用于治疗癌症相关病症的 6.7- 二烷氧基喹唑啉衍生物 本发明涉及 6， 7- 二烷氧基喹唑啉衍生物， 或其药学可接受的盐， 其具有抗癌活 性， 并且因此能用于人的治疗方法中。 本发明还涉及制备所述喹唑啉衍生物的方法， 以及含 有该喹唑啉衍生物的药物组合物。
过去对于细胞增殖疾病诸如银屑病和癌症的大多数治疗方案利用了抑制 DNA 合 成的化合物。这些化合物对细胞有毒性， 并且仅当它们对迅速分裂的肿瘤细胞显示选择性 时才可以得到它们的有益效果。
近年来， 已经发现细胞可能因为其 DNA 的一部分转化为癌基因而变成癌性的， 即， 所述癌基因是在激活时导致恶性肿瘤细胞形成的基因 (Bradshas， Mutagenesis( 诱变 )， 1986， 1： 91)。几种癌基因编码酪氨酸激酶并且某些生长因子受体也是酪氨酸激酶 (Larsen 等， Ann.Reports in Med.Chem.( 医学与化学年度评论 )1989， 第 13 章 )。
受体酪氨酸激酶在启动细胞复制的生物化学信号的传递中很重要。 它们拥有细胞 外结合结构域和细胞内部分， 所述细胞外结合结构域针对生长因子诸如表皮生长因子， 所 述细胞内部分作为蛋白中的磷酸化酪氨酸氨基酸并且因此影响细胞增殖的激酶起作用。 还 已知这些激酶经常存在于常见的人类癌症诸如乳腺癌 (Saimbury 等， Brit， J.Cancer( 英 国癌症杂志 )， 1988， 58 ： 458)， 胃肠道癌症诸如结肠癌、 直肠癌和胃癌 (Bolen 等， Oncogene Res.( 癌基因研究 )， 1987， 1： 149) 中。发现在酪氨酸激酶活性 (TK 活性 ) 在恶性细胞中比 在正常细胞中可更为常见地被检测到 (Hunter， Cell( 细胞 )， 1987， 50 ： 823)。
近年来， 已经显示具有 TK 活性的表皮生长因子受体 (EGFR) 在许多人类癌症中过 度表达， 所述癌症诸如脑癌、 肺鳞状细胞癌、 膀胱癌、 胃癌、 乳腺癌、 头颈部癌、 食管癌、 甲状 腺癌等 (W.J.Gullick， Brit.Med.Bull.( 英国医学通报 )1991， 47 ： 87)。表皮生长因子受体 (EGFR)， 是受体酪氨酸激酶 (RTK) 家族的成员， 其包括四种受体 Erbl/HER1， Erb/HER2， Erb/ HER3 和 Erb/HER4。
抑制 EGFR-TK 活性的重要策略已经开发了小的合成分子 (Arteaga CL， Exp.Cell Res.( 实验细胞研究 )， 2003， 284 ： 122-130)。已经广泛地研究了某些喹唑啉衍生物如吉非 TM 替尼 (gefitinib)( 易瑞沙 (IressaTM)， 阿斯利康 (Astra Zeneca))， 厄洛替尼 (erlotinib) TM TM (OSI-774， 特 罗 凯 (Tarceva ))， PD-183805， PKI-166， EKB-569， PD-168393， CGP-59362 对几种类型癌症的可能治疗选择 (Baselga 等， Oncology( 肿瘤学 )2002， 63 ： 6-16， Cohen RB.， ( 临床结直肠癌 )， 2003， 2： 246-251)。欧洲专利申请， 即 EP 0566226， EP0602851A1， EP 0635507A1， EP 0635498A1， EO 0520722A1 公开了由于其 TK 抑制特性而具有抗癌活性的某些 喹唑啉衍生物。
美 国 专 利 US 5475001， US 5457105， US 5616582， US 5770599， US5747498， US 6900221 等涉及具有如下结构特征的喹唑啉衍生物， 所述结构特征诸如在喹唑啉核中在 4 位中具有诸如取代的苯胺基结构部分并且在 6 位和 7 位中具有各种官能化烷基。
具 体 地， US 5457105， US 5616582 涉 及 N-(3- 氯 -4- 氟 苯 基 )-7- 甲 氧 基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 ( 吉非替尼 )， 以及 US 5747498 和 US 690221 涉 及 N-(3- 乙 炔 基 苯 基 )-6， 7- 双 (2- 甲 氧 基 乙 氧 基 )-4- 喹 唑 啉 胺 ( 厄 洛 替 尼 )。WO
20005/070909， WO 2007/060691A2 和 WO 06/090413 涉及这两种极性抗癌药的合成或多晶 型中的变化。
鉴于所述喹唑啉类化合物所提供的巨大潜力， 我们开始合成并筛选了大量的具有 新结构特征的新化学实体。已经令人惊奇地和出人意料地发现在第 4 位处具有 3- 乙炔基 苯胺基并且在 6 和 7 位中被特别地取代的烷氧基的喹唑啉， 当与喹唑啉类药物的其他杰出 成员相比时， 其具有较强的和特殊的抗增殖特性。此外， 令人惊奇地， 本发明的化合物的毒 性较低， 并且其安全性非常有益于治疗性应用。本发明中所述的新化学实体表示为通式结 构 (I) 并且以前从未被合成， 且其治疗性益处和安全性也从未被研究过。
且 R2 ＝ OCH3.OC2H5 化合物 (I) 是 NRC-2694， 当 且 R2 ＝ OCH3 时NRC-2694 的单盐酸盐是 NRC-2694A。NRC-2694 的二盐酸盐是 NRC-2694B。本发明 的新化合物尤其是 NRC-2694 与此类的杰出药物相比， 具有如下所详述的出人意料的优良 的抗癌 / 抗增殖特性， 并且提供其他的治疗益处 ：
1) 较低的抑制浓度 ： 在 MTT 增殖测定法中的抑制浓度 (IC50) 表明该值的范围为 40-90ng/ml(100-200nm)， 而厄洛替尼盐酸盐的值为 836ng/ml(1945nm)。 通过 western 印迹 分析和基质胶侵袭性实验 (Matrigel invasion assay) 已经证实了相同的结果。
2) 完全的肿瘤消退 ： 通过在植入 A549 人肺肿瘤细胞的裸鼠中以 10mg/Kg 的剂量 施用所述化合物观察到完全的肿瘤消退。在对比研究中， 甚至以 100mg/Kg 剂量， 厄洛替尼 盐酸盐都不能诱导完全的肿瘤消退。植入 A549 的小鼠的肺组织的肉眼检查和萤光素酶表 达试验均证实了相同的观察结果。
3) 药物功效 ： 有效剂量的评价表明本发明的典型化合物， 即， NRC-2694 的值 (ED50) 为 6.3mg/Kg， 相比使用厄洛替尼盐酸盐获得的值为 22mg/Kg。使用 NRC-2694 观察到 100％的疗效， 而在厄洛替尼盐酸盐的情况下仅为 50-60％。
4) 其他独特的指征 ： 本发明的化合物， 典型地为 NRC-2694， 显示其他的指征， 如下 调 ErbB2， ErbB3， ErbB4 和 VEGFR 受体的表达水平。此特殊的、 非常有前途的和令人惊奇的 结果完全是出人意料的， 并且使用厄洛替尼盐酸盐未发现此结果。
5) 安全性 ： 本发明的化合物， 典型地为 NRC-2694， 其安全性是十分有前途的， 出人 意料地很宽， 并且是非常有益的。因此， NRC-2694 显示的最大耐受剂量 (MTD) 为 500mg/Kg， 相比厄洛替尼盐酸盐为 2000mg/Kg。
NRC-2694 所提供的宽治疗窗由其 LD0 值证明， 其 LD0 值为 2000mg/Kg， 相比厄洛替 尼盐酸盐为 500mg/Kg。对 NRC-2694 的 LD50 值不能精确地获得， 而对厄洛替尼盐酸盐测定 其值为 805mg/Kg。
下面的实施例的给出是为了说明制备本发明的化合物的方法及其优良的生物学 功效， 因此其不应该被认为限制本发明的范围或精神。( 路线图 -1)
路线图 -1实施例 -1
N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 (I， NRC-2694) 的制备
i)4- 氯 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 -4- 喹唑啉胺 (IIIa) 的制备
向清洁的和干燥的装配有机械搅拌器、 回流冷凝器、 均压滴液漏斗和温度计插座 的 5 升四颈圆底烧瓶中装入氯仿 (3000ml)， 二甲基甲酰胺 (30ml)， 然后加入根据公开为 WO.2005/070909A1 的 PCT 国际申请的实施例 1 中所给出的方法获得的 7- 甲氧基 -6-(3- 吗 啉代丙氧基 )-3， 4- 二氢 - 喹唑啉 -4- 酮 (IIa)(150g)。缓慢地加入草酰氯 (120g)， 并将 反应物质加热至回流温度， 并且在回流温度下保持约 5 小时。通过 HPLC 试验发现反应结 束。通过施加低真空蒸馏掉溶剂氯仿和过量的草酰氯。反应物质冷却至约 40 ℃并加入 氯仿 (300ml)， 并且再次施加低真空蒸馏出溶剂。反应混合物冷却至室温， 并且加入乙腈 (3000ml)， 搅拌 10-15 分钟， 在氮气气氛中保持以继续进行下一步骤。
ii)N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 (I， NRC-2694) 的制备
向含有来自上述步骤 (i) 的乙腈中的含氯化合物的装配有机械搅拌器、 回流冷 凝器和温度计插座的 5 升四颈圆底烧瓶中在约 10-15 分钟内缓慢地加入 3- 乙炔基苯胺 (69g)， 将反应物质加热至回流温度， 并且在回流温度下保持约 4 小时。通过 HPLC 试验发现 反应结束。然后反应物质冷却至 25-35℃并过滤， 用乙腈 (500ml) 洗涤滤饼并使滤饼干燥。 将上述干燥的粗制化合物加入至另一 5 升圆底烧瓶中， 并加入水 (2500ml)， 并且 使温度缓慢地升至 60-65℃， 用稀氢氧化钠溶液将反应物质的 pH 调节至 10-12。将分离的 固体产物过滤， 并用水洗涤， 在 70-75℃下干燥得到 173.0g 为灰白色固体的 N-(3- 乙炔基苯 基 )-6-(3- 吗啉丙氧基 )-7- 甲氧基 -4- 喹唑啉胺。
iii) 从甲苯重结晶制备 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧 基 ]-4- 喹唑啉胺。
向装配有机械搅拌器、 回流冷凝器和温度计插座的 5 升四颈圆底烧瓶中加入甲 苯 (3750ml)， 然后加入通过上面给出的实施例 (1) 中所述的方法获得的 N-(3- 乙炔基苯 基 )-6-(3- 吗啉代丙氧基 )-7- 甲氧基 -4- 喹唑啉胺 (50g)。 将反应混合物加热至 90-95℃， 使得固体完全溶解。然后进行碳处理并过滤。滤液冷却至 25-35℃， 保持约 1 小时并过滤， 将物质干燥得到 40.15g 为白色结晶固体的 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉 基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺。
mp ： 185-187℃
纯度 ： 99.72％ (HPLC)
IR(KBr)(cm-1) ： 3280.9， 2954.6， 2810.3， 1620.1， 1604.2， 1572.1， 1527.7， 1505.2， 1484， 1430.5， 1388.2， 1247.5， 1211.2， 1140.3， 1110.4， 1010.3， 953.4， 859.6， 784.2Cm-1 1
HNMR(300MHz ； DMSO-d6) ： 9.57(s， 1H) ； 8.48(s， 1H) ； 7.99(s， 1H) ； 7.86-7.92(d， 2H) ； 7.34-7.44(t， 1H)7.18-7.21(s， 2H) ； 4.15-4.21(t， 4H) ； 3.92(s， 3H)3.5-3.6(t， 4H) ； 2.4-2.52(m， 5H) ； 1.95-2.01(m， 2H).
质量 ： 419.4(M+1)
实施例 -2
从 乙 腈 中 重 结 晶 N-(3- 乙 炔 基 苯 基 )-7- 甲 氧 基 -6-[3-(4- 吗 啉 基 ) 丙 氧 基 ]-4- 喹唑啉胺
向装配有机械搅拌器、 回流冷凝器和温度计插座的 2 升三颈圆底烧瓶中加入乙 腈 (1000ml)， 然后加入由上面给出的实施例 (1) 中所述的方法获得的 N-(3- 乙炔基苯 基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 (25g)。反应物质缓慢地加热至 65-70℃， 使得固体物质完全溶解并且进行碳处理和过滤反应物质。 将滤液转移至另一圆底 烧瓶中并缓慢地冷却至 10-15℃， 并且在该温度下保持 30 分钟。 将物质过滤， 用冷乙腈洗涤 滤饼并干燥后得到 20.50g 为白色结晶固体的 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗 啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺。
mp ： 186-187℃
纯度 ： 99.68％ (HPLC)
实施例 -3
从乙酸乙酯中重结晶 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧 基 ]-4- 喹唑啉胺
向装配有机械搅拌器、 回流冷凝器和温度计插座的 3 升三颈圆底烧瓶中加入乙酸 乙酯 (2000ml)， 然后加入由上面给出的实施例 (1) 中所述的方法获得的 N-(3- 乙炔基苯 基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 (25g)。反应物质缓慢地加热至 65-70℃， 使得固体物质完全溶解并且进行碳处理和过滤反应物质。 将滤液转移至另一圆底 烧瓶中并缓慢地冷却至 10-15℃， 并且在该温度下保持 30 分钟。 将结晶物质过滤， 用冷乙酸 乙酯洗涤滤饼并干燥后得到 20.95g 为白色结晶固体的 N-(3- 乙炔基苯基 )-6-(3- 吗啉代 丙氧基 )-7- 甲氧基 -4- 喹唑啉胺。
mp ： 185-187℃
纯度 ： 99.7％ (HPLC)
实施例 -4
N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺单盐酸 盐 (NRC-2694A) 的制备
向装配有机械搅拌器、 回流冷凝器和温度计插座等的 500ml 三颈圆底烧瓶中加入 异丙醇 (250ml)， 然后加入由实施例 1 中给出的方法获得的 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧 基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 (5g)。 反应物质的温度升高至 65-70℃， 使得固 体物质溶解并且进行碳处理和过滤。 将滤液冷却至约 55-60℃， 并且当向其加入 1 摩尔当量 的溶解在异丙醇溶液中的 HCl-gas 时析出单盐酸盐。 反应物质在回流温度下保持约 2 小时， 然后冷却至室温， 过滤和干燥得到 5.1g 为白色结晶物质的 N-(3- 乙炔基苯基 )-6-(3- 吗啉 代丙氧基 )-7- 甲氧基 -4- 喹唑啉胺单盐酸盐。
纯度 ： 99.8％ (HPLC)
HCl 含量
( 化学 ) ： 8.19％ ( 理论值 ： 8.01％ ) -1
IR(KBr)(cm )3407， 3305， 3259.5， 2934， 2619， 1625.9， 1593.8， 1579.9， 1530.8， 1512， 1476.9， 1392.2， 1356.8， 1282.1， 1242.1， 1207.9， 1141.3， 1100.8， 1076.1， 1042.1， 1026.5， 1011.5， 957.7， 941.5， 922.1， 857.3， 852， 838.1， 796， 782.4实施例 -5
N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺二盐酸 盐 (NRC-2694B) 的制备
向装配有机械搅拌器、 回流冷凝器和温度计插座等的 500ml 三颈圆底烧瓶中加入 异丙醇 (250ml)， 然后加入由实施例 1 中给出的方法获得的 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲氧 基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺 (5g)。反应物质的温度升高至 65-70℃， 使得 所有固体物质溶解。进行碳处理并过滤。将滤液冷却至约 55-60℃， 并且当向其加入 2 摩尔 当量的溶解在异丙醇溶液中的 HCl-gas 时析出二盐酸盐。反应物质在回流温度下保持约 2 小时， 然后冷却至室温， 过滤和干燥得到 5.5g 为白色结晶物质的 N-(3- 乙炔基苯基 )-7- 甲 氧基 -6-[3-(4- 吗啉基 ) 丙氧基 ]-4- 喹唑啉胺二盐酸盐。
纯度 ： 99.78％ (HPLC)
HCl 含量
( 化学 ) ： 14.9％ ( 理论值 ： 14.83％ ) -1
IR(KBr)(cm ) ： 3406.8， 3194.1， 2942.7， 2681.9， 2623.6， 1633.7， 1566.2， 1528.6， 1512.5， 1438.6， 1359.6， 1282.3， 1218.3， 1157.1， 1132.7， 1105.9， 1075.6， 1001.9， 942.1， 875.3， 816.1， 787.2 实施例 -6
最大耐受剂量 (MTD) 和急性毒性评价 ( 表 1&2) ：
在雄性和雌性 Swiss Albino 小鼠 ( 重量 20-25gm) 中进行 MTD 早期引用研究 (early citation study)。
根据 OECD 准则 420 条进行研究， 研究在 9am-5pm 之间进行以避免昼夜节律周期， 化合物厄洛替尼和 NRC-2694 用 2％阿拉伯树胶悬浮， 化合物以 5， 50， 300 和 2000mg/Kg 的剂 量 (po) 口服给药。根据死亡率施用中间剂量。每小时观察动物的总行为变化直至药物施 用后 6 小时。如果有的话， 进一步观察动物直至 72 小时的死亡率。将存活的动物尸检以评 估化合物通过胃肠道的吸收。
厄洛替尼和 NRC-2694 的急性毒性在雄性和雌性小鼠中进行。口服施用 500， 750， 1000 和 2000mg/Kg 的剂量。每组由 5 只小鼠组成。观察动物的死亡率持续至化合物给药后 14 天。将存活的动物尸检以评估化合物通过胃肠道的吸收。
使用 Litchfield 和 Wilcoxon(J.Pharmacol.Exp.Ther.( 药理学和实验治疗学杂 志 )1949， 96 ： 99-113) 测定 LD50。
毒性研究的结果制成表 -1&2。发现厄洛替尼盐酸盐的最大耐受剂量 (MTD) 为 500mg/Kg(po)， 而对于 NRC-2694， 为 2000mg/Kg(po)。 类似地， 发现厄洛替尼盐酸盐的 LD0 为 500mg/Kg(po)， NRC-2694 为 2000mg/Kg。因此， 已经确定了 NRC-2694 的出人意料和令人惊 奇的超过厄洛替尼盐酸盐的低毒性和安全性。
表 -1
厄洛替尼盐酸盐和 NRC-2694( 小鼠 ) 早期引用研究的比较 (mtd)
10CN 101918374 A
说化合物明书MTD mg/Kg(po) 500 20007/10 页厄洛替尼盐酸盐 NRC2694
表 -2 小鼠中的急性 LD50 研究 ( 单剂量 7 天观察结果 ) 化合物 厄洛替尼盐酸盐 NRC2694 LD0mg/Kg(po)* 500 2000 LD50mg/Kg po) 805 -*LD0 ： 在 7 天结束时没有观察到死亡。
实施例 -7
体外和体内评价研究以及治疗功效的评价
样品 ： 使用厄洛替尼作为对照参考药物， 与作为阳性对照的此药物比较， 检测本发 明的新化合物的生物学活性。
i)MTT 增殖测定 ：
MTT[3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2- 基 )-2， 5- 二苯基四唑溴鎓 ] 测定法， 首先由 Mosmann 在 1983 年描述， 该测定基于来自活细胞的线粒体脱氢酶裂解淡黄色 MTT 的四唑鎓环并且形
成主要对细胞膜不通透的深蓝色甲晶体的能力， 由此导致其在健康细胞内的积累。通过 产物的水加入去垢剂溶解细胞使晶体释放， 使该晶体溶解。存活细胞的数目与生成的甲平直接成正比。然后可使用简单的比色测定法对颜色进行定量。使用 0-1000ng/ml 浓度的 厄洛替尼和测试化合物在 A549 和 H1299 细胞中完成此测定。试验方案基于 ATCC 并且根据 生产厂商的使用说明书 ( 目录编号 ： 30-1010K)。 从 MTT 增 殖 测 定， 确 定 本 发 明 的 化 合 物 的 抑 制 浓 度 (IC50) 为 40-90ng/ ml(100-200nm)， 而用作阳性对照的 “厄洛替尼盐酸盐” 的值高达 836ng/ml(1945nm)。因此 得出结论， 本发明的新化合物的效力为厄洛替尼盐酸盐的至少 10 倍。
ii)Western 印迹分析 ： ( 图 -1)
使 用 从 MTT 增 殖 测 定 中 确 定 的 理 想 药 物 浓 度 来 处 理 在 适 当 的 培 养 基 中 的 6 1x10 H1299 或 A549 细胞 72hr， 然后提取细胞溶胞产物， 并在 10％ SDS PAGE 凝胶上在还原 条件下分级。凝胶点样在经处理的尼龙膜 (Biorad) 上， 并免疫探测 EGFR， P13K 和 AKT。
观察到 EGFR 表达以剂量依赖方式的显著变化。80ng(190nm) 浓度的 NRC-2694 导 致的 EGFR 表达的抑制与 800ng(1860nm) 浓度的厄洛替尼盐酸盐相当。 因此， 显然 NRC-2694 有 10 倍水平的效力。
iii) 基质胶侵袭性测定 ： ( 图 -2)
在各种浓度的 NRC 化合物 ( 如通过 MTT 测定所确定 ) 的存在下使用改良的 Boyden 小室测定 (Boyden chamber assay) 来评估 H1299 和 A549 细胞的体外侵袭性。细胞用这些 化合物处理 48 小时。1x106 细胞悬浮在 600μl 补充了 0.2％ BSA 的无血清培养基中并放 置在包被以基质胶 (0.7mg/ml) 的 transwell 小室 (Corning Costar Fisher Scientific cat#07-200-158， 匹兹堡， PA) 的上室中。小室的下室充以 200μl 血清培养基， 并使细胞迁 移 24h。温育后， 将细胞固定并用 Hema-3 染色， 如前所述进行定量 (Mohanam 等， 1993)。将 迁移的细胞定量为侵袭性百分比。化合物 NRC-2694 显示以剂量依赖的方式显著地减少侵 袭性。
iv) 裸鼠中皮下肺肿瘤的体内评价 ( 图 -3) ：
在裸鼠的右后肢侧面植入 2x106A549 细胞。在观察到肿瘤 ( ＞ 2mm) 后， 小鼠口服 或经腹膜内给予测试化合物治疗， 包括用作阳性对照的厄洛替尼盐酸盐。100mg/Kg 剂量的 厄洛替尼盐酸盐被鉴定为基线剂量。
测量肿瘤尺寸， 并且在使用 10mg/Kg 剂量 NRC-2694 治疗的小鼠中观察到肿瘤的完 全消退。然而在类似地用即使以 100mg/Kg 剂量水平的厄洛替尼盐酸盐治疗的对照组中肿 瘤仍然存在。因此已经确定本发明的化合物 (NRC-2694) 具有 10 倍的功效优越性。 v) 治疗后从裸鼠获得的肺组织的评价 ： ( 图 -4)
检验从用各种浓度的厄洛替尼盐酸盐和 NRC-2694 经口服 / 腹膜内途径治疗的植 入 A549 萤光素酶表达细胞的裸鼠获得的肺中的残余肿瘤。
在 NRC-2694 治疗组中观察的肿瘤的完全消退， 而在厄洛替尼盐酸盐治疗组中肿 瘤仍然存在， 由此确定了本发明的化合物的出人意料的和令人惊奇的优良功效。
vi) 肺组织中肿瘤肉眼检查 ： ( 图 -5)
通过肺内注射 A549 细胞而植入至裸鼠中。小鼠使用厄洛替尼盐酸盐和 NRC 2694 以 2.5 和 20mg/Kg 的剂量经口服 / 腹膜内途径治疗。每天药物治疗后 30 天， 将小鼠处死， 并获取肺。肺组织固定在 10％缓冲的甲醛中， 石蜡包埋并切片。将切片根据法定试验方案 进行 H&E 染色以观察实体或弥漫性肿瘤。
在所有剂量水平上 NRC 2694 治疗组均表现得好于厄洛替尼盐酸盐处理组， 因此 确定 NRC 2694 的优良功效。
vii) 使用 A549 萤光素酶表达细胞植入的裸鼠 ： ( 图 6&7)
观察用各种浓度的厄洛替尼盐酸盐和 NRC 2694 通过口服和腹膜内途径治疗用 A549 萤光素酶表达细胞植入的裸鼠的肿瘤， 并且图像观察结果在图 6 和图 7 中给出。观察 到 NRC 2694 治疗组表现得远好于厄洛替尼盐酸盐治疗组。在用 NRC 2694 治疗 42 天结束 时没有观察到肿瘤， 而在厄洛替尼盐酸盐治疗组中残余肿瘤仍然存在， 两者均通过口服和 腹膜内途径治疗。
viii) 来自裸鼠体内研究的疗效 ：
对作为治愈的动物数目与研究中使用的动物数目的比率的疗效制表， 并且显示在 表 3 中。
表 -3 ： NRC-2694 和厄洛替尼盐酸盐对肺癌的疗效
12CN 101918374 A说药物明浓度 Mg/Kg书治愈比9/10 页厄洛替尼腹膜内2.5 5 10 201/5 2/5 2/5 3/5 2/5 0/5 1/5 2/5 1/5 1/5 3/5 5/5(100％ ) 1/5 2/5 3/5 3/5厄洛替尼口服2.5 5 10 20NRC 2694 腹膜内2.5 5 10 20NRC 2694 口服2.5 5 10 20
可以看出在 NRC 2694 时该比率接近 100％， 而在厄洛替尼盐酸盐的研究组时该比 率为 40-60％。
ix)ED50 的评价 ：
基于肺切片和肿瘤消退研究评价 ED50 值。通过口服途径对 NRC 2694 计算的值为 6.3mg/Kg， 而对厄洛替尼盐酸盐获得的值为 22mg/Kg。 因此确定了本发明的化合物的优良功 效。
x) 其他受体诸如 HER-1， HER-2， HER-3， HER-4 和 VEGFR 的体外研究 ( 图 -8) ：
为了确定 NRC 2694 对 EGFR 家族 (Erb/HER) 的各种其他的受体的作用， 人肺癌细 胞 A549 用各种浓度的 NRC 2694 以及厄洛替尼盐酸盐处理以进行并排比较。通过 western 印迹分析测定 Erb-1， Erb-2， Erb-3， Erb-4 和 VEGFR 的水平。
观察到 NRC 2694 有效地下调 Erb B2， Erb B3， Erb B4 和 VEGFR 的水平， 而厄洛替 尼盐酸盐没有此指征。 上面提及的受体表达水平的额外的抑制指征清楚地证明了本发明的 主要分子， 即 NRC 2694， 的出人意料和令人惊奇的特性。
xi) 结论 ：
因此， 在上面的试验中与厄洛替尼盐酸盐的比较， 确定了本发明的化合物的出人 意料的， 令人惊奇的和优良的抗肿瘤特性和额外的治疗潜力。
实施例 -8
下列是用于人类预防性治疗应用的含有式 NRC-2694 的化合物或其药学可接受的
盐的说明性的代表性药物剂型 ：
片剂 化合物 NRC-2694 无水乳糖 (USP) 微晶纤维素 (Avicel pH102) 十二烷基硫酸钠 羟基乙酸淀粉钠 (Sodium starch glycolite) 聚维酮 K-30 羟丙基纤维素 (LH-11) 硬脂酸镁mg/ 片 50 156 15 5 10 3 10 1