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1、10申请公布号CN101948470A43申请公布日20110119CN101948470ACN101948470A21申请号201010185401022申请日20100528C07D471/04200601A61K31/4745200601A61P29/00200601A61P37/02200601A61P1/0020060171申请人南开大学地址300071天津市卫津路94号南开大学新生物站72发明人尹芝南汪清民刘兰珍温倜吴震州刘玉秀赵立青王开亮54发明名称菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物在医药上的应用57摘要本发明涉及通式如I所示的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物在药物上的应用，具。
2、有很好的抗炎作用。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书25页附图3页CN101948472A1/1页21一种结构新颖的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物，如通式I所示式中RCOOH代表有机酸，分别选自如下所示有机酸丙酸、丁酸、丙二酸、草酸、己二酸、樟脑磺酸、反式阿魏酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、对羟基苯甲酸、乳酸、咖啡酸、绿原酸、对氨基苯磺酸、5磺基水杨酸、富马酸、葡萄糖酸、衣康酸、山梨酸。R1选自甲氧基，羟基；R2选自甲氧基，氢原子；R3选自氢原子，羟基及其立体异构体。上述通式I化合物，与氮原子相连的标的手性碳原子为R、S构型，或其不同比例的混合物。
3、；当R3不为氢原子时，与R3相连的标的手性碳原子为R、S构型，或其不同比例的混合物。其特征在于它具有很好的抗炎作用。2按照权利要求1所述的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物I，其特征在于R2，3，6，7四甲氧基菲并吲哚里西啶有机酸盐衍生物。RCOOH代表有机酸，分别选自如下所示有机酸丙酸、丁酸、丙二酸、草酸、己二酸、樟脑磺酸、反式阿魏酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、对羟基苯甲酸、乳酸、咖啡酸、绿原酸、对氨基苯磺酸、5磺基水杨酸、富马酸、葡萄糖酸、衣康酸、山梨酸。3按照权利要求1所述的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物I，其特征在于S2，3，6，7四甲氧基菲并吲哚里西啶有机酸盐衍生物。RCOOH代表。
4、有机酸，分别选自如下所示有机酸丙酸、丁酸、丙二酸、草酸、己二酸、樟脑磺酸、反式阿魏酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、对羟基苯甲酸、乳酸、咖啡酸、绿原酸、对氨基苯磺酸、5磺基水杨酸、富马酸、葡萄糖酸、衣康酸、山梨酸。4按照权利要求1所述的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物I，其特征在于R，S2，3，6，7四甲氧基菲并吲哚里西啶有机酸盐衍生物。RCOOH代表有机酸，分别选自如下所示有机酸丙酸、丁酸、丙二酸、草酸、己二酸、樟脑磺酸、反式阿魏酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、对羟基苯甲酸、乳酸、咖啡酸、绿原酸、对氨基苯磺酸、5磺基水杨酸、富马酸、葡萄糖酸、衣康酸、山梨酸。5按照权利要求4所述的R，S2，3，6，7。
5、四甲氧基菲并吲哚里西啶有机酸盐衍生物，其特征在于RCOOH代表苹果酸。权利要求书CN101948470ACN101948472A1/25页3菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物在医药上的应用技术领域0001本发明涉及菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物在药物上的应用，特别涉及自身免疫性疾病相关的化学药物和抗炎药物的应用。背景技术0002免疫体系是机体对抗各种疾病的卫士，它主要通过分泌一些细胞因子来调节和激发各种免疫过程；而细胞因子异常高量表达时会导致诸如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生。0003TNF是一种前炎细胞因子，在炎症、感染和其它环境压力作用下多种细胞都可产生TNF，包括巨噬细胞、淋巴。
6、细胞、成纤维细胞和角质化细胞。根据细胞种类不同，通过结合于TNFR1P55或TNFR2P75，TNF可诱导不同的生物学效应，募集下游的信号转导、激活效应因子。通过复合信号级联和网络，这些效应可介导半胱氨酸蛋白酶和两种转录因子JNK和NFBNUCLEARFACTORKAPPAB的激活。NFB可促进多种前炎因子的释放，同时也反过来作用于TNF。过量或非调节性TNF的产生可介导并加速多种疾病，因此降低TNF含量或抑制NFB活性理论上是一些炎症、感染、免疫或恶性疾病的有效治疗手段，例如风湿性关节炎、牛皮癣、炎症性肠病等等。0004我们前期的工作研究已经揭示菲并吲哚里西啶生物碱DCB3503的抗炎作用Z。
7、HINANYIN等，ARTHRITISRHEUMATISM，2006，543，877886，HERSHYONGSHIAH等人也证实DCB3503可抑制NFB的活性，而NFB可促进多种前炎因子的释放。WO03070166公开了菲并吲哚里西啶和菲并喹喏里西啶衍生物的制备方法和它们在医药上的应用。CN101189968公开了菲并吲哚喹喏里西啶衍生物及其盐在农药上的应用。CN101348483公开了菲并吲哚里西啶衍生物的制备。00050006于是我们在DCB3503基础上进行了系列衍生物的合成，通过基于影响免疫系统细胞因子产生的高通量药物筛选，我们发现了一系列新的DCB3503衍生物，可用来调节TNF。
8、的分泌，并作为新药研发的先导化合物，将对于炎症性疾病的治疗有重要意义。发明内容0007本发明的目的是提供菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物在药物上的应用，特别涉及自身免疫性疾病相关的化学药物和抗炎药物的应用。菲并吲哚里西啶生物碱有机酸说明书CN101948470ACN101948472A2/25页4盐衍生物不仅改善了DCB3503不稳定、见光分解等特性，还降低了药物的毒性，并且有很好的抗炎作用。0008本发明提供了一种结构新颖的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物，如通式I所示00090010式中0011RCOOH代表有机酸，分别选自如下所示有机酸0012丙酸、丁酸、丙二酸、草酸、己二酸、樟脑磺。
9、酸、反式阿魏酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、对羟基苯甲酸、乳酸、咖啡酸、绿原酸、对氨基苯磺酸、5磺基水杨酸、富马酸、葡萄糖酸、衣康酸、山梨酸。0013R1选自甲氧基，羟基；0014R2选自甲氧基，氢原子；0015R3选自氢原子，羟基及其立体异构体。0016上述通式I化合物，与氮原子相连的标的手性碳原子为R、S构型，或其不同比例的混合物；当R3不为氢原子时，与R3相连的标的手性碳原子为R、S构型，或其不同比例的混合物。0017本发明优选的化合物为通式I中0018RCOOH均选自丙酸、丁酸、丙二酸、草酸、己二酸、樟脑磺酸、反式阿魏酸、水杨酸、苹果酸、琥珀酸、对羟基苯甲酸、乳酸、咖啡酸、绿原酸、对氨基苯。
10、磺酸、5磺基水杨酸、富马酸、葡萄糖酸、衣康酸、山梨酸；0019R1，R2选自甲氧基，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为R、S构型比例11的外消旋体。0020R1，R2选自甲氧基，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为S构型。0021R1，R2选自甲氧基，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为R构型。0022R1选自甲氧基，R2，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为R、S构型比例11的外消旋体。0023R1选自甲氧基，R2，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为S构型。0024R1选自甲氧基，R2，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为R构型。
11、。0025R1选自羟基，R2，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为R、S构型比例11的外消旋体。0026R1选自羟基，R2，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为S构型。0027R1选自羟基，R2，R3选自氢原子，与氮原子相连的标的手性碳原子为R构型。0028R1，R2选自甲氧基，R3选自羟基，与氮原子相连的标的手性碳原子为R、S构型比说明书CN101948470ACN101948472A3/25页5例11的外消旋体，与R3相连的标的手性碳原子为R、S构型比例11的外消旋体。0029本发明提供的菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物I具有很好的抗炎作用，是通过影响炎症细胞因子TN。
12、F水平从而控制炎症性疾病的一类小分子化合物。具体实施方式0030下述的实施例和生测试验结果可用来进一步说明本发明，但不意味着限制本发明。0031实施例1部分菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物I的化学结构式和物理常数，见表10032表1部分菲并吲哚里西啶生物碱有机酸盐衍生物的化学结构式和物理常数00330034说明书CN101948470ACN101948472A4/25页60035说明书CN101948470ACN101948472A5/25页70036说明书CN101948470ACN101948472A6/25页80037说明书CN101948470ACN101948472A7/25页90。
13、038说明书CN101948470ACN101948472A8/25页100039说明书CN101948470ACN101948472A9/25页110040说明书CN101948470ACN101948472A10/25页120041说明书CN101948470ACN101948472A11/25页130042说明书CN101948470ACN101948472A12/25页140043说明书CN101948470ACN101948472A13/25页150044说明书CN101948470ACN101948472A14/25页160045说明书CN101948470ACN101948472。
14、A15/25页170046说明书CN101948470ACN101948472A16/25页180047说明书CN101948470ACN101948472A17/25页190048说明书CN101948470ACN101948472A18/25页200049说明书CN101948470ACN101948472A19/25页210050说明书CN101948470ACN101948472A20/25页220051说明书CN101948470ACN101948472A21/25页230052说明书CN101948470ACN101948472A22/25页240053说明书CN101948470。
15、ACN101948472A23/25页250054实施例20055化合物25又命名NK007在体外显著抑制LPS刺激条件下小鼠脾脏细胞TNF的产生00561先将药物在含10胎牛血清的改良型RPMI1640培养液中依次梯度稀释，各取100L加入96孔板中，设置002DMSO和水为对照组。取野生型BALB/C小鼠脾脏，在超净台中研磨得到淋巴细胞，用含10胎牛血清的改良型RPMI1640培养液制成密度为4106个细胞/ML的细胞悬液，加入1MG/MLLPS刺激细胞增殖分化，将细胞平行加入已加入不同浓度小分子药物的96孔板中，培养24小时后，1,400R/MIN，离心7分钟，吸出全部上清至另一96孔板。
16、中，密封后保存在4。00572ELISA实验使用BIOLEGENDMOUSETNFELISA试剂盒。首先将溶解于包被缓冲液COATINGBUFFER中的特异性包被抗体CAPTUREANTIBODY包被在固相载体上，密封后置于4冰箱中过夜，洗涤液WASHBUFFER，即PBST，洗涤除去没有结合的抗体和杂质；加入封闭液ASSAYDILUENT，可以阻断非特异性的结合，进而减少背景，置于20摇床中1小时，摇床转速200R/MIN。PBST洗涤除去上一步的多余物质。加入待测上清和梯度稀释的标准品，标准品依次浓度为500PG/ML、250PG/ML、125PG/ML、625PG/ML、312PG/ML。
17、、156PG/ML和78PG/ML，置于20摇床中2小时，摇床转速200R/MIN。此步可使抗体与抗原充分结合。PBST洗涤除去未结合的物质。加入检测抗体DETECTIONANTIBODY，特异性结合抗原，置于20摇床中1小时，摇床转速200R/MIN。洗涤未结合的物质。加入酶标抗体AVIDINHRP，酶标抗体可与检测抗体结合，置于20摇床中30分钟，摇床转速200R/MIN。PBST洗涤未结合的物质。加入新鲜制备的底物TMBSUBSTRATESOLUTION，避光下置说明书CN101948470ACN101948472A24/25页26于20摇床15分钟，摇床转速200R/MIN。此时溶液会。
18、显现出蓝色。用终止反应液STOPSOLUTION终止反应，溶液由蓝色变为黄色。酶联免疫检测仪470NM处测量各孔的吸光值。00583结果如图1NK007与DCB3503剂量效应曲线，在不同药物浓度梯度下与对照相比后对TNF的抑制百分率。00590060实施例30061NK007在体外显著抑制LPS刺激条件下小鼠单核巨噬细胞系TNF的产生00621先将药物在含10胎牛血清的改良型RPMI1640培养液中依次梯度稀释，各取100L加入96孔板中，设置002DMSO和水为对照组。取小鼠RAW2647细胞系，用含10胎牛血清的改良型DMEM培养液制成密度为2106个细胞/ML的细胞悬液，加入1MG/M。
19、LLPS刺激细胞增殖分化，将细胞平行加入已加入不同浓度小分子药物的96孔板中，培养24小时后，吸出全部上清至另一96孔板中，密封后保存在4。00632ELISA实验使用BIOLEGENDMOUSETNFELISA试剂盒。首先将溶解于包被缓冲液COATINGBUFFER中的特异性包被抗体CAPTUREANTIBODY包被在固相载体上，密封后置于4冰箱中过夜，洗涤液WASHBUFFER，即PBST，洗涤除去没有结合的抗体和杂质；加入封闭液ASSAYDILUENT，可以阻断非特异性的结合，进而减少背景，置于20摇床中1小时，摇床转速200R/MIN。PBST洗涤除去上一步的多余物质。加入待测上清和梯。
20、度稀释的标准品，标准品依次浓度为500PG/ML、250PG/ML、125PG/ML、625PG/ML、312PG/ML、156PG/ML和78PG/ML，置于20摇床中2小时，摇床转速200R/MIN。此步可使抗体与抗原充分结合。PBST洗涤除去未结合的物质。加入检测抗体DETECTIONANTIBODY，特异性结合抗原，置于20摇床中1小时，摇床转速200R/MIN。洗涤未结合的物质。加入酶标抗体AVIDINHRP，酶标抗体可与检测抗体结合，置于20摇床中30分钟，摇床转速200R/MIN。PBST洗涤未结合的物质。加入新鲜制备的底物TMBSUBSTRATESOLUTION，避光下置于20。
21、摇床15分钟，摇床转速200R/MIN。此时溶液会显现出蓝色。用终止反应液STOPSOLUTION终止反应，溶液由蓝色变为黄色。酶联免疫检测仪470NM处测量各孔的吸光值。00643结果如图2NK007时间剂量效应曲线，在不同时间点与不同药物浓度梯度下与对照相比的TNF水平。0065实施例40066NK007在体外对原代小鼠脾脏细胞与传代的小鼠单核巨噬细胞系毒性均低于DCB3503。00671先将药物在含10胎牛血清的改良型RPMI1640培养液中依次梯度稀释，各取100L加入96孔板中，设置002DMSO和水为对照组。00682一方面，取野生型BALB/C小鼠脾脏，在超净台下磨碎脾脏得到脾脏。
22、细胞，用含10胎牛血清的改良型RPMI1640培养液配制成密度为2106个细胞/毫升的细胞悬液，加入1MG/MLLPS刺激细胞增殖分化，将细胞平行加入已加入不同浓度小分子药物的96孔板中。另一方面，将培养的细胞系RAW2647用含10胎牛血清的DMEM培养液制成密度为说明书CN101948470ACN101948472A25/25页271105个细胞/毫升的细胞悬液，同样，将细胞平行加入已加入不同浓度小分子药物的96孔板中。00693培养48小时后，每孔吸出上清120L，加入MTT溶液每孔20L，再培养4小时。取出后1400R/MIN，离心7MIN，吸出所有上清，并每孔加入100LDMSO，置。
23、摇床上低速振荡10分钟，紫色结晶全部溶解。在酶联免疫检测仪570NM处测量各孔的吸光值。注意要设置空白对照与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照，其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。00704结果如图3NK007与DCB3503剂量毒性曲线，在不同药物浓度梯度下与对照相比的细胞毒性。0071实施例50072NK007可明显抑制DSS诱导的自身免疫性肠炎。00731TNF荧光素酶报告转基因小鼠在TNF基因后插入IRESLUCIFERASE序列，TNF表达的同时引发LUCIFERASE荧光素酶的表达，而荧光素酶的表达可以通过加入LUCIFERIN底物指示，此报告老鼠称之为TNFLUCIFER。
24、ASE小鼠。应用我们特有的报告老鼠，可以在连续时间内对活动物体内TNF的表达情况进行监视，从而最佳在体观测药物的作用。00742将TNF荧光素酶报告转基因小鼠随机分为对照组CONTROL组与药物处理组NK007组，从D0天开始给小鼠喂饮4DSS溶液，制造一种急性肠炎模型。对照组CONTROL组与药物处理组NK007组分别在D0、D2、D4、D6天进行注射，对照组每只老鼠腹腔注射200UL水，药物处理组每只老鼠腹腔注射200ULNK007药物浓度为6MG/KG，两组老鼠于D2、D4、D6天腹腔注射底物，在XENOGEN动物活体成像系统中进行活体成像，并于D7天取结肠部分在体外成像。结果见图400。
25、75以下见说明书附图0076图1不同浓度药物对TNF的抑制效果0077图2不同时间下NK007的剂量效应0078图3NK007与DCB3503的细胞毒性对比。ANK007与DCB3503对小鼠脾脏原代细胞的毒性对比；BNK007与DCB3503对单核巨噬细胞系RAW2647的毒性对比。0079图4NK007在DSS诱导的急性肠炎模型中对TNF的抑制作用。0080A第2、4、6天注射NK007后的小鼠TNF荧光强度明显低于对照组；0081B第7天处死小鼠后，注射NK007的小鼠肠道TNF荧光强度明显低于对照组。说明书CN101948470ACN101948472A1/3页28图1图2说明书附图CN101948470ACN101948472A2/3页29图3A图3B说明书附图CN101948470ACN101948472A3/3页30图4说明书附图CN101948470A。