J＝1.5Hz，1H)，6.29(d，J＝0.9Hz，1H)，3.67(s，3H)，3.50-3.47(m，4H)，2.58-2.54(m，6H)，2.27(s，3H)，1.94-1.89(m，1H)，1.58(s，1H)，1.19(s，6H)，0.94-0.87(m，1H)，0.65-0.59(m，1H)。
实施例1. 3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸

将氢氧化钠(9.27g，231.68mmol)加入到3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸甲酯(35.03g，77.23mmol)在水(210.18mL)和异丙醇(210.18mL)中的浆液中，加热至85℃达45min。冷却至室温，用2M盐酸中和至pH 6-6.5。浓缩该混合物以除去异丙醇，通过过滤分离出得到的沉淀物，在烧结滤器(sinter)上洗涤。 将分离的固体于40℃真空干燥过夜，得到3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸(32.6g，95.12％收率)。MS(m/z)：440.1(M+H).1H NMR(300.11MHz，CDCl3)：7.03(d，J＝7.9Hz，1H)，6.92(dd，J＝1.3，8.1Hz，1H)，6.84(d，J＝1.3Hz，1H)，6.32(d，J＝0.9Hz，H)，3.70(s，4H)，2.88(t，J＝4.6Hz，4H)，2.62(s，2H)，2.30(s，3H)，1.97-1.91(m，1H)，1.28(s，6H)，0.98-0.91(m，2H)，0.67-0.62(m，2H)。
实施例2. 3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸二盐酸盐

将2M盐酸(0.119mL，0.24mmol)加入到3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸(0.0497g，0.11mmol)在乙腈(1mL)和水(1mL)中的混悬液中，冷冻干燥，得到3-[4-(2-环丙基-8-甲基-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并氧杂氮杂-4-基)哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙酸二盐酸盐(0.058g，100％)。MS(m/z)：440.2(M+H)。
文献数据(Morairty SR，Hedley L，Flores J，Martin R，Kilduff TS.(2008)选择性5-HT2A和5-HT6受体拮抗剂促进大鼠的睡眠(Selective 5-HT2A and 5-HT6 receptor antagonists promote sleep in rats).Sleep 31，34-44.；和Barbier，A.J.和Bradbury，M.J.，睡眠-醒觉循环的组胺能控制：睡眠和觉障碍的最近治疗进展(Histaminergic Control of Sleep-Wake Cycles：Recent Therapeutic Advances for Sleep and Wake Disorders)，CNS&Neurological Disorders-Drug Targets，vol 6，pg.31-43(2007))和非临床动物研究中产生的数据支持双重活性H1反向激动剂/5-HT2A拮抗剂在治疗失眠中和在对症治疗与其它障碍例如抑郁性疾病、焦虑性障碍、疼痛、变态反应、肺或气 道障碍、精神病学障碍、痴呆和/或神经变性疾病和/或昼夜节律睡眠障碍相关的失眠中的作用。特别地，使用EEG监测的啮齿类动物发现一些双重活性H1反向激动剂/5-HT2A拮抗剂有效地增加总睡眠时间，没有不成比例的或临床相关的活动减退、REM睡眠减少或嗜睡症。
为了进一步证实本发明的化合物的特点，可以使它们进行下面的体外和体内测定法：
体外结合和活性测定法：
H1竞争性结合测定法
在SPA(闪烁迫近测定法)96-孔格中进行[3H]-新安替根结合实验。本测定法中所用的膜是由稳定表达重组H1受体(人)的HEK-293细胞制备的。通过将WGA PVT SPA珠(1mg/孔，Perkin Elmer(MA，USA)RPNQ0001)和3μg膜的混合物添加到含有3.5nM[3H]-新安替根和不同浓度的测试化合物(10点浓度响应曲线)的测定缓冲液(67mM Tris；pH 7.6)中启动温育。在10μM曲普利啶的存在下测定非特异性结合。将样品在室温(22℃)下温育4hr，然后用Trilux读数。
5-HT2A竞争性结合测定法
在SPA 96-孔格中进行[3H]-酮色林结合实验。本测定法中所用的膜是由稳定表达重组5-HT2A受体(人)的AV-12细胞制备的。通过将WGA YSi SPA珠(1mg/孔，Perkin Elmer(MA，USA)，RPNQ0011)和2μg膜的混合物添加到含有3.1nM[3H]-酮色林和不同浓度的测试化合物(10点浓度响应曲线)的测定缓冲液(67mM Tris，0.5mM EDTA；pH 7.6)中启动温育。在20μM 1-(1-萘基)哌嗪的存在下测定非特异性结合。将样品在室温(22℃)下温育4hr，然后用Trilux读数。
5-HT2C竞争性结合测定法
在SPA 96-孔格中进行[125I]-(±)DOI结合实验。本测定法中所用的膜是 由稳定表达重组5-HT2C受体(人)的AV-12细胞制备的。通过将WGA PVT SPA珠(0.5mg/孔，Perkin Elmer(MA，USA)，RPNQ0001)和2.5μg膜的混合物添加到含有0.2nM[[125I]-(±)DOI和不同浓度的测试化合物(10点浓度响应曲线)的测定缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、0.5mM EDTA、10μM帕吉林、0.1％抗坏血酸，pH7.4)中启动温育。在20μM 1-(1-萘基)哌嗪的存在下测定非特异性结合。将样品在室温(22℃)下温育4hr，然后用Trilux读数。
结合数据分析
使用4-参数对数非线性方程评价曲线，得到导致放射性配体结合的50％抑制的竞争物浓度(IC50)。根据以下方程计算平衡解离常数(Ki)：Ki＝IC50/(1+L/Kd)，其中L等于实验中所用的放射性配体的浓度，Kd等于受体的放射性配体的平衡解离常数，其是根据标准饱和分析或同源竞争实验测定的。将报告的Ki值(其中显示n值)显示为几何平均值±平均值的标准误差(SEM)，其中用n表示重复测定的次数。几何平均值是根据方程GeoMean＝10^(平均值(log Ki 1+log Ki 2+...log Ki n)/sqrt n)计算的。
使用天然受体在初级神经元培养物中的GABAA拮抗作用
通过使用96孔格系统(Fluorometric Imaging Plate Reader(Molecular Devices)监测钙流量评价化合物对天然GABAA受体的活性。简言之，从E18大鼠胚胎中剖离出皮质胚胎神经元，以最佳密度放入黑色壁透明底聚-D-赖氨酸包被的96-孔板。给细胞加载钙敏感性染料(Fluo4-AM，Molecular Devices)后，将细胞浸入含有低氯离子的溶液(氯离子被葡糖酸根替代)。在这些条件下，GABAA受体的活化导致氯离子流出(以化学梯度的方向)，这导致膜去极化且随后导致电压门控钙通道(VGCC)活化。记录通过VGCC的钙流入量并且使用系统离线分析。为了对测定法进行药理学验证，对于标准激动剂(GABA)和标准拮抗剂(Gabazine)记录浓度响应曲线(CRC)。以CRC模式针对10μM的激动剂GABA固定浓度测定任意作用(等同于EC90GABA响应)。
方法：
使用10-点剂量响应曲线通过在存在或不存在化合物的情况下比较峰值荧光响应与激动剂GABA对化合物的拮抗作用进行定量。将测定窗定义为用GABA在其预定EC90浓度下获得的最大响应减去用gabazine完全抑制浓度(50μM)获得的响应。将拮抗作用计算为测定窗的百分比。使用4-参数对数曲线拟合程序(Prism3.01)将所有数据计算为相对IC50值。所有化合物的拮抗效能与gabazine比较，在每个测定运行中重复3次。
此外，可以在结合测定法和功能性活性测定法中通过公知的用于其它生理学重要受体的方法测试本发明的化合物，所述的其它生理学重要受体例如、但不限于hERG通道、其它血清素受体(特别是5-HT1B和5-HT1D受体，对5-HT2B受体、5-HT2C、5-HT5、5-HT6和5-HT7受体无激动剂活性)、多巴胺能受体(特别是D1、D2和D3)、GABAA受体、肾上腺素能受体和单胺转运蛋白。
基本如以上所述的那样测试了实施例2的化合物，发现其具有表1中所示的活性性质。
表1.选择性数据
 实施例2H1Ki(nM)43.25-HT2AKi(nM)10.25-HT2B Ki(nM)1185-HT2B激动剂EC50(nM)＞100005-HT2B拮抗剂Kb(nM)93.45-HT2CKi(nM)493GABAA IC50(μM)＞100hERG通道(μM)在10μM下53％抑制多巴胺D1Ki(nM)996多巴胺D2Ki(nM)2320多巴胺D3Ki(nM)＞6280
5-HT1D Ki(nM)＞39805-HT5Ki(nM)34805-HT6Ki(nM)＞58305-HT7Ki(nM)＞2060肾上腺素能α1A Ki(nM)4620肾上腺素能α1B Ki(nM)＞15500肾上腺素能α2A Ki(nM)5920肾上腺素能α2B Ki(nM)1060肾上腺素能α2C Ki(nM)1380血清素转运蛋白Ki(nM)＞478去甲肾上腺素转运Ki(nM)＞671多巴胺转运蛋白Ki(nM)＞867
因此，预计本发明的化合物的生理学相关剂量在体内提供对H1和5-HT2A受体的基本抑制，同时基本上不与其它生理学相关受体发生相互作用，由此预计其提供所需的药理作用，同时避免与脱靶活性相关的不希望的作用。这类不希望的作用包括、但不限于下列作用：与治疗中突然出现的体重增长相关的5-HT2C拮抗剂活性、与心瓣膜病相关的5-HT2B激动剂活性、与QT延长相关的hERG通道调节以及与癫痫发作活动相关的GABAA拮抗剂活性。此外，通过超过多巴胺受体、其它血清素受体、肾上腺素能受体和单胺转运蛋白的选择性避免了对睡眠/醒觉生理学的干扰。
5-HT2A受体占位：测定受体占位(RO)以证实在体内对5-HT2A受体的拮抗剂/反向激动剂活性。简言之，使重约230-280克的雄性Sprague-Dawley大鼠rHarlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)自由取食和饮水，直到3-hr实验方案开始。将1mg/kg酮色林(非选择性5-HT2A拮抗剂)用作阳性对照以建立测定法可靠性。通过口腔管饲施用在包含20％羟丙基β-环糊精的媒介物中的测试化合物或对照。将MDL 100907((R)-(+)-α-(2，3-二甲氧基苯基)-1-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-哌啶甲醇)(一种选择性5-HT2A拮抗剂)用作示踪物。将MDL 100907混悬于含有5μl稀乳酸的水中(1mg/ml)，用盐水稀释 至6μg/ml，通过侧尾静脉静脉内施用1mL/kg体积，得到3μg/kg示踪物剂量。给大鼠施用测试化合物、酮色林或媒介物(N＝4)，1hr后，静脉内施用3μg/kg MDL 100907示踪物剂量。在施用示踪物时，将RO视为被测定。示踪物施用后15min，通过脱颈椎处死大鼠。采集血浆样品，取出额皮质和小脑样品。测定每一皮质和小脑样品中的MDL 100907示踪物水平。使用充分建立的比例方法计算RO，该方法使用具有或不具有极低水平受体(小脑)情况下用面积归一化的的代表总结合(额皮质)的高受体密度区域。该区域(被称为空区域)代表了配体探针的非特异性结合。相对于小脑的皮质中的示踪物水平的媒介物比例代表0％占位。比值1代表100％占位，当MDL 100907示踪物与5-HT2A受体的所有特异性结合被阻断时实现。在媒介物处理的动物的示踪物水平比值(0％占位)与比值1(100％占位)之间线性内插测试化合物预处理组的皮质与小脑示踪物的中间比，以测定5-HT2A RO百分比。
MDL 100907分析：将皮质和小脑样品称重，放入冰上的圆锥形离心管中。向每个管中加入4体积(w/v)的含有0.1％甲酸的乙腈。然后匀化样品，以14,000RPM(21，920xg)离心16min。通过在HPLC进样小瓶中添加100-900μL无菌水稀释上清液，用于LC/MS/MS分析。使用Agilent型1200HPLC(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)和API 4000质谱仪对MDL 100907进行分析。色谱分离是在2.1X 50mm C18柱(Agilent部件编号971700-907)上进行的，流动相由具有共计0.1％甲酸含量的60％乙腈的水溶液组成。通过监测具有374.2至123.0的质荷比(m/z)的前体至产物离子转变来实现MDL 100907的检测。通过将已知量的分析物添加到来自未处理大鼠的脑组织样品中并且如上所述处理来制备标准品。
统计学方法：使用8.0版(SAS Institute Inc，Cary NC)将每次研究的曲线拟合至具有固定在0％的底的4参数对数函数，用软件计算绝对ED50。值以平均值、标准误差和95％置信区间给出。基本如所述的那样测试了实施例2的化合物，发现实现了高5-HT2A受体占位，ED50为0.41mg/kg。
DOI诱导的摇头活动的抑制：通过其阻断由5-HT2A受体激动剂2，5- 二甲氧基-4-碘苯丙胺(DOI)诱导的摇头活动的能力进一步证实了本发明的化合物的体内5-HT2A受体拮抗剂活性。(参见例如Bartoszyk GD，van Amsterdam C，H，Seyfried CA.EMD 281014，a new selective serotonin 5-HT2A receptor antagonist.Eur J Pharmac0l.2003 473：229-230.)简言之，使雄性C57BL/6J小鼠(20-25g，Charles River)居住在标准居住条件下(32只小鼠在一个大IVC笼中，07.00至19.00光照期，恒定温度(19-23℃)和湿度(50％+/-10)，自由取食和饮水)。小鼠接受媒介物(0.25％甲基纤维素)、DOI(在盐水中3mg/kg)或口服10mg/kg测试化合物+DOI(在盐水中3mg/kg)。对于每种化合物在n＝4的每次实验4只的组中分别评价测试化合物，以及媒介物和DOI+媒介物(n＝8)。在测试化合物预处理60min时间后，小鼠接受皮下给药的媒介物(盐水)或3mg/kg DOI，然后将它们放入透明的聚甲基丙烯酸甲酯观察室内。DOI或媒介物施用后5min，将每只小鼠表现出的视觉评分的摇头次数计数15min。使用ANOVA和post-hoc Dunnet检验分析数据。基本如所述的那样测试了实施例2的化合物，发现它在10mg/kg下100％抑制3mg/kg DOI产生DOI诱发的的摇头响应。
大鼠的睡眠和行为监测：在大鼠中测试本发明的化合物增加睡眠的量或减少睡眠中断或这二者、而没有不希望的作用例如抑制REM睡眠、清醒动力受损(waking motor impairment)和/或反跳性失眠的能力。通过脑电图(EEG)、肌电图(EMG)和运动连续监测测试动物以测定累积非REM睡眠、累积总睡眠、平均睡眠发作期(average sleep bout duration)、最长睡眠发作期(longest sleep bout duration)、反跳性失眠、REM睡眠抑制和不眠(wakefulness)期间的运动行为强度。用于这类研究的方法是本领域公知的(参见例如下列文献中所述的方法：Edgar DM，Seidel WF.莫达非尼在大鼠中在不加强动力活动或随后的反跳性嗜睡症的同时诱导不眠(Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat).J Pharmacology&Experimental Therapeutics 1997；283：757-769；van Gelder RN，Edgar DM，Dement WC.实时自动化睡眠评分：针对小鼠的基于微电脑的系统验证(Real-time  automated sleep scoring：validation of a microcomputer-based system for mice).Sleep 1991，14：48-55；和Gross BA，Walsh CM，Turakhia AA，Booth V，Mashour GA，Poe GR.在大鼠中使用电生理学记录的开放来源逻辑自动化睡眠评分(Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats).JNeurosci Methods.2009；184(1)：10-8.)研究如下进行：
动物准备.如下通过手术方式使成年雄性Wistar大鼠(手术时约270-300g)适合用于长期记录EEG、EMG和运动：使用用于EEG记录的由4个不锈钢螺钉(2个位于前额[前卤点前3.9mm，中间外侧±2.0mm]和2个位于枕骨[前卤点后6.4mm，中间外侧±5.5mm])组成的颅内植入物和用于EMG记录的2个特氟隆包被的不锈钢丝(位于颈背棱形骨肌肉下)对大鼠进行手术准备。将所有导联(lead)焊接在微型连接器(Microtech，Boothwyn，PA)上，然后进行手术。通过不锈钢EEG记录螺钉、应用在植入物连接器与颅骨之间的氰基丙烯酸酯和牙科丙烯酸树脂的组合将植入物装配物附着在颅骨上。通过手术置于腹部的微型传感器(Minimitter PDT4000G，Philips Respironics，Bend，OR)监测运动行为。允许恢复至少3周。
记录环境.使每只大鼠分别居住在微型隔离(microisolator)笼中，其用插入的聚碳酸酯过滤器-顶部竖板(riser)改良，以使得有更多的垂直顶部空间。连接最小程度地限制运动的软电线，一端连接至附着在笼顶部的转换器上，另一端连接至动物颅内植入物上。每个笼子位于不锈钢的睡眠-醒觉记录室的单独的通风的隔室内。可自由取食和饮水，环境温度维持在约23±1℃。在整个研究中使用荧光灯维持24-hr光照-黑暗循环(LD 12∶12)。相对湿度平均值为约50％。在每次处理之前和之后使动物不被惊扰达至少30hrs。
研究设计和给药.将媒介物(安慰剂，甲基纤维素15厘泊0.25％的水溶液)或测试化合物剂量水平之一以1mL/kg假随机方式口服施用，使得无大鼠接受相同处理2次，在任意一个研究中都没有大鼠接受8次处理中的超过2次处理。将每只大鼠从其笼中取出，以进行约1分钟称重和处理。 先进行至少6天“洗脱”期，然后进行每次处理。
数据采集.睡眠和不眠辨别可以自动化(例如Van Gelder等人1991(上文)；Edgar等人1997(上文)；Winrow CJ，等人，Neuropharmacology2010；58(1)：185-94；和Gross等人，2009(上文)。EEG被放大并过滤(X10,000，通带1-30Hz)，EMG被放大并整合(通带10-100Hz，RMS整合)，同时监测非特异性运动活动(LMA)。在10秒期限内将觉醒状态分类为非-REM睡眠、REM睡眠、不眠或θ-支配的不眠(theta-dominated wakefulness)。将运动活动(LMA)记录为每分钟计数并且通过商业可获得的遥测接收器(ER4000，Minimitter，Bend，OR)检测。
统计学分析.总结结果中包括具有至少一种结果的所有动物(例如，我们包括来自对其使用遥测的动物处理的适合数据，但不是EEG数据)。将处理后观察期分入适宜于每一结果的给药后间隔，其中给药时间被定义为小时＝0开始，通过计算每小时平均值或经过每个期的累积值在观察期中总结结果(参见表2针对精确定义每个结果的说明)。用对数标尺分析睡眠发作(sleep bout)以稳定变化，用线性标尺分析所有其它变量。通过使用处理组和处理日期作为因子和24hr前相应的预处理间隔作为协变量分析协方差来分析每个期中的每个结果。对每个处理组概括调整的平均值(Adjusted mean)和来自媒介物平均值的变化及其相应的标准误差。将用对数标尺分析的结果反转换以报告几何平均值和与媒介物结果的平均比值。
基本如所述的那样测试了实施例2的化合物。发现实施例2的化合物在3mg/kg下显著地增加累积NREM睡眠时间和累积的总睡眠时间，没有显著的反跳性失眠、REM睡眠抑制或运动活动强度(LMI)的抑制。(参见表2中的睡眠情况和运动活动强度)。

最长睡眠发作

表2.结果统计学：缩写：N＝样品大小；调整的平均值＝相对于媒介物对照的调整的组平均值；SE＝平均值的标准误差；LCL＝95％置信下限；NREM＝非-REM，即，非REM睡眠的所有睡眠。平行参比媒介物组样品大小为N＝27。
定义和单位-意指调整的与媒介物对照的差异：
●累积睡眠：跨越第一个6hr处理后，以分钟计(‘总睡眠’表示NREM睡眠+REM睡眠)。
●平均睡眠发作：每小时平均睡眠发作的平均值，跨越第一个6hr处理后，表示为比媒介物对照增加n-倍。
●最长睡眠发作：第一个6hr处理后的最长睡眠发作，表示为比媒介物对照增加n-倍。
●反跳性失眠：第一个3hr光照期过程中、即第7、第8和第9小时处理后NREM+REM睡眠的累积分钟数。
●REM抑制：第一个12hr处理后过程中REM睡眠的累积分钟数。
●运动活动(LMA)强度：表示为跨越第一个6hr处理后平均的EEG-确定的不眠的每分钟LMA计数。
测定效能.通过将处理后6hr时间过程中相对于媒介物对照的每个变量的增加值对log(剂量)绘图计算4个效能变量的阈值效能。每个变量的 阈值效能是通过4参数对数非线性回归估算的剂量，其给出了确定的效能阈值；+30min另外累积的非-REM睡眠、+25min另外累积的总睡眠、1.75x平均睡眠发作期的增加和1.5x最长睡眠发作期的增加。将最终值用游离碱浓度表示。发现实施例2的化合物具有表3中所示的阈值有效剂量。

＊n.e.＝不可进行统计学评估，＊＊插入

剂量(mg/kg)
反跳性失眠

剂量(mg/kg)

测定不希望的作用.将每中‘不希望的作用’结果变量(参见表2针对定义的说明)对log(剂量)绘图。REM睡眠抑制的阈值被定义为-10min的REM睡眠飞累积减少。反跳性失眠的阈值被定义为-20min。减少的LMI的阈值被定义为EEG-确定的不眠的-5运动活动计数/分钟。当置信下限在任意剂量下低于阈值或低于平均有效剂量10倍时，确定显著的不希望的作用发生，剂量响应趋势对于高于阈值有效剂量的剂量而言是明显的。对于实施例2的化合物，REM睡眠抑制在10mg/kg下超过阈值，但是该剂量是0.78mg/kg的最保守有效剂量的超过10倍(表3)。负值表示REM抑制、反跳性失眠和减少的LMI。在上面的图中，星号表示对于给定剂量而言相对于媒介物的统计学显著性，但不必然表示不希望的作用。因此，得出结论，在最保守有效剂量范围10倍内未观察到不希望的REM抑制、反跳性失眠或LMI减少。
血浆清除率：在用于治疗睡眠障碍例如失眠的化合物中重要的是，以有利的清除率从体内充分清除该化合物，以避免不需要的副作用，例如超出所需睡眠期的延长的嗜睡、日间睡意、清醒后认知受损等。本发明提供了具有改善的清除率的化合物。清除率可以基本如下面所述的那样测定。
具有内在股动脉插管的雄性Sprague Dawley大鼠(体重范围250-320g)得自Charles River，Wilmington，MA01887，USA。以(1mL/kg)在20％的22.5mM磷酸盐缓冲液pH 2溶液中的溶液形式(最终药物浓度为1.0mg/mL(游离碱当量))静脉内施用测试化合物。使用内在插套历经24hr获得血样。通过离心得到血浆样品，冷冻储存(-20℃)或在干冰上储存，然后分析。
雄性比格犬(体重范围10-12kg)得自Marshall Bioresources，USA。以(1mL/kg)在20％的22.5mM磷酸盐缓冲液pH 2溶液中的溶液形式(最终药物浓度为1.0mg/mL(游离碱当量))静脉内施用测试化合物。血样历经24hr得自颈静脉。通过离心得到血浆样品，冷冻储存(-20℃)，然后分析。
将冷冻的血浆样品融化至室温，用于进行测试化合物的浓度的生物分析。将在乙腈/甲醇(1∶1，v/v)中的相关内标化合物加入到所有血浆样品中 (1∶1，v/v)。离心样品以除去沉淀的蛋白质，然后分析。通过进样并且用Javelin Betasil C18柱(20x2.1mm柱，流动相A：水/1M NH4HCO3，2000∶10v/v，流动相B：MeOH/1M NH4HCO3，2000∶10v/v)快速梯度洗脱分析上清液。通过LC-MS-MS分析、使用Sciex API 4000三联四极质谱仪检测洗脱的分析物。由所制备的标准品测定化合物浓度并且在相同条件下分析。使用Watson 7.4，Thermo Fisher Scientific，Inc的非隔室分析计算清除率。

基本如所述的那样允许了实施例2的化合物，发现其具有有利的清除特性：
实施例  清除率(mL/min./Kg)
        犬
2       6.06(+/-0.90)
尽管如在本发明的方法中使用的那样不使用任何制剂直接施用本发明的化合物是可能的，但是通常将化合物以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包含作为活性成分的所述化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。这些组合物可以通过各种途径施用，包括口服、舌下、鼻、皮下、静脉内和肌内。这类药物组合物和制备它们的方法是本领域公知的。参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(University of the Sciences in Philadelphia，ed.，第21版，Lippincott Williams&Wilkins Co.，2005)。
优选将组合物配制成单位剂型，每个剂量含有约0.1-约60mg、更通常约0.5-约30mg、例如约1-约10mg活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为单元剂量用于人个体和其它哺乳动物的物理分散单位，每个单位含有经计算产生所需的治疗作用的既定量的活性物质以及至少一种适合的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
概括而言，式I的化合物在宽剂量范围内有效。例如，每天的剂量通 常在约0.002-约1.0mg/kg体重范围内，更通常为约0.008-0.5mg/kg体重，例如0.015-0.15mg/kg体重。在一些情况中，低于上述范围下限的剂量水平可能远远足够了，而在另一些情况中，也可以使用更大剂量而不导致任何有害的副作用，因此上述剂量范围不用于以任何方式限定本发明的范围。应当理解的是，实际施用的化合物的量由临床医师根据相关情况确定，所述相关情况包括所治疗的病症、选择的施用途经、所施用的实际的一种或多种化合物、各患者的年龄、体重和响应以及患者症状的严重性。