说明书甲硝唑衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属药物化学领域，涉及一类甲硝唑衍生物，具体涉及式(I)所示的甲硝唑衍生物的制备及含该类衍生物的药物组合物及其用途。该类化合物抗癌活性广谱，可作为治疗肿瘤、癌症等疾病的药物或先导化合物。
背景技术
癌症已成为世界范围内最重要的致死性疾病，发达国家癌症患者死亡率也很高。癌症可于任何年龄在各种器官及组织中发生，导致死亡的主要癌症种类有：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌等。
近年来，肺癌成为发病率最高的恶性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)统计：2008年全世界被诊断为肺癌的人数为1,600,000人，占癌症总发病人数的13％，死亡人数1,400,000例，占癌症总死亡人数的18％(Jemal A,et al.C A Cancer J.Clin.2011,61:69-90)；2010年，美国新增肺癌患者222,520人，死亡人数157,330，其中死于非小细胞肺癌(NSCLC)患者占肺癌总死亡人数的85％(Jemal A,et al.C A Cancer J.Clin.2010,60:277-300)。从我国近年来城乡前10位恶性肿瘤构成来看，肺癌已代替肝癌成为我国首位致死的恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤死亡的22.7％(She J,et al.Chest.2013,143(4):1117-1126)。
乳腺癌是全世界妇女目前面临的最为常见的癌症,每年约有138万乳腺癌新发病例及45.8万例死亡。据报道：美国每年新增232,340例乳腺癌患者。2011年，美国有接近40,000女性死于乳腺癌；印度每年有100,000新增乳腺癌患者被确诊，而且每28位女性中有1位会患乳腺癌(Yadav D K,et al.Curr.Med.Chem.2014,21(9):1160-1170)；在我国，乳腺癌也成为女性最常见的癌症，截止2008年，我国总计有169,452例新发乳腺癌患者，449,08例死亡，分别占世界的12.2％和9.6％。我国乳腺癌全年检出人数是欧洲(2008年共计332,000例，总人口四亿九千八百万)的一半，与美国(2008年共计182,000例，总人口三亿零四百万)基本相当。如果这一趋势保持不变，到2021年，我国乳腺患者将高达 250万，发病率将从不到60例/10万女性(年龄在55岁到69岁之间)增加到超过100例/10万女性(Fan L,et al.Lancet Oncol.2014,15:e279-289)。就全球来看，女性患乳腺癌数量在不断增加，乳腺癌对妇女的生存造成巨大威胁。
结肠癌和直肠癌统称大肠癌，是消化道常见恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，平均每年递增2％，在欧美国家病死率居肿瘤死亡的第2位，2003年美国大肠癌新发展病例数和死亡率均居第3位(徐富星.国际消化病杂志.2006,26(6):365-366)。近年来我国大肠癌的发病率以极快的速度上升，就全国范围而言，大肠癌已上升至恶性肿瘤发病的第4位，在一些经济发展较快的城市中，如上海已高居第2位(李德録,等。中国肿瘤.2011,20(6):413-418)。然而大部分癌症发现时已是中期至晚期，临床治疗总体效果较差，尤其是多药耐药性的不断出现，使得癌症的治疗困难重重。
目前我国临床上应用的抗癌药物大部分依赖进口，价格高昂。另外，大部分抗癌药物仍无法达到令人满意的专一性程度，患者在进行化疗时，体内的正常细胞往往也会一并被毒杀，严重影响正常的生理机能，并伴有许多副作用。因此，必须开发出活性高、副作用低的专一性抗癌药物来满足临床的需求。
近年来，我们研究小组致力于开展小分子抗癌化合物的设计、合成及抗癌活性方面的研究(专利申请公开号CN103360382A公开了含异噁唑杂环取代的喹唑啉衍生物对肺癌细胞A549、大肠癌细胞HCT-116及乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性；专利申请公开号CN103664991A公开了含异噁唑杂环取代的噻吩[2,3-d]嘧啶衍生物对肺癌细胞A549、大肠癌细胞HCT-116及乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性；专利申请公开号CN103601762A公开了含异噁唑杂环的二茂铁衍生物对肺癌细胞A549、大肠癌细胞HCT-116及乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性；专利申请公开号CN104230912A公开了含异噁唑杂环的喹啉衍生物对肺癌细胞A549、大肠癌细胞HCT-116及乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性)。上述文献引入本文作为前期的研究基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一类甲硝唑衍生物及其制备方法和用途。该类化合物对人肺癌细胞株A549、大肠癌细胞株HCT-116及乳腺癌细胞株MCF-7具 有很强的抑制活性。可用于治疗癌症或肿瘤。
本发明通过如下技术方案实现：
一种式(I)所示的甲硝唑衍生物，或其药学上可接受的盐，
其中：
对于式(I)所示的A类化合物，
R可相同或不同，独立的选自：氢、卤素、氰基、硝基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基或卤代C1～C6烷基、卤代C1～C6烷氧基、芳基、芳氧基等；所述的芳基、芳氧基任选被一个或多个取代基取代，或者两个相邻的R连在一起形成3-8元环；所述取代基独立的选自：C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、硝基、氰基、卤素、卤代C1～C6烷基、卤代C1～C6烷氧基；
n为0-4的整数。
根据本发明，n可以为2或3。
根据本发明，所述两个R与所连接的碳形成3-6元环，例如环戊基、苯环、吡啶环。更优选地，所述两个R与所连接的吡啶环形成喹啉环、喹唑啉环等。更优选为喹唑啉环。
根据本发明，所述烷基指具有1-6个碳原子的直连或支链烷基，所述烷基例如为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基。
根据本发明，所述烷氧基指具有1-6个碳原子的直连或支链烷基氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基。
根据本发明，所述卤素为氟、氯、溴、碘，优选为氟、氯。
根据本发明，所述卤代C1～C6烷基为C1～C6烷基中的一个或多个氢原子被卤素取代，例如三氟甲基等。
根据本发明，所述芳基指具有6-20个(优选6-14个)碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基包括：苯基、萘基、蒽基、芘基等。
根据本发明，所述芳氧基为芳基氧基。
根据本发明，所述式(I)所示的甲硝唑衍生物优选选自下述任一种化合物：
式(I)所示的甲硝唑衍生物，可以分别选择与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。其中术语“药学上可接受的盐”包括但不限于与无机酸形成的盐，如盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、及其类似盐；也包括与有机酸形成的盐，如乳酸、草酸、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、三氟乙酸或氨基酸和链烷酸盐如醋酸盐，HOOC-(CH2)m-COOH其中m是0-4的盐，及其类似盐。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。
本发明还提供一种药物组合物，其包括本发明所述的式(I)所示的甲硝唑衍生物，或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体或稀释剂。
根据本发明，所述药物组合物还包括一种或多种选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂和包衣材料的药学可接受的辅助材料。本发明还提供一种药物制剂，其特征在于，所述制剂包括本发明的式(I)所示的甲硝唑衍生物。
根据本发明的药物制剂，其特征在于，所述制剂优选为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
根据本发明的药物制剂，所述制剂选自片剂(分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片)、胶囊、颗粒剂、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明还提供一种式(I)所示的甲硝唑衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于抗肿瘤或癌症药物中的应用。
根据本发明，所述的肿瘤或癌症是与EGFR过渡表达和/或活性过高的癌症。更优选地，所述肿瘤或癌症选自：膀胱癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，乳腺癌，胃癌，食道癌，肺癌，头颈癌，结肠癌，咽癌，和胰腺癌等，更是非小细胞肺癌(NSCLC)中的应用。
本发明还提供一种式(I)所示的甲硝唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
式(I)所示的A类化合物由如下的过程制备：
R取代吡啶-甲酸(X＝OH)或R取代吡啶甲酰氯(X＝Cl)和甲硝唑为原料，在有机溶剂、缚酸剂中反应制备：
其中，X为OH、Cl，R，n如上述所定义；
式(I)所示的B类化合物由如下的过程制备：
2-喹啉甲酸(X＝OH)或2-喹啉甲酰氯(X＝Cl)和甲硝唑为原料，在有机溶剂、缚酸剂中反应制备：
其中，X为OH、Cl，R，n如上述所定义；
如果需要保护，可以将式(I)所示的A类化合物中的任何官能团予以保护。
根据本发明，在上述A、B类化合物的制备方法中，所述反应的温度为0℃至回流条件，优选0℃至室温条件。
根据本发明，在上述A、B类化合物的制备方法中，所述有机溶剂为苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、二氧六环、四氢呋喃或DMF，更优选为四氢呋喃。所述有机溶剂为干燥的。
根据本发明，所述缚酸剂(碱性催化剂)为有机碱或无机碱，所述有机碱优选为三乙胺、三丙胺、DMAP、叔丁醇钾等；所述无机碱优选为碳酸钾、氢化钠、碳酸钠等。优选的缚酸剂为DMAP。
本发明所述的式(I)化合物，包括但不限于：它们的光学异构体，外消旋体及其混合物。
术语”有效量”指的是，所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐对于能有效“治疗”个体的一种疾病或不适的用量。如果是癌症时，有效量能减少癌症或肿瘤细胞的数目；缩小肿瘤的大小；抑制或阻止肿瘤细胞向周边器官的侵入，例如，肿瘤蔓延入软组织或骨骼中；抑制或阻止肿瘤的转移；抑制或阻止肿瘤的生长；一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状；减少发病 率和死亡率；提高生活质量；或者是上述效果的结合。有效量可以是通过抑制EGFR活性来减少疾病症状的用量。对于癌症治疗，体内实验的效果可以通过评估如存活期、疾病进展时间(Time to Disease Progression，TTP)、反应率(Response Rates，RR)、持续反应期和/或生活质量来测量。
本领域技术人员已经意识到，有效量可以随着给药的途径、赋形剂的剂量、以及与其他药物的合用而变化。
术语“有效量”还可指的是所述至少一种化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐对抑制EGFR的过度表达和/或活性过高有效的剂量。
本发明的化合物具有抗肿瘤、抗癌活性，尤其是对人肺癌细胞株A549、大肠癌细胞株HCT116和乳腺癌细胞株MCF-7具有很强的抑制活性，本发明化合物对A549、HCT115及MCF-7癌细胞株的IC50值都达到了纳摩尔级。例如化合物YJP-6抑制肺癌细胞株A549的IC50为535.13μM，抑制大肠癌细胞株HCT116的IC50为922.26μM，抑制乳腺癌细胞株MCF-7的IC50为774.38μM。
因此本发明的化合物具有广谱的抗癌、抗肿瘤活性，可作为治疗肿瘤、癌症的候选药物或先导化合物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，下述实施例不能作为对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进都不违背本发明的精神。
仪器与试剂：
AVANCE III核磁共振仪(400MHz,DMSO-d6,TMS为内标)，离子阱液质连用仪(DECAX-30000LCQ Deca XP)，XT5数字显示显微熔点测定仪(北京市科仪电光仪器厂制造，温度未经校正)，可调波长式微孔板酶标仪(Molecular Devies SPECTRAMAX190)。化学试剂均为市售的分析纯或化学纯试剂，RPMI1640购自Gibco公司，噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]购自Sigma公司，其它试剂均为市售的分析纯，在使用前没有特殊说明未进行处理，四氢呋喃在使用前用干燥分子筛处理。
实施例1式(I)所示的A类甲硝唑衍生物的合成
只以烟酸和甲硝唑的反应作为示例说明，其余A类甲硝唑衍生物的制备过程均与烟酸和甲硝唑的反应过程类似，在实施例中不再一一举例说明。
甲硝唑衍生物YJP-1的合成：
将0.123g(1mmol)烟酸和0.206g(1mmol)DCC加入50mL圆底烧瓶，加入10mL干燥的THF，冰浴搅拌反应30min后，将溶有0.171g(1mmol)甲硝唑和0.122g(1mmol)DMAP的10mL THF溶液缓慢滴加入反应体系，冰浴搅拌反应30min后自然升至室温反应。TLC检测反应完成后，反应液真空浓缩，残渣直接柱分离V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝5:1～2:1)即得目标化合物YJP-1。
化合物YJP-2—YJP-11的制备按照化合物YJP-1的合成过程合成。
实施例2式(I)所示的B类甲硝唑衍生物YJP-12的合成
将0.173g(1mmol)2-喹啉甲酸和0.206g(1mmol)DCC加入50mL圆底烧瓶，加入10mL干燥的THF，冰浴搅拌反应30min后，将溶有0.171g(1mmol)甲硝唑和0.122g(1mmol)DMAP的10mL THF溶液缓慢滴加入反应体系，冰浴搅拌反应30min后自然升至室温反应。TLC检测反应完成后，反应液真空浓缩，残渣直接柱分离V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝5:1～2:1)，即得目标化合物YJP-12。
实施例1-2中制备的化合物的结构均通过1H NMR,ESI-MS等分析方法进行了表征。他们的物性常数及光谱数据以列表的形式进行说明：
化合物的结构、编号及物性常数如下表所示：
表1-化合物结构编号及质谱
编号MS(m/e,100％)编号MS(m/e,100％)
YJP-1277([M+1]+,50)YJP-2277([M+1]+,80)
YJP-3345([M+1]+,20)YJP-4359([M+1]+,50)
YJP-5325([M+1]+,10)YJP-6369([M+1]+,100)
YJP-7345([M]+,100)YJP-8341([M+1]+,100)
YJP-9311([M+1]+,85)YJP-10295([M+1]+,50)
YJP-11355([M]+,100)YJP-12327([M+1]+,100)
表2-化合物的NMR数据
实施例3抗癌活性测试
采用MTT法进行了抗大肠癌细胞株HCT-116、人肺癌细胞株A549及乳腺癌细胞株MCF-7的活性筛选。具体的筛选过程如下：
(1)将肺癌细胞株A549铺于96孔板中，加入100μL培养基培养，待细胞长至90％，将1μL药品加入孔中，每种药品检测8种不同的浓度(分别为药品的初始浓度，50μM,5μM,500nM,50nM,5nM,500pM,50pM)，每种药品浓度平行做3个复孔，培养24h之后，在每个孔中加入配制好的5mg/mL MTT溶液20μL，4小时后将培养基吸出，每孔加入150μL DMSO，在595nm波长下测定其光密度(OD)值。其中阴性对照为DMSO。按照公式计算抑制率。
其IC50值由GraphPad Prism5软件计算得出。
(2)大肠癌细胞株HCT-116及乳腺癌细胞株MCF-7的筛选过程同肺癌细胞株A549的筛选过程。
本发明化合物抑制人肺癌细胞A549、大肠癌细胞珠HCT-116及乳腺癌细胞株MCF-7的活性结果见下表3、表4和表5。
表3-式(I)中部分实施例化合物抑制人肺癌细胞A549的活性测试结果
表4-式(I)中部分实施例化合物抑制大肠癌细胞珠HCT-116的活性测试结果
表5-式(I)中部分实施例化合物抑制乳腺癌细胞株MCF-7的活性测试结果