柔软的自立性的蛋白质纳米薄膜、 其制造方法和应用 技术领域 本发明涉及一种不仅能够迅速而且简单地分离 ( 或者浓缩 ) 分子量大的分子， 而 且能够迅速而且简单地分离 ( 或者浓缩 ) 分子量比较小的分子 ( 约 1000 左右 ) 的 “柔软的 自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的蛋白质薄膜” 。本发明还涉及上述蛋白质膜的制造方法 或者上述蛋白质膜的应用。
背景技术 目前， 膜 (membrane) 实际上正在广泛地被应用 ： 从海水制造饮料水、 工业废水的 净化、 贵重成分的回收、 食品· 医药品产业中的高分子混合物的浓缩、 精制或者分馏， 以及气 体或蒸气的分离。膜也是能量转化系统、 人体器官或者给药 ( 医药输送 ) 装置中重要的构 成要素。 但是， 因为制备具有高选择性、 分离物质的纯度高、 操作的成本低、 以及透过性高这 些优选的组合的膜 ( 即， 不仅膜的流量高， 而且还要削减膜面积和制造成本 ) 是困难的， 所 以分离操作中的膜的广泛使用受到制约。膜的高流量 (flux) 是决定膜系统的成本的关键 的基本性能。 但是不幸的是， 以前的聚合物膜材料随着选择性增加， 透过性会无一例外地减 少， 反之也是一样。 此外， 如果为了提高流量而减少膜的厚度， 膜的稳定性也会急剧减少。 为 了组合聚合物的机械伸缩性和操作性与空间上严密的沸石孔的尺寸选择性， 克服上述的制 约， 有人尝试过在有机聚合物中添加微米级的多孔性沸石粒子 (Lai， Z.P.et al， 2003)。但 是， 由于聚合物 / 沸石的粘接性低、 不合适的粒子分散以及膜的低流量 ( 低 flux) 而这个方 向的商业化受到了阻碍。
具有特殊结构和形态的新型纳米结构材料的发展， 对用于气体分离的具有能够高 度控制的选择性和透过性的膜的制备提供了有力的工具 (Lai， Z.P.et al， 2003 ； De Vos， R.M.et al， 1998 ； Merekel， T.C.et al， 2002 ； Shiflett， M.B.et al， 1999)。时至今日， 大 部分的纳米复合膜厚度都大于 100nm， 具有支撑层， 这极大地限制了膜的流量 (flux)、 分 离效率和大规模的应用 ( 特别是液体分离系的应用 )(Holt， J.K.et al， 2006 ； Jirage， K.B.et al， 1997)。超薄 ( 数十 nm 左右的厚度 ) 的自立性的膜到目前有几篇报告 (Yang， H.et al， 1996 ； Mamedov， A.A.et al， 2002 ； 以及其他 )， 其用于传感器 (sensor) 和制动器 (actuator)。 但是， 可能是由于功能性和作业性的缺陷， 所以没有关于它们的分离操作的报 告。只是， 作为例外， 也只有 Striemer 及其共同研究者报告 (Striemer.C.C.et al， 2007) 过在根据尺寸的巨大分子的分离中使用超薄纳米膜的最初的例子中， 使用了通过精确的硅 沉积和蚀刻技术以及高温 ( 约 700℃ ) 热退火工艺制造的厚度为 15nm 的自立性硅膜。
本发明人们的研究室利用单纯的过滤和剥离技术开发出了大规模且超薄的自 立性中孔膜的一般合成法， 所述中孔膜具有由负电荷的色素分子 ( 参照非专利文献 1)、 DNA( 参照非专利文献 2)、 或者正电荷的金属氢氧化物纳米链 ( 参照非专利文献 3) 生成的 纤维性纳米复合结构。 但是不幸的是， 因为金属氢氧化物纳米链的化学稳定性低， 所以这些 纤维性纳米复合膜较脆并且容易破坏。因此， 使用 ( 聚苯胺或者聚吡咯等的 ) 共轭聚合物 涂覆纳米链， 生成中孔超薄膜， 所述中孔超薄膜在生理条件下可尺寸选择性地分离蛋白质
(Peng， X.S.et al， 2007)。但是， 这样的膜， 在低于 pH4 的酸性溶液条件下不能够支撑 ( 自 身 )。
非专利文献 1 ： Luo， Y.-H.， Huang， J.， Ichinose， I. “氢氧化镉纳米链和阴离子染料 的束状聚集 (Bundle-like assemblies of cadmium hydroxide nanostrandsand anionic dyes)” J.Am.Chem.Soc.127， 8296-8297(2005).
非专利文献 2 ： Ichinose， I.， Huang， J.， Lou， Y.-H.“使用氢氧化镉纳米链进行双 链 DNA 的静电捕捉 (Electrostatic trapping of double-strand DNA by usingcadmium hydroxide nanostrands)” Nano Lett.5， 97-100(2005).
非专利文献 3 ： Ichinose， I.， Kurashima， K.， Kunitake.T.“水中氢氧化镉纳米链 的自发形成 (Spontaneous formation of cadmium hydroxide nanostrands inwater)” J. Am.Chem.Soc.126， 7162-7163(2004).
非专利文献 4 ： Luo， Y.-H.et al.“正 电 荷 氢 氧 化 铜 纳 米 链 的 形 成 及 其 结 构 特 征 (Formation of positively charged copper hydroxide nanostrands and theirstructural characterization)” Chem.Mater.18， 1795-1782(2006). 发明内容 本发明所要解决的问题
为了解决上述纤维性纳米复合物存在的问题， 本发明人们进一步研究了使用蛋白 质涂覆正电荷的金属氢氧化物纳米链的方法。这样， 通过用戊二醛 (GA) 使纤维性复合物中 的蛋白质进行共价键交联， 之后除去无机纳米链， 幸运的是， 能够成功地开发出强健的柔软 的自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的纯蛋白质膜。
解决问题的手段
即， 本发明提供一种蛋白质膜， 是柔软的自立性的超薄 ( 纳米或者 nm 尺寸 ) 的或 者薄的蛋白质膜， 前述蛋白质由二官能性的交联剂结合 ( 交联 )。这里， 本说明书中， “膜” 和 “フィルム (film)” 的意思相同， “自立性” 和 “自支撑性” 的意思相同。
另外， 本发明还提供一种上述柔软的自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的蛋白质膜 的制造方法。该制造方法包含以下的工序 ：
(1) 形成金属氢氧化物纳米链的工序 ： 即， 将金属 (Cd、 Cu 或者 Zn) 硝酸盐或者盐 酸盐稀溶液保持为中性或者弱碱性 pH， 自发形成所述金属 (Cd、 Cu 或者 Zn) 氢氧化物纳米 链；
(2) 得到由蛋白质和上述金属氢氧化物纳米链形成的复合纳米纤维的工序 ： 即， 把得到的金属 (Cd、 Cu 或者 Zn) 氢氧化物纳米链与蛋白质溶液混合， 得到由蛋白质和金属 (Cd、 Cu 或者 Zn) 氢氧化物纳米链形成的复合纳米纤维 ；
(3) 过滤工序 ： 即， 在过滤器上过滤所得到的复合纳米纤维的分散液 ；
(4) 交联工序 ： 即， 通过二官能性交联剂结合 ( 交联 ) 包含在复合纳米纤维中的蛋 白质 ； 然后
(5) 除去金属氢氧化物的工序 ： 即， 从上述反应物中除去金属 (Cd、 Cu 或者 Zn) 氢 氧化物纳米链。
另外， 本发明还提供上述自立性的超薄的或者薄的蛋白质膜的几种应用。作为一
个应用， 本发明提供一种自立性的薄膜， 由两层构成， 一层为上述的蛋白质膜， 另外一层为 在前述蛋白质膜上沉积规定的分子、 并且用二官能性交联剂交联而形成的薄的分子膜。
发明的效果
本发明的柔软的自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的蛋白质膜是一种新型膜。 ( 使用 脱铁铁蛋白作为蛋白质的 ) 有的例子中， 得到的蛋白质膜是这样的膜 ： 厚度为均一的 25nm， 直径为 7.5cm， 直径 / 厚度之比为 3,000,000( 如此高的比率以前还没有报道过。)。
本发明的柔软的自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的蛋白质膜， 能够应用于小分子 量 ( 约 1000 或其以下 ) 的分子的尺寸选择性分离。 它们还可以进一步以非常高的容量 ( 摩 尔比 ) 应用于 ： pH 控制下的分子的高效分离， 或者一边使 pH 变动一边进行的色素分子的可 逆的吸附和解吸。
根据本发明的制造方法， 能够较容易地制造上述柔软的自立性的超薄 ( 纳米 ) 或 者薄蛋白质膜。
本发明的由两层构成的自立性薄膜， 其一层为上述的蛋白质膜， 另外一层为在前 述蛋白质膜上沉积规定的分子、 并且用二官能性交联剂交联而形成的薄的分子膜， 该自立 性薄膜是新型的多层膜， 应该能够和上述柔软的自立性的超薄 ( 纳米 ) 或者薄蛋白质膜具 有不同的使用方法。 附图说明
图 1 是表示超薄的 ( 纳米 ) 或者薄的自立性的蛋白质膜的典型的制造过程的示意 图。
图 2 是交联反应后的铁蛋白 / 氢氧化镉纳米链的纳米纤维性膜的 TEM 平面照片。
图 3 是从图 2 所示的交联反应后铁蛋白 / 氢氧化镉纳米链的纳米纤维性膜中除去 氢氧化镉纳米链之后的， 铁蛋白膜的 TEM 平面照片。
图 4 是直径为 7.5cm 的自立性的铁蛋白膜的照片的复印件。
图 5 中， (a) 是除去氢氧化镉纳米链之前的铁蛋白 / 氢氧化镉纳米链膜 ( 厚度 ： 40nm) 的 SEM 截面照片， (b) 是它的 SEM 平面照片。
图 6 中， (a) 是除去氢氧化镉纳米链之后的铁蛋白膜 ( 厚度 ： 40nm) 的 SEM 截面照 片， (b) 是它的 SEM 平面照片。
图 7 是由氢氧化镉纳米链除去之前 ( 前 ) 以及除去之后 ( 后 ) 的交联膜记录的 EDX 谱图。
图 8 中， (i) 交联前 ( 未交联 )、 及 (ii) 交联后并除去氢氧化镉纳米链之后 ( 交联 除去 CdOH) 的膜的 FTIR 谱图。
图 9 是在具有和不具有氢氧化镉纳米链的场合下， 铁蛋白膜及脱铁铁蛋白膜的各 自的负荷 ( 负荷 )- 脱负荷 ( 脱负荷 ) 曲线的典型的例子。
图 10 是表示对 PC/Cu 的浓缩性能的典型的 UV- 可见光谱图和照片的复印件。
图 11 是使用脱铁铁蛋白膜 ( 厚度 ： 300nm、 直径 ： 3.2cm) 的场合， 伊文思蓝的吸附 ( 吸附 ) 的典型的 UV- 可见光谱图和照片的复印件。
图 12 是使用脱铁铁蛋白膜 ( 厚度 ： 300nm、 直径 ： 3.2cm) 的场合， 伊文思蓝的解吸 ( 解吸 ) 的典型的 UV- 可见光谱图和照片的复印件。图 13 是表示通过铁蛋白膜解吸的荧光色素分子的光致发光 (PL) 谱图的典型例 子。插入的照片 ( 复制件 ) 是在波长为 375nm 的光照射下拍摄的。荧光色素分子 (OPTAT) 的结构如图中的右下所示。
图 14 是脱铁铁蛋白膜上形成的 PAMAM 膜 ( 厚度 ： 4.6μm) 的典型的 SEM 照片。(b) 是 (a) 中点划线围起来部分的放大图。
( 符号说明 )
( 图 9 中 )1 ： 有 (Cd) 纳米链的脱铁铁蛋白 ；
2： 无 (Cd) 纳米链的脱铁铁蛋白 ；
3： 有 (Cd) 纳米链的铁蛋白 ；
4： 无 (Cd) 纳米链的铁蛋白。 具体实施方式
首先， 详细说明自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的蛋白质膜的制造方法。本发明 的制造方法， 如上所述， 包含以下各工序 ：
(1) 形成金属 (Cd、 Cu 或者 Zn) 氢氧化物纳米链的工序 ； (2) 得到由蛋白质和上述金属氢氧化物纳米链形成的复合纳米纤维的工序 ；
(3) 过滤工序 ；
(4) 交联工序 ； 以及
(5) 除去金属氢氧化物的工序。
这 里，不 一 定 要 按 照 上 述 顺 序 进 行，不 过，上 述 顺 序，即 (1) → (2) → (3) → (4) → (5) 的顺序是最优选的。
进一步地， 工序 (4)( 交联工序 ) 之后， 也能够增加剥离由蛋白质和金属氢氧化物 生成的复合纳米纤维的工序。
本发明中， 能够使用各个种类的蛋白质。在后面将示出使用铁蛋白、 脱铁铁蛋白、 细胞色素 c、 肌红蛋白以及葡萄糖·氧化酶 ( 不必说， 也能够使用其他的蛋白质 ) 的例子。 尽管不限于单一的蛋白质， 也可以使用混合的蛋白质， 但是从期望得到膜的均一性这方面 来看， 单一蛋白质的使用是优选的。
自立性的超薄的 ( 纳米 ) 或者薄的蛋白质膜的典型的制造过程的路线如图 1 所 示。
最先的工序 ( 形成金属氢氧化物纳米链的工序 ； 不过， 在这里图中未示出 ) 中， 按 照其他地方 ( 参照非专利文献 3、 4) 所示的那样， 制备聚合物状正电荷的金属氢氧化物纳 米链。简而言之， 将稀碱液添加至 Cd、 Cu 或者 Zn 的硝酸盐 ( 对于 Cd 或者 Zn， 盐酸盐也可 以 ) 的稀溶液中， 将 pH 调至中性或者弱碱性 (pH ＝ 6.0 ～ 8.5)， 以此状态在室温下放置数 分钟到一天， 自发地形成金属氢氧化物纳米链 ( 其粗度直径达到约 2 ～ 3nm， 其长度达到数 十 μm)。
把得到的金属氢氧化物纳米链和带负电荷的蛋白质的水溶液一起混合规定的时 间， 则生成由蛋白质和金属氢氧化物纳米链形成的复合纳米纤维分散液。把得到的分散液 在孔径为 200nm( 孔隙率为约 10％ ) 的聚碳酸酯 (PC) 膜那样的过滤器的上面过滤， 形成复 合纳米纤维性膜。 接下来， 将得到的膜用二官能性交联剂的溶液 ( 例如， 10 重量％戊二醛水
溶液 ) 中处理足够长的时间， 完成交联反应。
使用戊二醛的场合的反应如下 ：
Protein·NH2+O ＝ CHC3H6HC ＝ O → Protein·N ＝ CHC3H6HC ＝ N·protein+2H2O
除了戊二醛， 也能够使用其他的二官能性交联剂， 例如， 作为蛋白质的二官能性交 联剂为人熟知的各种酰亚胺酯类、 N- 羟基琥珀酰亚胺酯类或者碳二亚胺类。
图 1 表示的是这些交联之后的纳米纤维性复合膜的剥离例。为了所述剥离， 可以 把带有上述膜的过滤器浸渍在醇 ( 例如乙醇 ) 中， 而得到具有自立性的交联膜。
接着， 把具有自立性的上述交联膜浸入盐酸溶液那样的无机酸水溶液中， 除去金 属氢氧化物纳米链。然后， 用精制水洗去过剩的金属离子和盐酸。这样， 能够得到纯净的 ( 即， 不含金属氢氧化物 )、 漂浮在水中的自立性蛋白质膜。为了进一步的应用或者评价， 可 以将这些膜保存在醇中。
蛋白质膜的厚度， 通过调节被过滤的纤维性复合物液的容量， 能够在 10nm 到 10μm 的范围内较容易地控制。( 参照实施例 3、 表 1。)
为了施行作为对象的材料的迅速而且简便的分离 ( 或者浓缩 )， 蛋白质膜的厚度， 优选为 15nm ～ 1000nm、 更优选为 20nm ～ 1000nm。想要过滤规定浓度的纤维性复合物的时 候， 蛋白质膜的厚度及其过滤操作的时间、 与过滤液的容量呈线性关系。 蛋白质膜的大小 ( 直径 ) 没有限制。原因是， 蛋白质膜的直径基本上由漏斗的大 小 ( 内径 ) 所决定。上述的自立性的超薄 ( 纳米 ) 的或者薄的蛋白质膜具有各种应用。如 上所述， 一个应用是， 制备由两层构成的自立性的薄膜， 一层为上述的蛋白质膜， 另外一层 为在前述蛋白质膜上沉积规定的分子、 并且用二官能性交联剂交联而形成的薄的分子膜。
这里， 作为 “规定的分子” ， 能够使用在合成高分子那样结构的已知的各种分子中， 具有不能通过上述蛋白质膜的通路的程度的大分子量的分子。作为那样的合成高分子， 例 如可以使用具有末端氨基的树形物。然后， 作为那样的树形物， 优选使用分子量约 2000 以 上 ( 不能通过上述蛋白质膜的通路的大小 ) 的聚酰胺胺。
实施例
实施例中使用的材料如下。CdCl2·2.5H2O、 Cu(NO3)2·3H2O、 2- 氨基乙醇、 直接黄 50、 伊文思蓝 (evansblue)、 8- 氨基萘 -1， 3， 6- 三磺酸二钠盐、 K3[Fe(CN)6]、 氯化氢 (5M 溶 液 ) 和戊二醛 (50 重量％水溶液 ) 是从关东化学购入。四 (1- 甲基吡啶鎓 -4- 基 ) 卟吩、 对 甲苯磺酸、 8- 辛酰基羟基芘 -1， 3， 6- 三磺酸三钠盐、 铜酞菁四磺酸四钠盐、 葡萄糖氧化酶、 细胞色素 c、 肌红蛋白、 马脾铁蛋白 (76mg/ml 溶液 ) 和脱铁铁蛋白 (38mg/ml 溶液 ) 是从西 格玛奥德里奇公司购入。 去离子水 (18.2MΩ) 是由密理博公司的直接 -Q(Direct-Q) 系统制 造， 用于全部实验之中。为了制备自立性膜， 使用聚碳酸酯 (PC) 膜和直径为 2.5cm、 4.7cm、 以及 9.0cm 的过滤器 (Nuclepore， 沃特曼公司 )。氧化铝膜 (Anodisc， 孔径为 0.2μm， 直径 为 2.5cm， 厚度为 60μm) 也是从沃特曼公司购入。
使用的器具和方法如下。通过扫描电子显微镜 (SEM、 日立 S-4800)、 透射电子显 微镜 (TEM、 JEOL 1010) 和具备能量分散性 X 射线分析系统的高分解能透射电子显微镜 (HR-TEM， JEM 2100F)， 对得到的膜进行特性评价。 将该自立性膜移动至用碳涂覆的栅格上， 来准备用于 TEM 和 HR-TEM 观察的样品。关于 SEM 观察， 是用日立 e-1030 离子溅射仪， 在 10Pa 的压力、 10mA 的电流密度下， 涂覆 2nm 厚度的铂层之后进行。关于紫外可见吸收光谱，
是用 SHIMAZU UV-3150 分光光度计得到。关于光致发光光谱， 是通过 JASCOEP-6500 分光光 度计得到。关于磁性， 是通过具备超导干涉装置的市售的磁强计 (MPMS-XL、 量子设计公司 ) 测定。关于机械特性， 是用原位纳米力学测试系统 (TriboIndenter， Hysitron 公司 )， 使用 带有硅基板的金刚石制博克维茨压头 (Berkovitch indenter) 测定。关于分子的大小， 是 通过 Chem3D Ultra 10.0( 剑桥科学计算公司， Cambridge Scientific Computing) 测定。
实施例 1 本发明的蛋白质膜的制备及特性评价
(a) 制备
首先， 利用文献 ( 参照非专利文献 2-4) 中记载的方法， 制备聚合物那样的带有正 电荷的氢氧化镉纳米链。简而言之， 把稀苛性钠溶液或者氨基乙醇溶液 (2mM， 20mL) 投入到 20mL 的 4mM 硝酸镉水溶液中， 迅速混合， 进一步搅拌数分钟， 制备出氢氧化镉纳米链。
在得到的氢氧化镉纳米链分散液中， 加入蛋白质 ( 铁蛋白、 脱铁铁蛋白、 细胞色素 c、 肌红蛋白或者葡萄糖氧化酶 )， 然后搅拌 30 分钟。 铁蛋白和脱铁铁蛋白的情况， 其混合液 是由 3.8mg/mL 的蛋白质液 1mL 和氢氧化镉纳米链分散液 20mL 制得。细胞色素 c、 肌红蛋白 和葡萄糖氧化酶的情况， 其混合液是由 6.4mg/mL 的蛋白质液 1mL 和氢氧化镉纳米链分散液 20mL 混合而制得。 在表压 ( 压差 )90KPa 的条件下， 将规定量的该混合物在聚碳酸酯膜 ( 用于过滤的 膜 / 漏斗的直径 ： 3.2cm) 上过滤。然后， 将该膜浸入 10 重量％的戊二醛水溶液中， 室温下 交联反应 1 小时。把带有膜的 PC 膜浸入乙醇中， 剥离， 得到这些交联反应后的纳米纤维性 复合膜。把得到的自立性膜浸渍在 10mM 盐酸溶液中 3 小时， 除去无机的纳米链， 然后， 用密 理 -Q(mili-Q) 精制水洗去过剩的镉离子和盐酸。这样， 得到 5 种漂浮在各自的水中的纯粹 的自立性蛋白质 ( 铁蛋白、 脱铁铁蛋白、 细胞色素 c、 肌红蛋白或者葡萄糖氧化酶 ) 膜。
(b) 特性评价
图 2 是交联反应后的铁蛋白 / 氢氧化镉纳米链的纳米纤维性膜的 TEM 照片， 从该 照片可以看出， 纤维性结构比较明显， 另外， 对于蛋白质而言， 大部分沿着纳米链聚集。 在该 照片中， 由于铁蛋白的铁化合物核的原因， 铁蛋白蛋白质被显示成直径约 8nm 的黑点。氢氧 化镉纳米链则被显示成 ( 粗度 ) 约 2nm 的纤维结构。
图 3 是从图 2 所示的铁蛋白 / 氢氧化镉纳米链的纳米纤维性膜中除去氢氧化镉纳 米链之后的、 纯铁蛋白膜的 TEM 照片。在该照片中， 纤维性结构消失， 这意味着纳米链已经 完全被除去。
图 4 是直径为 7.5cm 的自立性铁蛋白膜的照片的复印件。该膜的直径与过滤用的 漏斗的尺寸相等。
利用 SEM 和 EDX， 进一步详细研究了氢氧化镉纳米链除去之前及除去之后的膜的 形态及组成。把自立性膜移至孔径为 200nm 的阳极氧化铝膜之上。
图 5 是除去氢氧化镉纳米链之前的铁蛋白 / 氢氧化镉纳米链膜 ( 厚度 ： 40nm) 的 SEM 截面照片 (a) 和 SEM 平面照片 (b) ； 图 6 是除去氢氧化镉纳米链之后的铁蛋白膜 ( 厚 度： 40nm) 的 SEM 截面照片 (a) 和 SEM 平面照片 (b)。
图 5a 和图 6a 相比较， 膜的厚度没有大的区别， 即， 除去纳米链之后， 膜的厚度没有 减少。这意味着没有因为纳米链的除去而引起崩溃。但是， 纳米链除去后的膜表面， 和纳米 链除去前相比变得更加平滑。( 请比较图 5b 和图 6b。)
图 7 表示由氢氧化镉纳米链除去之前 ( 前 ) 以及除去之后 ( 后 ) 的交联膜记录的 EDX 谱图。这些 EDX 谱图证明镉元素已经从膜完全除去， 这并不与根据前述的 TEM 的研究 结果相矛盾。天然铁蛋白 ( 未交联 ) 和在本发明得到的纯铁蛋白膜的各自的 FTIR 谱图如 图 8 所示。两者的特征峰大致上相同， 不过对于峰的强度而言， 铁蛋白膜比天然铁蛋白强。 峰的位置相同的原因是在交联反应期间膜中没有导入任何新的官能团。 约 1660cm-1 处的峰 强度的增加， 是由于在交联反应期间 C ＝ N 共价键的形成 (Rozkiewicx， D.I.et al， Chem. Eur.J.12， 6290-6297， 2006)。这些结果表示蛋白质没有变性。
另外， 氢氧化镉纳米链虽然不会因除去它而对蛋白质膜带来不良影响， 但是与氢 氧化镉纳米链有同样的性质、 并且比它更安全的氢氧化铜纳米链、 氢氧化锌纳米链那样的 纳米链也可以使用， 来制备自立性蛋白质膜 ( 此处未示出数据 )。
实施例 2 各种厚度和直径的蛋白质膜的控制合成
(a) 制备
变化过滤时间和 / 或过滤液量， 并且， 使用的膜 / 漏斗的直径为 1.7cm、 3.2cm 或者 7.5cm， 除此之外与实施例 1 相同地操作， 制备具有自立性的超薄的纯蛋白质膜。结果如表 1 所示。
表1
这里， Vmixturea 是指， 以由铁蛋白或者脱铁铁蛋白蛋白质 3.8mg/ml( 其他的蛋白质为 6.4mg/ml) 溶液 2ml 和氢氧化镉纳米链液 40ml 制作的混合物作为供给源时混合物的过滤容 量。蛋白质膜的厚度是通过截面 SEM 照片测定。
(b) 特性评价
通过肉眼观察 ( 或者照片 ) 和 SEM 照片及 TEM 照片 ( 这里未示出 ) 对得到的膜进 行评价。从这些结果可以看出， 蛋白质膜的厚度和过滤操作的时间， 与过滤液量呈线性关 系。这些例子中， 得到 1.7cm、 3.2cm 和 7.5cm 三个直径的薄膜。另外， 对于铁蛋白的情况而 言， 1.7cm 直径时为最薄的厚度即 40nm， 3.2cm 和 7.5cm 直径时各自为 60nm 的厚度。最厚的 薄膜是， 1.7cm 直径的情况下过滤时间为 1 小时的薄膜， 达到了 4000nm。即， 对于铁蛋白的 情况， 铁蛋白的厚度从 40nm 开始到 4000nm 为止的范围内， 能够实现控制。
比较氢氧化镉纳米链除去前的厚度 60nm、 200nm、 600nm 和 4000nm 的膜， 膜的厚度 越大颜色越深。除去氢氧化镉纳米链之后， 对应的膜的厚度也几乎没有变化。这表示， 除去 纳米链之后的膜并没有牢固地结合， 而是变成了更加多孔性的膜。
对于另外一种蛋白质即脱铁铁蛋白的情况而言， 得到的脱铁铁蛋白超薄蛋白质 膜， 即使直径为 7.5cm( 序号 12) 的时候， 厚度也是均一的 25nm。直径对厚度的比率达到了 3,000,000 倍。TEM 照片 ( 这里未示出 ) 表示， 该膜是 nm 尺寸的非常柔软的膜。如此极端 大尺寸的柔软性， 可以通过如下证据得到证明 ： 将直径为 7.5cm 的脱铁铁蛋白自立性膜吸 入到端部 0.8mm 孔径的移液管中。该蛋白质膜能够可逆地穿过比其面积 ( 大小 ) 小 8790 倍的小孔， 应该是令人惊奇的事情。这是因为该蛋白质膜是柔软而且极端薄的。 用金刚石博克维茨压头， 通过使用 Triboindenter(Hysitron 公司 ) 的纳米压头， 分别测定氢氧化镉纳米链除去之前和除去之后的厚度 1500nm 的铁蛋白和脱铁铁蛋白膜的 各自的机械特性。它们的典型的负荷 - 脱负荷曲线如图 9 所示。各自的样品测定 3 次， 求 出其平均值。硬度 (H) 和杨氏模量如表 2 所示。
表2
铁蛋白和脱铁铁蛋白膜的机械特性
a 泊松比为 0.5， 用于杨氏模量的计算。
b n1 表示测定点的号码， n1、 n2 和 n3 意思是 3 点测定。
c Avg 是指 3 点测定值的平均值。
d ( 前 ) 是指氢氧化镉纳米链除去前。
e ( 后 ) 是指氢氧化镉纳米链除去后。
能够得出这样的结论 ： 氢氧化镉纳米链除去前的膜的硬度和杨氏模量， 比纳米链 除去后的膜的硬度和杨氏模量大。同时， 铁蛋白膜的硬度和杨氏模量比脱铁铁蛋白膜的硬 度和杨氏模量大。纳米链除去前后的膜的这些差异表明， 蛋白质膜的机械特性的增强是由 于无机成分和蛋白质之间的相互作用而产生的。 同时， 铁蛋白中的铁化合物， 使得铁蛋白膜
成为具有比脱铁铁蛋白膜更高的硬度和杨氏模量的膜。铁蛋白膜、 脱铁铁蛋白膜的硬度和 杨氏模量的值， 比以前报道的明胶、 大豆、 酪蛋白或者酪蛋白酸钠等乙二醛交联结构的天然 蛋白质膜 (Vaz， C.M.et al， J.Mater.Sci. ： Mater.In Medicine 14， 789-796， 2003) 的值高 10 倍， 比戊二醛交联结构的大豆蛋白质膜 (Chabba， S.et al， J.Matter.Sci.40， 6263-6273， 2005) 高 4 倍。
进一步地， 我们用厚度为 60nm 的膜封住内径为 5mm 且外径为 7mm 的塑料管的孔 口， 在其上连接内径为 7mm 且外径为 10mm 的别的塑料管， 然后， 把直接黄的乙醇溶液非常谨 慎地注入到大的塑料管中， 使其维持垂直。该膜能够支撑 21cm 的乙醇柱 ( 由此， 乙醇没有 明显透过时， 可以计算出能够支撑膜自身重量的约 180,000 倍的重量 )。
从铁蛋白或者脱铁铁蛋白膜除去纳米链之后的膜， 用肉眼观察厚度 1550nm 的膜 时变得更加柔软 ( 照片未示出 )。 关于该现象， 不仅纳米链除去后的这些蛋白质膜在酸性或 者碱性的任一条件下都非常稳定， 而且对丙酮、 苯、 氯仿等有机溶剂也非常稳定， 对于应用 膜而言是期望的特性。
实施例 3 本发明的蛋白质膜在分离、 浓缩、 吸附或者解吸的应用
通过研究具有各种大小、 电荷状态和 pH 特性的分子的透过， 检验这些自立性纯蛋 白质膜的分离特性。过滤操作是在 90kPa 的压力下进行。该分子 ( 包含其的溶液 ) 的容量 为 20ml。 流速等于根据有效面积和操作时间而标准化的透过液的容量。 根据对过滤前后的 溶液、 进而上部液记录的紫外可见吸收光谱来监控透过特性。结果汇总于表 3.
表3 各种 pH 情况下， 厚度为 60nm 的自立性铁蛋白薄膜的分离特性通过使用厚度为 60nm、 直径 1.7cm 的铁蛋白薄膜， 实现了分子尺寸选择性的分子 的高速分离。PC/Cu(MW ： 984.25)、 TMPyP 染料 (MW ： 1363.6) 和 Cyt.c(MW ： 13000) 那样的大 分子， 从它们的水性介质中完全分离。 ANTS 分子 (MW ： 650.58) 和 [Fe(CN)6]3+ 离子 (MW ： 212) 完全通过了膜。DY( 直接黄 50)(MW ： 956.82) 和 EB( 伊文思蓝 )(MW ： 960.81) 分子， 在中性 pH 时部分通过了膜。但是， 变化 DY、 EB 水溶液的 pH， 即， pH 高于 7 时， 这些色素分子完全通 过了蛋白质膜， pH 低于 3.19 时， 膜通过受到了阻碍。 这种 pH 依存性是由于蛋白质膜的表面 电荷性状引起的。如果是铁蛋白和脱铁铁蛋白的场合， 其等电点都是相同的约 4.4。因此， pH 比 4.4 低的时候， 膜为正电荷， 通过静电力吸附负电荷的色素分子， 膜孔 ( 通道 ) 变窄。
像 ANTS和 [Fe(CN)6]3-那样， 如果分子足够小， 也能够通过该变窄的膜孔 ( 通道 )。但是， 如果分子的大小比该变窄的膜孔 ( 通道 ) 大， 那么 就不能通过膜。当然， 如果分子的大小比 ( 没有变窄的 ) 膜孔大， 无论 pH 是多少， 其分子也 不能通过膜。pH 为 13.03 时， PC/Cu 分子和 DY 分子的混合液的透过实验中， DY 分子完全通 过了膜， 与此相对， PC/Cu 分子显示出几乎不能通过。但是， ( 过滤 ) 水的流速在 90kPa 的压 -2 -1 力下全都大于 5,000Lm h 。由于大分子不能通过膜， 所以能够实现稀液体的浓缩。
例如， 关于 PC/Cu 分子溶液进行考察 ( 图 10)。PC/Cu 分子， 通过使用氧化铝膜 上的 60nm 厚的铁蛋白膜， 在 90kPa 的压差下吸引， 2 分以内能够从 10μM 高效地浓缩到 28.89μM。为了监控浓缩操作的效率， 使用 UV 可见光谱。操作时间越长， 上侧的液体越蓝， -2 -1 但是过滤液 ( 通过液 ) 中没有检出 PC/Cu。过滤液的流速为 6671.9Lm h 。
由于蛋白质的可逆的电荷特性， 如果 pH 比该等电点高或者低， 蛋白质能够在不同 的 pH 的溶液中作为对带电荷的分子或者粒子的吸收剂使用， 也能够通过变化 pH 把这些带 电荷的分子或者粒子释放于其他的溶液中。 为了该研究， 检验了色素分子 ( 伊文思蓝和 DY) 的可逆性吸附和解吸。 把厚度为 300nm、 直径为 3.2cm 的脱铁铁蛋白膜用于溶液中的伊文思 蓝分子的吸附和解吸， 控制该溶液的 pH。pH 为 1.50 的伊文思蓝 (10μM) 溶液 10mL 中的色 素分子， 一天之内， 完全被该蛋白质膜捕捉。然后， 这些被捕捉的分子， 在 pH 为 13.09 的碱 性条件下重新释放到液体中。该捕捉和释放的过程， 用 UV 可见光谱监控。
图 11a 表示的是捕捉操作中的 UV 可见光谱的时间经过的典型例。图 11b 是原液 及一天后的照片 ( 复印件 )， 可以看出， 利用膜， 色素分子从溶液中完全除去。这与 UV 可见 光谱的结果一致。释放的实验结果如图 12a 和图 12b 所示。2.5h(150min) 之后， 伊文思蓝 分子的 83.5％从膜释放到溶液中。随着时间的延长， 更多的色素分子释放到溶液中。最初 的释放循环的最大速度为 94.5％， 这与 DY 分子的释放速度 ( 数据未显示 ) 相似。但是， 在 该最初的捕捉和释放循环之后， 释放效率在后面循环中为 99.4％。捕捉和释放操作， 根据 脱铁铁蛋白膜的电荷特性的 pH 而诱发。( 即 ) 溶液的 pH 比脱铁铁蛋白的等电点 4.4 低的 时候， 该膜带正电， 相反， 溶液的 pH 比 4.4 高的时候， 该蛋白质膜应该带负电。所以， 在 pH 低于 4.4 的溶液中， 负电荷的分子应该通过静电力被捕捉在膜中。相反 ( 溶液的 pH 比 4.4 高 ) 的场合， 负电荷的色素分子应该通过排斥力从膜上被赶走。伊文思蓝溶液的 pH 为 1.5 时的蓝色 ( 图 11) 以及 pH 为 13.09 时的紫色 ( 图 12)， 各自为色素分子自身的颜色。
吸附实验的另外的一个例子如图 13 所示。在 pH 为 1.39 时， 使 10μM 的 8- 辛酰 基羟基芘 -1， 3， 6- 三磺酸三钠盐 (OPTAT) 溶液 10mL， 吸附在厚度为 300nm、 直径为 3.2cm 的 铁蛋白膜上。 光致发光 (PL) 谱图表示的是， 7h 后， 前述分子全部被捕获在铁蛋白膜上， 膜的 PL 强度比原液的强。插入的照片 ( 复制件 ) 为用波长 375nm 激发膜所得到的。
实施例 4 在一层为蛋白质膜、 另外一层为在其上形成的分子薄膜这样的两层所构 成的自立性薄膜的制备中的， 本发明的蛋白质膜的其他的应用。
(a) 蛋白质 ( 脱铁铁蛋白 ) 膜的制备
蛋白质 ( 脱铁铁蛋白 ) 膜的制备方法和实施例 1 中所述的方法相同。
(b) 两层， 即， 一层为蛋白质 ( 脱铁铁蛋白 ) 膜， 另外一层为在该蛋白质 ( 脱铁铁蛋 白 ) 膜表面上形成的分子薄膜的两层构成的自立性薄膜的制备
作为过滤器， 将厚度为 1.9μm 的脱铁铁蛋白薄膜放置在孔径 200nm 的聚碳酸酯膜之上用于吸引过滤系统。对于树形物 PAMAM( 聚酰胺胺 ) 分子 ( 常规 4( ジェネラル 4)， 分 子量 ： 14215， 直径 ： 4.5nm， 表面的氨基数 ： 64， 从西格玛奥德里奇公司购入 ) 的 2 重量％的 甲醇溶液 2ml， 在 90kPa 的表压 ( 压差 ) 下， 用前述吸引过滤系统过滤。通过过滤除去甲醇 之后， 使得 PAMAM( 聚酰胺胺 ) 分子的滤饼用 5 重量％的戊二醛水溶液 1ml 交联反应 1.5 小 时。最后， 将得到的膜用甲醇和水洗涤 4 次。图 14 为 1.9μm 厚的脱铁铁蛋白膜表面上形 成 4.6μm 厚的 PAMAM 膜的典型的 SEM 照片。
PAMAM 膜的厚度能够通过 PAMAM 溶液的滤液量来控制。
进一步地， 基于蛋白质膜利用相同的过滤操作和交联过程， 还能够制备其他的分 子膜。该方法提供构建例如分离等各种应用的功能性分子薄膜的简单的方法。