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1、10申请公布号CN104099367A43申请公布日20141015CN104099367A21申请号201310129273122申请日20130415C12N15/82200601C12N15/11200601C12Q1/68200601A01H5/0020060171申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号72发明人林拥军陈浩74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人张红兵54发明名称一种培育转基因抗虫水稻的方法57摘要本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及一种转基因抗鳞翅目害虫尤其是抗螟虫水稻的培育方法。利用SEQIDNO1所示的人工合成的新型杀虫基因。
2、CRY2A作为目标基因，以BAR基因为选择标记基因，采用农杆菌介导的遗传转化法，将目标基因导入水稻优良恢复系明恢63中，获得高抗水稻鳞翅目害虫尤其是抗螟虫的转基因水稻材料T2A1。此外，可通过有性杂交和体细胞杂交等技术将T2A1的抗虫基因重组到新的水稻种质中去，培育成水稻抗虫新品种系。本发明公开了转化载体构建，水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定，插入位点的序列分析以及室内和田间抗虫试验等系列过程的验证试验。51INTCL权利要求书1页说明书14页序列表14页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书14页序列表14页附图4页10申请公布号CN104099367A。
3、CN104099367A1/1页21一种培育抗螟虫的转基因水稻的方法，其特征在于，利用序列表SEQIDNO16所示的抗虫基因CRY2A构建植物表达载体PBAR13CRY2A，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将所述的表达载体PBAR13CRY2A导入到水稻受体中，使其在转基因水稻中表达CRY2A基因，通过检测转基因水稻对水稻螟虫的抗性，获得抗螟虫的转基因水稻T2A1。2一种植物表达载体PBAR13CRY2A，其特征在于，该载体含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。3一个水稻复合转基因结构，其特征在于在权利要求1所述的转基因水稻T2A1的水稻基因组第12染色体上，。
4、所述的复合转基因结构由以下所示的序列沿5到3方向顺序连接而成ISEQIDNO3所示的插入位点5端侧翼序列；IISEQIDNO4所示的插入的外源基因序列；和IIISEQIDNO5所示的插入位点3端侧翼序列。4应用权利要求3所述水稻复合转基因结构的方法，其特征在于培育一种衍生抗虫水稻的材料，所述衍生水稻材料基因组第12染色体特定位点携带有权利要求1所述的由ISEQIDNO3所示的序列，IISEQIDNO4所示的插入的外源基因序列，和IIISEQIDNO5所示的序列连接而成的复合转基因结构。5一种侧翼序列，其特征在于所述的侧翼序列是在转基因水稻T2A1的外源基因中插入一个片段，所述的片段的核苷酸序列。
5、如SEQIDNO3所示。6一种侧翼序列，其特征在于所述的侧翼序列是在转基因水稻T2A1的外源基因中插入一个片段，所述的片段的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。7一种转基因抗虫水稻5端侧翼序列的定性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示AD5F1GCAACTCAAGAAGGACTCAATG；ESPUBIRAGGCTGGCATTATCTACTCG。8一种转基因抗虫水稻3端侧翼序列的定性PCR检测方法，其特征在于PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示BAR1FACAAGCACGGTCAACTTCC；T2A2RATGCCAACACGCCCAATC。权利要求书CN10409。
6、9367A1/14页3一种培育转基因抗虫水稻的方法技术领域0001本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌介导的遗传转化技术将外源基因导入水稻受体品种从而获得转基因抗虫水稻的方法。背景技术0002水稻是最重要的粮食作物之一，是全球一半人口的主粮。全球每年种植的水稻面积超过了145亿公顷，我国的常年种植面积在3000万公顷左右。虫害是水稻ORYZASATIVAL生产上水稻减产的主要原因之一。据统计，国内有记载的水稻害虫有385种，其中最主要的害虫有鳞翅目的二化螟CHILOSUPPRESSALIS、三化螟TRYPORYZAINCERTULAS和稻纵卷叶螟CNAPHALOCROCISM。
7、EDINALIS。二化螟和三化螟主要危害水稻茎秆，在苗期和分蘖期造成枯心；在孕穗初期侵入，造成枯孕穗；在孕穗末期和抽穗初期侵入，造成白穗PATHAK1977。稻纵卷叶螟CNAPHALOCROCISMEDINALIS则以幼虫缀丝纵卷水稻叶片成虫苞，幼虫匿居其中取食叶肉，形成白色条斑。长期以来，水稻螟虫主要通过化学农药进行防治，不但增加了生产成本，而且造成了环境污染、生态破坏和危害人体健康等问题通过大规模的筛选，目前尚未在水稻中找到有效控制虫害的抗性基因资源。因此，通过转基因技术培育抗虫水稻是解决上述问题的最有效途径。0003目前在转基因抗虫水稻培育上，最成功的例子就是表达苏云金芽胞杆菌BACIL。
8、LUSTHURINGIENSIS，简称BT来源的杀虫蛋白的转基因水稻。BT菌是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界如土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中贾士荣等，2001。1901年，日本学者石渡从染病的家蚕体液中首次分离出BT菌，并证明部分BT对鳞翅目昆虫有杀虫活性。二十世纪50年代，人们发现BT菌的杀虫活性与伴胞晶体有关HANNAY1953，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成HANNAY和FITZJAMES，1955。这种蛋白通常被称作内毒素ENDOTOXINS或杀虫晶体蛋白INSECTICIDALCRYSTALPROTEIN，ICP。杀虫晶体蛋白的分子量一般为130140KD左右，其基因一。
9、般位于苏云金芽胞杆菌的质粒上。苏云金芽胞杆菌菌株通常含有不只一种杀虫晶体蛋白基因；而同种杀虫晶体蛋白基因可以在多种不同的菌株中存在。目前人们已从不同的BT菌的亚种中分离出对不同昆虫如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、螨类等和无脊椎动物如寄生线虫、原生动物等有特异毒杀作用的杀虫晶体蛋白。0004近年来基因工程技术的不断发展，通过在转基因植物中导入并表达苏云金芽胞杆菌内毒素基因培育抗虫植物成为现实。相对于传统的BT杀虫制剂，应用表达内毒素的转基因植物有优点也有缺点。表达内毒素的转基因抗虫植物可以在整个生长季节提供保护，对于钻到土壤下面或茎秆里面的害虫如欧洲玉米螟EUROPEANCORNBORER，ECB或大。
10、部分时间都是躲在花或铃里的棉铃虫COTTONBOLLWORM，CBW也更有效。但是，相对于微生物制剂，转基因作物会对害虫造成更大的选择压力，更快导致抗性害虫的产生。在实验室中，已经有抗性害虫被筛选出来了。各种策略可以被采用以延缓和阻止害虫在田间产生抗性。与合成的化学杀虫剂相比，转基因植物或微生物杀虫剂对环境的一个主要优说明书CN104099367A2/14页4点是其杀虫毒性的专一性，因而可以显著降低其对非靶标昆虫和其他生物的不利影响。0005一些主要作物的主要害虫均在BT蛋白毒杀的范围内，所以BT菌及其相关技术在作物虫害的防治上具有广泛的应用前景。据估计全球范围内农业生产每年花费在杀虫剂上的费。
11、用为81亿美元，而若采用BT相关技术则可减少约27亿美元的花费。0006由于BT基因来源于苏云金芽胞杆菌，若将野生BT基因直接导入植物细胞，往往难以检测出其MRNA的转录，BT蛋白表达量很低，因而转基因植株的抗虫性部很弱，抗虫效果不理想。因此，要使得BT基因在转基因植物中高效表达，必须对野生BT基因进行有效的改造。1990年，ADANG等通过调整野生基因的AT含量和密码子的使用频率，使其与双子叶植物基因保持一致，去除了影响基因在植物中表达的AATGAA，合成了一个新BT基因。他们利用改造的基因转化植物，BT蛋白的表达量得到提高。1991年，PERLAK等在不改变晶体蛋白氨基酸序列的情况下，对C。
12、RYLAB基因进行了部分改造或通过人工合成进行完全改造，选用植物偏爱的密码子，部分去除了原序列中干扰基因在植物中表达的元件，如ATTTA序列，获得了PM和FM基因，将其转化植物后目标蛋白表达量获得提高。1992年，郭三堆等人通过双链合成DNA方法，人工合成了全长1824BP的CRY1AB和CRY1AC融合的GFM杀虫基因，结果BT毒蛋白在植物中的表达量提高了约100倍。1996年，STRIZHOV等首次对野生CRY1CA进行了改造，改造后的CRY1C在苜蓿和烟草中的表达量大幅增加，并表现对SPODOPTERALITTORALIS和SPODOPTERAEXIGA较高水平的抗性。1999年，CAO。
13、等对野生的CRY1C进行了改造并导入椰菜，获得了对PLUTELLAXYLOSTELLA高效抗性的转基因株系。之后，许多科学工作者对BT杀虫基因进行了大量的改造研究，并利用改造的BT杀虫基因做了大量的植物转化工作，为培育BT抗虫植物打下了基础。据不完全统计，至今已有部分改良或人工合成的BT基因专利四十多项。0007为了防治鳞翅目害虫，许多BT基因部通过转基因方法被导入水稻中，成功地获得了具有抗虫性的转基因株系，并进行了一些田间试验FUJIMOTOETAL，1993；NAYAKETAL，1997；TUETAL，2000；CHENETAL，2005；TANGETAL，2006。水稻是粮食作物，因此各。
14、国对其转基因品种的商业化种植许可极其谨慎，相应的生物安全性评价也更为严格。迄今为止，只有伊朗在2005年开始商业化种植BT水稻，面积达到4000公顷JAMES，2005。2009年，转CRY1AB/AC基因的抗虫水稻华恢1号及其杂交种BT汕优63获得了在中国湖北省生产应用的安全证书，具有里程碑的意义。在其它的国家，由于政府决策、生物安全法规、消费者等因素的影响，还没有BT水稻品种实现商业化种植。发明内容0008本发明的目的在于提供一种培育转基因抗虫水稻的方法，其中基因转化的受体为水稻品种明恢63，所使用的目的基因为杀虫基因CRY2A其核苷酸序列见中国发明专利ZL021390002文献和本说明书。
15、的序列表SEQIDNO16。0009采用农杆菌介导的籼稻遗传转化法参见专利号为ZL2004100133442文献，将杀虫基因CRY2A导入受体水稻品种明恢63中。通过PCR分析对T0代转基因植株进行阳性检测，SOUTHERN杂交确定不同转基因家系的拷贝数，以酶联免疫吸附法检测杀虫晶体蛋白的含量，室内离体茎杆接虫结合田间自然发虫鉴定确定不同转基因家系的抗虫性。同时在田间调查转基因植株的株高、分蘖数、产量等农艺性状，最终获得外源基因单拷贝插入，高说明书CN104099367A3/14页5抗水稻鳞翅目害虫且农艺性状与原品种没有显著差异的转基因水稻新材料。通过反向PCR确定外源基因插到受体品种明恢63。
16、中的侧翼序列。该转基因抗虫材料可通过有性杂交和体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，进而培育获得抗虫水稻衍生新品种系。0010本发明还公开了转化载体的构建，水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定，插入位点的序列分析，室内和田间抗虫试验以及农艺性状调查等过程。0011本发明的具体步骤是0012一种培育提高水稻对螟虫抗性的转基因植物的方法，利用序列表SEQIDNO16所示的抗虫基因CRY2A，构建获得如图2所示的植物表达载体PBAR13CRY2A，通过农杆菌介导的籼稻遗传转化方法，将所述的表达载体PBAR13CRY2A导入到水稻受体中，使其在转基因水稻中表达CRY2A基因，通过在室内和田间检测转基因水稻。
17、对水稻螟虫的抗性，最终获得高抗螟虫的转基因水稻植株；0013其中图2所示的植物表达载体PBAR13CRY2A含有序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列。0014其中的植物表达载体PBAR13CRY2A含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列和图2所示结构，该载体通过如下步骤构建而成0015先用XHOI酶切图1所示PCAMBIA1300质粒载体，然后用T4DNA聚合酶抹成平末端，连入BAR基因形成中间载体PBAR13，用HINDBAMHI双酶切PBAR13后，连入玉米UBIQUITIN启动子，再用BAMHI酶切后，连入SEQIDNO16所示的CRY2A基因后形成如图2所示的植物表达载体PBAR13C。
18、RY2A。0016本发明利用上述方法获得的一个复合转基因结构，该转基因水稻植株T2A1基因组的特定位点上携带了一种能稳定遗传的复合转基因结构，该特定位点位于水稻基因组第12染色体，所述的复合转基因结构由以下所示的序列沿5到3方向顺序连接而成0017ISEQIDNO3所示的插入位点5端侧翼序列；0018IISEQIDNO4所示的插入的外源基因序列；和0019IIISEQIDNO5所示的插入位点3端侧翼序列。0020所述衍生水稻材料基因组第12染色体特定位点携带有由ISEQIDNO3所示的序列，IISEQIDNO4所示的插入的外源基因序列，和IIISEQIDNO5所示的序列连接而成的复合转基因结构。
19、。0021本发明得到一种侧翼序列，其在转基因水稻T2A1的外源基因中插入位置的5端，该片段的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。0022本发明得到另一种侧翼序列，其在转基因水稻T2A1的外源基因中插入位置的3端，所述的片段的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。0023本发明提供了一种转基因抗虫水稻T2A1的5端侧翼序列的定性PCR检测方法，PCR反应中的引物对的核苷酸序列如下所示0024AD5F15GCAACTCAAGAAGGACTCAATG3；00255ESPUBIR为5AGGCTGGCATTATCTACTCG3。0026本发明提供了一种转基因抗虫水稻T2A1的3端侧翼序列的定性PCR检测方法，。
20、PCR反应中的引物对的DNA序列如下所示0027BAR1F5ACAAGCACGGTCAACTTCC3；说明书CN104099367A4/14页60028T2A2R5ATGCCAACACGCCCAATC3。0029具体地，本发明是这样实现的0030先以PCAMBIA1300质粒为基础载体，构建具有选择标记BAR基因的载体PBAR13，再将人工合成的CRY2A基因插入其多克隆位点，形成相应的植物表达载体PBAR13CRY2A。将水稻品种明恢63的成熟种子消毒后诱导胚性愈伤组织。将含有表达载体PBAR13CRY2A的农杆菌菌株与胚性愈伤组织进行共培养后，在含有除草剂BASTA的筛选培养基上进行抗性愈。
21、伤组织的筛选，将筛选出来的抗性愈伤组织在分化培养基上进行分化，当分化的小植株长到2CM左右时，切掉原生根，放到生根培养基上进行生根，当新根生长到2CM左右时，炼苗后移栽到温室。这些再生小苗即为T0代转基因苗。0031在T0代苗生长期间，通过PCR检测的方法去掉假阳性转基因植株，并对阳性的T0植株进行收种。在T1代，转基因植株分家系进行种植，通过田间观察，挑选抗虫性好且农艺性状无明显变异的转基因家系，并进行SOUTHERN杂交分析，确定其外源基因插入的拷贝数。随后，将挑选出来的单拷贝家系分单株进行收种。收获的种子在含有BASTA的培养基上进行发芽试验，筛选出纯合的转基因单株。通过进一步的室内和田。
22、间抗虫试验、CRY2A蛋白的含量测定、农艺性状调查等检测，获得具有商业化潜力的转基因水稻家系。最后对挑选出来的具有商业化潜力的转基因水稻家系进行TDNA插入位点侧翼序列的分析。0032本发明的优点在于00331本发明将人工合成的抗虫基因CRY2A基因导入水稻受体品种的基因组中，其后代具有相关的抗虫特性，不用或少用农药，提高水稻产量，保护生态环境。00342本发明获得的抗虫材料可以通过杂交、回交的方式，将抗虫特性导入到其他水稻品种，培育抗虫新品种或新品系。附图说明0035序列表SEQIDNO1是表达载体PBAR13CRY2A的核苷酸序列，序列长度为12764BP。0036序列表SEQIDNO2是。
23、SOUTHERN分析的探针序列，序列长度为1566BP。0037序列表SEQIDNO3是T2A1插入位点相邻的5基因组侧翼序列。0038序列表SEQIDNO4是T2A1的插入外源基因序列。0039序列表SEQIDNO5是T2A1插入位点相邻的3基因组侧翼序列。0040序列表SEQIDNO615是本发明所涉及到的相关PCR引物序列。0041序列表SEQIDNO16是人工合成的CRY2A基因的全长序列，序列长度为1902BP。0042图1是原始质粒PCAMBIA1300物理图谱。0043图2转化载体PBAR13CRY2A结构示意图。该载体是在PCAMBIA1300的基础上改造而来，在多克隆位点处连。
24、接了外源基因CRY2A及以BAR基因替代了HPT基因作为选择标记基因。0044图3CRY2A水稻对两种主要的水稻钻蛀虫的室内抗性检测喂饲5天后。A对一龄三化螟室内抗性检测。B对一龄二化螟室内抗性检测。T转基因CRY2A水稻。N原品种明恢63对照。CRY2A水稻茎杆内的螟虫被杀死了，死亡的螟虫个体很小且身体褐化，和接种时比较体形没有增长。CRY2A水稻茎杆未受到任何危害，茎杆内也没有发现虫粪。阴说明书CN104099367A5/14页7性对照茎杆内，接种的一龄幼虫生长良好，体形明显增大，侵入的螟虫聚集在水稻茎杆的节的附近危害，并产生大量粪便。0045图42004年在武汉的田间抗性评价试验。T转基。
25、因CRY2A水稻；N原品种明恢63对照。在自然发虫和人工接虫的条件下，原品种明恢63植株受害严重，而CRY2A植株未表现出明显症状。0046图5是自然发虫条件下或人工接虫条件下的田间表现观察结果。图中A是自然发虫条件下的田间表现。B是人工接虫条件下的田间表现。转基因CRY2A家系T在自然发虫和人工接虫条件下都表现出高抗性。而种植在人工接虫田块的原品种明恢63N的受害程度要明显高于种植在自然发虫田块的原品种明恢63的受害程度，并且种植在人工接虫田块的原品种明恢63N的发虫更为均一。虽然由于人工接种了三化螟幼虫造成原品种明恢63的受害严重，但是明恢63良好的分蘖能力进行了部分补偿。0047图6水稻。
26、T2A1家系SOUTHERN分析结果。图中MECOT14DNAMARKER；BBAMHI酶切；EECORI酶切。具体实施方式0048实施例1植物表达载体的构建0049本发明所用目的基因为华中农业大学林拥军教授和张启发教授人工设计合成的CRY2A基因序列见SEQIDNO16。该基因合成时在末端添加了NOS终止子，合成后的基因克隆于PUC18质粒载体上。本发明所用的原始转化载体为农杆菌TI双元载体PCAMBIA1300，由澳大利亚CAMBIA实验室CENTERFORTHEAPPLICATIONOFMOLECULARBIOLOGYTOINTERNATIONALAGRICULTURE提供。用XHOI酶。
27、切PCAMBIA1300图1，然后用T4DNA聚合酶抹成平末端，连入BAR基因形成中间载体PBAR13。HINDBAMHI双酶切PBAR13连入玉米UBIQUITIN启动子；再用BAMHI酶切后，连入人工合成的CRY2A基因形成最终表达载体PBAR13CRY2ASEQIDNO1，图2。将PBAR13CRY2A转化到农杆菌菌株EHA105中，转化后的菌株置于70保存待用。0050实施例2农杆菌介导的明恢63的遗传转化0051愈伤组织诱导和继代主要参考林拥军博士论文林拥军等，2002。愈伤组织继代使用的培养基配方采用LIN和ZHANG所改进的籼稻转化的培养基配方LIN和ZHANG，2005。通过梯。
28、度试验确定明恢63抗性愈伤组织筛选所需最适的BASTA浓度为25MG/L。农杆菌介导的明恢63来自福建省农业科学院，为中国大面积推广水稻品种的转化的操作过程及转化参数主要遵从林拥军博士论文及其发表的文献林拥军，2001；林拥军等，2002；LIN和ZHANG，2005。由于BASTA作为筛选试剂的作用机理是抑制植物细胞的谷氨酰胺合成酶的活性。因此，在筛选培养基中去掉谷氨酰胺和水解酪蛋白等组织培养中常添加的营养成分。为了转化PBAR13CRY2A载体，一共用农杆菌侵染了5批愈伤组织，侵染的愈伤组织块总数达15000多块，获得抗性愈伤组织数174块，分化获得T0独立转化植株102株。0052农杆菌。
29、介导的遗传转化的具体步骤如下005321愈伤组织诱导0054将成熟的明恢63水稻种子去壳，然后依次用70的乙醇处理1分钟，015氯化汞种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子45次；将种子放在诱导培养基上；将接种后的说明书CN104099367A6/14页8培养基置于黑暗处培养46周，温度281。005522愈伤组织继代0056挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基上黑暗下培养3周，温度281。005723预培养0058挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度281。005924农杆菌培养0060在带有对应抗性选择的LA培养基LA培养基的配制参照J萨姆。
30、布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等译，科学出版社，2002，北京预培养农杆菌2天，温度为281；将农杆菌转移至AA悬浮培养基里，在摇床上以28，200RPM的条件培养23小时。006125农杆菌侵染0062将预培养的愈伤组织转移至灭好菌的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD600值为03左右；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度1920。006346愈伤组织洗涤和选择培养0064灭菌水洗涤愈伤组织78次；浸泡在含400MG/L的羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤组织至选择培养基上。
31、选择培养3次，每次2周。006547分化0066将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上于黑暗处培养7天，温度261；转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上，光照光照强度2000LX下培养，温度261。006748生根0068剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照光照强度2000LX下培养23周，温度261。006949移栽0070洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。0071实施例3转基因植株的PCR检测0072小量叶片总DNA的抽提步骤如下007331取约2CM长叶片置于15ML离心管；007432在研钵中加入800L15CTAB，将叶片取。
32、出研磨至匀浆倒回内离心管内；00753365水浴2030MIN，每5MIN中颠倒混匀一次；007634加入等体积的241氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，持续10MIN；00773510,000RPM离心，10MIN；007836吸取400L上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰镇的95乙醇，20冰镇20MIN；00793712,000离心15MIN；说明书CN104099367A7/14页9008038弃上清，加入500L75的乙醇，12,000离心5MIN；008139弃上清，空气中晾干10MIN，加100LDDH2O溶解。0082PCR引物的设计利用网上的PRIMER3软件完成HTTP/BIOI。
33、NFORMATICSHZAUEDUCN/。用于CRY2A基因扩增的引物是CRY2AFCGTGTCAATGCTGACCTGATSEQIDNO6；CRY2ARGATGCCGGACAGGATGTAGTSEQIDNO7，PCR的产物大小为600BP。PCR反应体系为DNA模板3050NG，10XPCRBUFFER20L，2MMDNTP15L，25MMMGCL220L，10M引物F/R各04L，加灭菌DDH2O至20L。PCR扩增反应程序为945MIN；941MIN，581MIN，7215MIN，35CYCLES；725MIN。扩增产物在08的琼脂糖凝胶上进行检测。对所有T0代植株进行PCR检测，根据检。
34、测结果剔除假阳性的转化植株。一共检测T0代转CRY2A基因植株102株，阳性株71株，阳性率为696。0083实施例4具有商品化潜力的转基因家系的筛选0084对PCR阳性的T0代转基因家系分单株收种，一共收到可育的T0代CRY2A家系36个。然后在这36个可育家系中，挑选具有商品化潜力的转基因家系。将可育转基因植株的T1代分家系种植到田间，每个家系种植50株。全生育期不喷施任何的杀虫剂，自然发虫。田间观察选择抗虫性好，农艺性状无明显变异的转基因家系。对符合条件的转基因家系混合单株取叶片，每个家系取至少6个单株的叶片，然后提取总DNA。植物叶片总DNA的抽提及SOUTHERN杂交的分析方法参照实。
35、验室的操作手册。总DNA用HINDIII酶切，以CRY2A基因的PCR产物为杂交探针，所用引物同PCR检测的引物。通过SOUTHERNBLOT分析，筛选出高抗虫性、单拷贝插入且农艺性状变异不明显的T1转基因家系共4个，命名为T2A1，T2A2，T2A3和T2A4。对选择出来的T1代转基因家系分单株收种，将收获的成熟种子在含有BASTA的培养基上进行发芽试验。BASTA培养基发芽试验具体操作步骤如下将成熟种子去壳，先用75的乙醇浸泡消毒1MIN。然后将75的乙醇倒掉，再用015的升汞消毒15MIN。最后将015的升汞倒掉，用灭菌水洗3次。将消毒后的种子接种于BASTA浓度为10MG/L的1/2M。
36、S培养基上MURASHIGE和SKOOG，1962，先暗培养261培养3天，再光照培养2613天，6天后统计发芽率。理论上讲，若消毒的种子在不加BASTA的条件下具有100的发芽活力，则在含BASTA的1/2MS培养基上，阳性纯合转基因单株的发芽率为100，杂合转基因单株的发芽率为75左右，阴性纯合单株的发芽率为0。通过BASTA培养基发芽试验挑选出T2A1，T2A2，T2A3和T2A4各家系的纯合阳性转基因单株。0085实施例5纯合转CRY2A基因家系的BT蛋白含量测定0086CRY2A蛋白的测定采用美国ENVIRONLOGIX公司ENVIRONLOGIX，PORTLAND，USA的检测试剂。
37、盒ENVIRONLOGIXKITSAPP005。检测的方法如下从田间采集新鲜的水稻叶片，每个样品取大约20MG并精确称重。用500L检测试剂盒提供的蛋白抽提液在研钵中将叶片磨成浆，然后转移到15ML的离心管中静置5MIN，以10,000R/MIN的速率离心2MIN。最后用新的15ML离心管取上清。在测量CRY2A蛋白浓度前，用相应的抽提液将样品稀释5001000倍。稀释的样品按照试剂盒的说明书进行测定和计算。测定叶片的BT蛋白的浓度后，再用PIERCE公司的COOMASSIEPLUSTMPROTEINASSAYREAGENTPIERCE，ROCKFORD，USA试剂盒测定叶片总可溶性蛋白的浓度。
38、，最后计算叶片外源BT蛋白占叶片总可溶性蛋白的百分比。对所有4个纯合转基因家系植株的叶片进行了CRY2A蛋白浓度的测定。结果说明书CN104099367A8/14页10显示，4个CRY2A家系叶片中CRY2A蛋白的含量为8494234G/G13875432G/G鲜叶重，估算出的相对含量则为叶片中CRY2A蛋白占叶片总可溶蛋白的022032表1。0087表1四个纯合转基因家系CRY2A蛋白的表达情况抽穗期00880089实施例6纯合转CRY2A基因家系的室内抗虫性测定0090待田间的CRY2A水稻生长至拔节期，分家系采集新鲜的水稻茎杆，剪成5CM6CM的小段。将3根茎段置于一个玻璃试管中，并接种。
39、10头一龄的三化螟，管口用棉塞和黑色塑料膜封好以防止三化螟逃逸。每个家系设3次重复即接种3管，明恢63原品种的茎杆作为检测的阴性对照。接种完毕后将封好的玻璃试管于室温避光放置。5天后剥开被检测的茎杆，统计死虫数并计算死亡率。CRY2A水稻室内二化螟抗性检测，除供试的害虫为一龄二化螟外，其它检测试验条件完全同三化螟的抗性检测。转CRY2A基因的水稻茎杆可以在5D内完全杀死接种的一龄三化螟表2，相应的阴性对照中三化螟的死亡率仅为23358，且存活的螟虫生长正常并发育为二龄幼虫图3A；转CRY2A基因的水稻茎杆可以5天之内杀死绝大部分的接种的一龄二化螟，其死亡率为8464392966表2，相应的非转。
40、基因对照茎杆中的一龄二化螟的死亡率仅为300100，存活的螟虫生长正常并发育为二龄幼虫图3B。0091表2不同转CRY2A基因水稻家系的杀虫活性00920093实施例7CRY2A水稻田间抗性评价00942004年夏季在武汉进行了转CRY2A基因水稻家系的田间抗性评价。试验在华中农业大学校园内的试验田中进行。参试的田间抗性评价材料共有5份，其中CRY2A水稻纯合家系4份T2A1、T2A2、T2A3和T2A4，以及作为感虫对照的原品种明恢63。试验材料田间排布为随机区组设计，每个被测材料重复3次，每个小区种植10行，每行10棵，共100棵。小区内的种植尺寸为20CM267CM，不同小区间空一行作为。
41、间隔。田间试验采用自然发虫和人工接虫相结合的办法，即田间管理同普通的大田管理，但不喷施任何针对鳞翅目害虫的杀虫剂。然后待田间水稻生长至分蘖盛期八月上旬时，人工接种初孵的三化螟幼虫，每株接种510头三化螟幼虫。随后共进行了两次田间调查，每个小区随机调查20说明书CN104099367A109/14页11株。第一次调查在八月下旬即接种后约2周，统计各小区植株的枯心数和卷叶数，并计算每株的枯心率枯心率每株枯心数/每株总分蘖数100；第二次在水稻的抽穗灌浆期，除了统计枯心率和卷叶数外，还调查了白穗的情况白穗率每株白穗数/每株总穗数100。00952005年夏季在武汉的进行了转CRY2A水稻家系田间抗性。
42、评价的第二次试验。2005年的田间抗性评价同样在华中农业大学校园内的试验田中进行。参试材料与2004年一致。所有材料分别种植在两块不同处理的田块中一块采用自然发虫；一块采用自然发虫结合人工接虫。除了不喷施任何防治鳞翅目害虫的杀虫剂，田间管理同普通大田管理。两个不同处理田块的种植方式完全一样。试验材料田间排布采用随机区组设计，每个材料重复3次。每小区种植2行，每行10株。小区内种植尺寸为20CM267CM，各小区间空一行作为间隔。待水稻生长至分蘖盛期八月上旬，在接虫处理的田块中人工接种初孵的三化螟幼虫，每个植株接种一管装有一块已孵化的三化螟卵块的玻璃试管约有40100头。八月下旬即接虫两周后，对。
43、自然发虫和人工接虫的两块田同时进行田间调查，考察对象为每个小区所有的20株植株，主要考察枯心情况自然发虫的田块还考察了卷叶情况。0096在2004年的田间抗性试验中，所有的转基因家系均表现出了比对照明恢63显著增强的抗虫性。在第一次田间调查时遇上稻纵卷叶螟爆发高峰，转基因家系与明恢63原品种的抗性差异非常明显图3。第一次田间调查结果显示，CRY2A家系平均枯心率为536056748064，每株卷叶数为023015043035，远低于对照明恢63的枯心率1724186和卷叶数2080115表3。第二次田间调查结果显示，对照明恢63枯心率为1737526，每株卷叶数为157160；另外还有一定比例。
44、的白穗557107。而CRY2A家系的枯心率为098062418162；每株卷叶数仅为014006149151；此外仅有极少数的白穗白穗率为000000050070。00972005年的田间抗性试验中，在自然发虫条件下，对照明恢63的枯心率为865081，每株卷叶数为893122。CRY2A水稻家系受到的螟虫危害比较低，枯心率仅为050015172088，卷叶数为020008055039表4。在人工接种大量的初孵三化螟的情况下，对照明恢63的危害程度大大加重了，接虫两周后其枯心率达到4804421。此时由于将近一半的分蘖已经枯死，不能准确调查卷叶螟危害的情况。但是在人工接虫的条件下，转基因水稻。
45、的受危害程度基本上与自然发虫处理下相似，并未表现出更严重的螟虫危害症状表4和图4。田间试验结果表明人工接种的初孵三化螟不能对转基因BT水稻造成实质性的损害，该结果与实验室内的生测结果吻合。0098表3CRY2A水稻家系的田间抗性评价武汉，2004年。说明书CN104099367A1110/14页1200990100所有数值为平均数标准差。0101表4CRY2A水稻家系的田间评价自然接虫和人工接虫，武汉，200501020103所有数值为平均数标准差。0104实施例8纯合CRY2A家系的主要农艺性状考察。0105经过多代的种植，我们挑选了2个表现最好的纯合转CRY2A基因家系T2A1T5代和T2。
46、A3T5代，加上明恢63原品种对照共3个材料，在2005年进行了田间农艺性状的考察。试验地点为华中农业大学校园内的试验田。田间试验包含两个不同的处理，分别在不同田块内进行一个田块采用正常的虫害治理；一个田块不进行任何虫害的治理。两个田块的其它管理如水、肥及杂草等完全一样。两个田块中，供试材料的田间排列方式一样，均为随机区组设计，每个材料重复种植3次。每个小区种植2行，每行10株，单本种植。小区内种植尺寸为20CM267CM，各小区之间空一行。成熟后，每小区收获中间16株进行农艺性状考察。考察的性状包括株高、穗长、有效穗数、结实率、千粒重、每穗实粒数和单株产说明书CN104099367A1211。
47、/14页13量。考查方法见表5。所有数据采用T测验进行统计分析。0106表5农艺性状考查的方法01070108两个挑选的转基因家系农艺性状考察结果见表6。2005年田间发虫程度不严重，对照材料在打药和不打药两种处理中的差异较小。在外观表型上，T2A3的株高有极显著水平的下降，但是下降幅度的绝对值不大，约5CM。在穗长上，2个转基因家系与对照均没有显著差异。在主要农艺性状上，2个转基因家系的单株产量与对照没有明显差异。虽然在不喷施杀虫剂的小区试验中，转基因家系的平均单株产量超过了明恢63对照，但是未达到显著水平。在产量相关性状中，转基因家系的每穗实粒数和千粒重与对照没有显著差异。但是其它两个性状。
48、有效穗数和千粒重，两种不同处理的结果存在一定差异。在喷施杀虫剂的田块中，转基因家系T2A3的有效穗数有明显增加；而在不喷施杀虫剂的田块中T2A1的有效穗数有明显增加。在千粒重上，喷施杀虫剂的田块中，T2A1有明显的降低；但是在不喷施杀虫剂的田块中，没有检测到转基因家系与对照之间存在显著差异。结实率上，在喷施杀虫剂的田块中，T2A1和T2A3的育性部有显著下降；但是在不喷施杀虫剂的田块中，未检测到转基因家系的育性与对照有显著差异。0109总的来说，两个转基因家系的不同性状均存在一定程度的变异，但是其产量都没有明显变化，且在不喷施杀虫剂的田块中，转基因家系的产量还有增高的趋势。考虑到T2A1的株高。
49、与对照无显著差异且其结实率略高于T2A3，我们最后挑选T2A1家系进行后续回交选育，为将来的商品化应用打下基础。0110表6不同转基因纯合阳性家系与明恢63的主要表型及农艺性状比较武汉，200501110112说明书CN104099367A1312/14页140113和分别代表显著水平P005和P0010114实施例9对T2A1家系外源基因插入位点的侧翼分析及染色体定位。011591T2A1家系外源基因插入拷贝数的验证0116为了确定T2A1家系外源基因插入的拷贝数，我们用两种识别位点不同的限制性内切酶BAMTHI和ECORI酶切T2A1的总DNA并进行了SOUTHERN杂交分析。杂交使用的探针为PCAMBIA3300质粒KPNI酶切回收后的小片段，该片段包含了完整的BAR基因和其CAMV35S启动子区域，探针的全序如SEQIDNO2所示。SOUTHERN杂交的结果显示，两种不同的酶切条件下均只出现了一条杂交带，因此可以确定外源基因为单拷贝插入，且不存在重复串联插入的现象图6。0。