33苯并呋喃2羰基硫脲基4甲氧基苯甲酸的新用途.pdf

本发明公开了3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸的新用途。具体而言，本发明中的3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸具备MIF抑制剂的功能，可以显著抑制LPS诱导的炎性因子（TNF-α和NO）的释放，抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移，还可以抑制ERK1/2的磷酸化，可以用于制备与MIF相关的抗炎药物。

权利要求书
1.  3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸或其可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸的结构式如下：
。

2.  根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述可药用盐为3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。

3.  根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、磷酸和硫酸。

4.  根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述有机酸选自醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸和酒石酸。

5.  根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与MIF相关的炎症性疾病选自类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。

6.  根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物为MIF抑制剂。

说明书3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸的新用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种小分子化合物的医药应用，具体涉及3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸或其可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物，特别是MIF抑制剂中的用途。
背景技术
巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一种集细胞因子、酶活性、神经内分泌激素于一身的多功能蛋白质。作为一种细胞因子，MIF几乎参与所有炎症性疾病过程，它通过活化巨噬细胞和T细胞来促进先天性和获得性免疫响应，是先天性免疫系统的重要调节因子，被认为是连接内分泌系统和免疫体系的介导剂。MIF与多种免疫性和炎症性疾病的发病机制密切相关，如MIF在单核/巨噬细胞的血管壁粘附、跨膜移动、内皮下聚集、泡沫细胞形成及斑块稳定中的作用，涉及到类风湿性关节炎、动脉粥样硬化发生和发展的多个方面。MIF还直接影响正常细胞的分裂和瘤基因诱导的恶性转化，或间接通过调节机体免疫反应，促进细胞增殖、迁移以及血管增生等。
由于具有广泛的生物活性，MIF与多种免疫、炎症以及肿瘤等疾病密切相关，已经成为治疗这些疾病的一个重要靶点。在与MIF相关的抗炎药物研究方面，国外许多医药公司和科研机构正在开发新的具有抗炎效果的MIF抑制剂，但目前还没有成功上市的MIF抑制剂。因此，积极寻找和设计新的MIF抑制剂，并探索其抗炎效果，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。
发明内容
针对上述情况，本发明提供了一种小分子化合物——3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸或其可药用盐在制备用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物中的用途，其中所述3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸的结构式如下：
。
优选的，在上述技术方案中，所述可药用盐包括（但不限于）3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸与盐酸、磷酸、硫酸等无机酸形成的酸加成盐以及与醋酸、马来酸、枸橼酸、苯磺酸、甲基苯磺酸、富马酸、酒石酸等有机酸形成的酸加成盐。
优选的，在上述技术方案中，所述与MIF相关的炎症性疾病包括（但不限于）类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和败血症。
优选的，在上述技术方案中，所述用于治疗与MIF相关的炎症性疾病的药物为MIF抑制剂。
本发明对上述小分子化合物进行了生物学活性测定，发现其对MIF具有明显的酶抑制活性，对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中的糖皮质激素具有负向调节效果，可以显著抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎性因子（TNF-α和NO）的释放，该化合物还可以抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移。此外，MTT法检测证实该化合物在10、20和40μM三个浓度下对小胶质细胞BV-2和巨噬细胞RAW264.7的活力均没有显著影响。在此基础上，进一步研究化合物抗炎作用是否与抑制MIF对ERK1/2的活化有关，发现这个化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化。
本发明中的小分子化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸具备MIF抑制剂的功能，对与MIF相关的炎症性疾病具有明显的抑制作用，可以用于制备与MIF相关的抗炎药物。
附图说明
图1为实施例1中化合物对MIF的酶抑制活性曲线。
图2为实施例2中化合物对MIF引起的巨噬细胞趋化迁移的影响效果图。
图3为实施例3中化合物对培养细胞的敏感性效果图。
图4为实施例4中化合物对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影响效果图。
图5为实施例5中化合物对MIF刺激的RAW264.7巨噬细胞中ERK活化的影响效果图。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明做出进一步的描述。
实施例1：化合物对MIF的酶抑制活性实验。
实验原理：MIF 具有多巴色素互变异构酶活性，可以将橙色的D、L型多巴色素甲酯转化为无色的吲哚衍生物，吸光度采用Tecan Infinite M1000酶标仪在475nm波长下进行3分钟吸光度测试。
实验试剂的准备：脂多糖（大肠杆菌血清型055:B5）、(L)-3,4-二羟基苯丙酮酸甲酯和高碘酸钠购买自西格玛奥德里奇（美国密苏里州东部城市圣路易斯）；(S,R)-3-(4-羟苯基)-4,5-二氢-5-异恶唑乙酸甲酯（ISO-1）为MIF的典型抑制剂，购买自德国Merck公司旗下的生化试剂品牌Calbiochem公司，在这里作为阳性对照；将化合物溶解在10mM的DMSO储备溶液中，最后在缓冲液中DMSO的浓度低于0.25%情况下，将RAW264.7巨噬细胞在37℃条件下添加5%热灭活胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），庆大霉素（50g/ml）和5%CO2的达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中生长和维持，重组人类MIF在大肠杆菌中表达，并且进行纯化。
实验步骤：为了制备(L)-多巴色素甲酯，将等体积(L)-3,4-二羟基苯甲基丙氨酸甲酯（4mM）和高碘酸钠（10mM）混合，并且在室温下培养3~5分钟，然后将(L)-多巴色素甲酯（30μL）添加到包含重组人类MIF（120nM）和10mM磷酸钾缓冲液的96孔板中，另外添加0.5mM EDTA并保持pH=6.2。为了测试化合物对MIF互变异构酶活性的抑制效应，将浓度为1、5、10、25、50和100μM的化合物分别添加到包含重组人类MIF（120nM）的96孔板中，在添加(L)-多巴色素甲酯之前培养30分钟，将孔板中的气泡去掉，采用Tecan InfiniteM1000酶标仪在475nm波长下进行3分钟吸光度测试。
实验结果：将浓度为1、5、10、25、50和100μM的3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸进行MIF的酶抑制活性实验，发现该化合物有很好的抑制活性，其半抑制浓度IC50为7.47μM/L（如图1所示）。
实施例2：化合物对MIF引起的巨噬细胞趋化迁移的影响实验。
实验原理：MIF对巨噬细胞有趋化迁移作用，抑制剂作用于MIF，可以在一定程度上抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移。
实验步骤：将重组人类MIF在添加或者缺失MIF互变异构酶抑制剂的情况下，分别置于CIM-16板的下室，然后在上室将RAW264.7巨噬细胞接种于包含20000个细胞的无血清培养基中。然后将CIM-16孔板转移到xCELLigence RTCA-DP中（德国曼海姆罗氏诊断公司），在4小时的检测周期内每隔15分钟采集一次数据，最后通过RTCA 1.2软件进行数据分析。
实验结果：Hit MIF表示热灭活的（Heat-inactivated）MIF，在这里作为阴性对照，图2中左边第一列柱状图表示没有添加MIF时，RAW264.7巨噬细胞的趋化迁移程度；第二列表示添加了热灭活的MIF时巨噬细胞的趋化迁移程度；第三列表示添加MIF之后引起巨噬细胞明显的趋化迁移；第四列表示添加阳性对照化合物ISO-1之后可以显著抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移；第五列表示添加化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸时，同样可以明显抑制MIF引起的巨噬细胞的趋化迁移。（*）p < 0.05，（**）p < 0.01表示与单独用MIF处理时做的比较。
实施例3：细胞敏感性实验。
实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对培养细胞的杀伤效果。
实验步骤：细胞活性通过MTT实验进行测定，BV-2小神经胶质细胞、THP-1细胞或者RAW264.7巨噬细胞接种于一式三份的密度为5×104的细胞/板中，将细胞在glycocalyixns和LPS中处理24小时，MTT添加到每个板中并且在37℃下培养4小时，在培养基废弃之后，将DMSO添加到溶解的甲瓒染料中，在540nm下测试光学密度，所有的实验结果采用M±S.D.表示，所有数据采用SPSS程序（版本14.0）进行单向方差分析和Student Newman Keul’s分析，p＜0.01认为具有统计显著性。
实验结果：图3中左边第一列表示没有添加任何其他物质时，细胞的活性；第二列表示添加脂多糖LPS后细胞的活性；第三列表示同时添加LPS和DEX之后细胞的活性，DEX（Dexamethasone）是上市的抗炎药地塞米松，在这里作为对照；第四列表示添加完LPS、DEX和MIF之后细胞的活性；第五列表示添加完LPS、DEX、MIF和ISO-1之后细胞的活性；第六列表示添加完LPS、DEX、MIF和化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸之后细胞的活性。总的来说，化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸对BV-2小神经胶质细胞、THP-1细胞和RAW264.7巨噬细胞均没有明显毒性。
实施例4：化合物对小胶质细胞中LPS诱导炎性因子的影响实验。
实验原理：MIF分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响MIF的生物学活性。此种MIF标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在MIF作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
实验步骤：将96孔板用鼠抗大鼠TNF-α抗体包被，并使用250μl含有1%牛血清蛋白、5%蔗糖及0.05% NaN3的PBS阻断抗体的非特异性结合位点，在4℃孵育16小时。然后用洗涤液洗涤平板3次，加入大鼠TNF-α标准血清及测试血清样本，孵育2小时后进行检测。检测抗体为生物素标记的大鼠TNF-α抗体。通过次级反应物链霉亲和素-辣根过氧化物酶，与四甲基联苯胺反应显色。
实验结果：图4a和4b中第一列表示，没有添加其他物质时NO和TNF-α的含量；第二列表示添加脂多糖LPS之后可以显著诱导NO和TNF-α的释放；第三列表示添加抗炎药地塞米松（DEX）之后可以抑制LPS诱导的炎性因子NO和TNF-α的释放；第四列表示添加MIF之后又可以促进炎性因子NO和TNF-α的释放；第五列表示添加MIF的典型抑制剂ISO-1之后可以在一定程度上抑制炎性因子NO和TNF-α的释放；第六列表示添加化合物3-(3-(苯并呋喃-2-羰基)硫脲基)-4-甲氧基苯甲酸可以有效抑制LPS和MIF引起的炎性因子NO和TNF-α的释放，而且相比DEX和ISO-1具有更好的抑制效果。
实施例5：化合物对MIF刺激的RAW264.7巨噬细胞中ERK活化的影响实验。
实验原理：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体进行免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体进行反应，经过底物显色或放射自显影来检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
实验步骤：将BV-2小胶质细胞以2.0×105密度接种于6孔板中，在37℃培养24小时后用于实验。加药处理16小时后弃去培养基，用4℃的PBS清洗2次，再向每孔中加入1mL PBS，将细胞吹下收集到离心管中，离心5分钟，弃去上清。加入细胞裂解液，震荡混匀反应10分钟，再离心15分钟，收集上清液到离心管中。采用BCA法测定每个样品中蛋白质的含量，并通过western blot方法对蛋白质进行定性定量分析。
实验结果：采用western blot方法检测了RAW264.7细胞胞浆中ERK1/2的蛋白质表达变化，以α-球管蛋白作为内参，发现该化合物可以抑制ERK1/2的磷酸化（如图5所示）。