一种降解辛硫磷农药的微生物制剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及微生物利用技术领域,尤其涉及一种可高效降解有机磷农药的菌株和利用该菌株制备而成的菌剂及该菌剂的制备方法。
背景技术
我国现在每年农药总产量已达50万吨,迄今为止,我国农药的积累用量已达400多万吨。杀虫剂占所有农药的70%以上,其中高毒的有机磷杀虫剂又占所有杀虫剂的70%以上,即高毒的有机磷杀虫剂占整个农药市场的50%以上。在年产量万吨以上的6个杀虫剂品种中,有5个是有机磷杀虫剂。从目前农药使用情况看,高毒农药使用量大,使用次数频繁是造成某些食品,特别是蔬菜、水果农药残留超标的主要原因。对于毒性低的农药,若用量大或使用不当也同样可造成对某些食品的污染。
有机磷农药(OPs)在杀虫剂中占据重要的地位,是世界上生产和使用最多的农药品种,我国的有机磷农药在杀虫剂中占70%,近几年经调整有所下降,但仍然是控制农作物害虫和病虫媒昆虫的重要手段。然而,由于有机磷农药的毒性,随着广泛使用,也带来严重的副作用,日益成为重要的化学环境污染物。有证据表明,OPs具有诱变性和致畸胎性,哺乳动物的神经和免疫系统疾病大多与OPs相关,这些疾病包括疯牛病、海湾战争综合症、帕金森综合症等。如何消除有机磷农药残留对环境和人类的危害,已成为事关人类健康和国民经济发展的问题。
微生物降解被认为是消除有机磷农药残留的一种有效措施,一直是国内外学者研究的热门方向。利用生物或生物产品来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点,是消除和解毒高浓度农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。但现有的降解有机磷的微生物存在生长缓慢,缺少竞争优势,降解性能不稳定等问题。细菌由于其具生化上多种适应能力以及容易诱发突变,从而在降解农药的微生物中占有主要的地位,尤其是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株降解能力较强。
【发明内容】
本发明目的是,针对目前微生物降解技术中所存在的缺少生长快、培养简单、能高效降解有机磷农药残留微生物菌种的现状,提供一种生长速度快、培养方法简单、能高效、稳定降解辛硫磷等有机磷类农药的菌株,并利用该菌株生产用于治理有机磷类农药引起的土壤、农作物及其产品污染的菌剂及该菌剂的制备方法。
本发明目的通过以下技术方案得以实现。
本发明所提供的微生物是一株命名为YJL-1的假单胞菌属(Pseudomonassp.)菌株,该菌株通过以下培养、分离、筛选而得到:
1)我们取2007年10月在杭州农药厂污水处理池中采集的活性污泥2g,加入100ml富集培养基中,该培养基的配方为:NaCl 0.5-1.5g/L,NH4NO30.5-1.5g/L,K2HPO4 1.0-2.0g,KH2PO4 0.3-0.8g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L,酵母提取物0.05-0.2g/L,调pH7.0-7.2后,按50-100mg/L添加辛硫磷,于28-37℃,120-180rpm摇床培养;
2)上述培养液每1-2周转接移种一次,以5-10%的接种量接入新鲜培养基中,如此驯化3-6个月;将最终的培养菌液用平板稀释法进行细菌分离,从中获得生长快、菌落规则的单菌落30多个;
3)将单菌接入LB试管中培养后,加入含50-100mg/L辛硫磷的无机盐培养基中,3d后检测辛硫磷含量,经过降解性能验证,筛选得到降解率最高的菌株(编号为X-1),经生理生化鉴定,确定该菌株属假单胞菌属(Pseudomonas sp.),命名为YJL-1;保存于LB斜面或甘油冻存管中,使用时在含辛硫磷的培养基上进行活化;该菌株的主要特征为:革兰氏阴性、无芽孢的杆状菌,菌落为淡黄色,边缘规则,表面光滑,无褶皱,好氧,化能异样,氧化酶阴性、接触酶阳性;最适生长温度为28-30℃,最适生长pH为7.0-7.2,在无机盐培养基中以(100mg/L)辛硫磷为唯一碳源生长,3-5天降解率达90-95%;
该菌已于2009年7月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3211。
一种降解辛硫磷农药的微生物菌剂,该菌剂可以LB为斜面或液体培养基,以NaCl 0.5-1.5g/L,NH4NO3 0.5-1.5g/L,K2HPO4 1.0-2.0g,KH2PO4 0.3-0.8g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L,酵母提取物0.05-0.2g/L,调pH7.0-7.2为无机盐培养基;以葡萄糖5-15g/L,酵母膏1-2g/L,(NH4)2SO41.0-2.0g/L,NaCl0.5-1g/L为发酵培养基;以保藏编号为CGMCC No.3211的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)YJL-1菌株为菌种,经活化、扩增及菌剂发酵制备而获得。
一种降解辛硫磷农药微生物菌剂的制备方法,该方法按以下步骤进行:
1)各种培养基的配制:包括
①LB培养基:2.5-7.5g/LNaCl,2.5-7.5g/L酵母膏,5-15g/L蛋白胨;
②无机盐培养基:NaCl 0.5-1.5g/L,NH4NO3 0.5-1.5g/L,K2HPO4 1.0-2.0g/L,KH2PO4 0.3-0.8g/L,MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L,酵母提取物0.05-0.2g/L,调pH7.0-7.2;
③发酵培养基:葡萄糖5-15g/L,酵母膏1-2g/L,(NH4)2SO41.0-2.0g/L,NaCl0.5-1g/L;
2)菌种的制备:将保藏编号为CGMCC No.3211的YJL-1菌株接种于LB斜面上,30-35℃培养18-24h,斜面保存于0-4℃冰箱中冷藏、备用;或将YJL-1菌株接种于LB试管中,120-180rpm振荡,30-35℃培养18-24h,将菌液加入50-70%的甘油中,-40℃至-80℃低温保存、备用;
3)菌种的活化:从LB斜面或甘油冻存管中划线至固体LB平板中,30-35℃活化培养18-24h;将活化后地单菌落接种于LB液体培养基中,加入100mg/L辛硫磷,30-35℃,120-180rpm摇床培养至对数生长期;将上述培养液离心,用pH7.0-7.2磷酸缓冲液(PSB)清洗后,以5-10%接种量加入含50-100mg/L辛硫磷的无机盐培养基中,30℃,150rpm摇床培养,3d后检测辛硫磷浓度,当降解率达到90%以上时,作为菌种使用;
4)摇瓶菌种扩增:按照步骤(3)的方法将菌体培养至对数生长期,按5-10%的接种量接入100mlLB培养基中,在pH7.0-7.2,摇床转速120-150rpm下培养18-24h,菌液直接用于接种或0-4℃冰箱中冷藏、备用;
5)菌剂发酵:将步骤(1)发酵培养基加入发酵罐中,罐内温度121℃保持30分钟后,保压至0.02-0.18MPa之间,进行蒸汽高温灭菌后冷却至30-35℃;在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入步骤(4)摇瓶菌种,接种量为5-10%;搅拌机转速为110-220转/分,温度30-35℃,通气量2-4m3/h,罐压0.02-0.18MPa,pH自然,培养18-24小时至菌体数达到108个/m1以上,发酵菌液灌装于无菌塑料瓶中即成菌剂产品,直接应用或于室温下保存。
本发明菌剂在应用时,将菌剂稀释500-1000倍,喷施于土壤、作物或农产品上,即可对上述物体上的辛硫磷农药残留进行有效的降解。
本发明的有益效果:
1、本发明分离、筛选得到的假单胞菌属YJL-1菌株,在目前已报道的有关降解辛硫磷的细菌中尚属首次,该菌株降解辛硫磷性能强而稳定,不仅可在三角瓶中降解,还可以降解残留于土壤、农作物和农产品上的辛硫磷,降解效率高达80-90%(见实施例4、5、6);
2、YJL-1菌株具有活力强,生长速度快,培养方法简单,降解能力稳定,环境适应能力强等优势,在LB培养基中只需培养18-24h就可以收获,适合用于对土壤等自然环境与农产品农药残留的修复(见实施例1、2、3);
3、该菌有望在减少农产品农药残留,降解土壤环境中农药残留中得到推广应用,在环境污染治理和保护人们身体健康方面发挥作用。
【具体实施方式】
通过以下实施例对本发明作更详细的说明,但以下实施例仅是说明性的,本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1:(降解辛硫磷农药微生物制剂制备1)
按以下步骤进行:
1)各种培养基的配制:包括
①LB培养基:2.5g/LNaCl,7.0g/L酵母膏,5g/L蛋白胨;
②无机盐培养基:NaCl 0.5g/L,NH4NO31.5g/L,K2HPO41.0g/L,KH2PO40.8g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,酵母提取物0.2g/L,调pH7.0;
③发酵培养基:葡萄糖10g/L,酵母膏1g/L,(NH4)2SO42.0g/L,NaCl 0.5g/L;
2)菌种的制备:将保藏编号为CGMCC No.3211的YJL-1菌株接种于LB斜面上,30℃培养24h,斜面保存于0℃冰箱中冷藏、备用;
3)菌种的活化:从LB斜面中划线至固体LB平板中,30℃活化培养24h;将活化后的单菌落接种于LB液体培养基中,加入100mg/L辛硫磷,35℃,180rpm摇床培养至对数生长期;将上述培养液离心,用pH7.0-7.2磷酸缓冲液(PSB)清洗后,以5%接种量加入含50mg/L辛硫磷的无机盐培养基中,30℃,150rpm摇床培养,3d后检测辛硫磷浓度,当降解率达到90%以上时,作为菌种使用;
4)摇瓶菌种扩增:按照步骤(3)的方法将菌体培养至对数生长期,按10%的接种量接入100mlLB培养基中,在pH7.0-7.2,摇床转速150rpm下培养18h,菌液直接用于接种或0-4℃冰箱中冷藏、备用;
5)菌剂发酵:将步骤(1)发酵培养基加入发酵罐中,罐内温度121℃保持30分钟后,保压至0.02MPa,进行蒸汽高温灭菌后冷却至30-35℃;在火焰保护下迅速通过接种阀门向种子罐内接入步骤(4)摇瓶菌种,接种量为5%;搅拌机转速为110转/分,温度35℃,通气量2m3/h,罐压0.18MPa,pH自然,培养18小时,发酵菌液灌装于无菌塑料瓶中即成菌剂产品,直接应用或于室温下保存;经菌落计数检测,培养好的菌液中菌体数达到108个/ml以上。
实施例2:(降解辛硫磷农药微生物制剂制备2)
本例中,步骤1)各种培养基的配制为:①LB培养基:4.5g/LNaCl,4.0g/L酵母膏,10g/L蛋白胨;②无机盐培养基:NaCl 1.0g/L,NH4NO31.0g/L,K2HPO41.5g/L,KH2PO40.5g/L,MgSO4·7H2O 0.3g/L,酵母提取物0.05g/L,调pH7.1;③发酵培养基:葡萄糖5g/L,酵母膏1.5g/L,(NH4)2SO41.5g/L,NaCl 0.75g/L;
步骤2)菌种的制备:将YJL-1菌株接种于LB试管中,180rpm振荡,30℃培养21h,将菌液加入60%的甘油中,-80℃低温保存、备用;
步骤3)菌种的活化:从LB甘油冻存管中划线至固体LB平板中,33℃活化培养21h;将活化后的单菌落接种于LB液体培养基中,加入100mg/L辛硫磷,30℃,150rpm摇床培养至对数生长期;将上述培养液离心,用pH7.0-7.2磷酸缓冲液(PSB)清洗后,以7%接种量加入含100mg/L辛硫磷的无机盐培养基中;
步骤4)摇瓶菌种扩增:按8%的接种量接入100mlLB培养基中,在pH7.0-7.2,摇床转速135rpm下培养21h;
步骤5)菌剂发酵:发酵罐中保压至0.10MPa;接种量为8%;搅拌机转速为150转/分,温度30℃,通气量3m3/h,罐压0.02MPa,pH自然,培养21小时;
其余步骤、工艺同于实施例1。经菌落计数检测,培养好的菌液中菌体数达到108个/ml以上。
实施例3:(降解辛硫磷农药微生物制剂制备3)
本例中,步骤1)各种培养基的配制为:①LB培养基:7.5g/LNaCl,2.5g/L酵母膏,15g/L蛋白胨;②无机盐培养基:NaCl 1.5g/L,NH4NO30.5g/L,K2HPO42.0g/L,KH2PO4 0.3g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,酵母提取物0.1g/L,调pH7.2;③发酵培养基:葡萄糖15g/L,酵母膏2.0g/L,(NH4)2SO41.0g/L,NaCl 1.0g/L;
步骤2)菌种的制备:将YJL-1菌株接种于LB斜面上,35℃培养18h,斜面保存于4℃冰箱中冷藏、备用;
步骤3)菌种的活化:从LB斜面中划线至固体LB平板中,35℃活化培养18h;将活化后的单菌落接种于LB液体培养基中,加入100mg/L辛硫磷,32℃,120rpm摇床培养至对数生长期;将上述培养液离心,用pH7.0-7.2磷酸缓冲液(PSB)清洗后,以10%接种量加入含75mg/L辛硫磷的无机盐培养基中;
步骤4)摇瓶菌种扩增:按5%的接种量接入100mlLB培养基中,在pH7.0-7.2,摇床转速120rpm下培养24h;
步骤5)菌剂发酵:发酵罐中保压至0.18MPa;接种量为10%;搅拌机转速为220转/分,温度33℃,通气量4m3/h,罐压0.10MPa,pH自然,培养24小时;
其余步骤、工艺同于实施例1。经菌落计数检测,培养好的菌液中菌体数达到108个/ml以上。
实施例4:(本发明有机磷降解菌对辛硫磷的降解效果试验)
将活化后的YJL-1菌株单菌落接种于LB液体培养基中,加入100mg/L辛硫磷,30℃,150rpm摇床培养24h;将上述培养液离心,用磷酸缓冲液(pH7.0-7.2)清洗、离心2次,再用磷酸缓冲液将菌体OD600调至0.1-0.2,以10%接种量加入含100mg/L辛硫磷的无机盐培养基中,28-30℃,120-150rpm摇床培养,3d后检测辛硫磷浓度和OD600值,验证降解效果和菌体生长情况。经检测,辛硫磷降解率在90%以上,菌体OD600达到0.6以上,说明YJL-1菌株对辛硫磷有很好的降解效果,并能利用辛硫磷生长。所述的LB液体培养基与无机盐培养基同于实施例1、2或3。
实施例5:(本发明有机磷降解菌剂对青菜上辛硫磷残留的降解)
试验地点为浙江省农科院试验基地,时间为2008年10月,各实验小区面积为1亩,对照与处理小区各3块。在对照与处理的青菜叶面上均喷0.5mg/mL的辛硫磷溶液,3d后再在处理的青菜叶面上喷实施例1制备的YJL-1菌剂稀释液(约108/mL),6kg/亩。至喷后第3,7,15,21d时分别测定青菜中辛硫磷的含量(由农业部农产品质量监督检验测试中心(杭州)检测)。结果(表1)显示,在使用YJL-1菌剂后第2d青菜中有机磷比对照有所下降,在第6d已下降到对照的50%左右,而到第14d时,与对照相比,处理已降解了约70%,到第20d时,处理中辛硫磷的浓度已降到0.01mg/kg以下,几乎完全降解。
表1YJL-1对青菜上辛硫磷的降解(辛硫磷残留量mg/kg)
实施例6:(本发明有机磷降解菌剂对土壤中辛硫磷残留的降解)
土壤取自浙江省农科院实验田,土壤类型为黄棕壤,有机质含量14.5g/kg,含氮1.2g/kg,pH值7.2,土壤含水量60-70%。选择土壤中无辛硫磷农药残留的表层土,每个样品10kg土壤,再在该土壤中人为添加辛硫磷浓度至50mg/kg,实施例1制备的YJL-1菌液使用量为108/g干土。施菌后,分别于第7,14,20d测定土壤中辛硫磷的含量。结果显示,在接种YJL-1的自然土壤中,辛硫磷的降解要比对照土壤中快得多,明显地加快了农药的降解。在加菌7d后,对照土壤中辛硫磷只降解了24.4%,而在接种YJL-1的土壤中辛硫磷已降解了71%。到了第20d,接种YJL-1的土壤中辛硫磷浓度已降到5mg/kg,而在对照土壤中辛硫磷的浓度仍有24.9mg/kg。显然,YJL-1加速了辛硫磷在自然土壤中的降解。