用于生产基于酵母的疫苗的方法.pdf

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1、10申请公布号CN104120086A43申请公布日20141029CN104120086A21申请号201410244501422申请日2008020160/899,28120070202US200880010797620080201C12N1/16200601A61K39/00200601C12R1/86520060171申请人环球免疫公司地址美国科罗拉多州72发明人A弗兰祖索夫D奎克74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张涛54发明名称用于生产基于酵母的疫苗的方法57摘要本发明提供了在中性PH水平培养酵母的方法。在中性PH条件下培养的酵母呈现出可用于生物学目的如研发疫苗、预。

2、防剂和治疗剂的期望特征。本发明还提供了含有使用本文公开方法所培养的酵母的组合物和试剂盒。30优先权数据62分案原申请数据51INTCL权利要求书2页说明书20页附图9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书20页附图9页10申请公布号CN104120086ACN104120086A1/2页21培养酵母的方法，包括在培养基中培养酵母，其中培养基在558的PH水平维持至少50的酵母培养时间。2培养酵母的方法，包括在培养基中培养酵母，其中培养基维持在558的PH水平，且其中酵母的密度为至少05酵母单位/ML。3培养酵母的方法，其中在至少50的酵母培养时间中酵母培养在PH。

3、水平至少55的培养基中。4权利要求3的方法，其中培养基维持在558的PH水平。5权利要求3的方法，其中酵母是酿酒酵母。6权利要求3的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。7权利要求6的方法，其中培养基还含有大豆胨。8权利要求3的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。9权利要求8的方法，其中酵母表达异源抗原。10权利要求9的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。11组合物，含有通过权利要求1、2或3中任一方法培养的酵母。12生产抗原表达酵母的方法，其中在培养基中培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中所述培养基的PH为至少55。13生产抗原表达酵母的方法，其中培养含有用于表达所述抗原。

4、的表达系统的酵母，其中培养基维持在558的PH水平。14权利要求12或13的方法，其中酵母是酿酒酵母。15权利要求14的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。16权利要求15的方法，其中培养基还含有大豆胨。17权利要求12或13的方法，其中在向个体施用时酵母激发兔疫反应。18权利要求17的方法，其中酵母表达异源抗原。19权利要求18的方法，其中异源抗原在酵母表面表达。20权利要求18的方法，其中与在低于55的PH培养酵母时相比，所述异源抗原更易于获得用于与其他细胞或物质相互作用。21组合物，含有通过权利要求12或13所述的任一方法培养的酵母。22诱导个体TH1型反应的方法，其中向个体施用。

5、含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在PH水平至少55的培养基中进行过培养。23诱导个体TH1型反应的方法，其中向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在培养基中进行过培养，其中所述培养基维持在558的PH水平。24权利要求23的方法，其中组合物含有荷载了已在中性PH培养、维持或收获的酵母的树突细胞。25权利要求23的方法，其中酵母是酿酒酵母。26权利要求23的方法，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。27权利要求26的方法，其中培养基还含有大豆胨。28权利要求23的方法，其中在向个体施用时酵母激发免疫反应。29权利要求28的方法，其中酵母表达异源抗原。30权利要求29的方法，其中异源。

6、抗原在酵母表面表达。权利要求书CN104120086A2/2页331权利要求23的方法，其中TH1型反应是产生干扰素。32权利要求23的方法，其中TH1型反应是产生IL12。33培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的PH为至少55。34培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的PH维持在558的PH水平。35权利要求34的试剂盒，其中培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲。36权利要求34的试剂盒，其中培养基还含有大豆胨。37权利要求34的试剂盒，其中试剂盒还包括酵母。38权利要求37的试剂盒，其中酵母是冷冻的或冻干的。39权利要求37的试。

7、剂盒，其中酵母已在至少PH55的培养基中培养过，或已在培养基的PH维持在558的PH水平的培养基中培养过。40权利要求37的试剂盒，其中酵母能够复制。权利要求书CN104120086A1/20页4用于生产基于酵母的疫苗的方法0001本申请是申请日为2008年2月1日，申请号为2008800107976国际申请号为PCT/US2008/052843，名称为“用于生产基于酵母的疫苗的方法”的发明专利申请的分案申请。0002相关申请0003本申请要求在2008年2月2日递交的美国申请系列号NO60/899,281的优先权，特此将其整体并入作为参考。发明领域0004本发明涉及在中性PH培养酵母培养物以。

8、改善酵母培养物的产率和某些特征的方法。本发明还涉及通过这些方法产生的组合物。0005发明背景0006疫苗是卫生护理产业可利用的费效比最高的措施之一。然而对于多种疾病而言依然急需研发安全有效的疫苗和佐剂，包括由于致病因子感染、癌症、遗传缺陷所致的那些疾病及其他免疫系统紊乱。有关疫苗的出版物，例如RABINOVICH等，SCIENCE265，140114041994指出，仍然需要能够口服给药以及仅需少次、优选在生命早期给药的安全热稳定的疫苗。还优选能够保护个体对抗不止一种疾病的组合疫苗，以及不需要佐剂的疫苗和能够激发粘膜免疫的疫苗。迄今为止，如果有的话，也只有极少的疫苗满足所有这些标准。0007亚。

9、单位疫苗的研发因为重组DNA技术而成为可能，但迄今为止一直令人失望，因为它们仅呈现出有限的免疫原性。一个例子是最近几种HIV人类免疫缺陷病毒亚单位疫苗的临床测试已被终止，这不仅是因为这些疫苗功效有限，而且还因为在一些情况下经免疫的个体在随后接触HIV时表现出加剧的病程进展；例如参见COHEN，SCIENCE26418391994和COHEN，SCIENCE2646601994。亚单位疫苗以及杀死的病毒和重组活病毒疫苗的一个劣势在于虽然它们似乎刺激强体液免疫反应，但是不能激发保护性细胞免疫。1994年国际艾滋病大会INTERNATIONALAIDSCONFERENCE的主要结论是，依然需要细胞毒。

10、性T细胞介导的反应来预防或减轻HIV感染性，而这在迄今为止的临床疫苗中是一直缺乏的。另外，迄今为止所测试的HIV疫苗不能在粘膜表面最初HIV感染发生的位置激发免疫。0008此外，在美国批准使用的唯一佐剂是铝盐，即氢氧化铝和磷酸铝，两者均不能刺激细胞介导的免疫。另外，铝盐制剂不能进行冷冻或冻干，且这样的佐剂并非对所有抗原都有效。0009酵母细胞已经用于亚单位蛋白疫苗的生产，包括前述HIV疫苗试验中测试的一些。还曾在动物免疫之前对其饲喂酵母，试图以非特异性方式引发免疫反应即刺激吞噬作用以及补体和干扰素的产生。这些结果模棱两可，且这样的方案未产生保护性细胞免疫；例如参见FATTALGERMAN等，D。

11、EVBIOLSTAND771151201992和BIZZINI等，FEMSMICROBIOLIMMUNOL21551671990。说明书CN104120086A2/20页50010除疫苗之外，许多基因和药物治疗也都需要有效的特异性递送运载体以确保最大的可能益处。缺乏足够的递送运载体是基因治疗应用的主要拦路虎，并且大幅限制了许多药物的治疗潜力。例如，最近的报道显示目前正在临床上进行基因治疗应用检测的腺病毒载体会刺激不期望的免疫和炎性反应，且似乎并不以期望的方式发生整合；例如参见ENGELHARDT等，HUMANGENETHERAPY5121712291994及其中引述的参考文献。0011酵母疫苗。

12、技术的另一主要障碍为生产过程。多年来已在实验室进行了酵母细胞培养，且已经确立了标准培养条件。例如参见METHODSOFENZYMOLOGY，194卷，GUTHRIE等编辑，冷泉港实验室出版社COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS1990。标准操作方案一般包括在以PH水平衡量为酸性的培养基中培养酵母。然而，在酸性培养基中培养酵母可能导致酵母呈现出对于使用酵母作为抗原携带载体用于免疫调节或疫苗制备目的而言并非最佳的不同生物学特性。因此，需要培养酵母的方法，以便酵母呈现出使之更佳地适用于作为抗原携带载体的特性。本文公开的发明部分地基于这样的发现，即，虽然酵母能够在酸性培养基中。

13、生长，但酵母在酸性培养基中生长时所呈现出的生物学特性不如酵母在中性PH水平的培养基中生长时那样值得期望。0012特此将本文引述的所有专利、专利申请和出版物的公开内容整体并入作为参考用于一切目的。0013发明概述0014本发明提供了通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基在558的PH水平维持至少50的酵母培养时间。本发明还提供通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培养基维持在558的PH水平，且其中酵母的密度为至少05酵母单位/ML。0015在其他方面，本发明提供通过在PH水平至少55的培养基中培养酵母来生长酵母的方法。本发明还提供通过在培养基中培养酵母来生长酵母的方法，其中培。

14、养基维持在558的PH水平。在本发明的一方面，酵母是酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE。在本发明的一方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基额外地含有大豆胨SOYTONE。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。0016本发明提供组合物，其含有通过上述任何方法和相关方面培养的酵母。0017本发明提供生产抗原表达酵母的方法，方式为在培养基中培养含有用于表达所述抗原的表达系统的酵母，其中所述培养基的PH为至少55。本发明还提供生产抗原表达酵母的方法，方式是培养含有用于表达。

15、所述抗原的表达系统的酵母，其中培养基维持在558的PH水平。在一个方面，酵母是酿酒酵母。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基可以额外地含有大豆胨。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。在一些方面，与在PH低于55培养酵母相比，该异源抗原更易获得用于与其他细胞或物质相互作用。0018本发明还提供组合物，含有通过上文所公开的方法培养的酵母。0019本发明还提供诱导个体TH1型反应的方法，包括向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在PH水平至少55的培养基中培养。说明书CN。

16、104120086A3/20页60020本发明还提供诱导个体TH1型反应的方法，包括向个体施用含有抗原表达酵母的组合物，其中酵母已在培养基中培养，其中培养基维持在558的PH水平。在一个方面，组合物含有荷载了已在中性PH培养、维持或收获的酵母的树突细胞。在另一方面，酵母是酿酒酵母。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基可以额外含有大豆胨。在本发明的其他方面，酵母激发免疫反应。在本发明的其他方面，酵母表达抗原，在一些情况下抗原是异源抗原。在一些情况下，异源抗原在酵母表面表达。在一个方面，TH1型反应是产生干扰素。在另一方面，TH1型反应是产生IL12。0021本发明还提供了培养。

17、酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的PH至少55。本发明还提供了培养酵母的试剂盒，含有培养基和使用培养基培养酵母的说明书，其中培养基的PH维持在558的PH水平。在其他方面，培养基用琥珀酸盐或琥珀酸进行缓冲，或者培养基可以额外含有大豆胨。在一个方面，试剂盒额外包括酵母。在一些情况下，酵母是冷冻的或冻干的。在一些情况下，酵母已在至少PH55的培养基中进行过培养，或已在培养基的PH维持在558的PH水平的培养基中进行过培养。在其他情况下，酵母能够复制。0022附图的简短说明0023图1描绘了培养基PH水平对细胞生长以及对培养物PH水平的影响。0024图2描绘了培养基P。

18、H水平对细胞壁厚度的影响。0025图3描绘了测试PH大约65的不同缓冲液的结果。显示了对7515细胞的生长和培养物PH的影响。0026图4描绘了通过葡聚糖酶裂解测量的、多种缓冲剂对细胞壁厚度的影响。培养基使用琥珀酸盐或柠檬酸盐进行缓冲，以缓冲培养基至大约65的PH水平。0027图5描绘了培养基配方研究的结果，其中测试了多种添加剂对生长和PH水平的影响。0028图6描绘了作为培养基配方研究一部分的酵母细胞存活力结果。酵母细胞表面上HA的表面表达利用流式细胞计数测量。0029图7描绘了培养基配方研究中的细胞生长和PH曲线结果，其中测试了多种添加剂。0030图8描绘了可以自完整酵母释放的血细胞凝集素。

19、HA的免疫印迹测定结果，当在中性条件培养酵母时相对于在较低PH条件培养酵母时，完整细胞显示出HA可及性的差异。免疫印迹为来自YEX和G18103的DTT洗脱物的WESTERN印迹蛋白质分析。0031图9描绘了在中性和低PH水平培养酵母细胞对于荷载酵母细胞的树突细胞的细胞因子分泌的影响。0032发明详述0033本文公开的发明基于这样的发现，即在中性PH、至少PH55、或PH558、或PH68培养酵母将导致酵母具有更为期望的生物学特征。这些期望特征中的一些在下文详述，包括但不限于能够在增大的细胞密度下生长良好，保持酵母细胞壁的柔韧性PLIABILITY和对细胞壁消化酶消化的敏感性，以及以使抗原更易。

20、于被其他细胞和/或物质所获得的方式展示抗原。0034通用技术说明书CN104120086A4/20页70035除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学包括重组技术、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，这些技术是本领域技术人员众所周知的。这样的技术在文献中有充分的解释，例如METHODSOFENZYMOLOGY，194卷，GUTHRIE等编辑，冷泉港实验室出版社1990；BIOLOGYANDACTIVITIESOFYEASTS，SKINNER等编辑，ACADEMICPRESS1980；METHODSINYEASTGENETICSALABORATORYCOURSEMANU。

21、AL，ROSE等，冷泉港实验室出版社1990；THEYEASTSACCHAROMYCESCELLCYCLEANDCELLBIOLOGY，PRINGLE等编辑，冷泉港实验室出版社1997；THEYEASTSACCHAROMYCESGENEEXPRESSION，JONES等编辑，冷泉港实验室出版社1993；THEYEASTSACCHAROMYCESGENOMEDYNAMICS，PROTEINSYNTHESIS，ANDENERGETICS，BROACH等编辑，冷泉港实验室出版社1992；分子克隆实验室指南MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL第二版SAMBROOK等，19。

22、89和分子克隆实验室指南第三版SAMBROOK和RUSSELL，2001，在本文联合称为“SAMBROOK”；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYFMAUSUBEL等编辑，1987，包括直至2001年的增补本；PCRTHEPOLYMERASECHAINREACTION，MULLIS等编辑，1994；HARLOW和LANE1988ANTIBODIES，ALABORATORYMANUAL，冷泉港出版公司COLDSPRINGHARBORPUBLICATIONS，纽约；HARLOW和LANE1999USINGANTIBODIESALABORATORYMANUAL冷泉港实。

23、验室出版社，冷泉港，纽约在本文联合称为“HARLOW和LANE”，BEAUCAGE等编辑，CURRENTPROTOCOLSINNUCLEICACIDCHEMISTRYJOHNWILEYSONS，INC，NEWYORK，2000和VACCINES，SPLOTKIN和WORENSTEIN编辑，第三版1999。0036定义0037如本文所用，一般使用的术语“中性PH”是指至少55的PH水平。中性PH范围可以是大约PH55至大约PH8，优选大约PH6至大约8。本领域技术人员将会理解，用PH计测量时会发生微小的波动例如十分之几或百分之几，照此，在任何给定时间确定PH水平时应当将此考虑在内。0038如本文。

24、所用，一般使用的术语“抗原”指任何能够为获得性免疫系统所识别的分子。在一个方面，抗原是与抗体特异性结合的分子。所述分子可以是天然存在或合成产生的蛋白质的任何部分肽、部分蛋白质、全长蛋白质；或是细胞组合物的部分全细胞、细胞裂解物或破坏的细胞；或是生物体的部分整个生物体、裂解物或破坏的细胞；或是糖或其部分。抗原本身或借助于其他化合物如佐剂像破碎的酵母细胞能够激发抗原特异性体液免疫反应。在另一方面，抗原在主要组织相容性复合体MHC的环境中被T淋巴细胞或T细胞识别。在另一方面，抗原能够作为耐受原TOLERAGEN，对抗在接受该抗原施用的动物细胞和组织内所遭遇的相同或相似抗原。0039在本发明的一个方面。

25、，当述及刺激免疫反应时，“抗原”可以是“免疫原”。免疫原是能够激发获得性免疫反应、例如诱导抗体产生的分子。免疫原在一些情况下能够产生记忆细胞，这些细胞在将来接触所述抗原时将产生识别所述抗原的抗体。正如本领域技术人员众所周知的那样，免疫原也能够为T淋巴细胞所识别，尽管T淋巴细胞所识别的免疫原的形式将有别于抗体所识别的免疫原的形式。0040培养酵母的方法0041本发明提供了培养酵母的方法，所述酵母产生期望的特征，例如期望抗原的高表说明书CN104120086A5/20页8达，细胞壁的柔韧性，抗原的展示。0042这些方法广泛适用于所有酵母。酵母为归属于下述三纲之一的单细胞微生物子囊菌纲ASCOMYC。

26、ETES、担子菌纲BASIDIOMYCETES和半知菌纲FUNGIIMPERFECTI。虽然根据本发明能够使用致病性酵母菌株或其非致病性突变株，但在一个方面，使用非致病性酵母菌株。非致病性酵母菌株的实例包括酵母菌属SACCHAROMYCES、假丝酵母属CANDIDA、隐球菌属CRYPTOCOCCUS、汉逊酵母属HANSENULA、克鲁维酵母属KLUYVEROMYCES、毕赤酵母属PICHIA、红酵母属RHODOTORULA、裂殖酵母属SCHIZOSACCHAROMYCES和耶氏酵母属YARROWIA。在一个方面，使用酵母菌属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。而在其他方面，使用酿。

27、酒酵母、卡尔酵母SACCHAROMYCESCARLSBERGENSIS、白假丝酵母CANDIDAALBICANS、乳酒假丝酵母CANDIDAKEFYR、热带假丝酵母CANDIDATROPICALIS、罗伦隐球酵母CRYPTOCOCCUSLAURENTII、新型隐球酵母CRYPTOCOCCUSNEOFORMANS、异常汉逊酵母HANSENULAANOMALA、多形汉逊酵母HANSENULAPOLYMORPHA、脆壁克鲁维酵母KLUYVEROMYCESFRAGILIS、乳酸克鲁维酵母KLUYVEROMYCESLACTIS、马克斯克鲁维酵母乳酸变种KLUYVEROMYCESMARXIANUSVARL。

28、ACTIS、巴斯德毕赤酵母PICHIAPASTORIS、深红酵母RHODOTORULARUBRA、栗酒裂殖酵母SCHIZOSACCHAROMYCESPOMBE和解脂耶氏酵母YARROWIALIPOLYTICA。应当理解本发明不局限于上述物种清单，本领域技术人员能够将本文的教导应用于任何类型的酵母。在另一方面，使用酿酒酵母实施本发明的方法。优选酿酒酵母是因为其易于进行分子操作，且用作食品添加剂“公认安全”“GENERALLYRECOGNIZEDASSAFE”，“GRAS”GRAS，FDA提出的细则62FR18938，1997年4月17日。0043PH水平在酵母培养中十分重要。本领域技术人员将会理。

29、解，培养过程不仅包括酵母培养物的起始，而且还包括培养物的维持。酵母培养物可以始于任何PH水平，可是由于酵母培养物的培养基倾向于随着时间的推移而变得更酸即，PH降低，因此在培养过程中必须小心监测PH水平。0044在本发明的一些方面，酵母在PH水平至少55的培养基中生长。在其他方面，酵母在大约55的PH水平生长。在其他方面，酵母在558的PH水平生长。在一些情况下，酵母培养物在558的PH水平维持。在其他方面，酵母在68的PH水平生长。在一些情况下，酵母培养物在68的PH水平维持。在其他方面，酵母在6181的PH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6282的PH水平生长和/或维持。在其他方面，酵。

30、母在6383的PH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6484的PH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在5585的PH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在6585的PH水平生长和/或维持。在其他方面，酵母在大约56、57、58或59的PH水平生长。在另一方面，酵母在大约6的PH水平生长。在另一方面，酵母在大约65的PH水平生长。在其他方面，酵母在大约6、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70的PH水平生长。在其他方面，酵母在大约7、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80的PH水平生长。在其他方面，酵母在高于8的PH水平生长。0045在一个方面，培养。

31、酵母以便培养基的PH水平不降至PH55以下。在一些情况下，降至PH55以下的时间不长于5分钟。在其他情况下，降至PH55以下的时间不长于10分钟、优选20、30、40、50或60分钟。在其他情况下，降至PH55以下的时间不长于1小时。在说明书CN104120086A6/20页9另一方面，培养酵母以便培养基的PH水平不降至PH50以下。在一些情况下，降至PH50以下的时间不长于5分钟。在其他情况下，降至PH50以下的时间不长于10分钟、优选20、30、40、50或60分钟。在其他情况下，降至PH50以下的时间不长于1小时。照此，酵母在至少PH55或以上的培养基中培养的时间越长，就获得具有下文所述。

32、期望特征的酵母而言结果就越好。0046在一个方面，利用中性PH方法生长酵母细胞意味着在至少50的酵母培养时间中酵母细胞生长在中性PH。更优选，在酵母培养的至少60时间中，更优选至少70的培养时间中，更优选至少80的培养时间中，最优选至少90的培养时间中，酵母在中性PH生长。0047在另一方面，在中性PH生长酵母包括在中性PH培养酵母细胞至少5分钟，优选在中性PH至少15分钟，更优选在中性PH至少1小时，更优选至少2小时，甚至更优选至少3小时或更长时间。0048如早先所指出的那样，随着酵母生长和复制，细胞密度变得更大，且培养基的酸度水平升高。照此，建议当酵母密度增大时将酵母培养在至少55的PH水。

33、平和/或维持在至少PH55。在一个方面，当酵母密度为05酵母单位YU/ML或以上时，将酵母培养和/或维持在558的PH。在其他方面，当酵母密度为至少06YU/ML或以上、优选07YU/ML或以上、08YU/ML或以上、09YU/ML或以上、或者1YU/ML或以上时，将酵母培养和/或维持在558的PH。在另一方面，当酵母密度为05YU/ML或以上时，将酵母培养和/或维持在68的PH。在其他方面，当酵母密度为至少06YU/ML或以上、优选07YU/ML或以上、08YU/ML或以上、09YU/ML或以上、或者1YU/ML或以上时，将酵母培养和/或维持在68的PH。0049在一些方面，优选收获时酵母培。

34、养物处于中性PH水平。在一些情况下，酵母培养物在收获时将处于68的PH水平。在其他情况下，酵母培养物在收获时将处于558的PH水平。0050培养基可以通过任何手段达到至少55的PH水平。在一个方面，利用琥珀酸及任何相关形式，如阴离子琥珀酸根缓冲培养基。如实施例中进一步详述的那样，利用琥珀酸盐缓冲培养基至至少PH55，允许酵母具有大约两个到两个半小时的倍增时间。琥珀酸盐可由商业可获得来源例如西格玛化学SIGMACHEMICALS获得。在其他方面，可利用柠檬酸盐使培养基达到PH至少55。本领域技术人员将能够容易地确定可用来使培养基达到PH至少55而同时保持酵母存活的其他缓冲剂。缓冲剂保持溶液处于稳。

35、定PH水平的概念是本领域熟知的，照此本文将不作详细讨论。如果根据本发明培养的酵母用于药物制品例如疫苗，则建议使用GMP级的材料。0051另外，可以向培养基中添加其他增补物以改善培养基。特别有助于添加到培养基中的其他增补物包括大豆胨。大豆胨可容易地由商业来源例如BDDIFCO获得。如实施例和附图中所显示的那样，向培养基中添加大豆胨支持在中性PH更高密度的生长。此外，添加大豆胨支持目的抗原流感病毒血细胞凝集素HA的表达。0052可以向酵母培养物中添加其他添加剂用于其他目的，例如包括表达异源基因。在一些方面，利用铜诱导血细胞凝集素表达。不过，中性PH使用铜并不理想，因而，为控制诱导型基因在于中性PH。

36、培养的酵母中表达，建议非铜的添加剂。0053中性PH对酵母培养物的影响说明书CN104120086A7/20页100054利用中性PH培养酵母可以促进若干生物学效应，就利用酵母作为载体进行免疫调节和/或激发免疫反应而言这些效应是期望的特征。在一个方面，在中性PH培养酵母允许酵母生长良好而对倍增时间没有任何负面影响例如减慢倍增时间。酵母能够持续生长至高密度而不丧失其细胞壁柔韧性。0055在另一方面，中性PH的使用，例如至少55的PH或PH558，允许在所有收获密度产生具有柔韧细胞壁的酵母，和/或对细胞壁消化酶例如葡聚糖酶具有敏感性的酵母。照此，本发明提供了有关具有如通过传统测定法例如对葡聚糖酶的。

37、敏感性所测量的细胞壁柔韧性的酵母的方法和组合物。以前的实验已经确立酵母在大约05YU酵母单位/ML的收获密度时丧失其对细胞壁消化酶消化的敏感性。照此，一个优势在于可以利用与在标准生长培养基中以05YU/ML培养的酵母进行的比较，来比较于任何密度的中性PH生长。这种性状是期望的，因为具有柔性细胞壁的酵母能够呈现出独特的免疫反应，例如促进酵母寄宿的细胞中的细胞因子例如INF分泌。本领域技术人员会使用中性PH方法的另一原因在于其允许位于细胞壁中的抗原具有更高的可及性。这有助于所表达蛋白质的更大的免疫原性和抗体检测，如通过标准技术如流式细胞仪所测量的那样。0056在中性PH培养的酵母中所观察到的另一期。

38、望特征是抗原以有益于免疫调节目的的方式表达。在一个方面，酵母用作为载体用于抗原表达例如参见美国专利NO5,830,463和7,083,787。抗原可以是酵母的天然抗原，或者是酵母表达的异源抗原。在一些方面，利用酵母表达抗原有助于研发疫苗、预防剂和治疗剂，以对抗多种疾病和紊乱例如传染性疾病或癌症。利用中性PH方法，本领域技术人员能够产生抗原携带酵母，其中抗原更易于被其他细胞例如用于免疫共刺激功能或免疫调控或其他物质例如抗体用于检测所获得。另外，对一些抗原，例如流感HA抗原，使用中性PH，允许通过二硫苏糖醇DTT处理释放二硫键键合的HA，这在HA表达酵母于PH降至PH5以下的培养基中培养的情况下是。

39、不可能的。在一些情况下，这发生在PH降至PH5以下任意长的时间的情况下。在其他情况下，这发生在PH降至PH5以下1分钟或几分钟或者1或多个小时的情况下。0057按照中性PH方法培养的酵母所呈现的另一期望特征在于与所述酵母接触的细胞将分泌TH1型细胞因子。TH1型细胞因子的实例包括但不限于干扰素、IL12和IL2。如实施例中进一步详述的那样，与在低酸性PH培养基中培养的酵母相比，荷载了依照中性PH方案培养的酵母的树突细胞呈现出增加水平的干扰素分泌和表达。利用中性PH培养方法时IL12的分泌水平并无下降。由此，本领域技术人员能够将本文公开的中性PH方法用于免疫调节目的，例如在罹患将得益于增强的TH。

40、1型反应的疾病或紊乱的个体中诱导TH1型反应。0058利用中性PH方法培养的酵母的组合物0059本发明还考虑含有利用本文公开的中性PH方法所培养的酵母的组合物。在一个方面，组合物含有在其表面、内部或表面及内部表达天然抗原的酵母。这类组合物可用于多种目的，例如作为佐剂给药。在另一方面，组合物含有在其表面、内部或表面及内部表达异源抗原的酵母。这类组合物可用于多种目的，例如对需要的个体进行免疫调节以及研发疫苗。0060这些组合物还可以包括可药用的赋形剂和/或载体。可药用的载体可以包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄说明书CN104120086A10。

41、8/20页11油、以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂例如基于林格氏葡萄糖液的那些等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。用可药用赋形剂配制含有中性PH条件下培养的酵母的组合物，对于本领域技术人员而言是一般常规的。0061本发明的试剂盒0062本发明考虑含有用于在中性PH条件下培养酵母的培养基组分的试剂盒。在一个方面，试剂盒包括培养基组分和有关其使用的一套说明书，其中所述。

42、培养基组分含有琥珀酸盐或琥珀酸，可用于使培养基达到至少55的PH。在另一方面，试剂盒还包括大豆胨作为附加组分。在另一方面，试剂盒还包括酵母细胞。酵母细胞可以是冷冻的，用于通过本文公开的方案起始培养物。在另一方面，酵母细胞可以在冷冻以包装为试剂盒的一部分之前就已经通过本文公开的方法进行过培养。在另一方面，酵母细胞可以是冻干的，并任选地纳入在试剂盒之中。在另一方面，试剂盒含有根据本文公开的方法制备的、能够复制的酵母。0063提供如下实施例以举例说明本发明的某些方面。它们并非旨在以任何方式限制本发明。实施例0064实施例1酵母培养基配方0065多种类型的培养基可用来培养酵母并可以进行调整以使PH水平。

43、为中性。下文给出了可以使用的几种培养基的实例，不过，应当理解本发明并不局限于这些培养基组分或培养基方案的使用。0066一种标准培养基配方是如下的ULDM培养基0067组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤00204SIGMAA9795色氨酸00204JTBAKER2092组氨酸00204JTBAKERN327葡萄糖一水合物2505000EMD1083422500说明书CN104120086A119/20页120068另一标准培养基配方是如下的UL2培养基0069组分G/L。

44、20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤0408SIGMAA9795色氨酸0408JTBAKER2092组氨酸0408JTBAKERN327葡萄糖一水合物1503000EMD10834225000070另一标准培养基配方是如下的UL3培养基0071组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸25500DIFCO233520硫酸铵751500EMDAX13853或者YNB不含氨基酸1002000DIFCO腺嘌呤00612SIGMAA9795色氨酸00612JTBAKER2092组氨酸0。

45、0612JTBAKERN327葡萄糖一水合物2254500EMD10834225000072另一标准培养基配方是如下的UL4培养基0073组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸34680DIFCO233520说明书CN104120086A1210/20页13硫酸铵1002000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸1342680DIFCO腺嘌呤00816SIGMAA9795色氨酸00816JTBAKER2092组氨酸00816JTBAKERN327葡萄糖一水合物3006000EMD10834225000074另一标准培养基配方是如下的UDM培养基0075组分G/L20L来源YNB不含硫。

46、酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者葡萄糖一水合物2505000EMD108342250000760077UL2AA培养基配方如下0078组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤00408SIGMAA9795色氨酸00612JTBAKER2092组氨酸00612JTBAKERN327葡萄糖一水合物1503000EMD1083422500说明书CN104120086A1311/20页140079UL3AA培养基配方如下0080。

47、组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸25500DIFCO233520硫酸铵751500EMDAX13853或者YNB不含氨基酸1002000DIFCO腺嘌呤00612SIGMAA9795色氨酸00816JTBAKER2092组氨酸00816JTBAKERN327葡萄糖一水合物2254500EMD10834225000081UDMAA培养基配方如下0082组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤00204SIGMAA9795色氨酸00408JTBAKER2092组氨酸。

48、00408JTBAKERN327亮氨酸00612JTBAKER2083葡萄糖一水合物2505000EMD108342250000830084U2AA培养基配方如下0085说明书CN104120086A1412/20页15组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤00408SIGMAA9795色氨酸00612JTBAKER2092组氨酸00612JTBAKERN327亮氨酸00918JTBAKER2083葡萄糖一水合物1503000EMD10834225000086U3AA培养。

49、基配方如下0087组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸25500DIFCO233520硫酸铵751500EMDAX13853或者YNB不含氨基酸1002000DIFCOYNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤00204SIGMAA9795色氨酸00204JTBAKER2092组氨酸00204JTBAKERN327亮氨酸00306JTBAKER2083葡萄糖一水合物2505000EMD108342250000880089另一标准培养基配方是如下的U2培养基0090说明书CN104120086A1513/20页16组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸17340DIFCO233520硫酸铵501000EMDAX13853或者YNB不含氨基酸671340DIFCO腺嘌呤00408SIGMAA9795色氨酸00408JTBAKER2092组氨酸00408JTBAKERN327亮氨酸00612JTBAKER2083葡萄糖一水合物1503000EMD10834225000091另一标准培养基配方是如下的U3培养基0092组分G/L20L来源YNB不含硫酸铵和氨基酸25500DIFCO233520硫酸铵751500EMDAX13853或者YNB不含氨基酸1002000DIFCO腺嘌呤00612SIGMAA9795色氨酸00612JTBAKER2092组。