一种新木脂素类型化合物及其在制备协同抗耐药金葡菌药物中的用途.pdf

本发明属于药学领域，涉及一种新木脂素类型化合物及其在制备协同抗耐药金葡菌药物中的用途，具体涉及化合物7R,8S,5'S-8-甲基-5'-甲氧基-1'-丙烯基-7-(3,4-二甲氧基苯基)-2',5'-二氢-2'-苯并呋喃酮((-)-denudatin B)及其在制备协同抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的用途。本发明的化合物与抗生素诺氟沙星联合用药能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低4倍。本发明的化合物(-)-denudatin B可提高抗生素诺氟沙星对耐药金葡菌SA1199B的抑制作用；或者使抗生素诺氟沙星的用药量减少到其原来单独用量的四分之一。所述的化合物可用于制备抗生素增效药物。

权利要求书
1.  式1结构的化合物(-)-Denudatin B，其分子式为C21H24O5，分子量356，

式1。

2.  权利要求1的化合物和抗生素诺氟沙星联合用于制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物中的用途。

3.  按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式1结构的化合物(-)-Denudatin B对细菌不具有直接生长抑制作用，与选定的抗生素药物联合使用时，具有协同作用抗耐药金葡菌作用。

4.  按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的耐药金葡菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时具有对氟喹诺酮类抗生素药物的耐药性。

5.  按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物与诺氟沙星合用提高抗生素对耐药金葡菌SA1199B的抑制效果，合用时，诺氟沙星对耐药金葡菌株SA1199B的最低抑菌浓度为单独使用时的四分之一；在不改变抑菌效果时，降低诺氟沙星抗生素的使用剂量。

6.  权利要求1所述化合物在制备抗耐药细菌抗菌增效剂中的用途。

7.  按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物为式1结构的化合物与诺氟沙星或其它氟喹诺酮类抗生素制成具有抗耐药金黄色葡萄球菌作用的药物组合物。

8.  按权利要求7的用途，其中的药物组合物制成抗耐药金葡菌外用药物制剂或其它形式药物制剂。

说明书一种新木脂素类型化合物及其在制备协同抗耐药金葡菌药物中的用途
技术领域
本发明属于药学领域，涉及一种新木脂素类型化合物及其在制备协同抗耐药金葡菌药物中的用途，具体涉及化合物7R,8S,5'S-8-甲基-5'-甲氧基-1'-丙烯基-7-(3,4-二甲氧基苯基)-2',5'-二氢-2'-苯并呋喃酮((-)-denudatin B)及其在制备协同抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的用途。
背景技术
现有技术公开了耐甲氧西林金黄葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)为医院内最常见的传染病菌之一，除了浅表皮肤感染，它还可以引起人体深度感染。如今，对所有内酰胺类抗生素如青霉素等药物具有耐药性的MRSA，对大环内酯，氟喹诺酮，四环素等抗生素也都产生了耐药性，这使得它的感染变得更加难以治疗。据报道，目前，可用于治疗MRSA的抗生素只有万古霉素，然而不幸的是，完全抗万古霉素MRSA菌株2002年在美国已经出现。我国近年来由于抗生素广泛的使用，甚至滥用，特别是万古霉素在多家医院成为常规抗生素类用药之后，这一形势变得愈加严峻。业内共识，除了采取措施通过限制滥用抗生素以减缓耐药MRSA增长的速度，同时必须研发新的抗耐药MRSA药物，以防现有的抗菌药物无法起作用时，细菌的大规模爆发。
研究显示，细菌可通过多种途径产生耐药性(Drug Resistance)，其中细菌对药物产生外排作用而导致的外泵(efflux)耐药性是重要的耐药性机制。根据世界卫生组织的报告，具有多药耐药外排泵的细菌引起的感染已经占到了院内感染的60%。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有多种耐药机制，除了具有染色体为40kb的耐药基因(mecA)通过编码甲氧西林接合蛋白(Penicilin Binding Protein，PBP)产生对β-内酰胺类抗生素的耐药性之外，还对多种类型抗生素产生耐药性。对氟喹诺酮类(fluoroquinolones)通过过度表达NorA[1]外泵蛋白产生耐药性。细菌细胞通过外排泵将普遍使用的绝大多数抗生素泵出细胞外，使细胞内的抗生素浓度降低而无法起到抗菌作用。
诺氟沙星是一种氟喹诺酮类抗生素，1986年开始被用于临床。因它对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，尤其是金黄色葡萄球菌，具有较强的抑制作用而广泛用于尿道、呼吸道等的抗感染治疗。也正因为诺氟沙星在临床及畜牧业的广泛应用，细菌对其产生了严重耐药性，从而限制了诺氟沙星的应用。本领域公知，产生耐药性的机制多样，其中之一便是细菌外排泵。因此，选择具有NorA外泵基因的MRSA细菌株作为外泵抑制剂的筛选靶标是寻找具有外泵 抑制作用的抗耐药金葡菌抗生素增敏剂的一种重要途径。
本申请的发明人，拟提供通过使用天然成分(-)-denudatin B分别与诺氟沙星配伍成组合药物，达到降低诺氟沙星的最低抑菌浓度，对诺氟沙星产生抗耐药金葡菌的增效作用的目的。
于本发明相关的现有技术有：
[1]Guay,GG,et al.The Tet(K)Gene of plasmid PT181 of Staphylococcus aureus encodes an efflux protein that contains 14 transmenbrane helices.Plasmid.1993,30(2):163-166.
[2]Bearden DT,Danziger LH.Mechanism of action of and resistance to quinolones.Pharmacotherapy2001,21:40-61.
[3]Holmes,B,et al.Norfloxacin.Drugs.1985,30(6):482-513.
[4]Markham PN,Neyfakh AA.Inhibition of the multidrug transporter NorA In Staphylococcus aureus prevents emergence of norfloxacin resistance.Antimicrobial Agents Chemotheropy.1996,40(11):2673-2674.
[5]Hooper DC.Emerging mechanisms of fluoroquinolone resistance.Emerging Infectious Diseases.2001,7:337–341.
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种新木脂素类型化合物及其在制备协同抗耐药金葡菌药物中的用途，具体涉及化合物7R,8S,5'S-8-甲基-5'-甲氧基-1'-丙烯基-7-(3,4-二甲氧基苯基)-2',5'-二氢-2'-苯并呋喃酮((-)-denudatinB)及其在制备协同抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的用途。
本发明进一步提供了抑制耐药金黄色葡萄球菌(drug-resistant MRSA)的抗菌组合物。
本发明的新木脂素类型化合物具有如下结构：其分子式为C21H24O5，分子量356；

本发明采用化合物(-)-denudatin B和抗生素诺氟沙星联合用于制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物，其中，在联用药物中，每种活性组份的量为使得并用药物产生协同抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性作用的量。
本发明中，耐药金葡菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同时具有对氟喹诺酮类抗生素药物的耐药性。
本发明中，将所述的天然化合物(-)-denudatin B与抗生素诺氟沙星在不同浓度下进行对耐氟喹诺酮金葡菌SA1199菌株单独抑菌实验，及两者形成不同配比的组合物进行抑菌试验，结果显示，所述化合物对诺氟沙星以协同作用方式产生抑菌增效作用，效果与阳性药物利血平相当，协同增效作用明显。
本发明中，所述的化合物本身对于含有NorA耐药外泵基因的耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)株SA1199B的生长没有抑制作用，但它与抗生素诺氟沙星配伍时能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低4倍。本发明涉及化合物(-)-denudatin B可提高抗生素诺氟沙星对耐药金葡菌SA1199B的抑制作用；或者使抗生素诺氟沙星的用药量减少到其原来单独用量的四分之一。
本发明中的天然化合物可从植物中分离得到。
本发明涉及的化合物(-)-denudatin B可进一步用于制备抗生素增效药物；更优选的，该化合物与诺氟沙星或其它氟喹诺酮类抗生素制成具有抗耐药金黄色葡萄球菌作用的药物组合物，所述药物组合物可为抗耐药金葡菌外用药物制剂或其它形式药物。
具体实施方式
实施例1.从植物蒌叶中分离增效化合物(-)-denudatin B。
胡椒属植物蒌叶(Piper betle)的95%乙醇提取物的氯仿萃取部位浸膏，用200-300目的硅胶拌样进行柱层析，每20mL为一个流分。先用氯仿冲柱，收集流分9，记为Fr02-9；以氯仿-丙酮（9:1）洗脱，收集流分32-36，记为Fr02-32。减压蒸干后称重，Fr02-9为260mg。对Fr02-9进行分离，以氯仿-丙酮（9:1）洗脱，收集流分4-6，记为Fr02-9-4，减压蒸干后称重为106mg。对Fr02-9-4进行分离，以石油醚-丙酮（8:2）洗脱，收集流分2-4，记为Fr02-9-4-2，减压蒸干后称重为44mg。继续对Fr02-9-4-2纯化，最终得淡黄色固体15mg，经薄层色谱和液相检测为一纯品，得到(-)-denudatinB。
化合物鉴定：取分离所得化合物5mg，加入氘代氯仿溶解进行核磁共振和质谱结构测试。质谱实验显示此化合物的分子量分别为356，1H-NMR及13C-NMR数据分别如表1所示，结 构如式1所示。
表1.化合物的1H-NMR及13C-NMR数据


式1.化学物的结构式
实施例2.从植物海风藤中分离增效化合物(-)-denudatin B。
胡椒属植物海风藤（Piper kadsura(Choisy)Ohwi）地上部分粗粉，用二氯甲烷室温提取四次，提取液减压浓缩，得墨绿色浸膏。取浸膏40g经硅胶H柱层析，环己烷-丙酮梯度洗脱，TLC检识合并，减压浓缩得17个部分（Fr1-17）。Fr3（3.4g）经硅胶柱层析（环己烷-丙酮）和制备TLC（二氯甲烷-乙酸乙酯）得化合物(-)-denudatin B，共170mg。
化合物鉴定方法以及鉴定结果同实施例1。
实施例3.确定化合物(-)-denudatin B与诺氟沙星联用时的协同增效作用结果
化合物(-)-denudatin B和诺氟沙星分别按下述协同作用试验方法进行化合物协同抗生素增效作用试验，试验结果如表2所示。
1）协同作用方法试验化合物对抗生素的增效作用
诺氟沙星及MTT购于西格玛公司(Sigma Chemical Co.Ltd.)，米勒-亨顿肉汤(Mueller-Hinton Brooth,MHB)购于Oxoid公司；取适量诺氟沙星溶于DMSO配成抗生素母液，取适量诺氟沙星母液溶于肉汤中配成诺氟沙星原液。，取化合物样品适量溶于DMSO配成母液，取一定量的化合物母液加至盛有肉汤的试管1中，混匀，配成浓度为128ug/mL溶液，然后遵循等倍稀释法依次操作，直至试管7，菌悬液配置成106CFU/mL，往96孔板每孔加入适量肉汤，再往第一列中每孔加入一定量诺氟沙星原液，使首孔浓度为256ug/mL，然后按照等倍稀释法依次操作，直至第10列，将第10列中吸出的溶液加至第12列，往第8行的每孔加入等量肉汤，其余各行加等量的相对应编号试管里的溶液，往除第十二列外的每孔中加入等量菌悬液，将此96孔板于37℃的培养箱中培养18-24小时，加入MTT，观察结果，记录每行细菌不生长的孔所对应的诺氟沙星的浓度，其中96孔板H行显示的是诺氟沙星单用时的MIC，其他行显示的是与化合物样品联用时诺氟沙星的MIC值；
基于报道药物利血平(reserpine)具有抑制外排泵作用，它能够抑制耐药细菌对药物的外排作用，增加抗生素的抑菌效果，利血平（购于阿拉丁化学试剂公司，Aladdin Chemistry Co.Ltd）作为在本实施例的阳性对照药物，采用本协同作用实验方法测试利血平与诺氟沙星联用对SA1199B的抑制作用，结果显示，在利血平浓度为4μg/mL时可将诺氟沙星对SA1199B的最低抑菌浓度降低4倍，由64μg/mL降至16μg/mL；
2.抗菌实验方法
取所述化合物样品及抗生素诺氟沙星各适量，以DMSO溶解配置成一定浓度的两种母液，取此母液适量加分别至适量肉汤中配得化合物样品及诺氟沙星的原液，以使得在96孔板首孔浓度为128ug/mL，往96孔板每孔加入适量肉汤，再往第一列的A-D孔加入等量诺氟沙星原液，E-H孔加入等量化合物样品原液，然后按照等倍稀释法从第1列中取等量到第2列，直至第10列，将第10列中吸出的0溶液加至第12列，往除第十二列外的每孔中加入等量菌悬液，将此96孔板于37℃的培养箱中培养18-24小时，加入MTT，观察结果，以细菌完全不生长时所需药物的最低浓度为药物对此菌种的MIC值；
浓度为5mg/mL的3-[4,5-二甲基噻唑基-2]-2,5-二苯基四唑蓝溴化物(MTT；Sigma)每孔加入20μL用于检测细菌的生长，MTT由黄色变成蓝色则指示有细菌生长；
结果显示，对于耐药菌株SA1199B，诺氟沙星的MIC值为64μg/mL，化合物(-)-denudatin B对此菌株的MIC大于128μg/mL，但与诺氟沙星配伍时，能使诺氟沙星对菌株SA1199B的MIC值降至16μg/mL，比单用诺氟沙星时MIC降低了4倍，结果表明，(-)-denudatin B协同增效作用与文献报道利血平相同，具有明显的协同抗菌活性。
本实施例中的实验菌SA1199B为过度表达NorA多药耐药外泵蛋白的金黄色葡萄球菌，诺氟沙星对其的MIC值为64μg/mL，所述的NorA蛋白是金葡菌的主要外排泵（efflux pump）。
表2.化合物及诺氟沙星(Norfloxacin)对耐药菌种SA1199B的最低抑菌浓度(MIC)和抑菌浓度指数(FICI)

其中：
（1）FICI≤0.5为协同作用；0.5<FICI≤1相加作用；1<FICI≤2为无相关作用;；2<FICI≤4为拮抗作用；
（2）化合物对SA1199B菌种皆无直接作用(MIC>128μg/mL)，但与诺氟沙星联用时能降低抗生素MIC4倍，协同作用明显。