牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒及用途.pdf

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1、10申请公布号CN104120109A43申请公布日20141029CN104120109A21申请号201310153641622申请日20130428CCTCCNOC20134520130403C12N5/20200601G01N33/577200601C12R1/9120060171申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市狮子山街1号72发明人刘正飞王单晶范强74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒及用途57摘要本发明公开了一种牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒及用途，试剂盒采用已灭活。

2、的纯化BHV1病毒粒子作为包被抗原,依据阻断ELISA原理检测牛血清中牛传染性鼻气管炎病毒的抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为灭活的纯化BHV1病毒粒子,其具有良好的抗原性。试剂盒包括杂交瘤细胞株、ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、终止液、底物显色液A、底物显色液B、阳性对照、阴性对照。该试剂盒敏感性强，特异性高，使用方便，易于标准化，尤其适用于大规模样品的检测，可以作为调查牛传染性鼻气管炎流行情况的金标准。与美国IDEXXGE阻断试剂盒相比，有很高阳性符合率及阴性符合率，可以作为诊断牛传染性鼻气管炎的标准方法。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书13页附图2页19中华人。

3、民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页附图2页10申请公布号CN104120109ACN104120109A1/1页21一种牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于杂交瘤细胞能分泌针对BHV1GB蛋白的抗体，杂交瘤细胞株为1H3，CCTCCNOC201345。2一种检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于杂交瘤细胞株、ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、终止液、底物显色液A、底物显色液B、阳性对照、阴性对照、酶标单克隆抗体所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白的单克隆抗体。3根据权利要求2所述的一种牛传染性鼻气。

4、管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述的ELISA板条每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为灭活的纯化BHV1病毒粒子；所述的血清稀释液血清稀释液为即用型；所述的浓缩洗涤液洗涤液为10倍浓缩，使用前稀释；所述的底物显色液A0006H2O2缓冲液；所述的底物显色液BTMB显色液；所述的终止液0025氢氟酸。4权利要求2所述的一种牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒在检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体中的应用。权利要求书CN104120109A1/13页3牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断EL。

5、ISA试剂盒及用途技术领域0001本发明属于生物技术领域。具体涉及一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测的阻断ELISA试剂盒，还涉及一种用检测牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒的用途。背景技术0002牛传染性鼻气管炎（INFECTIOUSBOVINERHINOTRACHEITIS，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（INFECTIOUSBOVINERHINOTRACHEITISVIRUSE，IBRV）即牛1型疱疹病毒（BOVINEHERPESVIRUS1,BHV1）引起的一种牛呼吸道接触性传染病，又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”。0003牛1型疱疹病毒（BHV1）是疱疹病毒科。

6、疱疹病毒亚科的成员，它是一种有囊膜的双股DNA病毒。BHV1的病毒粒子为圆球型，成熟的粒子直径约有150220NM，主要包括核心、衣壳被膜和囊膜三部分。其中核心是由病毒的DNA和蛋白质相互缠绕而成，而核衣壳是一个二十面体，它外观呈六角形，空间上立体对称。其外表面有162个壳粒，周围是一圈带有脂质的囊膜。0004牛传染性鼻气管炎的临床症状分为呼吸道型、生殖道型、流产型、脑炎型和眼炎型五种。呼吸道型表现为鼻气管炎，为本病最常见的一种类型；生殖道型表现为母畜外阴阴道炎，又称传染性脓疱性外阴阴道炎，公畜龟头包皮炎，因此称传染性脓疱性龟头包皮炎；流产型一般见初胎青年母牛怀孕期的任何阶段，也可发生于经产母。

7、牛；脑炎型易发生于46月龄犊牛；眼炎型表现为结膜角膜炎，常与呼吸道型合并发生。IBRV感染后虽然没有显示出很高高的死亡率，但是感染后会造成潜伏感染和终生感染，而且病牛会长期甚至终生都带毒，当机体的抵抗力降低时，则又重新激活，向外排毒，使得该病极难根治。0005该病于1955年被首次发现，至今几乎所有的国家均检出IBR抗体。目前仅在澳大利亚、丹麦、芬兰、挪威、瑞典、瑞士根除了该病。我国最早是于20世纪70年代在进口牛群中发现该病。20世纪80年代由周泰冲等在深圳海关从新西兰的进口奶牛中分离出该病病毒，之后在1986年由邓沛霖、1987年由王则兴等又从乳牛、水牛、黄牛中分离到此病毒，证实IBR在我。

8、国牛群中确实存在。在本实验室，2012年由范强等利用乳胶凝集抗体检测的方法检测了从我国内蒙古、新疆和江苏三省采集的521份临床样品，阳性率达到3457。0006病毒中和试验（VN）和酶联免疫吸附试验（ELISA）是检测抗体的常规方法，欧洲的实验室已经建立一些阻断ELISA方法，主要应用于牛传染性鼻气管炎的流行病学调查中。本发明制备了牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体，用辣根过氧化物酶（HRP）标记该单抗，建立了阻断ELISA抗体检测方法，为牛传染性鼻气管炎提供可靠的数据支持。0007目前许多发达国家均在推行牛传染性鼻气管炎的控制和消灭计划，其基本做法法是推广使用基因缺失疫苗和配套的鉴别诊断试剂盒。

9、，一方面通过疫苗免疫降低发病率和感染率，另一方面通过鉴别诊断筛选出免疫后的带毒牛，将带毒牛进行隔离饲养或直接淘汰，说明书CN104120109A2/13页4逐步使牛群得到净化。我国作为养牛大国，牛传染性鼻气管炎的危害十分严重，有条件的牛场应当借鉴发达国家的做法和经验，逐步实施对牛传染性鼻气管炎的控制和净化，提高经济效益。发明内容0008本发明的目的是在于提供了一种用于牛传染性鼻气管炎GB病毒抗体检测阻断ELISA试剂盒，该试剂盒敏感性强，特异性高，使用方便，易于标准化，与美国IDEXXGE阻断试剂盒相比，有很高阳性符合率及阴性符合率，可以作为诊断牛传染性鼻气管炎的标准方法。0009本发明的另一。

10、个目的是在于提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒在检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体中的应用，该应用用于检测牛血清中有无牛传染性鼻气管炎病毒的抗体出现，即检测被检牛是否感染牛传染性鼻气管炎病毒，灵敏性极强，几乎无假阳性及假阴性出现，尤其适用于大规模样品的检测，可以作为调查牛传染性鼻气管炎流行情况的金标准。0010为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是0011一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒，试剂盒采用灭活的纯化BHV1病毒粒子作为包被抗原,依据阻断ELISA原理检测牛血清中牛传染性鼻气管炎病毒的抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为纯化的BH。

11、V1病毒粒子,其具有良好的抗原性。所述的试剂盒包括由保藏号为CCTCCNOC201345的杂交瘤细胞系分泌的抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白单克隆抗体的酶标记物。申请人于2013年4月3日将该杂交瘤细胞株送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNOC201345，分类命名杂交瘤细胞株1H3。0012一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒，其特征在于杂交瘤细胞株、ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、终止液、底物显色液A、底物显色液B、阳性对照、阴性对照、酶标单克隆抗体所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白单克隆抗体。001。

12、3所述的ELISA板条每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为纯化的BHV1病毒粒子，规格为8孔12条；0014所述的血清稀释液血清稀释液为即用型；0015所述的浓缩洗涤液洗涤液为10倍浓缩，使用前稀释；0016所述的底物显色液A0006H2O2缓冲液；0017所述的底物显色液BTMB显色液；0018所述的终止液0025氢氟酸（HF）；0019阳性对照；阴性对照。0020一种辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白单克隆抗体，其制备步骤是0021一、建立细胞系00221抗原制备说明书CN104120109A3。

13、/13页50023MDBK细胞接种BHV1野毒，待80细胞出现裂解脱落，7882冻融三次，4下，6000RPM离心40MIN，取上清，于4下，25000RPM离心2H，TEN重悬沉淀，利用蔗糖梯度离心法得到纯化的病毒粒子。00242抗原免疫0025灭活纯化病毒粒子后，免疫6周龄BALB/C小鼠,首次基础免疫皮下注射抗原100G/只,使用完全弗氏佐剂；每隔2周进行一次免疫，共三次，皮下注射抗原100G/只/次，使用不完全弗氏佐剂；融合前3天腹腔注射加强免疫，200G/只，不加佐剂。00263杂交瘤细胞的制备0027A饲养细胞的制备0028空白小鼠1只，眼眶放血，收集阴性血清，75（质量分数）酒精。

14、浸泡5MIN，小鼠固定，无菌取脾脏，加3ML基本1640研磨，补加基本1640至10ML，静置2MIN，吸上层与50ML离心管备用，再加基本1640至10ML，重复两次，1000RPM离心10MIN去上清，100MLHAT培养基重悬，37备用。0029B免疫脾细胞的制备0030强化免疫小鼠，眼眶放血收集阳性血清，75（质量分数）酒精浸泡5MIN，小鼠固定，无菌取脾脏，加3ML基本1640研磨，补加基本1640至10ML，静置2MIN，吸上层与50ML离心管备用，再加基0031C骨髓瘤细胞的制备0032拉颈处死，75（质量分数）酒精浸泡5MIN，小鼠固定，无菌取肿瘤，置匀浆器，加5ML基本164。

15、0研磨，补加基本1640至10ML，静置2MIN，吸上层与50ML离心管备用，再加基本1640至10ML，重复两次，1000RPM离心10MIN去上清，基本1640重悬骨髓瘤细胞，总体积达20ML，另一50ML离心管加20ML淋巴细胞分离液，将骨髓瘤细胞悬液轻轻地沿管壁加在分离液之上，1000RPM离心10MIN，吸位于界面致密的白色细胞层（可适当吸取上层培养基），补加适量基本1640，1000RPM离心10MIN，弃上清，加10ML基本1640重悬，计数后4备用。0033D细胞融合及HAT选择杂交瘤0034骨髓瘤细胞（12107）与免疫细胞（1108）于50ML离心管混匀，1000RPM离心。

16、10MIN,倒空上清（灭菌滤纸吸干至沉淀处），轻敲管底，使细胞沉淀略加松动,37水浴中，1MIN内慢慢滴入预温至37度的50PEG08ML，边加边用吸管搅拌，继续搅拌30S后静置1MIN，慢慢加入37预温的基础164040ML（提前装入离心管），具体方法如下（37水浴中完成）第1MIN逐滴滴入1ML，第2MIN加1ML，第34MIN加3ML，第5MIN加5ML，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻搅拌，最后缓慢加入基础1640，补足40ML，总时间为10MIN，1000RPM离心10MIN去上清，重悬有饲养细胞的HAT培养基重悬，分种于4块96孔板，37，5CO2培养箱培养。0035杂交瘤细胞融合两。

17、周后,按照常规免疫酶技术进行杂交瘤细胞的筛选，筛选出能分泌针对牛传染性鼻气管病毒抗体的融合细胞。00364杂交瘤细胞的克隆化和冻存0037A杂交瘤细胞的克隆0038（1）制备饲养层按照2242制备饲养细胞，1820ML完全1640培养基重悬脾细胞，接种96孔细胞培养板。说明书CN104120109A4/13页60039（2）吸管吹打杂交瘤细胞使其悬浮于培养基中，取样、计数，调整浓度至50、20、10/ML，采用有限稀释法，具体步骤为0040完全1640培养基稀释计数后细胞使其浓度为103CELLS/ML，该细胞悬液视为A液；0041取A液02ML于38ML完全640培养基中，其浓度为50CEL。

18、LS/ML，该细胞悬液视为B液；0042取B液16ML于24ML完全640培养基中，其浓度为20CELLS/ML，该细胞悬液视为C液；0043取C液2ML于2ML完全640培养基中，其浓度为10CELLS/ML，该细胞悬液视为D液；0044（3）分别将上述B、C、D杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的培养板中，每孔100L，使每孔分别为5、2、1个细胞，每个稀释度做两列。0045（4）置于37、5CO2培养箱培养，3天后半量换液或补液，7天后细胞上清效价。0046（5）选取OD630NM较高的再次克隆，一般进行3次克隆，至杂交瘤细胞呈单克隆生长，并且细胞上清效价较高。0047B杂交瘤细胞的冻存00。

19、48细胞冻存液含10（体积比）二甲基亚砜的胎牛血清。0049将24孔板中扩大培养的细胞株，在细胞对数生长期时，收集细胞悬液，1000RPM离心10MIN，弃去细胞上清，用适量细胞冻存液重悬，混匀后分装于细胞冻存管中，1ML/管，依次430MIN、202H、80过夜，次日移入液氮罐中进行冻存。0050二、单克隆抗体的制备0051本发明中,大量生产单克隆抗体的方案为小鼠腹水法。0052方法为将小鼠提前五天腹腔注射弗氏不完全佐剂500L/只，然后将阳性细胞的上清收集于离心管中，细胞用1640基础培养基从孔壁上吹打下来，吸入15ML离心管中，1000RPM离心10MIN，然后再用1640基础液重悬，洗。

20、两次，最后用适量的1640基础液重悬，小鼠腹腔注射500L/只。9至10天后，小鼠腹部明显变大，酒精棉在小鼠腹部消毒，用10ML注射器针头插入小鼠腹部，同时用15ML离心管收集从针头中自动流出的腹水。1500RPM离心10MIN，去除细胞，将上清收集于另一个15ML离心管中，冻存于20冰箱中。0053三、单克隆抗体纯化及辣根过氧化酶标记00541单克隆抗体的纯化0055上述获得的腹水单抗的纯化方案为辛酸一硫酸铵沉淀法。0056步骤为将收集的腹水12000RPM离心5分钟，取上清XML；加入4XML的醋酸缓冲液；每XML上述腹水加辛酸33UL，边加边搅拌（慢）；加完后继续搅拌30MIN，然后在4。

21、下12000RPM离心30MIN；上清用滤纸进行过滤，收集的上清调PH74；45SAS沉淀一次，搅拌30MIN后4沉淀过夜；4下12000RPM离心30MIN，去上清，用10MMTRIS（PH90）重悬沉淀，再用10MMTRIS（PH90）透析3天，每天换一次透析液；吸出分装，1ML每管，20保存。0057纯化后的单克隆抗体辣根过氧化酶标记的制备方案为改良过碘酸钠法。0058步骤为取5MGHRP溶于05ML蒸馏水；加入05ML006MOL/LNAIO4，4轻搅说明书CN104120109A5/13页730MIN，溶液呈黄绿色；加入05ML016MOL/L乙二醇，室温避光轻搅作用30MIN，终止。

22、氧化反应；加入5MG抗体（IGG），装入透析袋，置005MOL/L，PH96碳酸盐缓冲液1000ML中，4透析过夜，更换3次；取出透析袋中液体，加入5MG/MLNAHB402ML42H或过夜；加等体积饱和硫酸铵溶液沉淀结合物，置430MIN后，3000RPM离心15MIN，弃上清；将沉淀物溶于PBS（002MPH74）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡612H，换液3次；透析后吸出液体分装于20保存。0059将制备抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系进行保藏，申请人于2013年4月1日将该杂交瘤细胞株送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNOC20。

23、1345，分类命名杂交瘤细胞株1H3。0060四、单克隆抗体抗原表位的鉴定00611免疫沉淀0062取200L纯化BHV1病毒粒子，加入133LEXTRACTIONBUFFER（含有PMSF和APTOTININ），充分混匀溶解。0063将上述溶液于80冻存4H以上。0064取出并迅速解冻，加入25TRITON10033L，冰水放置30MIN后重悬。0065加入约1G空白小鼠血清和20LPROTEINAGAGAROSE，4下震摇4H。00662500RPM离心5MIN，取上清共300L，分装150L/管。0067两管分别加入约2G单克隆抗体1H3，4下震摇过夜。0068加入40LPROTEINA。

24、GAGAROSE，4下震摇3H。00692500RPM离心5MIN，弃上清。0070PBS洗沉淀5次。007140L1SDSPAGESAMPLEBUFFER重悬沉淀，瞬时高速离心。007295下处理5MIN。0073进行SDSPAGE与WESTERNBLOT。00742质谱鉴定0075将SDSPAGE胶图（附图2A）中与WESTERNBLOT（附图2B）对应的蛋白胶上的条带切下，送武汉言行生物进行质谱鉴定，鉴定结果与WESTERNBLOT结果均显示单克隆抗体1H3针对牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白。0076一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒在检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体。

25、中的应用。其应用过程是00771本发明试剂盒的检测原理0078采用阻断法,将灭活的纯化BHV1病毒粒子包被于微孔板中,然后用1BSA将酶标板封闭，加入待测样品及标准阳性对照、阴性对照，37孵育后加入酶标单克隆抗体，继续在37下孵育后，加入辣根过氧化物酶底物显色，终止液终止反应，通过酶标仪在630NM波长下,测定各孔吸光度值，OD值的大小终止显色反应后颜色的深浅与待测样本中牛传染性鼻气管炎病毒抗体的含量成反比。00792本发明试剂盒的组成0080A酶标板的最佳制备方法0081用PH96005M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液,将上述制备的纯化BHV1病毒说明书CN104120109A6/13页8粒子。

26、稀释成4G/ML，按100L/孔加入微孔板中，包被过夜，次日，弃去包被液，按200UL/孔加入1BSA的封闭液，37静置2小时，洗涤甩干后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。0082B工作试剂的配置0083洗涤液PH74，015MPBSKH2PO402G，NA2HPO412H2O29G，NACL80G，KCL02G，TWEEN20011ML，加蒸馏水至L000ML，浓缩成10倍作为存储液。0084血清稀释液牛血清白蛋白01G，加洗涤缓冲液至100ML。0085底物缓冲液PH50磷酸盐柠檬酸缓冲液，02MNA2HPO4257ML,01M柠檬酸243ML,加蒸馏水50ML。0086底物显色液A000。

27、6H2O2缓冲液；0087底物显色液B取NA2HPO412H2O142G，柠檬酸105G,用DDH2O定容至500M配成01ML磷酸盐柠檬酸缓冲液，PH50，按终浓度为20MG/L添加联苯二胺；0088终止液0025氢氟酸（HF）；HF40625L，用DDH2O定容至100ML。0089C标准BHV1阳性血清及标准BHV1阴性血清的制备0090在ELISA检测过程中不同的操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品OD值的误差。本发明研制了标准BHV1抗体阳性对照血清和标准BHV1抗体阴性对照血清,用于检测条件的优化和检测结果的判定。0091标准阳性血清的制备0092选用。

28、健康成年牛，免疫前经检测为牛传染性鼻气管炎抗体阴性后，隔离观察7日。将牛传染性鼻气管炎病毒悬液灭活后，加入等量的佐剂乳化后作为免疫原。通过颈部肌肉注射途径分3次接种免疫原，每次间隔21日，末次免疫后710日采血检测。采血并分离血清，用待检血清进行ELISA试验检测抗体。取备用血清经56灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，按血清量的001加入硫柳汞，045M滤膜过滤除菌。无菌分装，每管1ML，4贮存。0093标准阴性血清的制备0094选用健康成年牛，经检测为牛传染性鼻气管炎阴性抗体阴性，隔离观察7日后，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心并分离血清备用（28保存，有效期为12个月）。取备用血。

29、清经56灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，按血清量的001加入硫柳汞，045M滤膜过滤除菌，无菌分装，每管1ML，4贮存。0095D检测牛传染性鼻气管炎的阻断ELISA试剂盒的组建0096组建牛传染性鼻气管炎的酶联免疫试剂盒,包含以下组分009796孔酶标板；辣根过氧化物酶标记的单抗；标准阳性对照；标准阴性对照；浓缩洗涤液；0098血清稀释液；终止液。00993本发明试剂盒的检测方法0100A用上述制备的试剂盒进行检测01011将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100L，加入酶标板，37孵育1小时01022洗涤液清洗35次；01033每孔加入稀释后的酶标单克隆抗体10。

30、0L，37孵育1H说明书CN104120109A7/13页901044洗涤液清洗35次；01055每孔加入底物A、B各50L，37孵育15MIN；01066每孔加入终止液50L；01077酶标仪检测630NM吸光度值。0108B检测结果分析01091测中阴性对照血清NC的OD值与阳性对照血清PC的OD值差值至少为04即NCPC04，检测被认为有效。0110S样品孔OD630值，N阴性对照孔OD630值。0111如果S/N比值06，样品判定为BHV1抗体阳性。0112如果S/N比值07但06，样品重测。0113如果S/N比值07，样品判定为BHV1抗体阴性。01142检测时阳性及阴性对照使用复孔。

31、，最终使用OD值为两个的平均值。0115本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果0116现有技术有乳胶凝集和中和试验等，乳胶凝集虽然操作简便但敏感性很低，假阴性率很高，中和试验操作繁琐，对技术人员的实验操作能力要求高，不易于大规模样品的检测。而本发明敏感性强，特异性高，使用方便，易于标准化，建立了一种准确、快速、安全性好、能够进行大量筛查牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测的方法,并且该试剂盒与美国IDEXX试剂盒有很高的符合率,阳性符合率为9612，阴性符合率为100，总符合率为9757，几乎无假阳性与假阴性出现，为动物检验检疫部门提供了一套实用性强，效果可靠的诊断试剂盒产品。下表为所建立试剂盒与美。

32、国IDEXX试剂盒的比对结果即敏感性试验结果011701180119而交叉反应性试验结果显示该方法特异性很高，得出该方法除与BHV5有交叉反应外，与其它病毒均无交叉反应，因为BHV1与BHV5二者同源性高达82以上，所以此结果也在意料之内，下表为特异性试验结果0120说明书CN104120109A8/13页10附图说明0121图1为一种牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒的整个制备流程。0122图2ASDSPAGE及BWESTERNBLOT具体实施方式0123实施例10124一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒，包括杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株申请人于20。

33、13年4月3日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNOC201345，分类命名杂交瘤细胞株1H3。0125一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒，其特征在于杂交瘤细胞株、ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、终止液、底物显色液A、底物显色液B、阳性对照、阴性对照、酶标单克隆抗体所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白单克隆抗体。0126所述的ELISA板条每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为纯化的BHV1病毒粒子，规格为8孔12条；0127所。

34、述的血清稀释液血清稀释液为即用型；0128所述的浓缩洗涤液洗涤液为10倍浓缩，使用前稀释；0129所述的底物显色液A0006H2O2缓冲液；0130所述的底物显色液BTMB显色液；0131所述的终止液0025氢氟酸（HF）；0132所述的酶标单克隆抗体所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白单克隆抗体；阳性对照；阴性对照。0133一种辣根过氧化物酶标记的鼠抗牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白单克隆抗体，其制备步骤是说明书CN104120109A109/13页110134一、建立细胞系01351抗原制备0136MDBK细胞接种BHV1野毒，待80细胞出现裂解脱落，80冻融三次，4下，6。

35、000RPM离心40MIN，取上清，于4下，25000RPM离心2H，TEN重悬沉淀，利用蔗糖梯度离心法得到纯化的病毒粒子。01372抗原免疫0138灭活纯化病毒粒子后，常规方法免疫6周龄BALB/C小鼠,首次基础免疫皮下注射抗原100G/只,使用完全弗氏佐剂；每隔2周进行一次免疫，共三次，皮下注射抗原100G/只/次，使用不完全弗氏佐剂；融合前3天腹腔注射加强免疫,200G/只,不加佐剂。01393杂交瘤细胞的制备0140A饲养细胞的制备0141空白小鼠1只，眼眶放血，收集阴性血清，75（质量分数）酒精浸泡5MIN，小鼠固定，无菌取脾脏，加3ML基本1640研磨，补加基本1640至10ML，。

36、静置2MIN，吸上层与50ML离心管备用，再加基本1640至10ML，重复两次，1000RPM离心10MIN去上清，100MLHAT培养基重悬，37备用。0142B免疫脾细胞的制备0143强化免疫小鼠，眼眶放血收集阳性血清，75（质量分数）酒精浸泡5MIN，小鼠固定，无菌取脾脏，加3ML基本1640研磨，补加基本1640至10ML，静置2MIN，吸上层与50ML离心管备用，再加基0144C骨髓瘤细胞的制备0145拉颈处死，75（质量分数）酒精浸泡5MIN，小鼠固定，无菌取肿瘤，置匀浆器，加5ML基本1640研磨，补加基本1640至10ML，静置2MIN，吸上层与50ML离心管备用，再加基本16。

37、40至10ML，重复两次，1000RPM离心10MIN去上清，基本1640重悬骨髓瘤细胞，总体积达20ML，另一50ML离心管加20ML淋巴细胞分离液，将骨髓瘤细胞悬液轻轻地沿管壁加在分离液之上，1000RPM离心10MIN，吸位于界面致密的白色细胞层（可适当吸取上层培养基），补加适量基本1640，1000RPM离心10MIN，弃上清，加10ML基本1640重悬，计数后4备用。0146D细胞融合及HAT选择杂交瘤0147骨髓瘤细胞（12107）与免疫细胞（1108）于50ML离心管混匀，1000RPM离心10MIN,倒空上清（灭菌滤纸吸干至沉淀处），轻敲管底，使细胞沉淀略加松动,37水浴中，1。

38、MIN内慢慢滴入预温至37度的50PEG08ML，边加边用吸管搅拌，继续搅拌30S后静置1MIN，慢慢加入37预温的基础164040ML（提前装入离心管），具体方法如下（37水浴中完成）第1MIN逐滴滴入1ML，第2MIN加1ML，第34MIN加3ML，第5MIN加5ML，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻搅拌，最后缓慢加入基础1640，补足40ML，总时间为10MIN，1000RPM离心10MIN去上清，重悬有饲养细胞的HAT培养基重悬，分种于4块96孔板，37，5CO2培养箱培养。0148杂交瘤细胞融合两周后,按照常规免疫酶技术进行杂交瘤细胞的筛选，筛选出分泌针对牛传染性鼻气管炎病毒抗体的融合。

39、细胞。01495杂交瘤细胞的克隆化和冻存说明书CN104120109A1110/13页120150A杂交瘤细胞的克隆克隆化方案为有限稀释法，按照常规杂交瘤细胞克隆方法进行,同法克隆进行三次。0151B杂交瘤细胞的冻存细胞冻存液含10（体积比）二甲基亚砜的胎牛血清。0152将24孔板中扩大培养的细胞株，在细胞对数生长期时，收集细胞悬液，1000RPM离心10MIN，弃去细胞上清，用适量细胞冻存液重悬，混匀后分装于细胞冻存管中，1ML/管，依次430MIN、202H、80过夜，次日移入液氮罐中进行冻存。0153将制备抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日。

40、2013年4月3日，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNOC201345，分类命名杂交瘤细胞株1H3。0154二、单克隆抗体制备0155本发明中,大量生产单克隆抗体的方案为小鼠腹水法。0156具体方法为将小鼠提前五天腹腔注射弗氏不完全佐剂500L/只，然后将阳性细胞的上清收集于离心管中，细胞用1640基础培养基从孔壁上吹打下来，吸入15ML离心管中，1000RPM离心10MIN，然后再用1640基础液重悬，洗两次，最后用适量的1640基础液重悬，小鼠腹腔注射500L/只。9至10天后，小鼠腹部明显变大，酒精棉在小鼠腹部消毒，用10ML注射器针头插入小鼠腹部，同时用15ML离心管收集从针头。

41、中自动流出的腹水。1500RPM离心10MIN，去除细胞，将上清收集于另一个15ML离心管中，冻存于20冰箱中。0157三、单克隆抗体纯化及辣根过氧化酶标记01581单克隆抗体的纯化0159上述获得的腹水单抗的纯化方案为辛酸硫酸铵沉淀法。0160具体步骤为将收集的腹水12000RPM离心5分钟，取上清XML；加入4XML的醋酸缓冲液；每XML上述腹水加辛酸33UL，边加边搅拌（慢）；加完后继续搅拌30MIN，然后在4下12000RPM离心30MIN；上清用滤纸进行过滤，收集的上清调PH74；45SAS沉淀一次，搅拌30MIN后4沉淀过夜；4下12000RPM离心30MIN，去上清，用10MMT。

42、RIS（PH90）重悬沉淀，再用10MMTRIS（PH90）透析3天，每天换一次透析液；吸出分装，1ML每管，20保存。0161纯化后的单克隆抗体辣根过氧化酶标记的制备方案为改良过碘酸钠法。0162具体步骤为取5MGHRP溶于05ML蒸馏水；加入05ML006MOL/LNAIO4，4轻搅30MIN，溶液呈黄绿色；加入05ML016MOL/L乙二醇，室温避光轻搅作用30MIN，终止氧化反应；加入5MG抗体（IGG），装入透析袋，置005MOL/L，PH96碳酸盐缓冲液1000ML中，4透析过夜，更换3次；取出透析袋中液体，加入5MG/MLNAHB402ML42H或过夜；加等体积饱和硫酸铵溶液沉淀。

43、结合物，置430MIN后，3000RPM离心15MIN，弃上清；将沉淀物溶于PBS（002MPH74）中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡612H，换液3次；透析后吸出液体分装于20保存。0163四、单克隆抗体抗原表位的鉴定01641免疫沉淀0165取200L纯化BHV1病毒粒子，加入133LEXTRACTIONBUFFER（含有PMSF和APTOTININ），充分混匀溶解。0166将上述溶液于80冻存4H以上。说明书CN104120109A1211/13页130167取出并迅速解冻，加入25TRITON10033L，冰水放置30MIN后重悬。0168加入约1G空白小鼠血清和20LPROTEI。

44、NAGAGAROSE，4下震摇4H。01692500RPM离心5MIN，取上清共300L，分装150L/管。0170两管分别加入约2G单克隆抗体1H3，4下震摇过夜。0171加入40LPROTEINAGAGAROSE，4下震摇3H。01722500RPM离心5MIN，弃上清。0173PBS洗沉淀5次。017440L1SDSPAGESAMPLEBUFFER重悬沉淀，瞬时高速离心。017595下处理5MIN。0176进行SDSPAGE与WESTERNBLOT。01772质谱鉴定0178将SDSPAGE胶图（附图2A）中与WESTERNBLOT（附图2B）对应的蛋白胶上的条带切下，送武汉言行生物进行。

45、质谱鉴定，鉴定结果与WESTERNBLOT结果均显示单克隆抗体1H3针对牛传染性鼻气管炎病毒GB蛋白。0179实施例20180一种用于牛传染性鼻气管炎病毒GB抗体检测阻断ELISA试剂盒在检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体中的应用。其应用过程是01811本发明试剂盒的检测原理0182采用阻断法,将灭活的纯化的BHV1病毒粒子包被于微孔板中,然后用1BSA将酶标板封闭，加入待测样品及标准阳性对照、阴性对照，37孵育后加入酶标单克隆抗体，继续在37下孵育后，加入辣根过氧化物酶底物显色，终止液终止反应，通过酶标仪在630NM波长下,测定各孔吸光度值，OD值的大小终止显色反应后颜色的深浅与待测样本中牛传染性。

46、鼻气管炎病毒抗体的含量成反比。01832本发明试剂盒的组成0184A酶标板的最佳制备方法0185用PH96005M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液,将上述制备的纯化BHV1病毒粒子稀释成4G/ML，按100L/孔加入微孔板中，包被过夜，次日，弃去包被液，按200UL/孔加入1BSA的封闭液，37静置2小时，洗涤甩干后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。0186B工作试剂的配置0187洗涤液PH74，015MPBSKH2PO402G，NA2HPO412H2O29G，NACL80G，KCL02G，TWEEN20011ML，加蒸馏水至L000ML，浓缩成10倍作为存储液。0188血清稀释液牛血清白蛋白01。

47、G，加洗涤缓冲液至100ML。0189底物缓冲液PH50磷酸盐柠檬酸缓冲液，02MNA2HPO4257ML,01M柠檬酸243ML,加蒸馏水50ML。0190底物显色液A0006H2O2缓冲液；0191底物显色液B取NA2HPO412H2O142G，柠檬酸105G,用DDH2O定容至500M配成01ML磷酸盐柠檬酸缓冲液，PH50，按终浓度为20MG/L添加联苯二胺；0192终止液0025氢氟酸（HF）；HF40625L，用DDH2O定容至100ML。0193C标准BHV1阳性血清及标准BHV1阴性血清的制备说明书CN104120109A1312/13页140194在ELISA检测过程中不同的。

48、操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品OD值的误差。本发明研制了标准BHV1抗体阳性对照血清和标准BHV1抗体阴性对照血清,用于检测条件的优化和检测结果的判定。0195标准阳性血清的制备0196选用健康成年牛，免疫前经检测为牛传染性鼻气管炎抗体阴性后，隔离观察7日。将牛传染性鼻气管炎病毒悬液灭活后，加入等量的佐剂乳化后作为免疫原。通过颈部肌肉注射途径分3次接种免疫原，每次间隔21日，末次免疫后710日采血检测。采血并分离血清，用待检血清进行ELISA试验检测抗体。取备用血清经56灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，按血清量的001加入硫柳汞，045M滤膜过滤除菌。无。

49、菌分装，每管1ML，4贮存。0197标准阴性血清的制备0198选用健康成年牛，经检测为牛传染性鼻气管炎阴性抗体阴性，隔离观察7日后，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心并分离血清备用（28保存，有效期为12个月）。取备用血清经56灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，按血清量的001加入硫柳汞，045M滤膜过滤除菌，无菌分装，每管1ML，4贮存。0199D检测牛传染性鼻气管炎的阻断ELISA试剂盒的组建0200组建牛传染性鼻气管炎的酶联免疫试剂盒,包含以下组分020196孔酶标板；辣根过氧化物酶标记的单抗；标准阳性对照；标准阴性对照；浓缩洗涤液；0202血清稀释液；终止液。02033本发明试剂盒的检测方法0204A用上述制备的试剂盒进行检测02051将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100L，加入酶标板，37孵育1小时02062洗涤液清洗35次；02073每孔加入稀释后的酶标单克隆抗体100L，37孵育1H02084洗涤液清洗。