猪仔笠黄酮类提取物及其提取方法和应用 技术领域：
本发明涉及猪仔笠黄酮类提取物及其制备方法和应用，属于医药领域。
背景技术：
猪仔笠属名Eriosema chinense Vog，为豆科毛瓣花属植物，约100种，分布于热带和亚热带地区。据《中药大词典》记载：猪仔笠块根入药，具有清热解毒、生热烦渴、化痰润肺、止咳之功效，而且是治疗伤风咳嗽、止呼吸道感染、发热烦渴、痢疾、跌打损伤等疾病的珍稀名贵中草药。猪仔笠主要用于治疗咳嗽、哮喘，疗效显著，安全可靠，价廉而方便，是一种良好的中草药资源，值得开发研究和推广运用。猪仔笠虽然已在民间应用较广，但对猪仔笠的有效成分以及生物活性的研究未见有关文献报道，猪仔笠的临床用药机理尚不明确，仅凭经验，这就限制了其在临床上的应用范围而没有得到充分有效的开发利用。同时，由于其主要活性成分不明，就无法对猪仔笠的有效成分进行检测、对药材质量进行有效控制和道地药材进行权威鉴定。
在中药的诸多研究中，对活性成分、药理作用和药效与成分关系的研究较少，所以无法阐明中药治疗疾病的药效物质基础和作用机理等重要科学问题，也无法为寻找新药物或合成新药提供先导物或结构母核，无法提升中药新药研究方法和技术水平。因此深入、系统和有效地分离、纯化、结构鉴定以及活性的追踪验证是开展和加强中药药效物质基础和作用机理系统研究的必然。而在传统的分离技术基础之上，积极探索和应用新的分离方法和技术是加速中药药效物质基础和作用机理系统研究的发展趋势。
开展对猪仔笠药理活性成分的研究，掌握猪仔笠被广泛用于治疗咳嗽、化痰的药效物质基础，可为猪仔笠治疗咳嗽、化痰的药理研究和临床应用提供参考，为探索该属植物的活性成分及其化学分类学方面提供借鉴。
发明内容：
本发明的目的是提供一种猪仔笠黄酮类提取物及其提取方法和应用。
本发明所述的猪仔笠黄酮类提取物，其分子量为438，分子式为：C26H30O6，具有下述结构的黄酮类化合物，本发明以化合物2表述。本发明所用的高速逆流色谱法(High-speedCountercurrent Chro-matography)，简称“HSCCC”，下同。
本发明所述的猪仔笠黄酮类提取物的提取方法为：包括如下步骤：
1)将猪仔笠块根粉碎，用乙醇回流提取获得乙醇提取液，将乙醇提取液减压浓缩得浸膏，浸膏加入水混悬，用石油醚萃取，石油醚萃取液减压浓缩得石油醚浸膏；2)石油醚浸膏在溶剂体系为正己烷、醋酸乙酯、甲醇、水构成的色谱条件下经过制备型HSCCC分离，形成色谱峰形，有组分1和组分2的色谱峰；3)组分2经手工收集后，本发明一般于室温常压下自然挥发后有淡黄色针状结晶析出，得到化合物2，为淡黄色针状晶体的黄酮类化合物。上述的减压浓缩可以采用本领域通用的旋转蒸发仪减压浓缩。
上述步骤2)的HSCCC分离的溶剂体系(以体积比计量范围)为正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝3～6∶3～6∶5～8∶2～4；固定相为上相；流动相为下相；HSCCC分离流速：0.5～4.0mL·min-1；转速：600～1200r·min-1；固定相的保留值不低于50％。
步骤1)粉碎的猪仔笠块根，可以用50～100％乙醇浸没药材且液面高出药材约0.5～1cm，在80～95℃和常压力回流提取2～4次，合并乙醇提取液，将乙醇提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏加入2～15倍量的水混悬，用其量为0.5～2倍上述水的量的石油醚萃取8～12次，合并上述所有石油醚萃取的石油醚萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩得石油醚浸膏。当然优选用95％乙醇在优选82～85℃温度和常压力下回流提取三次，合并三次乙醇提取液，将乙醇提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏加入3～5倍的水混悬，用0.5～1倍水的石油醚萃取10次，合并石油醚萃取液，旋转蒸发仪减压浓缩得石油醚浸膏。
步骤2)所述的HSCCC分离的最佳的HSCCC溶剂体系(以体积比计量)为正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶7∶3；固定相为上相；流动相为下相；HSCCC分离流速：2.0mL·min-1；转速：700r·min-1；固定相的保留值不低于50％。
经测定本发明溶剂体系正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶7∶3的固定相的保留率为63.96％。
本发明所述的猪仔笠黄酮类提取物，能作为防治抑菌、抗炎、止咳和化痰的药物，以及作为防治金黄葡萄球菌的药物的应用。
本发明的优点是：本实验用传统的溶剂回流提取方法，通过HSCCC与传统的薄层层析制备相结合进行分离纯化，首次从猪仔笠药材石油醚部位分离得到新的化合物2。本发明和传统的通过溶剂萃取、反复层析的方法相比，HSCCC不仅可以大大简化诸多步骤、节约时间，且不会造成溶剂和样品的损失，目标产物能达到较高的纯度。且在HSCCC操作过程中，只要调试好仪器，进样完毕后，后续分离过程则完全可以实现自动化，且分离过程可以结合紫外进行检测。上述特点显示了HSCCC在分离、提纯化合物方面的明显优势。本发明还研究探索出分离石油醚部位的最佳溶剂系统配比以体积比计量为正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶7∶3，这些溶剂体系不仅有合适的上、下相之比，合适的固定相保留值，而且对目标成分有比较理想的分配。本发明通过对猪仔笠黄酮类提取物——化合物2研究发现，1)猪仔笠黄酮类提取物——化合物2对金黄葡萄球菌有较好地抑菌活性，猪仔笠黄酮类提取物——化合物2对某些菌也具有一定的抑制效果，可能含有量比较少但是活性很高的物质。2)本发明的猪仔笠黄酮类提取物——化合物2能抑制二甲苯所致的小白鼠耳肿胀作用，具有良好的抗炎效果。3)本发明的猪仔笠黄酮类提取物——化合物2能延长咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，具有良好的镇咳作用。4)本发明的猪仔笠黄酮类提取物——化合物2明显增加小鼠气管酚红排泌量，表明可促进腺体分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，从而起到祛痰作用。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明进行详细说明：
第一部分猪仔笠石油醚萃取物的化学成分研究
1实验仪器及材料
1.1药材
猪仔笠购自地点：福建龙岩；鉴定：福建省中医药研究院王振登研究员鉴定。
1.2仪器
微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；恒温水浴锅；部分收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司)；超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(VARIAN，Cary 50)；AVATAR360红外光谱仪(美国Thermo Nicoler)；GS 20分析型高速逆流色谱仪(北京天宝物华生物技术有限公司)；GS 10制备型高速逆流色谱仪(北京天宝物华生物技术有限公司)；高效液相色谱仪(美国Agilent 1100series)；元素分析仪(德国Vario EL III)；质谱仪(美国LCQ DecaXP Max)；核磁共振仪(美国Unity 500)。
1.3试剂
正己烷、醋酸乙酯、甲醇、双蒸水、石油醚(60-90℃)均为AR级；色谱甲醇；无特别标明均为分析纯试剂。
2实验方法
2.1样品制备
将猪仔笠块根粉碎1kg，用95％乙醇浸没药材且液面高出药材约1cm，在82～85℃和常压力回流提取三次(2h，2h，2h)，合并乙醇提取液。将乙醇提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏140g，加入约700～1000mL的水混悬，用300～500mL石油醚萃取8～10次，用旋转蒸发仪减压浓缩得石油醚浸膏30g。
本发明优选实例：将猪仔笠块根粉碎1kg，用95％乙醇浸没药材且液面高出药材约1cm，在优选84℃温度和常压力下回流提取三次(2h，2h，2h)，合并三次乙醇提取液，将乙醇提取液用旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏140g，浸膏加入850毫升水混悬，用0.8倍上述水量的石油醚萃取10次，合并石油醚萃取液，旋转蒸发仪减压浓缩得石油醚浸膏30g。
2.2HSCCC溶剂体系的选择及样品溶液的制备
高速逆流色谱法(High-speed Countercurrent Chro-matography，简称“HSCCC”，下同)是两个互不混溶的溶剂逆向流动，样品在两相之间分配，不用固态吸附剂的全液态色谱方法；HSCCC溶剂体系的选择：按照被分离物质的粗略极性选择分离体系类别，在该实验中，选择弱极性的正己烷体系，同时采用薄层色谱法选择溶剂体系的配比，首先按选定的溶剂系统配制一定量的两相溶剂，各取2mL于小试管中，加入数毫克样品，剧烈振荡1min后，静置分层，用毛细管取近似等量的上下两层溶液于TLC板上，待溶剂挥发完后用溶剂系统中的有机层展开，用碘缸显色，根据斑点色度和面积可以观察样品中各组分在两相溶剂中的分配情况，即估算分配系数的大小和差异，由此判断溶剂系统的适用性，再通过分析型高速逆流仪确定溶剂系统。
样品溶液的制备：可以将上述的200mg石油醚粗提物溶解在2mL体积比为1/1的上下相溶剂系统中，用4.5μm有机系的滤膜过滤，本发明的实例中滤膜采用尼龙的滤膜，以备HSCCC进样。
2.3HSCCC分离步骤
每次分离之前，首先配制已选择好的两相溶剂系统，将其充分混合后静置分层。在使用前将两相分离，先用恒流泵将上述选定溶剂体系的上相打入HSCCC的柱内(总体积为V)，直至注满整个管子。然后开启HSCCC，转速为700r·min-1，同时流动相以2.0mL·min-1的流速打入HSCCC，等到聚四氟乙烯管尾端流出流动相后，表明HSCCC中两相已达到平衡，收集柱尾端流出的固定相体积V1，通过六通阀将样品注入HSCCC，流动相流出端紫外检测器波长为254nm。根据色谱图手工收集各色谱峰组分。分离结束后，用氮气将两相溶剂从聚四氟乙烯螺旋管中冲出，测定固定相的保留值(SF)SF＝V-V1/V×100％。
2.4各个组分的纯度分析
猪仔笠石油醚浸膏经HSCCC分离得到的各组分通过HPLC进行纯度分析。
2.5各个组分的结构鉴定
分离得到的化合物通过元素分析、MS、IR、UV、NMR等波谱学方法进行分子结构鉴定。
3结果与分析
3.1HSCCC溶剂体系
按“2.2”项下方法筛选，最后得到较佳的溶剂体系按体积比计量正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶7∶3。在下述最佳实验条件下进行实验：溶剂体系正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水(5∶5∶7∶3)；固定相：上相；流动相：下相；流速：2.0mL·min-1；转速：700r·min-1，获得石油醚萃取物的分离，从实验结果可以看出有4个峰，其中后面2个峰分离度比较好，达到基线分离。
3.2HSCCC分离结果
实验条件为：溶剂体系正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水以体积比计量＝5∶5∶7∶3；固定相：上相；流动相：下相；流速：2.0mL·min-1；转速：700r·min-1，200mg石油醚萃取物在一定色谱条件(溶剂体系正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水[以体积比计量]＝5∶5∶7∶3)下经过制备型HSCCC分离，形成色谱峰形，有组分1和组分2的色谱峰，组分1经手工收集后，于室温自然挥发有黄色油状物析出，黄色油状物经薄层制备，展开剂为：石油醚∶醋酸乙酯以体积比计量＝4∶1，得到黄色方晶(乙醇液中)，得到29mg化合物1；组分2经手工收集后，于室温自然挥发有淡黄色针状结晶析出，得到4mg化合物2。
3.3固定相保留值
固定相保留值对分离效果影响很大，保留值越大，分离效果越好。影响固定相保留值的因素很多，包括溶剂系统本身的特点、流动相流速、HSCCC仪器的工作性能等。为保证分离效果，固定相的保留值不能低于50％。
本实验测定溶剂体系以体积比计量为正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶7∶3的固定相的保留率为63.96％。
3.4HSCCC逆流分离组分的纯度
在3.2中HSCCC分离所得化合物1在HPLC色谱测定条件：水/乙腈以起始比例85∶15，5min后为80∶20，10min后为60∶40，20min后为50∶50，30min为40∶60，40min后为20∶80，45min后为10∶90，柱温：30℃，流速：1mL·min-1，检测波长：254nm的条件下分析显示HPLC图谱为单一峰，且峰形对称，表明为纯一组分；化合物2在HPLC色谱测定条件：水/乙腈以起始比例80∶20，25min后为60∶40，30min后为50∶50，33min为40∶60，35min后为20∶80，40min后为10∶90，柱温：30℃，流速：1mL·min-1，检测波长：254nm的条件下分析显示HPLC图谱为单一峰，且峰形对称，也表明为纯一组分，可进行结构分析。
3.6化合物2的结构
3.6.1化合物2的紫外吸收光谱
从化合物2的紫外光谱图可知，有2个主要的吸收带，出现在299nm及348nm；多数黄酮类化合物，因分子中存在桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故其在200～400nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带，称为峰带I(300～400nm)及峰带II(220～280nm)，根据化合物2的紫外光谱说明化合物2可能是黄酮类化合物。
3.6.2化合物2的红外吸收光谱
根据化合物2的红外光谱可知，将主要峰归属如下：3469cm-1附近的强宽吸收峰，表明有多个羟基所形成的相互结合的氢键所致，1615cm-1，1519cm-1的吸收峰显示有苯环存在，825cm-1为苯中C-H面内弯曲振动吸收峰，1650～1615cm-1附近的吸收峰显示有酮的C＝O结构存在，2922cm-1附近吸收峰为-CH2的C-H碳氢键伸缩振动，1373cm-1是-CH3的C-H弯曲振动，1256cm-1吸收峰显示有醚结构存在，进一步表明化合物2为黄酮类化合物。
3.6.3化合物2的元素组成和质谱分析结果
元素分析测定值：N：＜0.3％，C：71.14％，H：6.74％，ESI-MS图显示负离子峰为：437[M-1]-，说明分子量为438，结合元素分析，推断分子式为：C26H30O6。
3.6.4化合物2的核磁共振氢谱和碳谱
测化合物2的1H-NMR(400MHZ，CDCl3)氢谱，从氢谱可明显看到有30个氢：δppm：3.85(3H，s，OCH3)，为苯环上甲氧基的氢信号；1.67-1.754(12H，s，4CH3)，表明有四个甲基；3.26(2H，d，CH2)，3.51(2H，d，CH2)与5.17(1H，t，CH)，5.29(1H，t，CH)，表明有两个-CHCH2-；7.47(2H，d，2′，6′-H)，6.98(2H，d，3′，5′-H)，表明有一苯环是对称取代；6.477(1H，s，-OH)，11.496(1H，s，-OH)；4.50(1H，d，C-3)；4.98(1H，d，C-2)。
测化合物2的13C-NMR(100MHZ，CDCl3)碳谱图，δppm：196.26(C-4)，163.19(C-7)，160.15(C-5)，158.75(C-9)，157.80(C-4′)，134.90，134.42(C-3″，3″′)，128.72(C-1′)，128.67(C-2′，6′)，121.57，121.48(C-2″，2″′)，113.99(C-3′，5′)，107.82(C-10)，106.96(C-6)，100.40(C-8)，82.89(C-3)，72.55(C-2)，55.53(-OCH3)，21.70，21.27(C-5″，5″′)，25.85，25.84(C-4″，4″′)，17.90，17.82(C-1″，1″′)。
从氢谱和碳谱可知，所有的氢信号和碳信号都有合理的归宿，上述碳氢信号与6，8-(3-甲基-2-丁烯基)-5-甲氧基-3，7，4’-三羟基黄酮结构基本相符，再结合紫外图谱，红外图谱，元素分析，质谱结果，初步鉴定化合物2结构式如下，是首次从该猪仔笠植物中分离出的一种新化合物。
本发明采用分离、纯化的新手段HSCCC分离来分离纯化猪仔笠石油醚部位的化学成分。HSCCC利用多层螺旋管行星式运动形成特殊的离心力矢量场，来实现两溶剂相在管柱里的单向性流体动力学分布状态，在这种情况下，可以保证流动相高速穿过管柱时固定相在管柱里的保留百分率达50％以上，同时大大促进了两相间的充分混合和逆流传递。这种体系由于能够采用多样的体系条件和操作方式，对从天然产物粗提物中分离提取不同特性的有效成分提供了良好的条件，因而，更符合分离分析和制备纯化工作的需要。
HSCCC溶剂体系的选择对于HSCCC十分关键，同时也是最难解决的问题，溶剂选择的困难制约了逆流色谱的应用。通常，两相溶剂体系应满足以下要求：(1)不造成样品的分解或变性；(2)足够高的样品溶解度；(3)上-下两相的体积大致相等，以免浪费溶剂；(4)样品在溶剂系统中合适的分配系数值；(5)溶剂体系的分层时间小于30s，使固定相能实现足够高的保留。一般来说，前三点可以较简便地进行判断，后两点对高速逆流色谱仪显得特别重要，需要经过测定或实验判断。测定方法包括TLC、HPLC和分析型HSCCC法等。
TLC法的准确度较低，但方便、快速，可以对溶剂系统的适用性作出便捷的初步判断。根据斑点色度可以观察样品中各组分的相对含量及其在两相溶剂中的分配情况，即估计分配系数的大小及差异，由此可以确定溶剂系统的适用性及各组分的流出顺序。因此本实验采用TLC法，但TLC法只能对溶剂系统的适用性作出初步的判断，对分配系数作大致的估算，在缺乏经验的情况下，很难据此把握溶剂系统用于逆流色谱分离的可行性。因此本实验通过TLC法检测到溶剂的上、下相均有目标产物后，再通过分析型HSCCC法筛选最佳的溶剂系统。
结果表明：
1.溶剂体系的选择是HSCCC分离中最为关键的环节，溶剂体系选择的合适与否，直接关系到分离结果得好坏。石油醚部位的极性较弱，因此应选用弱极性体系。正己烷/醋酸乙酯/甲醇/水是已被广泛应用的溶剂分离系统之一，主要应用于弱极性物质的分离。在溶剂体系中，正己烷和水分别成为两相，再根据需要加入甲醇、醋酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果。对于正己烷/醋酸乙酯/甲醇/水的体系，若目标组分易溶于该体系的上相，增加甲醇水的含量，可将目标组分拉向下相。反之，则可降低甲醇的比例。原因在于当甲醇的量增加时，其一方面可以减小水相的极性，同时又可增加有机相的极性，可以达到改变待分离成分在两相中的分配系数的目的。本发明研究探索出分离石油醚部位的最佳溶剂配比系统(以体积比计量)为正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶7∶3，这些溶剂体系不仅有合适的上、下相之比，合适的固定相保留值，而且对目标成分有比较理想的分配。
2.和传统的通过溶剂萃取、反复层析的方法相比，HSCCC不仅可以大大简化诸多步骤、节约时间，且不会造成溶剂和样品的损失，目标产物能达到较高的纯度。且在HSCCC操作过程中，只要调试好仪器，进样完毕后，后续分离过程则完全可以实现自动化，且分离过程可以结合紫外进行检测。上述特点显示了HSCCC在分离、提纯化合物方面的明显优势。当然，HSCCC在分离、提纯化合物方面也不会是万能的。有的化合物由于难于选择合适的溶剂系统，则不能借助HSCCC的手段分离。另有，用来进行HSCCC分离的样品应尽可能使目标成分纯度提高。这样既便于寻找合适的溶剂系统，又可有效地提高分离效果。因此，HSCCC在应用于化学成分的分离提纯时，应尽可能与其它常用的分离方法互补进行。本实验用传统的溶剂回流提取方法，通过HSCCC与传统的薄层层析制备相结合进行分离纯化，首次从该药材石油醚部位分离得到2种新的化合物。
第二部分 猪仔笠黄酮类提取物——化合物2生物活性的研究
1实验仪器及材料
1.1药材
猪仔笠购自地点：福建龙岩；鉴定：福建省中医药研究院王振登研究员鉴定。猪仔笠黄酮类提取物——化合物2由本发明的第一部分实验获得。
1.2仪器
紫外可见分光光度计(VARIAN，Cary 50)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；BS210S型微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；电热干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(上海国华仪器设备有限公司)；超低温冰箱(Sanyo)；超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16G高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂)；低速大容量离心机(上海安亭仪器厂)；蒸馏水器(上海亚荣生化仪器厂)；SSB-1超净工作台(上海净化设备厂)。
1.3试剂
细菌菌株：金黄色葡萄球菌(GIM1.55)、大肠杆菌(GIM1.115)、伤寒沙门氏菌(ATCC6539)、枯草芽抱杆菌(O901)，由福建农林大学微生物实验室提供；普通琼脂培养基(医用)，新华中速滤纸，红霉素，复方甘草口服溶液(广西医科大学制药厂)；氨水(25％～28％)；地塞米松磷酸钠(福建三爱药业有限公司)；酚红；石油醚(AR，沸程60-90℃)、无水乙醇(AR)、NaOH、NaCl、NH4Cl均为国产分析纯。
1.4实验动物
昆明小鼠，平均体重为(18～22g)，购自福建医科大学实验动物中心。
2实验方法
2.1猪仔笠黄酮类提取物——化合物2抑菌活性的研究
2.1.1检测菌悬液的制备
将检测菌接至斜面，37℃培养24h，用震荡器将菌苔在生理盐水(已灭菌)中震荡分散，并用琼脂培养基将其稀释到所需的OD值。
2.1.2滤纸片法测定抑菌活性
用打孔器将滤纸片(厚约4mm)打成直径5mm的圆片，高压灭菌后待用。用上述制备好的菌悬液浸湿无菌棉签后，让棉签在试管壁上轻轻挤压，挤掉多余的菌悬液，用棉签的侧面而不是顶端从三个不同角度密涂平皿，每个角度相差约60°，最后沿平皿内缘涂沫一周。取直径6mm的灭菌滤纸片，每片滴加含量为
250mg·mL-1的化合物2提取液20μl作为实验样片，阴性对照样片滴加20μl无菌水，阳性对照样片滴加20μl的10μg·mL-1红霉素溶液，50℃烘干，用无菌镊子取出滤纸片贴在含菌平板上，并轻轻按压使其充分接触。置37℃恒温培养18-24h。测定滤纸片的抑菌圈大小，比较抑菌效果。
2.1.3试管连续稀释法
根据抑菌实验的结果，选取敏感菌测定各提取物对其的最低抑菌浓度。采用双倍稀释法，以吐温80做为助溶剂，吐温80的浓度为2％。取小号试管7支，编号。第1步每支管各加1mL肉汤培养基，然后在第1管加1mL药液，用吸管在第1管吹吸数次，使药液与肉汤培养基混匀，取出1mL加于第2管，混均取出1mL加于第3管，如此稀释至第6管弃去1mL，第7管不加药液作为对照。第3步每管加菌液50μl，混匀，置37℃温箱中培养24h。然后从每管中取出培养物20μl接种于普通琼脂平板上，再继续培养24h，观察结果。以无细菌生长的最高稀释浓度为该药液的最低抑菌浓度。平行做3次，以2次或3次相同结果为准，并设立吐温80对照和无菌水对照。因为中药液本身的混浊和人为视觉的差异，细菌生长后，使得肉眼无法观察，或观察的实验结果易出现偏差，因此，再从每一管中取培养物20μl，转种到琼脂平板培养基上，用L棒涂布，置37℃培养箱培养18-24h，以不生长菌落的最高药物稀释度为该药物对该种细菌的最小抑菌浓度(MIC)。
2.2化合物2抗炎活性的研究
2.2.1供试液的制备
第一部分获得的石油醚萃取物——化合物2以适量乙醇溶解后，加水加热使乙醇挥发，最后以水定容，配制的浓度为4.680mg·mL-1(小白鼠的用药量按照体表面积由人的用药量折算)。
2.2.2对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
将30只小白鼠随机分成3组，每组10只；阴性对照组灌生理盐水，阳性对照组按5mg·kg-1经皮下注射地塞米松磷酸钠给药，实验组灌石油醚萃取物——化合物2，每日上午给动物喂食前给药，给药液体积为10mL·kg-1，连续给药10d。于第10d给药1h后右耳壳滴二甲苯20μl，致炎后30min脱臼处死小鼠，用脱脂棉轻拭去左右耳残留药物，沿耳廓基线剪下两耳，用直径为8mm的打孔器分别在两耳同一部位打下圆耳片，电子天平称重，求出两耳重量差，以两耳重量差作为炎症肿胀程度的指标进行t检验。
2.3止咳活性的研究
2.3.1供试液的制备
猪仔笠黄酮类提取物——化合物2以适量乙醇溶解后，加水加热使乙醇挥发，最后以水定容，配制的浓度为4.680mg·mL-1(小白鼠的用药量按照体表面积由人的用药量折算)。
2.3.2实验分组及给药方法
将30只小白鼠随机分成3组，每组10只；阴性对照组灌生理盐水，阳性对照组灌复方甘草口服溶液(小白鼠的用药量按照体表面积由人的用药量折算)，实验组灌猪仔笠黄酮类提取物——化合物2，每日上午给动物喂食前灌胃给药，给药液体积为10mL·kg-1，连续给药10d。
2.3.3小鼠氨水引咳法
本试验于末次给药1h后进行。250mL广口瓶内放一注有80μl氨水的棉球，用装有通气管的塞子塞上，待氨水饱和后，将被测试的小白鼠逐个放入广口瓶内，记录小白鼠被放入杯内到出现腹肌收缩张嘴的时间(即第一次咳嗽的时间)以及1.5min内的咳嗽次数，观察记录氨水引起动物的咳嗽潜伏期和咳嗽次数，每测试一只动物均要更换新的氨水棉球。
2.4化痰活性的研究
2.4.1供试液的制备
猪仔笠黄酮类提取物——化合物2以适量乙醇溶解后，加水加热使乙醇挥发，最后以水定容，配制的浓度为4.680mg·mL-1(小白鼠的用药量按照体表面积由人的用药量折算)。
2.4.2标准酚红曲线的绘制
用分析天平准确称取一定量的酚红，加5％碳酸氢钠溶液溶解，配成1mL含100μg，然后顺次稀释成每毫升含酚红0.050，0.100，0.125，0.250，0.500，1.000，1.250，2.500，5.000，10.000μg，用分光光度计于546nm处测吸光值A，以酚红剂量为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线。
2.4.3气管段酚红法
取小鼠30只，随机分成3组，每组10只。阴性对照组灌生理盐水，按10mL·kg-1灌胃蒸馏水，阳性对照组按1g·kg-1灌胃氯化铵，实验组灌猪仔笠黄酮类提取物——化合物2，按10mL·kg-1灌胃，给药每日上午给动物喂食前灌胃给药，连续给药10d。
末次给药1h后，按0.5g·kg-1的剂量分别给每只小白鼠腹腔注射酚红-生理盐水，注射酚红0.5h后，处死小白鼠，小心剥离气管周围结缔组织，剪下从甲状软骨至支气管分叉处的气管，放入盛有2mL生理盐水的试管中，再加0.1mL氢氧化钠溶液(1mol·L-1)，摇匀，于546nm处测吸光值A。根据酚红标准曲线计算酚红含量，给药组和阴性对照组之间进行组间t检验。
校正酚红含量＝酚红含量(mg)/小鼠体重(kg)
化痰率(％)＝(给药组的酚红含量/模型组的酚红含量)×100％
3结果与分析
3.1抑菌效果
3.1.1化合物2的抑菌效果
供试样猪仔笠黄酮类提取物——化合物2对大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，枯草芽孢杆菌抑制作用不明显，而对金黄葡萄球菌有一定的抑制作用外，抑菌效果见下表：
表1化合物2的抑菌效果
3.1.2化合物2对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度
从化合物2对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度实验结果可以看出化合物2对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度为20mg·mL-1，最小抑菌浓度实验结果见下表：
表2各提取物对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度实验结果
表中“-”表示无菌落出现，“+”表示有菌落出现。
3.2抗炎效果
由表3可以看出，猪仔笠黄酮类提取物——化合物2对二甲苯所致的小鼠耳壳肿胀均有极显著的抑制作用，与阴性对照组比较差异极显著(P＜0.01)。
表3猪仔笠黄酮类提取物对二甲苯所致小鼠耳壳肿胀的影响
注：与阴性对照组比较，**P＜0.01
3.3止咳效果
由表4可以看出，猪仔笠黄酮类提取物能延长小白鼠咳嗽潜伏期及减少每分钟内的咳嗽次数，与阴性对照组比较差异有显著性，猪仔笠黄酮类提取物与阴性对照组比较差异极显著(P＜0.01)。
表4猪仔等黄酮类提取物对浓氨水致咳小鼠的影响
注：与生理盐水比较，**P＜0.01
3.4化痰效果
以酚红剂量为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，由曲线回归方程为：y＝0.1727x-0.0011；化痰实验结果见表5，猪仔笠黄酮类提取物对小白鼠具有很强的化痰作用，与阴性对照组比较，差异极显著，具有较强的化痰活性。
表5猪仔笠黄酮类提取物对小鼠气管酚红排泌量的影响
注：与阴性对照组比较，**P＜0.01
4本部分小结与讨论
4.1抑菌实验
本试验采用滤纸片法和试管稀释法，选用常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性代表菌，对猪仔笠黄酮类提取物的抑菌活性进行了研究。天然植物在长期的自然选择过程中，形成了一套精细的抗菌防御系统，表现为抗菌成分丰富多样，如挥发油、脂溶性色素、黄酮类化合物、皂贰、多酚类化合物和生物碱等。植物体外抑菌作用的强弱与提取物的成分和浓度有密切关系，大多数植物粗提物浓缩到较高的生药浓度时，往往变得粘稠，这种提取物成分复杂，常含有多种抗菌或抑菌成分，也有多糖、淀粉、树脂、蛋白质等无抑菌作用的成分，无抑菌作用的成分往往会影响抑菌效果。本实验利用萃取将猪仔笠的萃取物进行分段分离，得到猪仔笠黄酮类提取物——化合物2，再进行体外抑菌试验，使得有抑菌或杀菌活性的成分更加集中，用量少，效果更明显。
通过对猪仔笠黄酮类提取物——化合物2的体外抑菌试验研究发现，猪仔笠黄酮类提取物对金黄葡萄球菌有较好的抑菌活性，猪仔笠黄酮类提取物对某些菌也具有一定的抑制效果，含有量比较少但是活性很高的化合物2物质。
4.2抗炎实验
随着生命科学的发展，人们逐渐认识到各种炎症的发病机制，开发抗炎药物成了药学领域研究的热点。而目前抗炎药物主要来源于副作用大的化学药物，而中药在抗炎药物的研究中，因其药效好，不良反应少以及来源丰富等优势，越来越受到人们的重视，研究和开发具有抗炎活性成分的中药也逐渐成为热点。
本实验选用常用的炎症模型对其进行研究，以期从中找到具有抗炎作用的组分应用于临床。在以血管通透性为主要改变的急性炎症模型实验中，猪仔笠黄酮类提取物——化合物2能抑制二甲苯所致的小白鼠耳肿胀作用，具有较好的抗炎作用。
4.3止咳实验
咳嗽是上呼吸道一种重要的保护性反射，是呼吸系统疾病中的常见症状。有研究表明，咳嗽的产生主要与RARs受体和C-纤维受体接受刺激有关，RARs受体主要对机械刺激敏感，而C-纤维受体则主要对化学刺激敏感，如辣椒素、枸橼酸等。
在动物身上，咳嗽可由机械、化学刺激和电刺激气管粘膜、迷走神经而产生，其中以化学和机械刺激最接近正常生理情况。所以本实验采用以化学刺激引咳来考察药物的镇咳作用。猪仔笠黄酮类提取物——化合物2能延长咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，具有良好的镇咳作用。
4.4化痰实验
本实验采用酚红气管排泄法，利用酚红至小鼠注射后可从气管排泄的特点，测定气管酚红的排泄量，以判断受试药物对气管分泌液量的影响。此法简便，但用强碱洗出气管内酚红能损伤气管粘膜。实验结果表明，猪仔笠黄酮类提取物——化合物2明显增加小鼠气管酚红排泌量，表明可促进腺体分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，从而起到祛痰作用。