棕色棉中原花青素的提取方法 【技术领域】
本发明涉及一种从棕色棉中提取原花青素的方法。背景技术 棉花是世界上最重要的经济作物之一， 也是纺织工业的主要原料。 目前， 棉花种植 分布到世界上 80 多个国家， 解决近 8 亿人的温暖问题。天然彩色棉纤维因其独特的自然色 彩， 在加工过程中无需染色， 因此减少了对环境的污染 ； 其加工成的内衣， 手感柔软， 穿着舒 适， 不含残留化学毒素， 不会对人体健康产生危害， 同白棉花相比， 天然彩棉具有更高的经 济性 ； 采用天然彩色棉花加工成的服装， 也成为纺织出口大国克服 “绿色贸易壁垒” 的有效 手段之一。 天然彩色棉纤维诸多优点， 引起国内外棉花育种专家和纺织、 服装工业界的广泛 关注， 业已成为当今世界各国重点开发的生态棉。
我国在 20 世纪 90 年代， 在国家 “十五” 高科技发展计划的推动下， 彩色棉花的种植 2 和研究有了长足发展。据统计， 2002 年世界彩色棉种植面积 7.87 万 hm ， 中国 1.73 万 hm2， 占世界面积的 21.98％； 世界彩色棉产量 12 万 t， 中国 2.1 万 t， 占 17.5％， 种植面积和产量 已居世界第二。 特别是新疆， 不仅是全国最大的棉花种植地， 也是我国最大的天然彩色棉生 产基地， 据 2007 年统计， 新疆彩色棉花年产已达 8000t， 加工后产品销往全国各地， 并出口 国外， 成为推动当地经济发展的重要组成部分。
彩棉的色彩较单一， 只有棕色和绿色， 不满足现代人们对色彩的需求。 而且彩棉服 装经为数不多的洗涤， 颜色稍加深， 并趋于鲜艳。但经反复多次洗涤后， 颜色会变淡。特别 是绿色织物， 颜色会褪成暗淡白色。 故虽然彩色棉织物不需染色， 但对彩色棉固色提出了新 的要求。至此， 彩棉色素的不稳定性， 严重限制了彩棉业的发展。我们通过研究彩棉色素的 物质基础来说明彩棉的成色机理， 为验证基因的表达路径提供依据， 也为下一步的选育出 各种色彩的彩棉打下物质基础。
目前研究彩色棉色素的化学本质， 确定其色素合成路径， 选育出各色品种的彩色 棉是一个热点。于伯龄 ( 针织工业， 2002， 1： 35-37) 认为彩色棉纤维中的色素是花青素类 色素， 但没有提供可靠的依据和资料。赵向前和王学德 ( 作物学报， 2005， 31(4) ： 456-462) 报道棕色棉纤维色素为黄酮类化合物。詹少华等 ( 植物学通报 2007， 24(1)99-104) 研究了 棕色棉纤维色素的提取方法， 认为棕色棉属于缩合单宁类物质氧化而来的醌类化合物。石 河子大学的张小均 ( 棉花学报， 2008， 20(2) ： 133-136) 等人采用不同的试剂提取棕色棉色 素， 发现用蒸馏水效果最好。顾肇文， 梁光雁 ( 印染， 2005， 13 ： 10-13) 认为天然彩棉色素系 水溶性或醇溶性多酚类物质， 具有 2- 苯基苯并吡喃的结构。到目前为止， 棕色棉的主要组 分及结构还没有被鉴定出来。
发明内容
本发明的目的在于， 提供一种棕色棉中原花青素的提取方法， 该方法以棕色棉为 原料， 用乙腈、 三氟乙酸和水混合液避光冷浸提取， 抽滤， 再用乙酸乙酯萃取， 减压蒸馏， 获得沉淀， 用乙酸乙酯溶解沉淀， 制成原花青素的饱和溶液， 加入石油醚， 搅拌混合均匀， 放入 冰箱静置过夜， 过滤， 得到沉淀即为原花青素。该方法操作简单， 为以后的研究打下基础。
本发明所述的棕色棉中原花青素的提取方法， 按下列步骤进行 ：
a、 将棕色棉剪碎， 在室温下用乙腈、 三氟乙酸和水的混合液避光冷浸提取， 时间 10-20 天， 抽滤， 得到提取液 ；
b、 将提取液减压蒸馏， 除去乙腈和三氟乙酸， 得到提取液水溶液 ；
c、 将步骤 b 水溶液用乙酸乙酯萃取 2-4 次， 萃取体积比为 1 ∶ 1-3， 合并乙酸乙酯 相；
d、 将步骤 c 乙酸乙酯相减压蒸馏， 获得沉淀， 用乙酸乙酯溶解沉淀至完全溶解， 制 成原花青素的饱和溶液 ；
e、 将步骤 d 原花青素的饱和溶液中加入 3-4 倍体积的石油醚， 搅拌混合均匀， 放入 冰箱静置过夜 ；
f、 再将步骤 e 混合液过滤， 得到沉淀即为原花青素。
步骤 a 中棕色棉型号为 86、 新彩 1、 新彩 5、 棕 196、 棕 470。
步骤 a 中乙腈∶三氟乙酸∶水为体积比 50％∶ 0.1％∶ 49.9％。 步骤 a 棕色棉与提取液的质量体积比为 1g ∶ 25-35ml。
发明中所用的棉花品种有五个 ： 86、 新 彩 1、 新 彩 5、 棕 196、 棕 470， 用 50 ％ 乙 腈 -0.1％三氟乙酸分别提取以上五种棕色棉， 一般冷浸的时间在 10-20 天较佳。液料比为 每克棕色棉 25-35ml 提取液。
具体实施方式
实施例 1( 从棕色棉 86 中提取原花青素 )
a、 称取棕色棉 8620g， 剪碎， 在室温下加入 600ml 体积比 50％乙腈、 0.1％三氟乙酸 和 49.9％水混合液， 避光冷浸提取 15 天， 抽滤得提取液 ；
b、 将提取液减压蒸馏到 200ml， 除去乙腈和三氟乙酸， 得到提取液水溶液 ；
c、 将步骤 b 水溶液用乙酸乙酯萃取 3 次， 体积比为 1 ∶ 1， 合并乙酸乙酯相 ；
d、 将步骤 c 乙酸乙酯相减压蒸馏， 获得沉淀物， 再用乙酸乙酯溶解沉淀至沉淀完 全溶解， 制成原花青素的饱和溶液 ；
e、 将步骤 d 原花青素的饱和溶液中加入 4 倍体积的石油醚， 搅拌混合均匀， 放入冰 箱静置过夜 ；
f、 再将混合液过滤得到沉淀 30mg 的原花青素。
实施例 2( 从棕色棉新彩 1 中提取原花青素 )
a、 称取棕色棉新彩 1 20g， 剪碎， 在室温下加入 600ml 体积比 50％乙腈、 0.1％三氟 乙酸和 49.9％水混合液， 避光冷浸提取 10 天， 抽滤， 得提取液 ；
b、 将提取液减压蒸馏浓缩到 200ml， 除去乙腈和三氟乙酸， 得到提取液水溶液 ；
c、 将步骤 b 水溶液用乙酸乙酯萃取 2 次， 体积比为 1 ∶ 2， 合并乙酸乙酯相 ；
d、 将步骤 c 乙酸乙酯相减压蒸馏， 获得沉淀物， 用乙酸乙酯溶解沉淀至沉淀完全 溶解， 制成原花青素的饱和溶液 ；
e、 将步骤 d 原花青素的饱和溶液中加入 3 倍体积的石油醚， 搅拌混合均匀， 放入冰箱静置过夜 ；
f、 再将混合液过滤得到沉淀 27mg 的原花青素。
实施例 3( 从棕色棉新彩 5 中提取原花青素 )
a、 称取棕色棉新彩 5 20g， 剪碎， 在室温下加入 600ml 体积比 50％乙腈、 0.1％三氟 乙酸和 49.9％水， 避光冷浸提取 13 天， 抽滤得提取液 ；
b、 将提取液减压蒸馏浓缩到 200ml， 除去乙腈和三氟乙酸， 得到提取液水溶液，
c、 将步骤 b 水溶液用乙酸乙酯萃取 3 次， 体积比为 1 ∶ 3， 合并乙酸乙酯相 ；
d、 将步骤 c 乙酸乙酯相减压蒸馏， 获得沉淀物， 用乙酸乙酯溶解沉淀至沉淀完全 溶解， 制成原花青素的饱和溶液 ；
e、 将步骤 d 原花青素的饱和溶液中加入 3 倍体积的石油醚， 搅拌混合均匀， 放入冰 箱静置过夜 ；
f、 再将混合液过滤， 得到沉淀 28mg 的原花青素。
实施例 4( 从棕色棉棕 196 中提取原花青素 )
a、 称取棕色棉棕 196 20g， 剪碎， 在室温下加入 600ml 体积比 50％乙腈、 0.1％三氟 乙酸和 49.9％水混合液， 避光冷浸提取 18 天， 抽滤得提取液 ；
b、 将提取液减压蒸馏浓缩到 200ml， 除去乙腈和三氟乙酸， 得到提取液水溶液 ；
c、 将步骤 b 水溶液用乙酸乙酯萃取 3 次， 体积比为 1 ∶ 2， 合并乙酸乙酯相 ；
d、 将步骤 c 乙酸乙酯相减压蒸馏， 获得沉淀物， 用乙酸乙酯溶解沉淀至沉淀完全 溶解， 制成原花青素的饱和溶液 ；
e、 将步骤 d 原花青素的饱和溶液中加入 3.5 倍体积的石油醚， 搅拌混合均匀， 放入 冰箱静置过夜 ；
f、 再将混合液过滤， 得到沉淀 25mg 的原花青素。
实施例 5( 从棕色棉棕 470 中提取原花青素 )
a、 称取棕色棉棕 470 20g， 剪碎， 在室温下加入 600ml 体积比 50％乙腈、 0.1％三氟 乙酸和 49.9％水混合液， 避光冷浸提取 20 天， 抽滤得提取液 ；
b、 将提取液减压蒸馏浓缩到 200ml， 除去乙腈和三氟乙酸， 得到提取液水溶液 ；
c、 将步骤 b 水溶液用乙酸乙酯萃取 4 次， 体积比为 1 ∶ 3， 合并乙酸乙酯相 ；
d、 将步骤 c 乙酸乙酯相减压蒸馏， 获得沉淀物， 用乙酸乙酯溶解沉淀至沉淀完全 溶解， 制成原花青素的饱和溶液 ；
e、 将步骤 d 原花青素的饱和溶液中加入 4 倍体积的石油醚， 搅拌混合均匀， 放入冰 箱静置过夜 ；
f、 再将混合液过滤得到沉淀 24mg 的原花青素。
实施例 6 原花青素的分析
将实施例 1-5 方法所获得的原花青素用甲醇溶解沉淀后进行分析 ：
正丁醇 / 盐酸反应 ： 吸取 2ml 原花青素溶液， 加入 12ml 正丁醇 / 浓盐酸溶液 (v/v ＝ 95/5)， 在 95℃水浴 40min， 然后取出迅速冷却， 将反应产物旋干， 用 20ml 蒸馏水溶解， 用 乙酸乙酯 (1 ∶ 1) 萃取， 弃去乙酸乙酯相， 将水相旋至没有乙酸乙酯味即可， 水相再用 5ml 的 1- 戊醇萃取， 将 1- 戊醇相旋干， 用 1ml 甲醇溶解。
HPLC/DAD-ESI 分析反应产物液相条件 ： xTerra C18 柱 (2.1x100mm， 3.5um) ； 流动相 ： A 为纯 MeCN， B 为 0.2 ％ HCOOH 水溶液 ； 流速 ： 0.18ml/min ； 梯度条件 ： 0-1min， 2％ A ； 1-6min， 2％ -20％ A ； 6-18min， 20％ -50％ A ； 18-24min， 50％ -90％ A。进样量 ： 15ul ； 柱温 ： 20℃ ； +
质谱条件 ： 电喷雾正离子电离模式 (ESI m/z 100-1000)， 毛细管电压 3kv， 锥孔电 压 70v， 离子源温度 120℃， 脱溶剂气温度 450℃。
正丁醇 / 浓盐酸反应是鉴定原花青素的比较专一的定性反应， 通过裂解原花青 素， 纯化色素反应液， HPLC/DAD-ESI 初步推断出棕色棉中含有的原花青素的聚合单体为原 飞燕草色素和原矢车菊色素。6