一种提制烟碱的微生物处理工艺.pdf

本发明公开一种提制烟碱的微生物处理工艺，包括以下步骤：(1)烟叶的预处理；(2)菌种培育；(3)烟叶的发酵；(4)烟碱的提取。本发明采用复合微生物处理来提取烟碱，通过白腐直菌、管囊酵母等微生物降解、破坏经微波处理的烟草中的纤维素、半纤维素等植物组织，有效释放附着在组织结构上的烟碱，提高烟碱的溶出率和提取率；可同时有效降解烟草中有机酸、蛋白质等，减少烟碱提取过程中的乳化现象，同时减少有机溶剂的使用量。本方法烟碱提取率高，有机溶剂使用少，回收率高，有效实现废次烟草的减量化和烟草资源化再利用。

1、  一种提制烟碱的微生物处理工艺，包括以下步骤：
(1)、烟叶的预处理：将烟叶在80℃～110℃烘30min～2hr，粉碎，然后经60目筛筛分，选用粒径小于60目的烟叶；
(2)、菌种培育：选用白腐直菌和管囊酵母，分别经过斜面培养、一级种子试管培养后，按重量比1∶1将两菌种接种入摇瓶培养；将培养好的混合菌种接种入装液量为60ml的250ml三角瓶中，接入量为5％，29℃，180rpm，混合培养48hr；
(3)、烟叶的发酵：将步骤(1)预处理后的烟叶转入发酵装置中，加入豆粕和水，其中烟叶与水的重量比为3∶20～70，豆粕的重量百分量为5％～25％；将步骤(2)的混合菌种接入发酵装置中，接种量为20％～60％，调节pH为5～9，温度25℃～40℃，发酵时间12hr～72hr；
(4)、烟碱的提取：过滤步骤(3)的发酵液，向滤液中加入有机萃取剂，经萃取、分离，取有机相层，减压蒸馏后，得烟碱。

2、  根据权利要求1所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(1)中的烟叶筛分为：依次经20目、40目和60目筛。

3、  根据权利要求1所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(2)中的菌种还包括康宁木霉。

4、  根据权利要求1所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(3)中将烟叶转入发酵装置之前，对烟叶进行微波处理。

5、  根据权利要求1所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(3)中烟叶与水的重量为3∶20。

6、  根据权利要求1或5所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(3)烟叶的发酵条件为：发酵温度为30℃，发酵时间为48hr，pH为6。

7、  根据权利要求1所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(3)中豆粕的重量百分含量为15％。

8、  根据权利要求1所述的提制烟碱的微生物处理工艺，其特征在于：步骤(4)中有机萃取剂为氯仿、乙醚或乙酸乙酯。

一种提制烟碱的微生物处理工艺
技术领域
本发明涉及一种烟草中活性成分烟碱的提取技术，特别是涉及一种利用微生物发酵法处理烟草提制活性成分烟碱的技术。
背景技术
我国烟草资源丰富，每年烟叶产量450～500万吨，除用作卷烟生产外，其中约有近25％的烟叶、烟末等下脚料被废弃，造成环境污染。其实，烟草中富含烟碱(含量为1～3％)、加尼醇(含量为0.3～0.5％)、果胶、烟酸等多种特殊的天然植物素。烟碱，又称尼古丁(Nicotine)，因其具有蒸薰、胃毒、触杀功能以及迅速降解无残留等特点，是生产绿色食品的理想的高效杀虫剂和生物农药，主要具有以下特点：①低毒、低残留；②用量低；③作为天然物质，在环境中易分解，不造成二次污染；④有效期较长，一般为20天左右；⑤对害虫不易产生抗药性，杀虫广谱。作为农用杀虫剂，广泛用于粮食、油料、蔬菜、水果、牧草等农作物的喷雾防治杀虫，是保护生态环境的生物活性农药。此外，烟碱还广泛应用在医药工业上，是研制治疗心血管、皮肤病、蛇毒等疾患药物的特种原料，用其所制得的柠檬酸烟碱还可用于高级香烟的品种改良等。
目前，从烟叶中提制烟碱的传统工艺主要有：水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法和离子交换法；近年来还出现了微波协助萃取法、超声波协助萃取法、超临界流体萃取法、碳化脱羧法等方法。其中，①水蒸气蒸馏法水是提取天然烟碱的较为原始的工艺，操作方便，但是处理设备庞大，效率低，所得产品烟碱的纯度不高；②溶剂萃取法虽已有一定的工业基础，但因烟碱从有机相转入水相后进行分离时，在生产上相界面极易产生乳化层而导致停产，且萃取剂多为挥发性有机溶剂，具有挥发性，对环境的一定污染；③超临界流体萃取法虽具有萃取能力强、溶剂回收简单，节省能源等优点，但超临界流体CO₂，对烟碱的溶解能力受烟草原料含水量的影响较大，只有在烟草的含水量在25％时，CO₂才能有效的萃取尼古丁，且高压设备投资和维修费用大，设计和制造技术要求高，萃取釜还不能进行连续操作，生产能力较低。这些提制方法的局限性，使得烟碱的生产成本高，提取率不理想，尤其是高纯度产品的提取率低，存在着“提取率、能源消耗和环境污染”之间尖锐矛盾，难以满足市场需求。
近年来，生物酶工程技术开始广泛应用于中草药提取中。只要选用恰当的酶菌，采用微生物发酵，通过某些极性低的脂溶性成分转化为易溶于水的糖苷类的过程，不仅能分解植物组织，去除影响液体制的杂质，如淀粉、蛋白质、果胶等，还能迅速有效释放出有效成分，有利于提取物的分离、提取，避免萃取剂的挥发造成的污染和浪费。其工艺简单，操作方便。
综上所述，随着烟草工业、精细化工、制药、有机合成、国防、农药等的迅速发展，市场对烟碱的需求与日俱增，利用微生物处理烟草，提高烟草中有效成分的提取率和纯度，既解决烟草制造企业的污染排放问题，避免二次污染的产生，还能为社会创造良好的经济效益，这也完全符合目前国家强调“节能减排”的总体思路。
发明内容
针对于此，本发明的目的在于，提供一种提取工艺简单，产品的提取高，污染小的提制烟碱的微生物处理工艺。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种提制烟碱的微生物处理工艺，包括以下步骤：
(1)、烟叶的预处理：将烟叶在80℃～110℃烘30min～2hr，粉碎，然后经60目筛筛分，选用粒径小于60目的烟叶；
(2)、菌种培育：选用白腐直菌和管囊酵母，分别经过斜面培养、一级种子试管培养后，按重量比1∶1将两菌种接种入摇瓶培养；将培养好的混合菌种接种入装液量为60ml的250ml三角瓶中，接入量为5％，29℃，180rpm，混合培养48hr；
(3)、烟叶的发酵：将步骤(1)预处理后的烟叶转入发酵装置中，加入豆粕和水，其中烟叶与水的重量比为3∶20～70，豆粕的重量百分量为5％～25％；将步骤(2)的混合菌种接入发酵装置中，接种量为20％～60％，调节pH为5～9，温度25℃～40℃，发酵时间12hr～72hr；
(4)、烟碱的提取：过滤步骤(3)的发酵液，向滤液中加入有机萃取剂，经萃取、分离，取有机相层，减压蒸馏后，得烟碱。
优选的，步骤(1)中的烟叶筛分为：依次经20目、40目和60目筛。
优选的，步骤(2)中的菌种还包括康宁木霉。
优选的，步骤(3)中将烟叶转入发酵装置之前，对烟叶进行微波处理。微波输出功率为900W，频率为2450mhz；处理时间：30s。使用微波预处理烟叶，在微波照射下，烟叶内部结构蓬松化，有利于微生物进入植物组织内部，促进烟叶中纤维素类物质的降解，从而增大了烟碱的游离度。
优选的，步骤(3)中烟叶与水的重量为3∶20。
优选的，步骤(3)烟叶的发酵条件为：发酵温度为30℃，发酵时间为48hr，pH为6。
优选的，步骤(4)中有机萃取剂为氯仿、乙醚或乙酸乙酯。
与现有技术相比，本发明有效利用了生产香烟后的烟草，采用微生物发酵方式来提取烟叶中的烟碱；将废弃烟叶烘干、粉碎、筛分处理，便于发酵过程有效地进行；选用白腐直菌和管囊酵母，利用两种微生物协同处理烟叶，提高烟碱提取量，将发酵液经有机溶剂萃取处理，再减压蒸馏有机相即得到烟碱。
本发明采用复合微生物处理来提取烟碱，通过白腐直菌、管囊酵母等微生物降解、破坏经微波处理的烟草中的纤维素、半纤维素等植物组织，有效释放附着在组织结构上的烟碱，提高烟碱的溶出率和提取率；可同时有效降解烟草中有机酸、蛋白质等，减少烟碱提取过程中的乳化现象，同时减少有机溶剂的使用量。本方法烟碱提取率高，有机溶剂使用少，回收率高，有效实现废次烟草的减量化和烟草资源化再利用。整个工艺过程提高烟草中有效成分的提取率和纯度，开创了一条提制烟碱的新途径，既解决烟草制造企业的污染排放问题，还能为社会创造良好的经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
实施例1
一种提制烟碱的微生物处理工艺，是采用微生物处理工艺发酵烟草，依下述步骤完成：
(1)、将40g～50g废弃的烟叶洗净，晾干后，在80℃～110℃的烘箱中烘30min～2hr后取出，用粉碎机粉碎后连续经过20、40、60目的分子筛分别筛分，得到粒径小于60目的烟叶，用塑料袋分装，备用。
(2)、根据微生物降解植物组织的特性，特选取微生物菌种白腐直菌、康宁木霉、管囊酵母，分别进行斜面培养和一级种子试管培养、二级种子摇瓶培养。
①斜面培养
麦芽汁酵母培养基：取大麦芽一定数量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，保温糖化，不断搅动，经过数小时后，纱布过滤，除去残渣，煮沸，用滤布过滤，得澄清的麦芽汁。加琼脂2％，pH值为7，高温灭菌20分钟，液体直接装入试管中于一定温度灭菌20分钟。在30℃条件下，培养数天后，涂布分离与划线分离，得固体麦芽汁培养基。从原始菌种斜面上挑取一环酵母菌，直线法接种于麦芽汁斜面上，置于培养箱中一定温度，培养3天～4天，使菌丝长满斜面。
PDA霉菌培养基：马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸，用纱布过滤，加葡萄糖，琼脂，补水，pH值为7，融化琼脂，趁热分装到试管中。从原始菌种斜面上挑取一环，直线法接种于PDA斜面上，置于培养箱中一定温度，培养3天～4天，使菌丝长满斜面。
②种子液体培养
一级种子试管培养：在5ml的PDA液体培养基中，接种，摇匀后，置于培养箱中，29℃培养24hr。
二级种子摇瓶培养：以5％的接种量接种到装液量为60ml的250ml三角瓶中，29℃，180rpm，培养36hr。
③混合种子摇瓶培养
分别按5％比例将三种培养好的菌种子液接入装液量为60ml的250ml三角瓶中，29℃，180rpm，培养48hr。
(3)、取预处理后的烟叶10g转入发酵装置中，加入水100ml，豆粕为5g，接入培养好的混合菌种，总接种量为20％，用H₂SO₄调节发酵体系的pH为9，温度为25℃，发酵72hr。
(4)、将步骤(3)发酵体系经漏斗过滤，滤液转入锥形瓶，滤渣转入烧杯，用于制备活性炭，待用。
(5)、将步骤(4)所得滤液，取1ml离心后，于60ml分液漏斗中，加入pH为5.00的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2ml，饱和甲基橙溶液2ml，充分摇匀后，加入氯仿5ml，萃取2min，静置分层，取出下层氯仿层，采用采用分光光度法测定溶液体系中烟碱含量，数据记录及处理。
(6)、将步骤(4)所得滤液，加入0.5～1.5倍体积有机溶液氯仿或乙酸乙酯萃取二次，蒸馏，得烟碱0.276g。
实施例2
(1)、将烟叶在105℃烘1hr，粉碎，经60目筛筛分，选用粒径小于60目的烟叶10g，用输出功率为900W，频率为2450mhz的微波处理30s；
(2)、选用白腐直菌和管囊酵母，经斜面培养、一级种子试管培养后，将培养好的两个菌种按1∶1比例接种入60ml的250ml三角瓶中进行二级混合种子摇床培养，混合菌种接入量为5％，29℃，180rpm，培养48hr；
(3)、将步骤(1)预处理后的烟叶10g转入发酵装置中，加入1.5g的豆粕和60ml水，接入接种量为40％的烟叶重量的混合菌种于发酵装置中，调节pH为5，温度30℃，发酵48hr后取样1ml，离心后，采用分光光度法测定溶液体系中烟碱含量，测得烟碱浓度为3.29g/l，高于未发酵处理烟碱浓度(未发酵烟碱浓度为1.24g/l)；烟碱溶出率为2.84％。
(4)、烟碱的提取：过滤步骤(3)的发酵液，向滤液中加入有机萃取剂氯仿，经萃取、分离，取有机相层，减压蒸馏后，得烟碱。将滤液转入250ml分液漏斗中，分2次加入氯仿80ml进行萃取，取下层有机相减压蒸馏，得到烟碱粗品的质量为0.605g，经精馏提纯后的烟碱0.246g，氯仿的回收率为81.14％。
实施例3
(1)、将烟叶在80℃烘2hr，粉碎，经20目和60目筛筛分，选用粒径小于60目的烟叶10g，用输出功率为900W，频率为2450mhz的微波处理30s；
(2)、选用白腐直菌和管囊酵母，经斜面培养、一级种子试管培养后，将培养好的两个菌种按1∶1比例接种入60ml的250ml三角瓶中进行二级混合种子摇床培养，混合菌种接入量为5％，29℃，180rpm，培养48hr；
(3)、将步骤(1)预处理后的烟叶20g转入发酵装置中，加入5g的豆粕和160ml水，接入接种量为60％的烟叶重量的混合菌种于发酵装置中，调节pH为7，温度40℃，发酵12hr后取样1ml，离心后，采用分光光度法测定溶液体系中烟碱含量，测得烟碱浓度为3.43g/l，高于未发酵处理烟碱浓度(未发酵烟碱浓度为1.24g/l)；烟碱溶出率为3.84％。
(4)、烟碱的提取：过滤步骤(3)的发酵液，向滤液中加入有机萃取剂乙醚，经萃取、分离，取有机相层，减压蒸馏后，得烟碱。将滤液转入500ml分液漏斗中，分2次加入乙醚100ml进行萃取，取下层有机相减压蒸馏，得到烟碱粗品的质量为1.315g，经精馏提纯后的烟碱0.501g，乙醚的回收率为83.36％。
表1不同固液比(烟叶重量∶水的体积)与烟碱含量
烟叶发酵中加入水，烟叶与水的重量比例(g/ml)为3∶20～70

表2辅料比和烟碱含量
烟叶发酵中，豆粕的重量百分量为5％～25％

表3接种量和烟碱含量
烟叶发酵中，混合菌种接入发酵装置中，接种量为20％～60％

表4烟叶发酵中pH和烟碱含量

表5烟叶发酵中发酵温度和烟碱含量

表6烟叶发酵中发酵时间与烟碱含量

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。