说明书一种芳香基-杂环取代的嘧啶二胺类化合物及其衍生物及其医药用途
技术领域
本发明涉及一类新型芳香基-杂环取代的嘧啶二胺类化合物及其类似物、合成方法及其医药用途。该类化合物或含有该类化合物的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，用于各种恶性肿瘤，包括各类肿瘤转移和复发等相关疾病的治疗。本发明还涉及该类化合物的制备方法。
技术背景
双取代二氨基嘧啶化合物在肿瘤的治疗中发挥着重要的作用。2006年上市的达沙替尼(Dasatinib)通过靶向BCR-Abl融合蛋白治疗伊马替尼耐药的慢性髓细胞白血病；2009年上市的帕唑帕尼(Pazopanib)通过靶向VEGFR治疗晚期肾细胞癌；2014年上市的色瑞替尼(Ceritinib)通过靶向EML4-ALK融合蛋白治疗克唑替尼耐药的非小细胞肺癌；2014年获得FDA突破性疗法资格的CO-1686通过靶向EGFRT790M治疗吉非替尼和埃罗替尼耐药的非小细胞肺癌，这些小分子药物都含有二氨基嘧啶这个药物化学意义上的优势结构。
通过分析发现这些小分子主要通过靶向络氨酸激酶而发挥抗肿瘤作用，而且通过文献检索也发现越来越多的临床中和临床前研究的络氨酸激酶抑制剂都含有二氨基嘧啶这个优势结构。例如，NVP-BGJ398通过靶向FGFR用来治疗针对FGFR扩增的肿瘤(NCT02160041)；AZD1480通过靶向JAK用来治疗晚期实体瘤(NCT01219543)、PF-00562271通过靶向FAK用来治疗胰腺癌、头颈癌和前列腺癌(NCT00666926)；R460通过靶向Syk用来治疗慢性淋巴细胞白血病(Quiroga MP,et al.Blood,2009,114(5),1029-1037)。当然还有更多的处于临床前的二氨基嘧啶化合物通过靶向络氨酸激酶用来治疗肿瘤的发生、发展、转移、复发和耐药。
二氨基嘧啶衍生物不仅作为络氨酸激酶抑制剂在制备抗肿瘤药物中取得重大成功，而且越来越多的二氨基嘧啶衍生物也在靶向其他靶点用于新型抗肿瘤药物的制备研究中取得了很大进步。例如，BKM120通过靶向PI3K用来治疗转移性或局部晚期宫颈癌(NCT01613677)；BX-912通过靶向PDK-1能够显著抑制多种肿瘤细胞的生长和诱导凋亡(Feldman RI,et al.J Biol Chem.2005,280(20),19867-19874)；NSC23766通过靶向Rac能够抑制肺癌细胞PC-9细胞的增殖和锚定非依赖性生长(Gao Y,et al.Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(20),7618-7623)；Aurora A Inhibitor I通过靶向Aurora有效抑制结肠癌细胞HCT116细胞增殖(Aliagas-Martin I,et al.J Med Chem,2009,52(10),3300-3307)。
在本件申请研究人员前期的研究中也发现，芳香基噻唑类化合物及其类似物也具有很好的抗肿瘤活性，本发明通过结合两部分的优势结构，创造性地设计并合成了一类新型芳香基-杂环取代的二氨基嘧啶类化合物及其类似物，通过对化合物结构改造得到的此类结构更为特异的双取代嘧啶二胺类化合物，生物实验结果也表明此类化合物具有优异的抗肿瘤活性，包括在体内外都具有优异的抗肿瘤生长活性，同时具有优异的抗肿瘤细胞迁移活性。另外，此类化合物也具有很好的理化性质，这些在药效和理化性质的改善都能够增加此类化合物的成药性。与抑制正常细胞活性相比，本发明化合物对肿瘤细胞抑制活性更加特异，这种新颖的化学结构将来可望发展成为一类肿瘤治疗的候选药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新型芳香基-杂环取代的嘧啶二胺类化合物及相关类似物可作为抗肿瘤候选化合物，包括其可用盐、以及酯等。
本发明的另一目的在于提供此类芳香基-杂环取代的嘧啶二胺类化合物及相关类似物及药学上可接受的盐或含有上述化合物的药物组合物在制备治疗各种恶性肿瘤，特别是肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、卵巢癌、膀胱癌、肾癌以及口腔癌等疾病以及相关的癌症转移和复发过程中的药物中的应用。
本发明还提供一种芳香基噻唑取代的嘧啶胺类化合物或药学上可接受的盐，由下述结构式(I)表示：
其中：
X为CH或N；
Y为O或S；
R1和R2选自下列基团中的一个：氢、C1-C5烷基、苯基、苄基、或呋喃甲基；另外，R1和R2不同时为氢；
R3选自下列基团中的一个：氢、苄氧基、苯乙氧基、苯丙氧基、卤素、或苄氨基；
R4为氢或甲基。
本发明还提供一种嘧啶胺类化合物或药学上可接受的盐，是所述嘧啶胺类化合物与酸形成的酸加成盐；其中，所述酸是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乳酸、丙酮酸、马来酸、或琥珀酸。
本发明还提供一种芳香基噻唑取代的嘧啶胺类化合物或药学上可接受的盐，是所述嘧啶胺类化合物与放射性基团、荧光基团或者生物素结合形成标记物。
本发明提供嘧啶胺类化合物或药学上可接受的盐，包括：
N2-异丁基-N4-((2-(3-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(2-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((4-甲基-2-(4-(苯乙氧基)苯基)-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氨基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-(3-苯丙氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-氟苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(2-氯苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-氯苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2,N2-二丙基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2,N2-二乙基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-((2-呋喃基)甲基)-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-正丁基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-正戊基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-苄基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-苯基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噁唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-呋喃基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-正丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-呋喃基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、
N2-异丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-噻吩基)甲基)-2,4-嘧啶二胺、以及
N2-正丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-噻吩基)甲基)-2,4-嘧啶二胺。
本发明提供一种药物组合物，其中含有本发明所述的嘧啶二胺类化合物及相关类似物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。本发明所述药物组合物被配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。
本发明还提供所述的嘧啶胺类化合物及相关类似物物或药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提出了所述的嘧啶胺类化合物、其水合物或其药学上可接受的盐在抑 制肿瘤细胞增殖、生长、迁移和浸润的应用；其中，所述肿瘤细胞包括肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞。
本发明还提出了所述的嘧啶胺类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用；其中，所述恶性肿瘤包括肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞。
本发明还提出了所述的嘧啶胺类化合物或其水合物或药学上可接受的盐在制备治疗恶性肿瘤转移与复发的药物中的应用；其中，所述恶性肿瘤包括肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞。
本发明中，嘧啶胺类化合物或其药学上可接受的盐可以单独使用或与其他药物联合使用。
附图说明
图1所示为本发明化合物在不同浓度下对不同种类乳腺癌细胞或正常乳腺上皮细胞增殖抑制的效果图。
图2所示为本发明化合物浓度依赖性地抑制结肠癌细胞增殖效果统计图，其中图2(a)为本发明化合物抑制HCT116的效果统计图，图2(b)为本发明化合物抑制HT29的效果统计图。
图3所示为本发明化合物浓度依赖性地抑制肺癌细胞增殖效果统计图，其中图3(a)为本发明化合物抑制A549的效果统计图，图3(b)为本发明化合物抑制PC-9的效果统计图。
图4所示为本发明化合物与紫杉醇在不同浓度下对人源或者鼠源乳腺癌细胞以及正常乳腺上皮细胞抑制增殖抑制效果统计图。其中图4(a)为本发明化合物和紫杉醇抑制人源的乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖效果统计图，图4(b)为本发明化合物和紫杉醇抑制人源的乳腺癌细胞MCF7增殖效果统计图，图4(c)为本发明化合物和紫杉醇抑制属源的乳腺癌细胞4T1增殖效果统计图，图4(d)为本发明化合和紫杉醇物抑制正常乳腺上皮细胞MCF10A的效果统计图。
图5所示为本发明化合物在不同浓度下对人乳腺癌细胞(MCF7和T47D)和鼠源乳腺癌细胞(4T1)克隆形成能力影响的效果图。
图6所示为本发明化合物对人源乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和鼠源乳腺癌细胞4T1横向迁移抑制率的影响图。其中，图6(a)为本发明化合物对人源乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移效果形态图，图6(b)为本发明化合物不同浓度下对人源乳腺癌细胞MDA-MB-231 的迁移效果统计图。图6(c)为本发明化合物对鼠源乳腺癌细胞4T1的迁移效果形态图，图6(d)为本发明化合物不同浓度下对鼠源乳腺癌细胞4T1的迁移效果统计图，以对照组(药物浓度为零时)迁移细胞数为100％，其余各组与对照组比较，确定其相对迁移率。
图7所示为本发明化合物对人源乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和鼠源乳腺癌细胞4T1侵袭抑制率的影响图。其中，图7(a)为本发明化合物对人源乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭效果形态图，图7(b)为本发明化合物不同浓度下对人源乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭效果统计图。图7(c)为本发明化合物对鼠源乳腺癌细胞4T1的侵袭效果形态图，图7(d)为本发明化合物不同浓度下对鼠源乳腺癌细胞4T1的侵袭效果统计图，以对照组(药物浓度为零时)侵袭细胞数为100％，其余各组与对照组比较，确定其相对侵袭率。
图8所示为本发明化合物抑制4T1原位肿瘤的生长结果图。其中，图8(a)为本发明化合物抑制乳腺癌生长后剥离的小鼠实体肿瘤大小情况，图8(b)为给予本发明化合物不同天数后小鼠肿瘤体积变化统计结果图，图8(c)为给予本发明化合物不同天数后小鼠体重变化图。
图9所示为本发明化合物抑制4T1原位肿瘤的生长和转移结果图。其中，图9(a)为本发明化合物抑制乳腺癌生长的IVIS活体成像系统拍照结果图，颜色深浅表明肿瘤细胞聚集的多少；图9(b)为给予本发明化合物后肿瘤肺部转移图，图9(c)为给予本发明化合物后肿瘤肺部结节数统计结果图，图9(d)为给予本发明化合物后肿瘤肺部转移率统计表。
图10所示为本发明化合物抑制MDA-MB-231原位肿瘤生长结果图。其中，图10(a)为本发明化合物抑制乳腺癌生长的小鼠肿瘤体积变化图，图10(b)为给予本发明化合物或者紫杉醇25天后小鼠肿瘤重量相对于对照的统计图。
图11所示为本发明化合物抑制乳腺癌尾静脉(MDA-MB-231肿瘤)的实验性转移结果图。其中，图11(a)为本发明化合物抑制乳腺癌肺转移的IVIS活体成像系统拍照结果，颜色深浅表明肿瘤细胞聚集的多少。图11(b)为IVIS活体成像系统拍照结果的统计图。
图12所示为本发明化合物在自发性转移的疾病动物模型中抑制肿瘤的转移和复发结果图。图12(a)为IVIS活体成像系统拍照图，图12(b)和12(c)分别为小鼠原位复发和远端转移复发情况统计图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
1H-NMR用Varian MercuryAMX300型仪测定；MS用VG ZAB-HS或VG-7070型仪测定， 除注明外均为EI源(70ev)；所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得；除说明外，所有反应均是在氩气保护下进行并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥过程；产品的纯化除说明外均使用硅胶(200-300目)的柱色谱法；所使用的硅胶，包括200-300目和GF254为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。
实施例一：各化合物的制备
实施例1-01、化合物N2-异丁基-N4-((2-(3-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺的制备(ZH001)
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺按照参考文献(Sierra M.L.et.al.J.Med.Chem.2007,685-695.)制备2-(3-(苄氧基)苯基)-5-(溴乙基)-4-甲基噻唑；然后将2-(3-(苄氧基)苯基)-5-(溴乙基)-4-甲基噻唑按参考文献(Wurdak H.et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2010,16542-16547.)制备化合物(2-(3-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基胺；将(2-(3-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基胺(190mg,0.61mmol)与化合物2,4-二氯嘧啶(296mg,2mmol)溶解于10ml乙醇溶液，加热至40摄氏度搅拌10小时，反应后的混合物经减压蒸馏除去乙醇，用二氯甲烷和水萃取两次，有机相经饱和食盐水洗涤用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得到粗产物，经硅胶柱层析纯化得化合物N-((2-(3-(苄氧基)苯基-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2-氯嘧啶-4-胺；将N-((2-(3-(苄氧基)苯基-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2-氯嘧啶-4-胺与异丁胺(1ml)混合，溶解于10ml异丁醇，加热至120摄氏度回流，反应进行10小时后，将得到的混合物减压蒸馏蒸去异丁醇，用二氯甲烷和水萃取两次，有机相经饱和食盐水洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得到粗产物，经硅胶柱层析纯化得到化合物N2-异丁基-N4-((2-(3-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.34-8.31(m,1H),7.55-7.27(m,8H),7.03-7.00(m,1H),5.73(d,J＝6.0Hz,1H),5.13(s,2H),4.69(d,J＝5.4Hz,2H),3.25(t,J＝6.3Hz,2H),2.49(s,3H),1.94-1.85(m,1H),0.98(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-01到1-23、表1所示为化合物ZH001到ZH023的制备方法
实施例二：本发明化合物对肿瘤细胞生长的抑制实验
实施例2-1、MTS法测定细胞增殖
采用MTS法测定本发明物对不同种类肿瘤细胞增殖的影响。方法如下：将细胞以5×103个/孔密度接至96孔板(Corning)中，常规培养24h使细胞贴壁后，依次加入不同浓度本发明化合物，使其终浓度分别为1.0nM，100nM，500nM，1.0μM，5.0μM，10.0μM，20.0μM，50.0μM，对照组加入等量的DMSO(每组设3个复孔)。继续常规培养48h后，每孔 加入四甲基偶氮唑盐溶液20μL，37℃ 5％CO2培养箱中孵育2小时左右。将96孔板置于酶标仪(SPECTRA MAX 190)中，在490nm波长下测定其OD值。统计分析药物对于细胞存活率的影响。结果如图1-4所示，其中：
(A)本发明化合物在不同浓度下对多种乳腺癌细胞增殖抑制的效果图，见图1，可见本发明化合物浓度依赖性地抑制人源乳腺癌细胞增殖及对正常乳腺上皮细胞增殖无显著影响。与对照组相比，加入不同浓度的本发明化合物ZH001-023后，乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF7、BT549、Bcap37和T47D)增殖能力受到显著抑制，对乳腺癌细胞的半数有效抑制浓度(IC50)分别在1-5μM左右，并呈明显的剂量依赖关系。而且，本发明化合物对正常的乳腺上皮细胞MCF10A的毒性作用较小，半数有效抑制浓度大于20μM以上，说明本发明化合物在乳腺癌细胞和乳腺正常上皮细胞之间还具有较好的选择性。
(B)本发明化合物在不同浓度下对结肠癌细胞具有强烈的抑制效果，如图2所示，可见本发明化合物浓度依赖性地抑制结肠癌细胞增殖。在所测试的结肠癌细胞(HCT116和HT29等)上，本发明化合物ZH001-023剂量依赖性地抑制了这些癌细胞的增殖，说明本发明化合物对结肠癌细胞也具有明显的抑制作用。
(C)本发明化合物在不同浓度下对肺癌细胞具有强烈的抑制效果，如图3所示，可见本发明化合物浓度依赖性地抑制肺癌细胞增殖。在所测试的肺癌细胞(A549和PC-9等)上，本发明化合物ZH001-023剂量依赖性地抑制了这些癌细胞的增殖，说明本发明化合物对肺癌细胞同样具有明显的抑制作用。
(D)本发明化合物与紫杉醇在不同浓度下对乳腺癌细胞及正常细胞增殖抑制效果统计，见图4。本发明化合物在低浓度下(<5μM时)，紫杉醇对三株乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF7和4T1)的增殖抑制活性优于本发明化合物，但当本发明化合物浓度大于5μM时，本发明化合物对这三株乳腺癌细胞的抑制活性优于同浓度的紫杉醇抑制活性。更为重要的是，本发明化合物对正常乳腺上皮细胞的毒性明显小于紫杉醇。这些结果初步说明本发明化合物更选择性地抑制了肿瘤细胞的增殖。
另外，将本发明化合物对前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞等多种肿瘤细胞进行增殖抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例2-2、本发明化合物对肿瘤细胞克隆形成的抑制效果。
实体瘤是由肿瘤细胞通过增殖形成的。克隆形成法(colony formation)检测肿瘤细胞体外形成克隆的增殖和成瘤能力。在体外实验时，可以根据肿瘤细胞的克隆形成能力来反映其在体内生成实体瘤能力的强弱。因此可在体外利用克隆形成实验测试本发明化合物对肿瘤细 胞的克隆形成能力的影响，来评价化合物的抗癌效果。
方法如下：将乳腺癌细胞MCF7、T47D和4T1以3×103个/皿的密度接种于六孔板中，培养24h后分组，设副孔4个，分别加入不同浓度的待测化合物ZH001-023，使其终浓度分别为1.0μM和2.5μM，对照组加入等量的DMSO。继续培养，每两天更换一次培养基和相应浓度化合物。7天后，弃去培养基，PBS洗3遍，4％多聚甲醛室温固定10min，2‰结晶紫染色5min，自来水冲洗。显微镜下拍照，计算细胞克隆形成数量。实验结果如图5所示，可见本发明化合物对乳腺癌细胞克隆形成具有明显抑制作用。化合物在1.0μM浓度作用下对这两株肺癌细胞的克隆能力有明显的抑制，在2.5μM浓度下完全抑制这三株乳腺癌细胞的克隆形成，从另外一个角度说明此类化合物具有很强的抑制肿瘤生长的作用。
另外，将本发明化合物对肺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞等多种肿瘤细胞进行克隆形成抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例三：本发明化合物对肿瘤细胞迁移的抑制实验
实施例3-1、本发明化合物对肿瘤细胞横向迁移的抑制效果
通过划痕法(wound healing)检测对肿瘤细胞迁移能力的抑制
细胞在体外培养时会沿培养平面向细胞较少处运动。因此，可以在已经长满细胞的培养皿中人为“划”出一条“伤痕”，则“伤痕”左右两侧的细胞会向“伤痕”区域运动，最终重新迁移至该区域，即所谓的“伤痕愈合”。根据运动至“伤痕”区域的细胞数量及“伤痕愈合”程度，即可判断细胞的运动能力。
方法如下：将一定数量的肿瘤细胞接种至6孔板，细胞在37℃5％CO2培养箱中培养24h，至细胞长至80％左右。在长满细胞的孔中，用10μL的灭菌tip沿培养孔直径纵向划痕，划痕后用PBS洗两次，将划去的细胞洗净，然后分别向细胞培养孔中加入2mL含不同浓度的本发明化合物ZH001-023的培养基，将培养板放入培养箱，继续常规培养12h左右，直至对照组划痕区长满细胞。显微镜下观察细胞向划线部分运动的情况，拍照。统计分析不同剂量药物组迁移进入划线区域的细胞数量，确定药物对细胞迁移能力的影响。与此同时，用MTS法(如前文所述)检测相应细胞在相应浓度药物作用12h的增殖情况，以确定wound healing实验是否受细胞增殖影响。
结果如图6所示，可见本发明化合物剂量依赖性地抑制人源乳腺癌细胞MDA-MB-231和鼠源乳腺癌细胞4T1的迁移。其中，图6(a)为本发明化合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移抑制的效果图，图6(c)为本发明化合物对乳腺癌细胞4T1迁移抑制效果图，图6(b)、(d)分别是图6(a)、(c)统计结果。与对照组相比，在乳腺癌癌细胞MDA-MB-231和4T1 的细胞划痕迁移实验模型中，本发明化合物ZH001-023对MDA-MB-231和4T1的迁移抑制的半数有效抑制浓度IC50在1～2.5μM和0.1～0.5μM之间，说明本发明化合物浓度依赖性地抑制了乳腺癌细胞的横向迁移。
另外，将本发明化合物对肺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞等多种肿瘤细胞进行横向迁移抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例3-2、Transwell法检测本发明物对细胞浸润的影响
Transwell迁移实验采用Boyden小室检测细胞浸润情况。Transwell小室底部所铺的透水聚碳酸酯薄膜上有大量直径8μm的微孔。实验时，将Transwell小室放入24孔板中，聚碳酸酯薄膜将整个孔分为上、下两室，Transwell小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛有上层培养液，下室内盛有下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，Transwell小室上室预先铺一层胶原基质Matrigel，再将细胞接种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的血清可以诱导到上室内的细胞向下迁移，使得从薄膜的上室面移动到下室面。但肿瘤细胞若要运动至下室必须先溶解胶原基质，再通过溶解出的空洞运动，这一过程，与肿瘤细胞在体内的浸润过程相似，可以用来反映肿瘤细胞的侵袭浸润能力。
方法如下：取对数生长期的肿瘤细胞以5×104个/孔接种至预先铺有10％Matrigel(BD)Transwell小室的上室中，加药组如上文所示分别加入0.1μM，0.5μM，1.0μM，2.5μM，5μM，10.0μM，20μM的本发明化合物ZH001-023，对照组加入等量的DMSO。下室中分别各加入800μL完全培养基。常规培养培养箱中培养12h或24h。取出transwell小室，用棉签蘸擦拭transwell小室的上室一面，将未穿膜的细胞擦掉。将Transwell在4％多聚甲醛室温固定10min，2‰结晶紫染色5min，自来水冲洗。显微镜下拍照，计数每孔内上下左右中5个视野的细胞数目，获得穿膜细胞数/视野。每组平均设3个副孔。统计不同剂量药物组穿膜细胞的数量，确定药物对细胞迁移能力的影响。
结果如图7所示，在乳腺癌细胞MDA-MB-231的Transwell浸润实验模型中，这些化合物对MDA-MB-231浸润抑制的半数有效抑制浓度IC50在1-2.5μM之间；在乳腺癌4T1的Transwell浸润实验模型中，本发明化合物对浸润抑制的IC50在0.1-0.5μM之间，说明本发明化合物在浸润模型中同样表现出显著的抗乳腺癌细胞浸润的能力。实验结果表明，本发明化合物剂量依赖性地抑制人源乳腺癌细胞MDA-MB-231和鼠源乳腺癌细胞4T1的侵袭。
另外，将本发明化合物对肺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肾癌细胞以及口腔癌细胞等多种肿瘤细胞进行浸润抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例四：本发明化合物对小鼠体内的肿瘤生长及转移的抑制作用
实施例4-1本发明化合物对抑制小鼠乳腺原位癌
6-8周Bal b/c雌性小鼠，乳房垫原位注射7×104个小鼠乳腺癌细胞4T1。荷瘤后6天，原位瘤生长至直径约3-5mm，，按小鼠原位瘤大小平均分为2组，每组8只，给药组分别按照相应的剂量腹腔注射药物5.0mg/kg/day，对照组注射等量溶剂(DMSO)。每天注射化合物前测量肿瘤大小并称量小鼠体重。持续给药至21天，剥离肿瘤测量拍照。实验结果表明，本发明化合物对鼠源乳腺癌细胞生长具有抑制效果，而对小鼠体重没有明显影响。如图8结果显示，相对于对照组，肿瘤大小为1477±319mm3，该本发明化合物对肿瘤大小具有明显的抑制作用，肿瘤大小为329±174mm3，体积减少了77％，见图8(a)效果图及8(b)统计结果。在注射过程中，小鼠体重与对照组相比没有发生特别明显的差异，如图8(c)。
另外，将本发明化合物对肺癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、卵巢癌、膀胱癌、肾癌以及口腔癌等多种恶性肿瘤进行原位癌荷瘤模型抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例4-2.本发明化合物抑制小鼠乳腺癌肺转移
该实验模拟了临床上乳腺癌肺转移的发病和治疗过程。在6-8周龄的Bal b/c雌性小鼠乳房垫处接种7×104个/只的标记有luciferase的小鼠乳腺癌细胞4T1。7天后，可测量到在接种处直径约为3-5mm的原位瘤。通过小鼠活体成像技术(IVIS)将小鼠分为2组，分别开始腹腔注射5.0mg/kg/day的化合物，对照组仅注射溶剂DMSO，以此观察该化合物对于乳腺癌肺部转移的影响。给药21天后，利用活体成像技术IVIS追踪肿瘤细胞转移情况。将小鼠处死后，剥离肿瘤极其器官(肺、骨、肝、心、肾等)拍照，解剖计算肺部转移灶的数量并加以统计。在5.0mg/kg/day的剂量下，小鼠转移病灶的分布减少了95％，说明此类化合物对这类肿瘤的转移也具有明显的抑制作用。图9表明，本发明化合物对乳腺癌生长转移及转移肺结节数具有抑制效果。图9(a)显示IVIS活体成像和剥离器官后拍照的情况。图9(b)所示为肺部图片及肿瘤转移节点效果图。图9(c)所示肺部转移结节数统计图。图9(d)显示本化合物抑制乳腺癌转移率的情况。
另外，将本发明化合物对肺癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、卵巢癌、膀胱癌、肾癌以及口腔癌等多种恶性肿瘤进行肿瘤转移模型抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例4-3.本发明化合物对人源乳腺癌生长和自发转移的抑制效果
对6-8周雌性裸鼠乳房垫原位注射1×106个人乳腺癌细胞MDA-MB-231-luciferase。荷瘤6天后，根据IVIS反映的肿瘤大小的结果均匀将小鼠分为4组，分别为阴性对照组、2.5 mg/kg剂量给药组、5.0mg/kg剂量本发明化合物给药组、5.0mg/kg紫杉醇阳性对照组。给药组分别按照相应的剂量隔天腹腔注射药物，阴性对照组注射等量溶剂(DMSO)，阳性对照组按照剂量注射紫杉醇。每天注射化合物前称量小鼠体重，持续给药至35天，采用小鼠活体成像技术(IVIS)，观察肿瘤细胞的生长情况。将小鼠处死后，解剖其器官，利用IVIS观察肺等重要转移器官的荧光情况。
结果如图10所示用药35天后对小鼠乳腺癌生长的治疗效果肿瘤体积和重量统计图。图10显示本发明化合物与对照组相比，2.5mg/kg和5mg/kg剂量的本化合物则显著抑制乳腺原位瘤的生长。而图10(a)是通过动物活体成像系统计算软件得出的统计结果，图10(b)是实验结束后剥离出来的小鼠体重统计结果，结果显示本发明化合物可以很好地抑制原位瘤的生长，效果与相同剂量的紫杉醇类似。
另外，将本发明化合物对肺癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、卵巢癌、膀胱癌、肾癌以及口腔癌等多种恶性肿瘤进行肿瘤自发转移模型抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例4-4.本发明化合物在乳腺癌实验性转移模型中对小鼠肿瘤转移的抑制效果
在6-8周BALB/c雌性裸鼠尾静脉注射1×106个小鼠乳腺癌细胞MDA-MB231-luc，大约过12小时后注射底物拍照，然后将小鼠随机平均分为4组，确保每组小鼠所注射存活的细胞数大致一样，分别为阴性对照组、2.5mg/kg剂量给药组、5.0mg/kg剂量本发明化合物给药组和5.0mg/kg剂量紫杉醇阳性对照组。在注射肿瘤细胞的当天，给药组分别按照相应的剂量腹腔注射药物，隔天注射药物，阴性对照组注射等量溶剂(DMSO)，阳性对照组按照剂量注射紫杉醇。每2天注射化合物前称量小鼠体重，持续给药至22天，采用小鼠活体成像技术(IVIS)，观察肿瘤细胞的转移情况。如图11。
本发明化合物抑制乳腺癌转移复发的实验结果如图11所示，图11(a)为给药第0天和第22天后对小鼠乳腺癌实验性转移的治疗效果图。图11(b)为抗肿瘤效果统计图。结果显示在2.5mg/kg剂量和5.0mg/kg剂量的化合物则显著抑制乳腺癌实验性转移，并有剂量依赖效应。结果表明而且与阳性对照紫杉醇相比，在相同剂量下，本发明化合物抑制乳腺癌实验性转移的效果要优于紫杉醇。
另外，将本发明化合物对肺癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、卵巢癌、膀胱癌、肾癌以及口腔癌等多种恶性肿瘤进行肿瘤实验性转移模型抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
实施例五：本发明化合物抑制肿瘤的原位复发和远端转移的效果
通常乳腺癌患者会采取原位切除这种保守治疗手段，但切除后，有很大得几率会发生肿瘤的复发和远端转移。4T1鼠源乳腺癌荷瘤模型可自发产生高转移肿瘤，可转移到肺、肝、骨、肾、淋巴结和大脑等器官，同时在乳腺癌原发位置重新形成原位灶。由于4T1细胞是鼠源乳腺癌细胞，在BAL b/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌生长转移过程相近。常用于模拟人乳腺癌发生发展过程，尤其是晚期VI期乳腺癌。所以可以利用这种动物模型很好的模拟临床上保守治疗中的肿瘤切除的治疗方法。
6-8周雌性BAL b/c小鼠，将7×104个小鼠乳腺癌细胞4T1-luciferase接种到老鼠乳腺脂肪垫，5天左右就形成5mm左右的原位瘤。12天后，通过活体成像技术(IVIS)将小鼠平均分为4组，分别为阴性对照组、2.5mg/kg/day剂量给药组、5.0mg/kg/day剂量给药组和5.0mg/kg/day剂量紫杉醇阳性对照组。第13天，切除老鼠的原位瘤，缝合伤口。第15天开始给予本发明化合物。给药14天后，采用小鼠活体成像技术(IVIS)，观察本发明化合物对小鼠原位复发以及远端转移的影响。
实验结果如12所示，图12(a)为用药14天后对小鼠乳腺癌原位复发和远端转移的治疗效果图，右半部分分别为原位复发率12(b)及远端复发率统计图12(c)。与对照组相比，不同剂量的本发明化合物能将原位肿瘤复发率从80％左右降低到50％与12.5％左右；远端肿瘤转移发生几率从40％左右降低到12.5％与12.5％左右，而同剂量的紫杉醇只能将原位肿瘤复发几率和远端肿瘤转移发生几率分别降低至37.5％和25％，显见本发明化合物对肿瘤小鼠的保护作用明显优于紫杉醇。
另外，将本发明化合物对肺癌、前列腺癌、肝癌、皮肤癌、胰腺癌、白血病、卵巢癌、膀胱癌、肾癌以及口腔癌等多种恶性肿瘤进行肿瘤原位复发和远端转移模型抑制效果实验，均取得了相似的显著抑制效果。
以下实施例1-02到1-23提供了本发明化合物ZH002-023的制备方法及产物检测结果。实施例1-02、化合物N2-异丁基N4-((2-(2-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH002)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成2-(苄氧基)硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH002。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.35-8.32(m,1H),7.78(d,J＝5.4Hz,1H),7.47-7.29(m,6H),7.08-7.01(m,2H),5.69(d,J＝6.0Hz,1H),5.28(s,2H),4.65(d,J＝4.5Hz,2H),3.20(t,J＝6.0Hz,2H),2.48(s,3H),1.90-1.83(m,1H),0.94(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-03、化合物N2-异丁基-N4-((4-甲基-2-(4-(苯乙氧基)苯基)-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH003)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成4-(苯乙氧基)硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH003。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.78(d,J＝8.7Hz,3H),7.35-7.27(m,5H),6.91(d,J＝8.7Hz,2H),5.71(d,J＝6.0Hz,1H),4.66(d,J＝5.4Hz,2H),4.21(t,J＝6.9Hz,2H),3.24(t,J＝6.3Hz,2H),3.11(t,J＝6.9Hz,2H),2.46(s,3H),1.93-1.84(m,1H),0.97(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-04、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH004)制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成4-(苄氧基)硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH004。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.82-7.78(m,3H),7.46-7.35(m,5H),7.00(d,J＝9.0Hz,2H),5.72(d,J＝6.0Hz,1H),5.11(s,2H),4.70-4.66(m,2H),3.25(t,J＝8.1Hz,2H),2.46(s,3H),2.09-2.01(m,1H),0.98(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-05、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氨基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH005)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺换成4-(苄胺基)硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH005。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.80(d,J＝7.8Hz,2H),7.29-7.16(m,6H),7.05-7.03(m,2H),5.97-5.94(m,1H),4.90(s,2H),4.76(d,J＝3.6Hz,2H),3.30(t,J＝5.7Hz,2H),2.49(s,3H),1.95-1.88(m,1H),0.99(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-06、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-(3-苯丙氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH006)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成4-(苯丙氧基)硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH006。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.80-7.73(m,3H),7.31-7.20(m,5H),6.90(d,J＝8.7Hz,2H),5.71(d,J＝5.7Hz,1H),4.78(d,J＝4.2Hz,2H),4.70(s,2H),3.99(t,J＝6.3Hz,2H),3.65(q,J＝7.2Hz,2H),3.26(t,J＝6.0Hz,2H),2.81(t,J＝7.5Hz,2H),2.16-2.07(m,2H),1.95-1.86(m,1H),0.98(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-07、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-氟苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH007)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成4-氟硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH007。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.85-7.80(m,2H),7.40-7.38(m,2H),7.11-7.06(m,1H),5.93(d,J＝5.4Hz,1H),4.73(s,2H),3.27(t,J＝5.4Hz,3H),2.48(s,3H),1.95-1.85(m,1H),0.97(d,J＝6.0Hz,6H)。
实施例1-08、化合物N2-异丁基-N4-((2-(2-氯苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺 (ZH008)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成2-氯硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH008。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.16-8.12(m,1H),7.85(d,J＝5.7Hz,1H),7.48-7.45(m,1H),7.37-7.32(m,2H),5.72(d,J＝5.7Hz,1H),4.72(d,J＝5.4Hz,2H),3.24(t,J＝6.3Hz,2H),2.52(s,3H),1.93-1.84(m,1H),0.97(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-09、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-氯苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH009)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成4-氯硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH009。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.82(d,J＝8.7Hz,3H),7.40(d,J＝8.7Hz,2H),5.73(d,J＝6.0Hz,1H),4.71(d,J＝5.7Hz,2H),3.26(t,J＝6.3Hz,2H),2.50(s,3H),1.95-1.86(m,1H),0.99(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-10、化合物N2-异丁基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH010)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH010。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.98-7.93(m,3H),7.48-7.45(m,3H),7.13(s,1H),5.82(d,J＝5.7Hz,1H),4.72(d,J＝6.0Hz,2H),3.77(s,8H)。
实施例1-11、化合物N2,N2-二丙基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH011)的制备
将异丁胺置换成二丙基胺，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH011。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.90-7.85(m,3H),7.41-7.38(m,3H),5.65(d,J＝5.7Hz,1H),4.69(d,J＝5.4Hz,2H),3.50(t,J＝7.5Hz,4H),2.47(s,3H),1.70-1.51(m,4H),0.91(t,J＝7.5Hz,6H)。
实施例1-12、化合物N2,N2-二乙基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH012)的制备
将异丁胺置换成二乙基胺，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH012。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.92-7.85(m,3H),7.41-7.38(m,3H),5.66(d,J＝5.7Hz,1H),4.70(d,J＝5.4Hz,2H),3.61(q,J＝7.2Hz,4H),2.48(s,3H),1.18(t,J＝6.9Hz,6H)。
实施例1-13、化合物N2-((2-呋喃基)甲基)-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH013)的制备
将异丁胺置换成糠胺，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH013。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.88-7.84(m,3H),7.41-7.39(m,3H),7.35-7.34(m,1H),6.31-6.29(m,1H),6.23-6.22(m,1H),5.77(d,J＝5.7Hz,1H),4.68(d,J＝5.4Hz,2H),4.63(d,J＝5.7Hz,2H),2.47(s,3H)。 实施例1-14、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH014)的制备
将3-(苄氧基)硫代苯甲酰胺置换成4-(苄氧基)硫代苯甲酰胺，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH014。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.90-7.85(m,2H),7.81-7.79(m,1H),7.42-7.39(m,3H),5.73(d,J＝6.0Hz,1H),4.96(d,J＝6.0Hz,2H),3.38(q,J＝6.3Hz,2H),2.49(s,3H),1.67-1.60(m,2H),0.98(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例1-15、化合物N2-正丁基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH015)的制备
将异丁胺置换成正丁胺，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH015。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.89-7.82(m,3H),7.41-7.39(m,3H),5.72(d,J＝5.7Hz,1H),4.68(d,J＝5.4Hz,2H),3.41(q,J＝6.0Hz,2H),2.48(s,3H),1.64-1.54(m,2H),1.48-1.36(m,2H),0.94(t,J＝7.5Hz,3H)。
实施例1-16、化合物N2-正戊基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH016)的制备
将异丁胺置换成1-氨基戊烷，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH016。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.88-7.82(m,3H),7.41-7.39(m,3H),5.72(d,J＝5.7Hz,1H),4.68(d,J＝5.7Hz,2H),3.39(q,J＝6.6Hz,2H),2.48(s,3H),1.63-1.58(m,2H),1.36-1.34(m,2H),0.90(t,J＝6.9Hz,3H)。
实施例1-17、化合物N2-苄基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH017)的制备
将异丁胺置换成苄胺，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH017。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.86-7.82(m,3H),7.44-7.24(m,9H),5.76(d,J＝6.0Hz,1H),4.66(d,J＝5.7Hz,4H),2.45(s,3H)。
实施例1-18、化合物N2-苯基-N4-((4-甲基-2-苯基-5-噻唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH018)的制备
将异丁胺置换成苯胺，按制备化合物ZH010的方法制备化合物ZH018。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.97-7.94(m,1H),7.90-7.85(m,2H),7.60(d,J＝8.7Hz,2H),7.41-7.39(m,3H),7.34-7.31(m,1H),7.04-6.99(m,1H),5.90(d,J＝5.7Hz,1H),4.74(d,J＝5.1Hz,2H),2.49(s,3H)。
实施例1-19、化合物N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噁唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH019)的制备
将4-苄氧基苯甲酸、EDC.HCl和HOBt溶解于DMF中，在冰浴条件下搅拌5分钟后，加入DL-丙氨酸酯盐酸盐，搅拌至反应完全，萃取、干燥经柱层析分离纯化得到产物甲基2-(4-(苄氧基)苯甲酰胺基)丙酸甲酯；将化合物2-(4-(苄氧基)苯甲酰胺基)丙酸甲酯溶解于甲醇中，在冰浴条件下滴加4.0当量氢氧化锂的水溶液，搅拌至反应完全，除去甲醇，调节pH＝1后萃取、蒸干经柱层析分离纯化得到产物甲基2-(4-(苄氧基)苯甲酰胺基)丙酸；将2-(4-(苄氧基)苯甲酰胺基)丙酸溶入10ml苯中，在0℃下加入草酰氯，然后常温下过夜，减压蒸馏除掉多余的溶剂，冷却到0℃下将残渣溶解于30ml的MeOH中缓慢滴加1ml三乙胺，常温反应3小时，蒸干多余的溶剂用乙酸乙酯萃取两次，有机相经饱和食盐水洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物，经过柱层析纯化后得化合物2-(4-(苄氧基苯基))-4-甲基噁唑-5-甲酸甲酯；将2-(4-(苄氧基苯基))-4-甲基噁唑-5-甲酸甲酯溶于30ml无水乙醚中，将反应体系冷却至0℃，然后分批加入LiAlH4，0℃下反应1小时后加冰水灭活，过滤取滤液用乙酸乙酯萃和水萃取两次，有机相饱和食盐水洗涤后用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到粗产物，经过柱层析纯化后得化合物2-(4-(苄氧基苯基))-4-甲基噁唑-5-甲醇；用2-(4-(苄氧基苯基))-4-甲基恶唑-5-甲醇替换(2-(3-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲醇后采取ZH001的合成步骤和方法得到N2-异丁基-N4-((2-(4-(苄氧基)苯基)-4-甲基-5-噁唑基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH019)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.73(d,J＝5.4Hz,1H),7.37-7.19(m,7H),6.87(d,J＝8.7Hz,2H),5.61(d,J＝6.0Hz,1H),4.99(s,2H),4.54(d,J＝4.8Hz,2H),3.42(s,3H),3.12(t,J＝6.3Hz,2H),1.83-1.67(m,1H),0.88(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-20、化合物N2-异丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-呋喃基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH020)的制备
将4-溴噻吩-2-甲醛置换成5-(4-(苄氧基)苯基)呋喃-2-甲醛，按制备化合物ZH001的方法制备化合物ZH020。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.82-7.80(m,1H),7.57(d,J＝8.7Hz,2H),7.46-7.34(m,5H),6.99(d,J＝8.7Hz,2H),6.44(d,J＝3.3Hz,1H),6.29(d,J＝3.3Hz,1H),5.76(d,J＝6.0Hz,1H),5.09(s,3H),4.56(d,J＝4.5Hz,2H),4.13(q,J＝7.2Hz,1H),3.22(t,J＝6.3Hz,2H),1.95-1.81(m,1H),0.96(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-21、化合物N2-正丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-呋喃基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH021)的制备
将异丁胺置换成正丁胺，按制备化合物ZH020的方法制备化合物ZH021。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.82-7.81(m,1H),7.56(d,J＝8.7Hz,2H),7.45-7.33(m,5H),6.98(d,J＝8.1Hz,2H),6.44(d,J＝3.3Hz,1H),6.28(d,J＝3.3Hz,1H),5.76(d,J＝6.0Hz,1H),5.09(s,3H),4.55(d,J＝4.2Hz,2H),3.38(q,J＝6.3Hz,2H),1.62-1.53(m,2H),1.44-1.36(m,2H),0.93(t,J＝7.2 Hz,3H)。
实施例1-22、化合物N2-异丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-噻吩基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH022)的制备
将5-(4-(苄氧基)苯基)呋喃-2-甲醛置换成5-(4-(苄氧基)苯基)噻吩-2-甲醛，按制备化合物ZH020的方法制备化合物ZH022。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.84-7.83(m,1H),7.49-7.27(m,7H),7.04-6.92(m,4H),5.73(d,J＝6.0Hz,1H),5.09(s,2H),4.68(d,J＝6.0Hz,2H),3.24(t,J＝6.0Hz,2H),1.95-1.82(m,1H),0.97(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例1-23、化合物N2-正丁基-N4-((5-(4-(苄氧基)苯基)-2-噻吩基)甲基)-2,4-嘧啶二胺(ZH023)的制备
将异丁胺置换成正丁胺，按制备化合物ZH022的方法制备化合物ZH023。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.82-7.80(m,1H),7.49-7.34(m,7H),7.04-6.92(m,4H),5.74(d,J＝6.0Hz,1H),5.09(s,3H),4.69(d,J＝5.4Hz,2H),3.40(q,J＝6.6Hz,2H),1.64-1.54(m,2H),1.45-1.38(m,2H),0.94(t,J＝7.2Hz,3H)。