蛋白质反压过滤 相关申请的交叉引用
本申请根据 35U.S.C.§119(e) 享有于 2007 年 12 月 28 日申请的美国临时专利申 请 No.61/017,418 的优先权， 将其并入本文以供参考。
技术领域
本公开通常涉及用于蛋白质纯化的过滤方法。更具体的是， 本申请涉及比如在液 体中被传输时易受剪切力损害的蛋白质 ( 比如对剪切敏感的蛋白质、 凝血级联的蛋白质 ) 的低剪切、 反压灭菌过滤。 背景技术
被纯化的蛋白质混合物可以给药于病人用于各种治疗。 被制备的用于向病人输液 的被纯化的蛋白质混合物在使用前必须灭菌。 用于一些蛋白质的合适的灭菌过程包括被纯 化的蛋白质混合物的膜过滤。当蛋白质能通过膜， 滤过膜可以尺寸调整为保留 ( 即从蛋白 质混合物中除去 ) 微粒、 微生物和一些病毒。 然而， 一些蛋白质不能通过使用常规方法例如膜过滤来有效地回收成被纯化的、 灭菌的蛋白质。当试图过滤那些对剪切敏感和 / 或凝血级联部分的蛋白质时， 这种影响是 最明显的。 这个蛋白质的例子是冯威勒布兰特因子 (vWF)， 其在血浆中循环， 与因子 VIII 形 成复合物并促进生物凝血活性的调节。具体地说， vWF 蛋白质对输送液体介质的速度梯度 所产生的剪切力是敏感的， 尤其是当 vWF 蛋白质穿过或靠近滤膜 ( 即， 在滤膜孔附近液流集 聚和迂曲的流路的地方导致尤其大的速度梯度 ) 时。因此， 当过滤装置以足够大的压力运 转以便理想地产生想要的加工流速时， 增加的流速 ( 和伴随地引起的剪切力的增加 ) 倾向 于降低加工收率， 比如通过损害或破坏蛋白质、 和 / 或通过随着时间降低过滤速度。
因此， 希望能开发出过滤纯化后的 vWF 混合物的方法， 该方法对 vWF 基本上没有损 害， 而且随着时间的过去此方法仍然允许适当高的加工通量 ( 即过滤速度 )。另外， 希望开 发出能通常应用于任何蛋白质的过滤方法， 以致于一般的蛋白质可以以高效的速度被过滤 ( 如灭菌过滤 ) 而蛋白质基本上没有遭受损害 / 损失。
发明内容 被公开的方法可用于以分批或者连续的方式过滤液体混合物中的蛋白质， 基本上 没有损害或另外限制过滤滤液中蛋白质的回收。本方法通常将相反的压力施加于滤液上， 以便精确地减少和控制横跨过滤器的压力差。被公开的方法的优势在于 ： 在相对低的压力 差下可以达到相对高的过滤流速， 相比之下， 高压力差实际上降低了蛋白液体混合物的过 滤流速。更进一步地， 本方法基本上可以回收最初存在于液体混合物中的所有蛋白质。
更具体地说， 本公开提供了液体蛋白质混合物的过滤方法。 根据一种实施方式， 本 方法包括 ： 在第一个压力 P1 下提供液体混合物， 在第二个压力 P2 下液体混合物穿过过滤层 形成滤液， 并施加反压于滤液上以致于 P1-P2 的压力差不大于 300mbar。在另一个实施方式
中， 本方法包括以下步骤 ： 在第一个压力 P1 下提供液体混合物， 在第二个压力 P2 下使液体混 合物穿过过滤器形成滤液， 并将足以产生至少大约 300g/ 分钟·m2 过滤器表面面积的平均 滤液流速的反压于施加滤液上。液体混合物包括载体液体、 相对于载体液体在第一浓度 C1 下的蛋白质、 以及分散的污染物。滤液包括载体液体和相对于载体液体在第二浓度 C2 下的 蛋白质。过滤器是尺寸调整为从液体混合物中除去至少一部分分散的污染物。
在另一个实施方式中， 本方法能够过滤蛋白质水溶液混合物， 并且包括以下步骤 ： 在第一个压力 P1 下提供水溶液混合物， 在第二个压力 P2 下使水溶液混合物穿过多孔滤膜过 滤器形成滤液， 并施加反压于滤液上以致于压力差 P1-P2 不大于大约 90mbar。水溶液混合 物包括水和相对于水在第一浓度 C1 下的 vWF。滤液包括水和相对于水在第二浓度 C2 下的 vWF。多孔滤膜过滤器包括大小范围是大约 0.1μm 至大约 0.5μm 的孔。
在上述的任何一个实施方式中， 蛋白质优选是对剪切敏感的蛋白质和 / 或凝血级 联的蛋白质。更进一步地， 在滤液中蛋白质被回收， 优选回收比率 C2/C1 至少是大约 0.95， 更优选地是至少大约 0.99。 另外， 压力差 P1-P2 优选不大于大约 90mbar 并且第一压力 P1 优 选至少是大约 200mbar 的表压。上述方法的优选实施方式包括其中载体液体是水、 并且分 散的污染物包括微生物。蛋白可以包括冯威勒布兰特因子、 因子 VIII、 因子 XIII 和它们的 混合物。过滤器优选包括多孔滤膜过滤器， 孔径大小范围是从大约 0.1μm 至大约 0.5μm， 更优选孔径大小是大约 0.2μm 或大约 0.22μm。优选地， 滤液产物基本上不含分散的污染 物。
在反压的应用下， 蛋白的过滤允许蛋白以相对高的浓度、 相对高的滤液流速被回 收， 相反在没有反压的情况下不可能达到基本上恒定的滤液流速。这是与过滤理论的一般 应用至少在关于滤液流速方面是相反的， 因为理论预测随着增加横跨过滤器的压力差滤液 流速会增加 ( 即在没有反压的情况下 )。
从下面的详细说明、 连同附图看来， 进一步的方面和优势对于本领域中的技术人 员是很显而易见的。 此处描述的组合物、 膜和组允许各种形式的实施方式， 下面的描述中的 特定的实施方式被理解为是用来阐述发明的， 而不是将本发明限制于此处描述的特定的实 施方式。 附图说明
此处附加两个附图以便于理解本公开。 图 1 是轴对称的筒式过滤器的横截面， 用于蛋白质的反压过滤。 图 2 是使用常规过滤法与反压过滤法得到的过滤速度数据的比较。具体实施方式
此处描述的本方法通常可用于液体混合物中蛋白质的过滤纯化， 该方式中基本上 没有损害或另外限制过滤期间蛋白质的回收。除蛋白质之外， 液体混合物还包括载体液体 和分散的污染物。载体液体是蛋白质的悬浮介质， 通常不受限制。优选载体液体是水。类 似地， 分散的污染物也不是特别地受限制， 可以包括任何分散的固体物质， 是最终的纯化蛋 白滤液中不想要的成分。在灭菌过滤操作的情况下， 分散的污染物通常包括可能存在于液 体混合物中的各种微生物 ( 即细菌 ) 的任何一种。被公开的方法尤其优选地应用于那些对剪切敏感的蛋白质、 人凝血级联部分的蛋 白质、 或者两者 ( 即， 一些合适的蛋白质比如 vWF， 既可以分类为对剪切敏感的蛋白质又可 以分类为凝血级联的蛋白质 )。
适用于使用被公开的反压过滤方法进行纯化的对剪切敏感的蛋白质包括那些当 作为在耐受大剪切力 ( 即相对大的速度梯度 ) 的载体液体中的悬浮液被输送时易受损害、 破坏、 活性损失、 和 / 或过滤速度下降的蛋白质。通常， 对剪切敏感的蛋白质是过滤速度与 超过临界外加剪切之上的外加剪切 ( 或者外加压力 ) 之间呈现出反比例关系的蛋白质。在 临界外加剪切 ( 或者外加压力 ) 这一点， 过滤速度和外加剪切 ( 外加压力 ) 的正比例关系 和反比例关系发生转换 ( 即转换发生在过滤速度是最大值时 )， 临界外加剪切对于不同的 对剪切敏感的蛋白也许是不同的。例如， 临界的外加剪切可以至少是大约 2000S-1( 或者至 少大约 4000S-1) 并不大于大约 8000S-1( 或不大于 12000S-1)。然而， 不同的对剪切敏感蛋白 的定性行为被预期是相似的。对剪切敏感的蛋白包括 vWF， 虽然被公开的方法不是特别限 制于此。vWF 以一系列寡聚 / 多聚形式存在于血浆， 这些形式的分子量范围基于二聚物为 520kDa 是从大约 1000kDa( 千道尔顿 ) 至大约 20000kDa， 被公开的方法不是必然受限于特 别的分子量范围。 被公开的方法通常也适用于人凝血级联的蛋白质 ( 即， 凝血因子 ) 的纯化。比如， 凝血因子 II( 分子量大约 37kDa)、 VII( 大约 50kDa)、 VIII ： C( 大约 260kDa)、 IX( 大约 55kDa 至大约 70kDa)、 X( 大约 100kDa)、 XIII( 大约 350kDa)、 vWF( 如上所述 )， 以及它们的组合 物， 它们中的一些也是对剪切敏感的， 可以通过使用反压被有效地过滤和回收。
一些特别优选的纯化蛋白包括单一的蛋白例如因子 XIII 或 vWF、 和多蛋白组合物 例如因子 VIII ： C/vWF 复合物。 优选不是特别对剪切敏感的蛋白组合物， 但是通过使用反压 仍然顺利地被过滤， 该蛋白组合物是 FEIBA VH 混合物 (“( 蒸汽加热的 ) 因子八抑制剂旁 通道活性因子” ， 来自于巴克斯特， Deerfield， 伊利诺斯州 )， 可用于控制自发性出血和 / 或 治疗血友病 A/B 病人。FEIBA VH 混合物包括因子 II、 IX 和 X( 主要是未被活化的 )、 因子 VIII( 主要是被活化的 ) 以及因子 VIII ： C( 大约 1 至 6 个单位 /ml)。FEIBA VH 混合物受 益于反压的使用， 因为当反压被应用时， 蛋白混合物可以以比较高的过滤速度被过滤， 而蛋 白活性损失很少或没有损失。
包含蛋白和分散的污染物的液体混合物然后通过过滤器被纯化。 根据被公开的方 法， 适合采用的过滤器并不受特别的限制， 可以包括表面过滤器比如终端过滤器 ( 即液体 是垂直地通过过滤器表面而被过滤 ) 和错流过滤器 ( 即液体是平行于过滤器表面移动而被 过滤 )。参见比如 Kirk-Othmer， 《化学工艺学专科全书》 ， 第 10 卷， 第 788-853 页 ( “过滤” ) (1993 年第 4 版 )。关于它们的分级大小 ( 即， 此大小之上的分散物质在过滤器上被保留， 并且此大小之下的分散物质进入了滤液 )， 过滤器同样没有受特别的限制。 一旦过滤分级大 小被选中用于特定的应用中 ( 即， 待保留的分散物质相对于进入滤液的分散物质 )， 运转过 滤器时应当考虑流过过滤器的载体液体产生的剪切量相对于被过滤的特定蛋白质的剪切 敏感性。
优选的过滤介质是多孔滤膜， 通常有不同的大小 ( 即， 过滤器表面面积 ； 比如范围 2 2 从 0.001m 至大约 5m ) 和构造 ( 即， 滤片、 滤芯 )。多孔滤膜可以由下述材料形成 ： 例如硝 酸纤维素、 醋酸纤维素、 乙烯基聚合物、 聚酰胺、 碳氟化合物和聚醚砜。 多孔滤膜包括的孔通
常具有高度均一的大小， 这取决于要从液体混合物中被排除出去的分散污染物的大小。比 如， 在灭菌过滤的操作中想要除去微生物 ( 同时允许蛋白通过过滤器进入滤液 )， 孔径优 选的大小范围是大约 0.1μm 至大约 0.5μm， 或者大约 0.15μm 至大约 0.25μm， 例如大约 0.2μm 或大约 0.22μm。合适的多孔滤膜过滤器也可以包括 0.2μm/0.22μm 过滤器和粗 预过滤器 ( 例如， 大约 0.45μm)， 以便提高通量并限制滤饼积聚在 0.2μm/0.22μm 的过滤 器表面上。 用于含有蛋白质的液体混合物灭菌过滤的合适的商用多孔滤膜过滤器的例子包 括： SARTOBRAN P 0.2μm 醋酸纤维膜 ( 包括 0.2μm 滤孔并具有 0.45μm 滤孔的预过滤器 膜， 购自 Sartorius AG， 德国 ) 和 SUPOR EKV 0.2μm 聚醚砜膜 ( 购自 Pall 公司， East Hills， 纽约 )。
图 1 显示了液体混合物流过过滤器 100 比如具有多孔滤膜的筒式过滤器的情况。 正如所显示的那样， 液体混合物通过入口 110 进入密封的过滤器 100 的进水室 120。 进水室 120 的液体被加压， 具有的第一个压力 P1 通常高于环境压力 ( 即， 大约 1bar 绝对大气压 )。 进水室 120 中的第一个压力 P1 驱使液体混合物中的载体液体和蛋白穿过多孔滤膜 130。穿 过滤膜 130 的物质形成滤液， 在滤液室 140 中的滤液包括载体液体和蛋白质。滤液室 140 中的液体也被加压， 具有比第一压力 P1 小的第二压力 P2， 但是通常也高于环境压力。然后 被纯化的滤液通过出口 150 从过滤器流出。通过出口 150 的流速 ( 和第二压力 P2) 通过反 压调节器 160 被调节。
滤膜 130 的孔径尺寸调整为除去液体混合物中含有的至少一部分分散的污染物， 被去除的分散的污染物被保留在滤膜 130 的入口一侧 ( 即， 在进水室 120 中 )。优选地， 滤 膜 130 尺寸调整为基本上去除最初存在于入口液体混合物中的所有分散污染物 ； 因此， 滤 液基本上不含 ( 或者不含 ) 分散的污染物。具体地说， 滤液应当不含有一定数量的分散的 污染物， 该数量的污染物会不利地影响被过滤和被纯化的蛋白混合物作为治疗组合物的应 用。比如， 当分散的污染物包括微生物时， 滤膜 130 应当能够去除至少大约 10 7 个菌落形成 单位每 cm2 过滤面积。
入口液体混合物的第一压力 P1 可以通过任何合适的来源比如重力、 压缩气体 ( 如 压缩空气 ) 或者泵 ( 如低剪切泵 ) 被施加。优选地， 第一压力 P1 至少是大约 200mbar 表压， 或者范围是大约 200mbar 至大约 1000mbar 表压 ( 即大约 1bar 表压 )， 比如 300mbar 表压。 反压 ( 或者背压 ) 也可以通过任何合适的来源比如常规阀 ( 图 1 中显示的反压调节器 160) 被施加， 以便得到出口滤液的第二压力 P2。另外， 反压同样可以通过沿着出口 150 通路的流 动集聚、 阻塞等被施加。作为第一和第二压力 P1 和 P2 的结果， 被施加的反压产生 ( 正的 ) 压力差 P1-P2， 驱使载体液体和蛋白穿过过滤器进入滤液中。压力差是较低的， 合适的最大 压力差取决于各种因素， 比如被过滤的特定的蛋白和使用的特定的过滤器。 尤其是， 压力差 优选不大于大约 300mbar、 200mbar、 150mbar 或者 120mbar， 更加优选不大于大约 90mbar 或 者 50mbar， 甚至更加优选不大于大约 20mbar 或者 10mbar， 比如不大于 5mbar 或者不大于 3mbar。
在这种压差下， 穿过过滤器的流速是足够低的， 以便能产生低剪切的环境， 此剪切 环境基本上对蛋白的活性没有损害、 破坏或者减小。低剪切环境进一步基本上不限制过滤 过程的收率。
具体地说， 可以看到低压力差可以获得比较高的和基本上恒定的过滤速度。尤其是， 低的压力差可以被用于获得至少大约 300g/ 分钟·m2 的平均过滤流速， 比如大约 300g/ 2 2 2 分钟·m 至大约 1000g/ 分钟·m 或者大约 400g/ 分钟·m 至大约 800g/ 分钟·m2， 此处单 位是每单位时间 ( 即分钟 ) 获得的滤液质量 ( 即载体液体和蛋白结合的克数 )， 并被归一化 2 为过滤器的每单位表面面积 ( 即 m )。由反压的应用导致的低压力差还可以产生基本上恒 定的过滤速度， 尤其是在瞬时启动完成后， 这样提高了过滤器的净容量。 与在低压力差下看 到的过滤速度相比 ( 这与一般的过滤理论相反， 理论意味着过滤速度与横跨过滤器的压力 差成正比 )， 较高的压力差 ( 比如超过大约 100mbar) 趋向于降低过滤速度。 因此， 常规的过 滤法， 施加的压力差至少是大约 100mbar 至大约 300mbar， 不能达到在本公开的方法中看到 的平均流速。
更进一步地， 可以看到低压力差可以获得比较高的蛋白回收率。 具体地说， 最初存 在于液体混合物中的基本上所有蛋白质都被优选地回收在滤液中。比如， 当第一浓度 C1 指 的是在初始液体混合物中相对于载体液体的蛋白浓度， 第二浓度 C2 指的是在最终滤液中相 对于载体液体的蛋白浓度， 那么被公开的过滤法的回收率 C2/C1 优选至少是大约 0.95， 并且 更加优选至少是大约 0.99。
当被公开的反压过滤方法被应用于蛋白质时是有用的， 因为该方法提供了过滤流 速的精确控制。 被用于驱使液体混合物穿过过滤器的压力源， 通常提供了过高的压力， 导致 高剪切速度， 其反过来回导致过滤器堵塞和蛋白的损害。 如果不是不可能， 通常很难调节相 对于环境压力的单个压力源， 以致于得到的压力差足够低并且足够恒定， 从而导致通过过 滤器的平均流量足够低， 以免损害蛋白和基本上恒定。 然而， 通过将反压施加于处理液体的 滤液一侧， 相对较高的压力源 ( 比如第一压力 P1) 可以被精确地反向平衡 ( 即， 施加第二压 力 P2)， 从而获得低的和基本上恒定的压力差 ( 即 P1-P2)。
实施例
下面的实施例用来说明本发明， 并不是想限制本发明的范围。
实施例 1-8
对剪切敏感、 凝血级联的蛋白 vWF 的水溶液混合物被灭菌过滤， 以便确定压力 ( 和 反压 ) 及其他过程变量 ( 比如过滤器大小和类型 ) 对过滤有效性的影响， 比如基于滤液中 vWF 被回收的活性、 滤液的平均流量和放大加工的能力。
重组体 vWF 的水溶液混合物 (“rVWF:Rco” ) 具有 125IU/ml 的活性并且浓度是 1159μg/ml( 二喹啉甲酸 (“BCA” ) 实验 )， 此混合物被制备用于下面的实施例 1-8 中的 每一个实施例中。添加低分子量盐以便分别调节混合物的 pH 至 7.3 和渗透压度至大约 400mOsmol/l( 毫克渗透压 / 升 ) 的值。因为实施例 1-8 是用来孤立过滤器附近的蛋白上的 流体动力学作用 ( 比如剪切 )， 所以没有其他的分散污染物或材料 ( 比如细菌、 其他微生物 或其他蛋白 ) 被添加到混合物中。水溶液混合物的成分概括在表 1 中。
表 1. 实施例 1-8 的液体混合物成分
然后水溶液液体混合物以下述方式被检测。至少大约 500ml 测试量的混合物被添 加至耐压的不锈钢容器中。容器的出口通过第一节硅胶管被连接至灭菌过滤器 ( 蒸汽灭 菌 ) 的入口。大约 10cm 长的第二节硅胶管被连接于灭菌过滤室的出口。来自于灭菌过滤 的滤液流出物被收集在放置在天平上的烧杯中， 以便监测过滤速度。 天平与计算机对接， 以 便每隔一段时间记录被收集的滤液的总量作为时间的函数。
在 实 施 例 1-7 中， 使 用 了 SARTOBRAN P 0.2μm 的 醋 酸 纤 维 膜 过 滤 器 ( 包 括 0.45μm 预过滤器 )。在实施例 8 中， 使用了 SUPOR EKV 0.2μm 聚醚砜薄膜过滤器。实施 例 1-3 使用了圆盘薄膜过滤器， 而实施例 4-8 使用了筒式薄膜过滤器。每个过滤器的过滤 器表面面积提供在表 2 中。
对于实施例 1-8， 测试量的水溶液混合物在恒压下被过滤。在实施例 1 中， 根据 从不锈钢容器进入灭菌过滤器的柱子的高度， 进入灭菌过滤器的水溶液的外加压力是大约 100mbar 表压 ( 即大约 1.1bar 绝对大气压 )。在实施例 2-8 中， 干净的压缩空气被用于提 供水溶液进入灭菌过滤器的压力， 压力范围从 150mbar 至 300mbar， 如表 2 中所示。在实施 例 1-4 中， 没有进行反压过滤 ( 即， 当滤液注入收集烧瓶中时， 灭菌过滤器的出口管放空 )， 因此驱动过滤的压力差基本上是进入灭菌过滤器的水溶液的压力。对于实施例 5-8， 通过 将夹钳连在并夹紧在灭菌过滤器的出口管上， 反压被施加于滤液上。根据过滤期间测定的 平均滤液流速和已知被使用的商用的过滤器的压差 - 流速特性来推算实施例 5-8 的压力差 ( 在表 2 中被显示 )。
通常， 在每个实施例中， 在制备好测试量的水溶液混合物之后就很快将混合物过 滤。然而， 在实施例 5 中， 混合物在延迟了 8 小时后才被过滤， 以便检查储存对被公开方法 的任何潜在的影响。
表 2 概括了实施例 1-8 中每一个实施例的试验参数。
表 2. 用于实施例 1-8 的过滤试验参数
过滤试验的结果被概括在表 3 中。在表 3 中， “滤液量” 指的是单个试验期间获得 的滤液质量 ( 即， 包括水和任何被回收的 vWF)。对于实施例 1-4， 进行过滤实验直到过滤器 被堵塞并且不再能得到基本数量的滤液。对于实施例 5-8， 进行过滤实验直至获得数百克 的滤液并且实验结束时过滤器没有被堵塞仍然可以进一步过滤。表 3 中的 “过滤能力” 输 入项指的是被归一化的每单位面积过滤器表面的滤液数量。实施例 5-8 中的符号 “＞” 指 的是， 过滤能力是实际能力的较低的推定值， 因为过滤器在实验期间并没有被堵塞。表 3 中 的 “平均流速” 输入项指的是试验期间被平均并且被归一化为每单位面积过滤器表面的滤 液数量。
表 3. 实施例 1-8 的过滤结果
从表 3 中可明显看出， 蛋白的反压过滤增加了过滤能力和流速。甚至在适当低的 外加压力 ( 范围是从 100mbar 至 300mbar) 用于 vWF 和被使用的过滤器 ( 在此被使用的滤 芯可以承受最高压力的范围是从大约 2bar 至大约 5.5bar) 时， 实施例 1-4 显示过滤能力是 低的并且随着压力的增加而急剧减小。 与之相反， 当反压应用于滤液以便减少压力差时， 实 施例 5-8 呈现了大得多的过滤能力和流速。观察到的现象出乎意料， 因为过滤器通常的特 征是过滤流速和压力差之间呈正比关系 ： 公式 (1)
在公式 (1) 中， Q 是过滤流速 ( 每单位时间的体积或者质量 )， A 是过滤器的表面 面积， Δp 是横跨过滤器的压力差， μ 是被过滤的流体的粘度， 以及 R 是过滤介质的实验阻力。实施例 5-8 的结果之间的相似性进一步表明， 反压过滤的优势可以通过使用各种过滤 介质和 / 或过滤器大小而被获得。
实施例 4 和 6 的时间依赖性的过滤数据 ( 即， 被收集的滤液作为时间的函数 ) 在图 2 中被显示。从图 2 中可明显看出， 实施例 4 的高压力差导致了过滤试验的起初的 10-15 分 钟的比较高的过滤速度。然而， 实施例 4 中的高压方差同样导致了过滤器的更加急剧的堵 塞。与之相反， 实施例 6 中反压的使用降低了压力差和起始过滤速度。具体地说， 在最初的 短暂的大约 10 分钟至大约 15 分钟的期间， 低压差产生了低剪切过滤环境， 防止了过滤器被 vWF 堵塞， 因此提高了整个过滤器使用期限中的过滤能力和过滤流速， 并进一步导致了基本 上恒定的过滤流速。
正如表 4 中所概括的， 实施例 1-3 和 5 中每一个实施例的滤液同样被分析， 以便测 定滤液中重组体 vWF 的水平， 从而确定过滤过程是否相反地影响了存在于初始水溶液混合 物中的重组体 vWF 的浓度。在没有反压存在的情况下， 实施例 1-3 显示， 过滤期间甚至适当 较低的压力差也可能损害或者破坏蛋白质， 过滤期间在压力差是 200mbar 和 300mbar 时， 损 失最多可达大约重组体 vWF 的一半。 通过使用反压可以避免这种过滤损失， 正如实施例 5 中 所示， 在实施例 5 中 rVWF:Rco 浓度没有出现可测量的降低， 测定的蛋白 (BCA) 含量仅有 4％ 的减少。因此， 最初存在于水溶液混合物中的基本上所有蛋白质都可以被回收在滤液中。
表 4. 滤液中 vWF 的回收实施例 9-20
含有因子 VIII 的水溶液在带有 SARTOCLEAN 预过滤器的 过滤器上 被试验， 以便测定反压对过滤有效性的影响， 比如基于所需要的过滤器表面面积。 在实施例 9-13 中， 没有进行反压过滤 ； 初始的外加压力是 100mbar 至 500mbar。在实施例 14-16 中， 压力差是 200mbar， 并且在实施例 17-20 中， 压力差被减少至小于 150mbar。每个过滤器的 2 表面面积都是 1.2m 。表 5 包含了每个实验中过滤前后因子 VIII 活性。
表 5. 滤液中 FVIII 的回收
先前的数据证明， 当将反压过滤用于相同量的活性物质时， 所必需的过滤面积少 得多。反压过滤使过滤稳定化， 并且当压力差被优化时， 提高了平均活性收率。
实施例 21-25
含有因子 XIII 的溶液在 N66 聚酰胺过滤器上被实验， 以便 检测反压对过滤有效性的影响， 比如基于滤液中因子 XIII 被回收的活性和蛋白浓度。每个 2 过滤器的面积是 0.82m 。 在实施例 21-23 中， 没有进行反压过滤 ； 用于这些实施例的外加压 力是 600mbar。在实施例 24-26 中， 压力差大约是 100mbar。表 6 包含了每个实验的过滤前 后的蛋白浓度和活性以及收率。
表 6. 滤液中 FXIII 的回收
正如表 6 中所显示， 通过使用反压， 过滤期间的活性收率和蛋白收率得到了相当 大的提高。
上述给出的描述是为了清晰地理解本发明， 应理解没有不必要的限制， 本发明在 范围内的修改对于本领域的技术人员是很显而易见的。
说明书自始至终， 其中组合物被描述为包括成分或者物质， 可以预期组合物也可 以基本由、 或者由所列举的成分或者物质的组合所组成， 除非另有描述。
此处被公开的方法的操作以及它的单个步骤， 可以手动进行和 / 或借助于电子设 备进行。虽然根据具体的实施方式已经描述了过程， 但是本领域中的技术人员应当容易理 解可以使用与本方法相关联的其他方法。比如， 在不偏离本方法的范围和精神的情况下可 以改变各个步骤的顺序， 除非另有描述。此外， 一些单个步骤可以被组合、 省略或者进一步 的被细分为另外的步骤。