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化合物、筛选和治疗方法
关于联邦资助研究的声明
本发明的研究受到国立卫生研究院授权(授权号GM64703、AG012859和NS37141-08)的支持。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
在许多疾病中，细胞死亡是通过细胞凋亡和/或通路坏死介导的。虽然了解了大量有关控制细胞凋亡的作用机理，但还没有完全理解坏死的控制。理解调节细胞中坏死和细胞凋亡的机理对能够治疗病症比如神经变性疾病、中风、冠心病、肾病和肝病是必需的。充分地理解坏死和细胞凋亡性细胞死亡通路对治疗AIDS和与AIDS相关的病症比如视网膜坏死也很重要。
研究表明半胱天冬蛋白酶(Caspase)在诱发细胞凋亡中起着重要作用。半胱天冬蛋白酶的肽基抑制剂比如zVAD-fmk在防止受化合物比如TNFα刺激而进行细胞凋亡的细胞中细胞凋亡性细胞死亡通路的活化中有用。然而，用zVAD-fmk和这些细胞死亡刺激物处理的细胞仍以与半胱天冬蛋白酶无关的坏死形式死亡。
预防半胱天冬蛋白酶无关性细胞死亡(例如坏死或坏死样凋亡(necroptosis))的化合物的发现将提供用于治疗其中发生坏死和用于预防坏死或坏死样凋亡发病的有用的治疗剂。这些化合物和方法将对治疗神经变性疾病、大脑局部缺血和心脏损伤和头部创伤特别有用。
发明概述
本发明提供用于治疗多种病症的化合物、药物组合物、药盒和方法，所述病症包括细胞或组织坏死是诱发因素或结果的、增殖能力丧失是诱发因素或结果的、其中TNFα家族的细胞因子是诱发因素或结果的和其中RIP1蛋白质是起作用的因素的症状。本发明的化合物可用于例如减少想要的细胞坏死、增加细胞增殖或刺激免疫应答的治疗剂。本发明的化合物也可以用于例如治疗在表1中列出的病症中的任何一种。示例性的病症为中枢或周围神经系统的神经变性疾病；视网膜神经元细胞死亡的结果；心肌细胞死亡的结果；免疫系统细胞的细胞死亡的结果；中风；肝病；胰腺疾病；与肾衰竭相关的细胞死亡的结果；心脏、肠系膜、视网膜、肝脏的或大脑局部缺血性损伤；器官储藏期间的局部缺血性损伤；头部创伤；败血症性休克；冠心病；心肌病；骨无血管性坏死；镰状红细胞病；肌肉萎缩；胃肠疾病；结核病；糖尿病；血管改变；肌营养不良；移植物抗宿主反应疾病；病毒感染；克隆氏病；溃疡性结肠炎；哮喘；其中细胞或组织坏死为诱发因素或结果的任何病症；其中细胞增殖、分化或细胞内信号的改变为诱发因素的任何病症；和其中RIP1蛋白质为起作用的因素的任何病症。本发明进一步提供能鉴别RIP1抑制剂的筛选试验，一种本文描述的化合物分子靶。因此，如此鉴别的另外的抑制剂可以用于疾病治疗的方法中。
因此，在第一个方面，本发明提供一种通过给用药对象有效量的Nec-1e化合物、Nec-2b化合物或Nec-3b化合物来治疗患有在表1中列出的疾病或病症的所述患者的方法。在某些实例中，所述Nec-1e化合物为基本上纯的A异构体或B异构体。
本发明还提供一种通过给用药对象有效量的Nec-3化合物来治疗患有在表1中列出的疾病或病症的所述患者的方法，其中所述Nec-3化合物为基本上纯的((3R，3aR)-rel异构体或基本上纯的(3R，3aS)-rel异构体。在某些实例中，所述Nec-3化合物为基本上纯的(3R，3aR)-对映异构体、基本上纯的(3R，3aS)-对映异构体、基本上纯的(3S，3aR)-对映异构体或基本上纯的(3S，3aS)-对映异构体。在某些实例中，所述Nec-3化合物选自化合物(1)至(217)。例如，所述Nec-3化合物可选自来自表7的化合物(141)、(161)、(166)、(167)、(169)、(171)、(178)和(182)；来自表8的化合物(185)、(188)、(190)、(192)和(194)的表8；和来自表9的化合物(147)、(148)、(150)、(151)、(154)、(158)和(159)。
本发明进一步提供一种通过给用药对象有效量的Nec化合物来治疗患有在表2中列出的疾病或病症的所述患者的方法。在某些实例中，所述Nec化合物为式(I)的Nec-1化合物：
其中
R₁代表甲基、甲氧基、Cl、Br或F；和R₂代表一至四个碳原子的烷基。在某些实例中，R₁代表Cl和R₂代表甲基或乙基。所述Nec-1化合物可以为基本上纯的A异构体或B异构体。
本发明还提供一种通过给用药对象有效量的Nec-1c化合物来治疗患有在表3中列出的疾病或病症的所述患者的方法。
本发明进一步提供一种通过给用药对象有效量的Nec-1d化合物来治疗患有在表4中列出的疾病或病症的所述患者的方法。
一般而言，本发明提供一种通过给用药对象有效量的Nec化合物来治疗患有在表1中列出的疾病或病症的所述患者的方法。
本发明还提供一种通过给用药对象有效量的格尔德霉素来治疗患有在表1中列出的疾病或病症的所述患者的方法。可选地，可以通过服用有效量的任一种RIP1抑制剂或HSP90抑制剂治疗所述患者。
本发明进一步提供Nec化合物、包含Nec化合物和药物可接受的赋形剂的药物组合物和包括这些化合物或组合物和它们的使用说明的药盒。在某些实例中，本发明提供Nec-1e化合物；Nec-1e化合物的基本上纯的A异构体和B异构体；Nec-2b化合物；Nec-3b化合物；和Nec-3化合物的基本上纯的(3R，3aR)-rel异构体和(3R，3aS)-rel异构体，例如选自化合物(1)至(217)(例如，来自表7的化合物(141)、(161)、(166)、(167)、(169)、(171)、(178)和(182)；来自表8的化合物(185)、(188)、(190)、(192)和(194)；和来自表9的化合物(147)、(148)、(150)、(151)、(154)、(158)和(159)。在某些实例中，本文提供的Nec-3化合物可以是Nec-3化合物的基本上纯的(3R，3aR)-对映异构体、(3R，3aS)-对映异构体、(3S，3aR)-对映异构体或(3S，3aS)-对映异构体。
本发明进一步提供式(I)的Nec-1化合物：

其中R₁代表甲基、甲氧基、Cl、Br或F；和R₂代表一至四个碳原子的烷基。
在另一个实例中，本发明提供式(II)的Nec-1化合物：

其中R₁代表甲氧基、Cl、Br或F；和R₂代表一至四个碳原子的烷基。
在又一个实例中，本发明提供式(III)的Nec-1化合物：

其中R₁代表甲基；和R₂代表氢或一至四个碳原子的烷基。本发明进一步提供式(XVI)的Nec-1化合物：
其中
X₁和X₂各自独立地代表＝S、＝O、＝N、H、R₁₁、SR₁₁、NR₁₁或OR₁₁；Y代表S、NH或NR₈；G代表CH₂、O、SR₇或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_6-12芳基、酰基、乙酰基、酰氨基、C_2-9杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、酰基、乙酰基、酰氨基、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_6-12芳基、C_2-9杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、酰基、乙酰基、酰氨基、NO₂、C_1-7烷基、C_2-7烯基或C_2-7烯基；R₈代表H、OH、NO₂、F、Cl、Br、I、C_1-7烷基、C_6-12芳基、芳烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-9杂芳基、乙酰基、甲氧基、氨基、酰氨基、酰基或卤素；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、OH、F、Cl、B、I、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基或包括C_n和/或C_n’的三至六元环烷基，或R₉和/或R₁₀可以不存在；R₁₁代表H、OH、NO₂、F、Cl、Br、I、酰基、甲氧基、氨基、酰氨基、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基或酰基；n和n’各自为零到五的整数，包括端值；n”为0或1；和键(a)、(b)和(c)各自独立地为单键或双键，条件是键(a)和键(b)不同时为双键，其中当X₁为＝O、OH或H时，X₂不＝S或SR₁₂，其中R₁₂为H或烷基，和其中X₁和X₂不同时为＝O。在某些实例中，G和Y各自代表NH；R₁、R₂、R₃、R₅、R₉和R₁₀各自代表H；n为1；n′和n″各自为0；(a)为双键，和(b)和(c)各自为双键。在某些实例中，R₄代表甲基、甲氧基、Cl、Br或F；和R₆代表一至四个碳原子的烷基。在某些实例中，X₁为＝O或X₂为＝O。本文提供的任一种Nec-1化合物可以是基本上纯的A异构体或B异构体。
本发明进一步提供式(IV)的Nec-2化合物：
其中
R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自代表氢、酰基、乙酰基、直链和支链烷基、卤素、氨基、甲氧基、硝基或C(O)R₁₂、C(S)R₁₂、C(O)OR₁₂、C(O)_nR₁₂R₁₃、C(S)_nR₁₂R₁₃或S(O₂)R₁₂；其中R₁₂和R₁₃各自独立地代表氢、任选取代的C_1-12烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；(a)指示的键可以是单键或双键；(b)指示的键可以是单键或双键；和X为氢、酰基、乙酰基、烷基、卤素、氨基、酰氨基、硝基、＝S、SR₁₁、＝N、NR₁₁＝O或OR₁₁，其中R₁₁为氢、酰基、乙酰基、烷基或酰氨基；其中当R₁、R₄、R₅、R₆、R₉和R₁₀各自为氢，和R₂、R₃、R₇和R₈各自为甲氧基时，X不能＝O、氢或羟基。
本发明进一步提供式(V)的Nec-3化合物：
其中
Z为键、CH₂、CH₂CH₂、O、S、S(O)、S(O₂)或NR₈；其中R₈为任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；
(a)指示的键可以是单键或双键；
R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地代表氢、一至六个碳原子的烷酰基；一至六个碳原子的烷基；一至六个碳原子的烷氧基；烷氧基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的烷基亚磺酰基；烷基亚磺酰基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的烷基磺酰基；烷基磺酰基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；C_7-16芳烷基；氨基；一至六个碳原子的氨基烷基；C₆或C₁₀芳基；C₇或C₁₁芳酰基(aryloyl)；叠氮基；一至六个碳原子的叠氮基烷基；甲醛；(甲醛)烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；三至八个碳原子的环烷基；环烷基烷基，其中所述环烷基具有三至八个碳原子，和所述亚烷基具有一至十个碳原子；卤素；一至六个碳原子的卤化烷基；C_2-9杂环；C_2-9(杂环)氧基；C_3-10(杂环)酰基；羟基；一至六个碳原子的羟烷基；硝基；一至六个碳原子的硝基烷基；N-保护的氨基；N-保护的氨基烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的硫烷氧基；硫烷氧基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qCO₂R_A，其中q为零至四，和R_A选自(a)C_1-6烷基，(b)C₆或C₁₀芳基，和(c)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qCONR_BRC，其中R_B和RC独立地选自(a)氢，(b)C_1-6烷基，(c)C₆或C₁₀芳基，和(d)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qSO₂R_D，其中R_D选自(a)C_1-6烷基、(b)C₆或C₁₀芳基，和(c)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qSO₂NR_ER_F，其中R_E和R_F独立地选自(a)氢，(b)烷基，(c)C₆或C₁₀芳基，和(d)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qNR_GR_H，其中R_G和R_H独立地选自(a)氢；(b)N-保护基；(c)一至六个碳原子的烷基；(d)二至六个碳原子的烯基；(e)二至六个碳原子的炔基；(f)C₆或C₁₀芳基；(g)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；(h)三至八个碳原子的环烷基，和(i)环烷基烷基，其中所述环烷基具有三至八个碳原子，和所述亚烷基具有一至十个碳原子，条件是不存在两个基团通过羰基或磺酰基结合氮原子；C_1-6全氟烷基；C_1-6全氟烷氧基；C₆或C₁₀芳氧基；C_3-8环烷氧基；C_9-14环烷基烷氧基；或C_7-16芳基烷氧基；
R₅为任选取代的C₆或C₁₀芳基或任选取代的C_2-9杂芳基；
R₆为C(O)R₉、C(S)R₉、C(O)OR₉、C(O)_nR₉R₁₀、C(S)_nR₉R₁₀、C(NH)R₉或S(O₂)R₉，其中R₉和R₁₀各自独立地代表H、任选取代的C_1-12烷基、任选取代的C_1-7杂烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；
R₇为氢、C_1-6烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_7-16芳烷基、任选取代的C_2-9杂芳基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；和
R₁₁为H、任选取代的C_1-12烷基或任选取代的C_1-7杂烷基、
其中当R₁、R₂、R₄和R₇各自选自氢、氨基、卤化物和羟基，且Z为CH₂时，R₃不能为羟基或甲氧基。
本发明另外提供式(VI)的Nec-3化合物：
其中
Z为键、CH₂、CH₂CH₂、O、S、S(O)、S(O₂)或NR₁₂；其中R₁₂为任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；
(a)指示的键可以是单键或双键；
R₁、R₂、R₃、R₄、R₇、R₈、R₉、R₁₀和R₁₁各自独立地表示氢、一至六个碳原子的烷酰基；一至六个碳原子的烷基；一至六个碳原子的烷氧基；烷氧基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的烷基亚磺酰基；烷基亚磺酰基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的烷基磺酰基；烷基磺酰基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；C_7-16芳烷基；氨基；一至六个碳原子的氨基烷基；C₆或C₁₀芳基；C₇或C₁₁芳酰基；叠氮基；一至六个碳原子的叠氮基烷基；甲醛；(甲醛)烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；三至八个碳原子的环烷基；环烷基烷基，其中所述环烷基具有三至八个碳原子，和所述亚烷基具有一至十个碳原子；卤素；一至六个碳原子的卤代烷基；C_2-9杂环；C_2-9(杂环)氧基；C_3-10(杂环)酰基；羟基；一至六个碳原子的羟烷基；硝基；一至六个碳原子的硝基烷基；N-保护的氨基；N-保护的氨基烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的硫烷氧基；硫烷氧基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qCO₂R_A，其中q为零至四，和R_A选自(a)C_1-6烷基，(b)C₆或C₁₀芳基，和(c)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qCONR_BRC，其中R_B和RC独立地选自(a)氢，(b)C_1-6烷基，(c)C₆或C₁₀芳基，和(d)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qSO₂R_D，其中R_D选自(a)C_1-6烷基，(b)C₆或C₁₀芳基，和(c)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qSO₂NR_ER_F，其中R_E和R_F独立地选自(a)氢，(b)烷基，(c)C₆或C₁₀芳基，和(d)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qNR_GR_H，其中R_G和R_H独立地选自(a)氢；(b)N-保护基；(c)一至六个碳原子的烷基；(d)二至六个碳原子的烯基；(e)二至六个碳原子的炔基；(f)C₆或₁₀芳基；(g)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；(h)三至八个碳原子的环烷基，和(i)环烷基烷基，其中所述环烷基具有三至八个碳原子，和所述亚烷基具有一至十个碳原子，条件是不存在两个基团通过羰基或磺酰基结合氮原子；C_1-6全氟烷基；C_1-6全氟烷氧基；C₆或C₁₀芳氧基；C_3-8环烷氧基；C_9-14环烷基烷氧基；或C_7-16芳基烷氧基；
R₅为C(O)R₁₃、C(S)R₁₃、C(O)OR₁₃、C(O)_nR₁₃R₁₄、C(S)_nR₁₃R₁₄、C(NH)R₁₃或S(O₂)R₁₃，其中R₁₃和R₁₄各自独立地代表氢、任选取代的C_1-12烷基、任选取代的C_1-7杂烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；和
R₆为氢、C_1-6烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_7-16芳烷基、任选取代的C_2-9杂芳基或任选取代的C_2-15杂芳烷基，其中当R₁、R₂、R₄和R₆至R₁₁各自选自氢、氨基、卤化物和羟基，且Z为CH₂时，R₃不能为羟基或甲氧基。在某些实例中，(a)指示的键为双键；和R₁、R₂、R₄、R₆、R₇、R₈、R₁₀和R₁₁各自独立地代表氢。在某些实例中，R₃和R₉各自独立地代表一至六个碳原子的烷基；一至六个碳原子的烷氧基；卤素；或氨基。
本发明另外提供一种药物组合物，其包括：
(i)任一种本文描述的Nec化合物，例如Nec-1e、Nec-2b或Nec-3b化合物；和(ii)药物可接受的赋形剂。
本发明进一步提供一种药盒，其包括：(i)任一种本文描述的Nec化合物，例如Nec-1e、Nec-2b或Nec-3b化合物；和(ii)用于患有在表1中列出的疾病或病症的患者使用所述化合物的说明。
本发明还提供了鉴别一种候选化合物为选择性抑制RIP1的化合物的方法，包括步骤如下：a)在一定条件下培养包括RIP1多肽和该候选化合物的混合物，所述条件是在不存在该化合物的情况下，所述RIP1多肽能够以参考水平进行磷酸化；b)检测RIP1磷酸化的水平；c)测定RIP1磷酸化的水平与所述参考水平的比例；d)在一定条件下培养包括RIP2或RIP3多肽和所述化合物的第二混合物，所述条件是在不存在该化合物的情况下，所述RIP2多肽能够以第二参考水平进行磷酸化；e)检测RIP2或RIP3磷酸化的水平；和f)测定RIP2或RIP3磷酸化的水平与第二参考水平的比例。在该方法中，如果在步骤c)中测定的比例小于在步骤f)中测定的比例，则该化合物被认为选择性抑制RIP1。
本发明进一步提供一种鉴别候选化合物为选择性抑制RIP1的化合物的方法，包括下述步骤：a)使RIP1多肽和该候选化合物接触；b)检测该化合物对RIP1多肽的结合；c)使RIP2或RIP3多肽和所述化合物接触；和d)检测所述化合物对RIP2或RIP3多肽的结合。在这个方法中，结合RIP1多肽而不结合RIP2或RIP3多肽的化合物被认为选择性抑制RIP1。
定义
在整个说明书和权利要求书中使用的，下述术语具有指定的含义：
“Nec-1a化合物”指式(VII)的化合物：

其中R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自氢、羧基、甲基、羟基、甲氧基、氨基和硝基；R₅选自氢、C_1-6烷基和酰基；R₆选自C_1-6烷基、酰基、卤素、氢或羟基；R₇选自甲基、羟基、羧基和C_1-6烷基；X选自＝O、-OH和-H；Y选自＝S和-SR₈，其中R₈为氢或者C_1-6烷基；和键(a)、(b)和(c)各自独立地为双键或单键，然而，条件是键(a)和键(b)不同时为双键。
“Nec-1b化合物”指式(VIII)-(XV)中一种的化合物。
式(VIII)的化合物具有下述结构：

其中X代表O；Y代表S；G代表O或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)2、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、甲基、甲氧基、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基；R₈代表低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
式(IX)的化合物具有下述结构：

其中X代表O；Y代表NR₈；G代表O或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、甲基、甲氧基、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基；R₈代表低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n等于从零至五的整数。
式(X)的化合物具有结构：

其中X代表O；Y代表NH；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、甲基、甲氧基、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基，只是当R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₇为H时，R₆不能为甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基；R₈代表H、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
式(XI)的化合物具有下述结构：

其中X代表O；Y代表NH；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、甲基、甲氧基、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基；R₈代表低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
式(XII)的化合物具有下述结构：

其中X代表S，Y代表S；G代表O或NR₇，R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、甲基、甲氧基、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基；R₈代表低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
式(XIII)的化合物具有下述结构：

其中X代表S；Y代表NR₈；G代表O或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、甲基、甲氧基、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基；R₈代表低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
式(XIV)的化合物具有下述结构：

其中X代表S；Y代表NH；G代表O或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OR₈、F、Cl、BR、I、N(R₈)₂、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺、哌嗪、低级烷基和取代的低级烷基，除了甲基和甲氧基之外；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基，只是当R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₇为H时，R₈不能为甲基；R₈代表H、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
式(XV)的化合物具有下述结构：

其中X代表S或O；Y代表S、NH或NR₈；G代表O或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；R₄代表H、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基、胺、哌嗪、低级烷基和取代的低级烷基；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H或低级烷基；R₈代表H、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、烯基、炔基、杂芳基或取代的杂芳基；R₉、R₁₀、R_9’和R_10’各自独立地代表H、F、Cl、Br、I、低级烷基、取代的低级烷基或三至六元环烷基或包括C_n和/或C_n’的取代的环烷基；n和n′等于从零至五的整数。
“Nec-Ic化合物”指不是Nec-1a化合物的Nec-1b化合物。
“Nec-1d化合物”指不是Nec-1b化合物的Nec-1a化合物。
“Nec-1化合物”指Nec-1a化合物、Nec-1b化合物或式(XVI)的化合物。
式(XVI)的化合物具有下述结构：

其中X₁和X₂各自独立地代表＝S、＝O、＝N、H、R₁₁、SR₁₁、NR₁₁或OR₁₁；Y代表S、NH或NR₈；G代表CH₂、O、SR₇或NR₇；R₁、R₂和R₃各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_6-12芳基、酰基、乙酰基、酰氨基、C_2-9杂芳基；R₄代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、COOH、CO₂R₈、NO₂、NHC(O)R₈、酰基、乙酰基、酰氨基、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_6-12芳基、C_2-9杂芳基、胺或哌嗪；R₅、R₆和R₇各自独立地代表H、OH、OR₈、F、Cl、Br、I、N(R₈)₂、酰基、乙酰基、酰氨基、NO₂、C_1-7烷基、C_2-7烯或C_2-7烯基；R₈代表H、OH、NO₂、F、Cl、Br、I、C_1-7烷基、C_6-12芳基、芳烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-9杂芳基、乙酰基、甲氧基、氨基、酰氨基、酰基或卤素；R₉、R₁₀、R_9’、R_10’各自独立地代表H、OH、F、Cl、B、I、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基或包括C_n和/或C_n’的三至六元环烷基，或R₉和/或R₁₀可以不存在；R₁₁代表H、OH、NO₂、F、Cl、Br、I、乙酰基、甲氧基、氨基、酰氨基、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基或酰基；n和n′各自为从零至五的整数，包括端值；n″为0或1；和键(a)、(b)和(c)各自独立地为单键或双键，条件是键(a)和键(b)不同时为双键。示例性的酰基为：

在一个实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₉和R₁₀各自为氢；R₆为甲基；n为1；n′和n″各自为0；X₁为＝O；X₂为＝S；Y和G各自为-NH；键(a)为双键；和键(b)和(c)各自为单键。
在另一个实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₅、R₉和R₁₀各自为氢；R₄为甲基或卤素；R₆为甲基；n为1；n′和n″各自为0；X₁为＝O；X₂为＝S；Y和G各自为-NH；键(a)为双键；和键(b)和(c)各自为单键。
在另一个实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₅、R₉和R₁₀各自为氢；R₄为氢、甲基或卤素；R₆为甲基或氢；n为1；n′和n″各自为0；X₁为＝O；X₂为＝O；Y和G各自为-NH；键(a)为双键；和键(b)和(c)各自为单键。
“Nec-1e化合物”指既不是Nec-1a化合物也不是Nec-1b化合物的Nec-1化合物。
“Nec-2a化合物”指式(XVII)或(XVIII)的化合物。
式(XVII)的化合物具有下述结构：

其中X₁和X₂各自独立地选自＝O、-OH和-H；R₁选自氢和羟基；R₂选自氢、硫酸根、硝基和卤化物；和键(a)为单键或双键。式(XVIII)的化合物具有下述结构：

其中R各自独立地选自H或CH₃；键(a)为单键或双键；键(b)为单键或双键；和X选自＝O、-OH和-H。
“Nec-2化合物”指Nec-2a化合物或式(XIX)的化合物。
式(XIX)的化合物具有下述结构：

其中R₁、R₂、R₃、R₄和R₅各自独立地代表H、OH、SO₂、NO₂、F、Cl、Br、I、酰基、乙酰基、烷基、甲氧基、氨基、酰氨基、其中Ra为C_6-12芳基取代基；键(a)为单键或双键；X代表＝O、OH或H；R₆为：

键(b)为单键或双键，条件是当n＝0时，键(b)为单键；Y为O或S；R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地代表H、OH、SO₂、NO₂、F、Cl、Br、I、酰基、乙酰基、烷基、甲氧基、氨基、酰氨基、或其中Ra为C_6-12芳基取代基；和R₁₁代表＝O、OH或H。在一个实施方案中，R₆为：

R₁、R₄、R₅、R₇、R₁₀和R₁₁各自为氢；R₂、R₃、R₈和R₉各自为-CH₃；X为＝O；和键(a)和(b)各自为双键。
在另一个实施方案中，R₆为：

R₁₁和X各自为＝O；R₇和R₃各自为羟基；R₂为硝基；R₉为甲基；R₁、R₄、R₅和R₈各自为氢；和键(a)为双键。
在其它实施方案中，当Nec-2化合物具有下式时：

如果R₁₁为＝O，则X不为＝O；或R₇不为羟基；或R₂不为硝基；或键(a)不为双键。如果X为＝O，则R₁₁不为＝O；或R₇不为羟基；或R₂不为硝基；或键(a)不为双键。如果R₇为羟基，则R₁₁和X不同时为＝O；或R₂不为硝基；或键(a)不为双键。如果R₂为硝基，则R₁₁和X不同时为＝O；或R₇不为羟基；或键(a)不为双键。如果键(a)为双键，则R₁₁和X不同时为＝O或；R₇不为羟基；或R₂不为硝基；或键(a)不为双键。
“Nec-2b化合物”指不是Nec-2a化合物的Nec-2化合物。
“Nec-3a化合物”指式(XX)的化合物：

其中R₁、R₂、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地选自氢、氨基、卤化物和羟基；R₃选自氢和甲基；和键(a)为单键或双键。
“Nec-3化合物”指Nec-3a化合物、式(XXI)的化合物或化合物(1)至(217)中的任一种。
式(XXI)的化合物具有下述结构：

其中Z为键、CH₂、CH₂CH₂、O、S、S(O)、S(O₂)或NR₈；其中R₈为烷基、芳烷基或杂芳烷基；
(a)指示的键可以是单键或双键；
R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地代表氢、一至六个碳原子的烷酰基；一至六个碳原子的烷基；一至六个碳原子的烷氧基；烷氧基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的烷基亚磺酰基；烷基亚磺酰基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的烷基磺酰基；烷基磺酰基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；氨基；一至六个碳原子的氨基烷基；C_6-12芳基；C_7-16芳基烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；C₇或C₁₁芳酰基；叠氮基；一至六个碳原子的叠氮基烷基；甲醛；(甲醛)烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；三至八个碳原子的环烷基；环烷基烷基，其中所述环烷基具有三至八个碳原子，和所述亚烷基具有一至十个碳原子；卤素；一至六个碳原子的卤代烷基；C_2-9杂环；C_2-9(杂环)氧基；C_3-10(杂环)酰基；羟基；一至六个碳原子的羟烷基；硝基；一至六个碳原子的硝基烷基；N-保护的氨基；N-保护的氨基烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；一至六个碳原子的硫烷氧基；硫烷氧基烷基，其中所述烷基和亚烷基独立地具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qCO₂R_A，其中q为零至四，和R_A选自(a)C_1-6烷基，(b)C_6-12芳基，和(c)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qCONR_BRC，其中R_B和RC独立地选自(a)氢，(b)C_1-6烷基，(c)C_6-12芳基，和(d)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qSO₂R_D，其中R_D选自(a)C_1-6烷基，(b)C_6-12芳基，和(c)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qSO₂NR_ER_F，其中R_E和R_F独立地选自(a)氢，(b)烷基，(c)C_6-12芳基，和(d)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；-(CH₂)_qNR_GR_H，其中R_G和R_H独立地选自(a)氢；(b)N-保护基；(c)一至六个碳原子的烷基；(d)二至六个碳原子的烯基；(e)二至六个碳原子的炔基；(f)C_6-12芳基；(g)芳烷基，其中所述亚烷基具有一至六个碳原子；(h)三至八个碳原子的环烷基，和(i)环烷基烷基，其中所述环烷基具有三至八个碳原子，和所述亚烷基具有一至十个碳原子，条件是不存在两个基团通过羰基或磺酰基结合氮原子；C_1-6全氟烷基；C_1-6全氟烷氧基；C₆或C₁₀芳氧基；C_3-8环烷氧基；C_9-14环烷基烷氧基；或C_7-16芳基烷氧基；
R₅为任选取代的C₆或C₁₀芳基或任选取代的C_2-9杂芳基；
R₆为C(O)R₉、C(S)R₉、C(O)OR₉、C(O)_nR₉R₁₀、C(S)_nR₉R₁₀、C(NH)R₉或S(O₂)R₉，其中R₉和R₁₀各自独立地代表H、任选取代的C_1-12烷基、任选取代的C_1-7杂烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；
R₇为H、C_1-6烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_7-16芳烷基、任选取代的C_2-9杂芳基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；和
R₁₅为H、任选取代的C_1-12烷基或任选取代的C_1-7杂烷基；
在一个实施方案中，(a)指示的键为单键。
在一个期望的实施方案中，(a)指示的键为双键。
在另一个实施方案中，Z为键、CH₂CH₂、O、S、S(O)、S(O₂)或NR₈；其中R₈如本文之前定义的。
在另一个实施方案中，R₅为任选取代的C₁₀芳基或任选取代的C_2-9杂芳基。
在另一个实施方案中，R₆为C(O)R₉，其中R₉为任选取代的C_2-12烷基。期望的实例为其中R₉为被增加水溶性的结构部分取代的C_2-12烷基的那些，所述增加水溶性的结构部分比如，例如吗琳基(morpholino)、吗琳基酰胺或吗琳基烷基酯结构部分(例如R₉为-(CH₂)_n-吗琳基、-(CH₂)_nCO-吗琳基-或-(CH₂)_nCO₂(CH₂)₂-吗琳基)；哌嗪基、哌嗪基酰胺或哌嗪基烷基酯结构部分(例如R₉为-(CH₂)_n-哌嗪基，为-(CH₂)_n-N₄-烷基哌嗪基、-(CH₂)_nCO-哌嗪基-、-(CH₂)_nCO-N₄-烷基哌嗪基-、-(CH₂)_nCO₂(CH₂)₂-哌嗪基或-(CH₂)_nCO₂(CH₂)₂-N₄-烷基哌嗪基)，其中n为1至6的整数；羟基(例如1至4个羟基取代基)、C_2-7酰氧基、C_2-7羧酸酯、伯胺、仲胺或叔胺。还期望的是那些包括识别结构部分的烷基取代基，例如生物素结构部分，例如-(CH₂)_nNH-生物素基。
在另一个实施方案中，R₆为C(O)R₉、C(S)R₉、C(O)OR₉、C(O)_nR₉R₁₀、C(S)_nR₉R₁₀或S(O₂)R₉，其中R₉为任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基；和R₁₀为H、任选取代的C_1-12烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基。
在另一个实施方案中，R₆为C(S)R₉、C(O)OR₉、C(O)NR₉R₁₀、C(S)NR₉R₁₀或S(O₂)R₉，其中R₉和R₁₀为如上定义的。
在另一个实施方案中，Z为CH₂；R₁和R₄各自为H；R₂为H、C_1-6烷氧基、C_1-6硫烷氧基、卤素或与R₃一起形成二氧亚甲基(dioxomethylene)或二氧亚乙基；R₃为H、C_1-6烷氧基、C_1-6硫烷氧基、卤素或者与R₂一起形成二氧亚甲或二氧亚乙基；和R₅为
其中
R₁₁、R₁₂和R₁₃各自独立地代表H、C_1-6烷氧基或C_1-6硫烷氧基，其中R₁和R₁₂或R₁₂和R₁₃可以一起形成二氧亚甲基或二氧亚乙基，和R₁₄为H。
在一个期望的实例中，Z为CH₂；(a)指示的键为双键；R₁、R₂和R₄各自为氢；R₃为甲氧基；R₅为4-甲氧基苯环；R₆为甲基；和R₇为H。
在另一个实施方案中，Z为CH₂；(a)指示的键为双键；R₁、R₂和R₄各自独立地选自氢、氨基、卤化物和羟基；R₃为氢或甲氧基；R₅苯环，其在2-、3-、4-、5-和6位的取代基独立地选自：氢、氨基、卤化物和羟基；R₇为H；和R₉为甲基。
在一个期望的实例中，R₁、R₂和R₄各自为H；R₃为甲氧基；R₅为4-氟苯环；R₆为甲基；R₇为H；Z为CH₂；和(a)指示的键为双键。
“Nec-3b化合物”指不是Nec-3a化合物的Nec-3化合物。
“Nec化合物”、“坏死抑制素(necrostatin)化合物”和“坏死抑制素”在本文中可互换地使用，指Nec-1化合物、Nec-2化合物或Nec-3化合物。
“减少坏死”指相对于接受细胞死亡刺激物，例如使细胞接触TNFα或DMSO，而没有接触候选小分子抑制剂的对照细胞而言，坏死的细胞数量减少。优选地，与对照相比，坏死减少10％。更优选地，与对照相比，坏死减少50％。最优选地，与对照相比，坏死减少90％。优选地，通过测定在已接受了候选化合物(比如来自化学库的化合物)的细胞中的ATP水平，并将其与对照细胞中的ATP水平比较来测定坏死的减少。在用候选化合物处理的细胞中坏死被减少，而其中ATP的水平没有如其在对照细胞中的降低得那么多。
“候选化合物”指天然存在或人工衍生的化学品，通过采用本文描述的测定方法来研究其调节坏死水平的能力。候选化合物可包括，例如肽、多肽、合成有机分子、天然存在的有机分子、核苷酸分子及其组分。
“细胞死亡”指由细胞凋亡或者坏死引起的细胞死亡。
本文使用的“坏死”指以细胞ATP消耗为特征的半胱天冬蛋白酶无关性细胞死亡。优选地，相对于仅仅接受赋形剂(例如DMSO)的对照细胞而言，细胞消耗ATP 10％。更优选地，相对于对照细胞而言，细胞消耗ATP50％。最优选地，相对于对照细胞而言，细胞消耗ATP 90％。优选地，通过测定接受了化合物例如zVAD-fmk、DMSO或TNFα的细胞中的ATP水平，并将其与仅仅接受赋形剂的细胞中的ATP水平相比较来测定坏死。在用候选化合物处理的细胞中出现坏死，其中相对于对照细胞，ATP水平降低。
坏死可以是液化的，可影响脂肪或肝组织，且可以是干酪样的或纤维蛋白样的。细胞可能响应局部缺血的细胞损伤或病毒感染而坏死。
“半胱天冬蛋白酶无关性细胞死亡”指当细胞凋亡被防止时出现的细胞死亡。可以通过使细胞接触一定浓度的半胱天冬蛋白酶抑制剂比如zVAD-rmk来防止细胞凋亡，所述浓度足够当细胞受细胞凋亡刺激时存活，所述刺激例如用细胞凋亡促进药物或电离辐射处理。
“细胞凋亡”指特征为下述性质中任何一种的细胞死亡：有核凝结(nuclear condensation)、DNA碎裂、膜起泡或细胞缩水。
“TNFα介导的细胞内信号通路的调节”指响应细胞与TNFα接触，细胞组分之间的信息交流的变化。所述变化可以按其中细胞内的蛋白质相互作用的方式出现或持续，或者按其中蛋白质通过磷酸化或脱磷酸而被改变的方式出现或持续，或者按其中蛋白质与DNA相互作用的方式出现或持续。
“DMSO介导的细胞内信号通路的调节”指响应细胞与DMSO接触，细胞组分之间的信息交流的变化。所述变化可以按其中细胞内的蛋白质相互作用的方式出现或持续，或者按其中蛋白质比如通过磷酸化或脱磷酸被改变的方式出现或持续，或者按其中蛋白质与DNA相互作用的方式出现或持续。
“治疗”指使用药物组合物用于预防和/或治疗的目的。“预防疾病”指预防性治疗还没有患病，但易感染或存在患有特定疾病风险的人群。“治疗疾病”或用于“治疗处理”指对已经患有疾病的患者给药，以改善或稳定该患者的病症的治疗。因此，在权利要求书和实施方案中，治疗为给用药对象用于治疗或预防的目的。
“病症”指具有或感觉到的状况。病症包括，但不限于在表1中列出的。
本文使用的术语“有效的用量”和“有效量”指用于治疗病症，例如表1的病症所需的本发明的化合物的用量。示例性的病症为中枢或周围神经系统的神经变性疾病；视网膜神经元细胞死亡的结果；心肌细胞死亡的结果；免疫系统细胞的细胞死亡的结果；中风；肝病；胰腺疾病；与肾衰竭相关的细胞死亡的结果；心脏、肠系膜、视网膜、肝脏的或大脑局部缺血性损伤；器官储藏期间的局部缺血性损伤；头部创伤；败血症性休克；冠心病；心肌病；骨无血管性坏死；镰状红细胞病；肌肉萎缩；胃肠疾病；结核病；糖尿病；血管改变；肌营养不良；移植物抗宿主反应疾病；病毒感染；克隆氏病；溃疡性结肠炎；哮喘；其中细胞或组织坏死为诱发因素或结果的任何病症；其中细胞增殖、分化或细胞内信号的改变为诱发因素的任何病症；和其中RIP1蛋白质为起作用的因素的任何病症。实施本发明用于治疗或预防性治疗这样的病症所使用的有效量根据给药方式、用药者的年龄、体重和一般健康而变化。最终，主治医师或兽医将确定适当的用量和给药方案。这样的用量被认为是“有效的”用量。
“神经变性疾病”指以神经元细胞死亡为特征的疾病。神经变性疾病的实例包括，但不限于阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脑缺血、克罗伊茨费尔特-雅各布病、基底节钙化症、亨廷顿氏疾病和相关聚谷氨酰胺膨胀疾病(polyglutamine expansion diseases)、路易体疾病、Menke氏疾病、多发性硬化症、中风和威尔逊氏病。
“神经元”指来源于动物神经系统的任何部分的外胚层胚胎来源的细胞。神经元表达良好特征化的特定神经元标记物，其包括神经丝蛋白、MAP2和类型IIIβ-3微管蛋白。神经元包括，例如海马神经元、皮层神经元、中脑多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元、交感神经元、隔膜胆碱能神经元和小脑神经元。
“足够减少坏死的剂量”指当给用药对象给药时将减少坏死的化合物或小分子的用量。优选地，相对于未治疗的患者，所述患者的坏死减少10％。更优选地，相对于未治疗的患者，所述患者的坏死减少50％。最优选地，相对于未治疗的患者，所述患者的坏死减少90％。
“测量坏死”指测量与所述化合物不存在的情况下的细胞(对照细胞)相比较，在化合物存在的情况下，细胞是否通过坏死而死亡。坏死可以通过测量细胞的ATP水平来测量，其中与对照细胞相比较，经历坏死的细胞具有的细胞的ATP减少的水平。坏死也可以通过用活体染料染色例如锥虫蓝来测量，其中发生坏死的细胞将被活体染料染色，没有发生坏死的细胞将不会被所述染料染色。
“药物组合物”指包含本发明的化合物的组合物，配制以有药物可接受的赋形剂，且由政府管理机构批准作为用于治疗哺乳动物中疾病的治疗方案的一部分制备或销售。特别地排除由乙醇或DMSO组成的赋形剂。药物组合物可以被配制成，例如以单元剂型用于口服给药(例如片剂、胶囊、胶囊形片剂、软胶囊或糖浆剂)；用于局部给药(例如呈乳膏剂、凝胶、洗剂或软膏剂)；用于静脉内给药(例如，呈不含微粒栓且包含在适于静脉内使用的溶剂系统中的无菌溶液)；或任何本文描述的其它制剂。
本文使用的术语“药物可接受的盐”指在合理医学判断范围内的盐，其适用于人和低等动物的组织接触，而没有异常毒性、刺激性、过敏反应等，且具有合理的利益/风险比例。药物可接受的盐是本领域所熟知的。例如，S.M Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences，1977，66：1-19中详细描述了药物可接受的盐。所述盐可以在最后分离和纯化本发明的化合物期间原位制备或通过游离碱基团与适当的有机酸分别反应制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、磷酸甘油、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴化物、盐酸化物、氢碘酸、2-羟基乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及非毒性的铵、季铵和胺阳离子，包括，但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
本文使用的术语“药物可接受的酯”表示在体内水解的酯，其包括在人体中易于分解而成母体化合物或其盐的酯。适当的酯基包括，例如来源于药物可接受的脂肪族羧酸的那些，所述脂肪族羧酸特别是链烷酸、烯酸、环烷酸和链烷二羧酸，其中烷基或烯基各自优选地具有不超过6个碳原子。特定的酯的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和丁二酸乙酯。
本文使用的术语“药物可接受的前药”指本发明的化合物的前药以及可能情况下本发明的化合物的两性离子形式，其在合理医学鉴别的范围内，其适用于接触人和低等动物的组织，而没有异常毒性、刺激、变态反应等，且具有合理的利益/风险比例，并且对于它们的预定用途有效。
本文使用的术语“前药”表示在体内通过在血液中水解快速转化成上式母体化合物的化合物。详细地讨论提供在T.Higuchi和V.Stella的Pro-drugs as Novel Delivery Systems，A.C.S.Symposium Series的第14卷，Edward B.Roche主编，Bioreversible Carriers in Drug Design，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987和Judkins等人的Synthetic Communications，26(23)，4351-4367(1996)中，都将其以引用方式引入本文。
本发明的化合物可存在不对称中心或手性中心。本发明包括各种立体异构体及其混合物。本发明化合物的单独的立体异构体是从市售获得的包含不对称或手性中心的起始原料合成制备的，或通过制备对映体化合物的混合物，接着按本领域普通技术人员熟知的拆分来制备的。这些拆分方法的举例为：(1)将称为(+/-)的对映异构体的外消旋混合物结合到手性助剂，通过重结晶或色谱分离得到的非对映体和从助剂中释放光学纯的产物，或(2)直接在手性色谱柱上分离光学对映异构体的混合物。在本文中，对映异构体指定为符号“R”或“S”，取决于所述手性碳原子周围取代基的构型。
本发明的化合物也可存在几何异构体。本发明涉及由碳-碳双键周围的取代基排列导致的各种几何异构体及其混合物，这样的异构体称为Z或E构型，其中术语“Z”代表取代基在碳-碳双键相同面上，术语“E”代表取代基在碳-碳双键相对面上。
本发明所用的化合物包括以任何一种其药物可接受的形式存在的本文描述的，包括异构体比如非对映体和对映异构体、其盐例如酸加成盐或碱加成盐、酯、酰胺、硫酯、溶剂合物，以及本文描述的化合物的外消旋混合物和纯异构体。
本文使用的“A异构体”指Nec-1化合物(例如Nec-1a化合物、Nec-1b化合物、Nec-1c化合物、Nec-1d化合物或Nec-1e化合物)，其中在位置*的立体化学结构如式XXXIX中所示：

例如，R-7-Cl-O-Nec-1为A异构体，如下所示(注意乙内酰脲部分以下述表示法翻转)：

“基本上纯的A异构体”指其中A异构体与B异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
本文使用的“B异构体”指Nec-1化合物(例如Nec-1a化合物、Nec-1b化合物、Nec-1c化合物、Nec-1d化合物或Nec-1e化合物)，其中在位置*的立体化学结构如式XXXX中所示：

“基本上纯的B异构体”指其中B异构体与A异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“(3R，3aR)-rel异构体”(也称为C3/C3a顺式异构体)指Nec-3化合物(例如Nec-3a化合物或Nec-3b化合物)，其中在位置C3和C3a的最低优先级的取代基(例如氢)彼此是顺式的，如式XXII所示。“基本上纯的(3R，3aR)-rel异构体”指其中(3R，3aR)-rel异构体与(3R，3aS)-rel异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“(3R，3aS)-rel异构体”(也称为C3/C3a反式异构体)指Nec-3化合物(例如Nec-3a化合物或Nec-3b化合物)，其中在位置C3和C3a的最低优先级的取代基(例如氢)彼此是反式的，如式XXII所示。“基本上纯的(3R，3aS)-rel异构体”指其中(3R，3aS)-rel异构体与(3R，3aR)-rel异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“(3R，3aR)-对映异构体”指Nec-3化合物(例如Nec-3a化合物或Nec-3b化合物)，其中在位置C3的绝对立体化学结构是R，如式XXII所示，和在位置C3a的绝对立体化学结构为R，如式XXII所示，如通过Cahn-Ingold-Prelog优先规则测定的。“基本上纯的(3R，3aR)-对映异构体”指其中(3R，3aR)-对映异构体与(3S，3aS)-对映异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“(3R，3aS)-对映异构体”指Nec-3化合物(例如Nec-3a化合物或Nec-3b化合物)，其中在位置C3的绝对立体化学结构为R，如式XXII所示，和在位置C3a的绝对立体化学结构是S，如式XXII所示，如通过Cahn-Ingold-Prelog优先规则测定的。“基本上纯的(3R，3aS)-对映异构体”指其中(3R，3aS)-对映异构体与(3S，3aR)-对映异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“(3S，3aR)-对映异构体”指Nec-3化合物(例如Nec-3a化合物或Nec-3b化合物)，其中在位置C3的绝对立体化学结构为S，如式XXII所示，和在位置C3a的绝对立体化学结构是R，如式XXII所示，如通过Cahn-Ingold-Prelog优先规则测定的。“基本上纯的(3S，3aR)-对映异构体”指其中(3S，3aR)-对映异构体与(3R，3aS)-对映异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“(3S，3aS)-对映异构体”指Nec-3化合物(例如Nec-3a化合物或Nec-3b化合物)，其中在位置C3的绝对立体化学结构为S，如式XXII所示，和在位置C3a的绝对立体化学结构是S，如式XXII所示，如通过Cahn-Ingold-Prelog优先规则测定的。“基本上纯的(3S，3aS)-对映异构体”指其中(3S，3aS)-对映异构体与(3R，3aR)-对映异构体的比例为至少10、20、30、100、200或者甚至400的组合物。
“局部缺血”指以低氧状态为特征的心血管病症，通常是由动脉血供应障碍或血流不足导致组织缺氧引起。
“心肌梗死”指以局部坏死为特征的心血管病症，由血液供给障碍引起。
“中风”指由脑中血凝块或出血引起的心血管病症，最常见是由从凝结阻断血管开始的脑内血流中断引起。在本发明的某些实施方案中，术语“中风”指缺血性卒中或出血性卒中。
“创伤”指由暴力、事故、骨折等引起的身体上的任何身体损伤。
Nec-1b化合物的具体定义
下述定义特别地应用于Nec-1b化合物。
术语“烷基”指饱和的脂肪基的基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷(脂环)基、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链上具有12个或更少的碳原子(例如，对于直链C₁-C₁₂，对于支链C₃-C₁₂)，更优选地，6个或更少、并且甚至更优选的是4个或更少的碳原子。同样，优选的环烷基在其环状结构中具有3-10个碳原子，和更优选地，在其环状结构中具有5、6或7个碳。例如，C_1-7杂烷基包括1至6个碳原子和一个或多个杂原子。其它原子数和其它种类的原子可以按类似的方法标示。
除非碳的数量另有说明，本文使用的“低级烷基”指如上定义的烷基，但具有一至十个碳，更优选地在其主链结构中具有一至六个碳原子，并且甚至更优选地在其主链结构中具有一至四个碳原子。同样，“低级烯基″和“低级炔基”具有类似的链长。优选的烷基为低级烷基。在优选的实施方案中，本文指定的烷基取代基是低级烷基。
在本文中，术语“卤素”和“卤代”可互换地使用，指-F、-Cl、-Br或-I；术语“巯基”指-SH；和术语“羟基”指-OH。
术语“甲基”指一价基团-CH₃，术语“甲氧基”指一价基团-CH₂OH。
本文使用的术语“芳烷基”或“芳基烷基”指用芳基取代的烷基(例如芳香基或杂芳基)。
术语“烯基”和“炔基”指长度类似的并且可以用如上所述的烷基取代的不饱和的脂肪基，但其分别包含至少一个双键或三键。
本文使用的术语“芳基”包括5-、6-和7-元单环芳族基，其可包括零至四个杂原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。那些在环结构中具有杂原子的芳基也可称为“芳基杂环”或“杂芳基”。所述芳香环可以在一个或多个环位置被如上所述的取代基取代，所述取代基例如卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸根、亚膦酸根、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环、芳香基或杂芳基部分、-CF₃、-CN等。术语“芳基”也包括具有两个或多个环状环的多环体系，其中两个或多个碳共同邻接两个环(所述环为“稠环”)，其中至少一个环是芳香的，例如，另一个环状环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。
术语邻、间和对分别应用于1，2-、1，3-和1，4-二取代的苯。例如，名称1，2-二甲苯和邻-二甲苯是同义的。
术语“杂环”或“杂环基”或“杂芳基”指3-至10-元环状结构，更优选3-至7-元环，其中环状结构包括一至四个杂原子。杂环也可以是多环。杂环基包括，例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、苯并吡喃、呫吨、吩噻噁、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、二氮杂萘、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧杂环戊烷、四氢噻吩、噁唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺比如氮杂环丁酮类和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯等。所述杂环可以在一个或多个位置被如上所述的取代基取代，所述取代基例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸根、亚膦酸根、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环、芳香基或杂芳基部分、-CF₃、-CN等。
本文使用的各个术语的定义，例如烷基、m、n等，当其在任一个结构中出现超过一次时，规定其定义与在相同结构中其它位置的定义无关。
应当理解“取代”或“被...取代”包括暗含的条件：这样的取代符合取代的原子的化合价和取代基的允许，而且该取代得到稳定化合物，例如其不会自发地进行转化比如重排、环化、消去等。
本文使用的术语“取代的”指包括所有可允许的有机化合物的取代基。在一个宽的方面，所述可允许的取代基包括非环状和环状的、支链的和无支链的、碳环的和杂环的、芳香的和非芳香的有机化合物的取代基。示例性的取代基包括，例本文上述的。对于适当的有机化合物，所述可允许的取代基可以是一个或多个且可以相同或不同，如例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、膦酸根、亚膦酸根、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环、芳香基或杂芳基部分、-CF₃、-CN等。为了本发明的目的，所述杂原子比如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的满足所述杂原子化合价的有机化合物的任何可允许的取代基。本发明不意味着以任何方式受有机化合物的可允许的取代基限制。
本发明的某些化合物可存在特定的几何学或立体异构形式。本发明涉及所有这些化合物，包括顺式和反式异构体、R-和S-对映异构体、非对映体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及其它的其混合物，都落入本发明的范围内。另外不对称的碳原子可以存在取代基比如烷基。所有这样的异构体及其混合物都意味着包括在本发明中。在某些实施方案中，本发明涉及由本文给出的任何结构代表的化合物，其中所述化合物是单一立体异构体。
如果，例如期望特定的本发明的化合物的对映异构体，可以通过如下方法制备：不对称合成或通过用手性助剂衍生化，其中得到分离得到的非对映的混合物和分离所述助剂基团以提供纯的期望的对映异构体。可选地。当所述分子包含碱性功能基比如氨基或酸性功能基比如羧基时，用合适的光学活性酸或碱形成非对映体的盐，然后通过本领域熟知的分步结晶或色谱方法拆分如此形成的非对映体，并接着回收纯对映异构体。
涉及的如上所述的化合物的同等物包括如下化合物：不同的与此相应的，且具有与其相同的一般性质(例如起细胞坏死的抑制剂的作用)，其中具有取代基的一个或多个简单的变化，该变化不会相反地影响该化合物的功效。通常，本发明的化合物可以通过在如例如如下所述的一般反应图示中图解的方法，或其改进，使用易于获得的起始原料、试剂和常规合成过程来制备。在这些反应中，也可能使用变体，其为本身已知的，但本文中没有提及。
为了本发明的目的，化学元素根据元素周期表(CAS版，Handbookof Chemistry and Physics，第67版，1986-87)的封二确定。
非Nec-1b化合物的具体定义
下述定义应用于本文公开的除了Nec-1b化合物之外的所有化合物，因为上述提供了Nec-1b化合物的可选择的定义。
在本发明的非-Nec-1b化合物的一般说明中，取代基中特定类型的原子数通常以范围给出，例如包含1至7个碳原子的烷基或C_1-7烷基。提及这样的范围意味着包括具体的具有在所述特定范围内各个整数原子的基团。例如，1至7个碳原子的烷基包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆和C₇。例如，C_1-7杂烷基包括1至6个碳原子和一个或多个杂原子。其它数量的原子和其它类型的原子可以按类似的方法指示。
本文使用的术语“烷基”和前缀“烷基-”包括直链和支链基团和环状基团，即环烷基。如果没有规定，烷基指C_1-7烷基。环状基团可以是单环或多环，优选地具有3至6个环碳原子，包括端值。示例性的环状基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。所述C_1-7烷基可以是取代的或未取代的。C_1-7烷基包括，但不限于甲基；乙基；正-丙基；异丙基；环丙基；环丙基甲基；环丙基乙基；正丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；环丁基；环丁基甲基；环丁基乙基；正戊基；环戊基；环戊基甲基；环戊基乙基；1-甲基丁基；2-甲基丁基；3-甲基丁基；2，2-二甲基丙基；1-乙基丙基；1，1-二甲基丙基；1，2-二甲基丙基；1-甲基戊基；3-甲基戊基；4-甲基戊基；1，1-二甲基丁基；1，2-二甲基丁基；1，3-二甲基丁基；2，2-二甲基丁基；2，3-二甲基丁基；3，3-二甲基丁基；1-乙基丁基；2-乙基丁基；1，1，2-三甲基丙基；1，2，2-三甲基丙基；1-乙基-1-甲基丙基；1-乙基-2-甲基丙基；和环己基。
“C_2-7烯基”指包含一个或多个双键且具有2至7个碳原子的支链的或无支链的烃基。C_2-7烯基可任选地包括单环或多环环，其中各个环期望地具有三至六个成员。所述C_2-7烯基可以是取代的或未取代的。C_2-7烯基包括，但不限于乙烯基；烯丙基；2-环丙基-1-乙烯基；1-丙烯基；1-丁烯基；2-丁烯基；3-丁烯基；2-甲基-1-丙烯基；2-甲基-2-丙烯基；1-戊烯基；2-戊烯基；3-戊烯基；4-戊烯基；3-甲基-1-丁烯基；3-甲基-2-丁烯基；3-甲基-3-丁烯基；2-甲基-1-丁烯基；2-甲基-2-丁烯基；2-甲基-3-丁烯基；2-乙基-2-丙烯基；1-甲基-1-丁烯基；1-甲基-2-丁烯基；1-甲基-3-丁烯基；2-甲基-2-戊烯基；3-甲基-2-戊烯基；4-甲基-2-戊烯基；2-甲基-3-戊烯基；3-甲基-3-戊烯基；4-甲基-3-戊烯基；2-甲基-4-戊烯基；3-甲基-4-戊烯基；1，2-二甲基-1-丙烯基；1，2-二甲基-1-丁烯基；1，3-二甲基-1-丁烯基；1，2-二甲基-2-丁烯基；1，1-二甲基-2-丁烯基；2，3-二甲基-2-丁烯基；2，3-二甲基-3-丁烯基；1，3-二甲基-3-丁烯基；1，1-二甲基-3-丁烯基和2，2-二甲基-3-丁烯基。
“C_2-7炔基”指包含一个或多个三键且具有2至7个碳原子的支链的或无支链的烃基。C_2-7炔基可任选地包括单环、二环或三环环，其中各个环期望地具有五或六个成员。所述C_2-7炔基可以是取代的或未取代的。C_2-7炔基包括，但不限于，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、5-己烯基-1-炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基；1-甲基-2-丙炔基；1-甲基-2-丁炔基；1-甲基-3-丁炔基；2-甲基-3-丁炔基；1，2-二甲基-3-丁炔基；2，2-二甲基3-丁炔基；1-甲基2-戊炔基；2-甲基-3-戊炔基；1-甲基-4-戊炔基；2-甲基-4-戊炔基；和3-甲基-4-戊炔基。
“C_2-9杂环”或“C_2-9杂芳基”指稳定的5-至7-元单环或7-至14-元二环杂环，其为饱和的、部分不饱和的或不饱和的(芳香族)，并且其由2至9个碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子组成，且其包括其中任一个上述定义的杂环稠合苯环的任何二环基团。所述杂环基团可以是取代的或未取代的。所述氮和硫杂原子可任选地被氧化。所述杂环可以经由任何能得到稳定的结构的杂原子或碳原子共价连接，例如咪唑啉基环可以是在任何环-碳原子位置或在氮原子位置连接的。在所述杂环中的氮原子可任选地被季铵化。优选地，当所述杂环中的S和O原子总数超过1时，则这些杂原子不能彼此邻接。杂环包括，但不限于1H吲唑、2-吡咯烷酮基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻嗪基、吖啶基、吖辛因基(azocinyl)、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并苯基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、benzimidazalonyl、卡唑基、4aH-卡唑基、b-咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2，3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基(furazanyl)、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、indolenyl、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢氮茚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、二氮杂萘基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑烷基萘嵌间二氮杂苯基(oxazolidinylperimidinyl)、菲啶基、菲咯啉基、phenarsazinyl、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathiinyl、吩噁嗪基、2，3-二氮杂萘基、哌嗪基、哌啶基、蝶啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑基、吡啶并咪唑基、吡啶并噻唑基、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、咔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1，2，5-噻嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、thianthrenyl、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、呫吨基。优选的5至10元杂环包括，但不限于吡啶基、嘧啶基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、四唑基、苯并呋喃基。苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、1H-吲唑基、噁唑烷基、异噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、oxindolyl、苯并噁唑啉基、喹啉基和异喹啉基。优选的5至6元杂环包括，但不限于吡啶基、嘧啶基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基和四唑基。
“C_6-12芳基”指具有由具有共轭电子的碳原子组成的环状体系的芳香基(例如苯基)。所述芳基具有6至12个碳原子。芳基可任选地包括单环、二环或三环环，其中各个环期望地具有五或六个成员。所述芳基可以是取代的或未取代的。
“C_7-14烷芳基”指被芳基(例如苄基、苯乙基或3，4-二氯苯基)取代的烷基，其具有7至14个碳原子。
“C_3-10烷基杂环基”指烷基取代的杂环基团，其具有7至14个碳原子和一个或多个杂原子(例如3-呋喃基甲基、2-呋喃基甲基、3-四氢呋喃基甲基或2-四氢呋喃基甲基)。
“C_1-7杂烷基”指支链的或无支链的烷基、烯基或炔基，其具有1至7个碳原子和1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子。杂烷基包括，但不限于叔胺、仲胺、醚、硫醚、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸根、硫代氨基甲酸根、腙、亚胺、磷酸二酯根、氨基磷酸根、亚磺酰氨基和二硫化物。杂烷基可任选地包括单环、二环或三环环，其中各个环期望地具有三至六个成员。所述杂烷基可以是取代的或未取代的。
“酰基”指具有式R-C(O)-的化学部分，其中R选自C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-6杂环、C_6-12芳基、C_7-14烷芳基、C_7-14烷基杂环基或C_1-7杂烷基。
对于任何上述定义，示例性的取代基包括烷氧基；芳氧基；巯基；烷硫基；芳硫基；卤化物；羟基；氟代烷基；全氟烷基；羟烷基；烷基亚磺酰基；烷基磺酰基；叠氮基；硝基；氧代；羟烷基的酰基衍生物；-CO₂RA；-C(O)_nR_BRC；-SO₂R_D；-SO₂NR_ER_F；和-NR_GR_H；其中RA、RB、RC、RD、RE、RF、RG和RH各自独立地选自H、C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-6杂环、C_6-12芳基、C_7-14烷芳基、C_3-10烷基杂环基、C_1-7杂烷基和酰基。
“卤化物”为指溴、氯、碘或氟。
“氟代烷基”指被氟取代的烷基。
“全氟烷基”指仅仅由碳和氟原子组成的烷基。
“羟烷基”指具有式-(R)-OH的化学部分，其中R选自C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-6杂环基、C_6-12芳基、C_7-14烷芳基、C_3-10烷基杂环基或C_1-7杂烷基。“烷氧基”指式-OR的化学取代基，其中R选自C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-6杂环基、C_6-12芳基、C_7-14烷芳基、C_3-10烷基杂环基或C_1-7杂烷基。
“芳氧基”指式OR的化学取代基，其中R为C_6-12芳基。“烷硫基”指式-SR的化学取代基，其中R选自C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-6杂环基、C_6-12芳基、C_7-14烷芳基、C_3-10烷基杂环基或C_1-7杂烷基。
“芳硫基”指式-SR的化学取代基，其中R为C_6-12芳基。
“糖类”指醛糖或酮糖，单糖或二糖或多糖的一部分。糖类包括单糖、氨基葡糖、己醛醣、己酮糖、戊醛糖、戊酮糖、二糖、3-20个糖单元的多糖，和脱氧物及卤化物(例如氟化的)、胺、其烷羧酸盐、硫酸酯和/或磷酸盐衍生物。适当的单糖包括，但不限于一些简单的开环或闭环链糖(L或D构型)中的任一个，典型地具有5或6个碳(戊糖单糖或己糖单糖)和7个碳(庚糖单糖)包括其中环氧原子被碳、氮或硫取代的糖衍生物、其中在单糖上的羟基取代基被氨基取代的氨基糖或在两个相邻碳原子之间具有双键的糖。在本发明的化合物和方法中可以使用的糖类包括，但不限于鼠李糖、葡萄糖、洋地黄毒糖、洋地黄糖、2-脱氧毛地黄糖(diginose)、箭毒羊角拗糖、vallarose、果糖、氨基葡糖、5-硫代-D-葡萄糖、野尻霉素、脱氧野尻霉素、1，5-脱水-D-山梨糖醇、2，5-脱水-D-甘露醇、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧-D-葡萄糖、阿洛糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、岩藻糖醇、岩藻糖、半乳糖醇、山梨醇、艾杜糖醇、来苏糖、甘露醇、左鼠李糖醇、2-脱氧-D-核糖、核糖、核糖醇、核酮糖、鼠李糖、木糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、古洛糖、艾杜糖、果糖、甘露糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、半乳醛、葡萄烯糖、岩藻烯糖、鼠李烯糖、阿拉伯醛、木聚糖、井冈霉烯胺、醋酸PT 141(validamine)、井冈霉醇胺、valiol、valiolon、valienol(井冈霉烯醇)、井冈霉烯酮(valienone)、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰神经氨酸、葡糖酸-D-内酯、半乳糖酸-γ-内酯、半乳糖酸-δ-内酯、甘露糖酸-γ-内酯、D-脱氧-阿卓糖、D-甘露-庚酮糖、D-甘油基-D-甘露-庚糖、D-甘油基-D-葡糖-庚糖、D-allo-庚酮糖、D-脱氧-3-庚酮糖、D-甘油基-D-甘露-庚糖醇和D-甘油基-D-脱氧-庚糖醇等)。期望地，在本发明的化合物中所用的糖类具有下式：

其中R₄₀为F、Cl、CF₃、OH、NH₂、NHR_40A、NR_40BR₄₀C、NHC(O)R_40D、NHC(S)R_40E、NHC(O)OR_40F、NHC(S)OR_40G、NHC(O)_nHR_40H、NHC(S)_nHR_40I、NHC(O)SR_40J、NHC(S)SR_40K或NHS(O)₂R_40L，和其中R_40A、R_40B、R₄₀C、R_40D、R_40E、R_40F、R_40G、R_40H、R_40I、R_40J、R_40K和R_40L独立地代表C_1-7烷基、C_2-7烯基、C_2-7炔基、C_2-6杂环基、C_6-12芳基、C_7-14烷基芳基、C_3-10烷基杂环基或C_1-7杂烷基。
本发明的其它特征和优点将根据下述发明的详细说明和权利要求书而变得显而易见。
附图说明
图1为一组三个示例性的坏死抑制素Nec-1、Nec-2和Nec-3的结构。
图2为一对显示Nec-1选择性抑制CICD的图表。用5ng/ml的不含环己酰胺(A)或含有环己酰胺(CHX)(B)的FasL处理Jurkat细胞以诱发细胞凋亡，或者用5ng/ml FasL、1μg/ml的CHX和100μM的zVAD.fmk诱发CICD(B)。Nec-1(30μM)保护以抗FasL/CHX/zVAD(B)诱发的CICD，但不抗FasL或FasL/CHX(A和B)诱发的细胞凋亡。在用指定的试剂培养24小时后，使用CellTiter-Glo ATP试验测定细胞生存力。值代表相对于没有用FasL处理的对照Jurkat细胞而言的生存力，所述对照Jurkat细胞的生存力值设定为100％生存力。
图3为显示来自CICD的Nec-1保护的L929细胞的图表。用40ng/ml的TNFα和如下指定的试剂之一处理L929细胞72小时：50μM的Nec-1、2μg/ml的Hsp-90抑制剂格尔德霉素、5μM组织蛋白酶B抑制剂Ca-074-Me和5μM的p38抑制剂PD169316。选择这些化合物用于保护它们抗在Jurkat或Balbc 3T3细胞中的CICD。使用ATP-Lite-MATP试验(Packard)测定细胞生存力。值代表相对于缺少TNFα的对照而言的生存力，所述对照的生存力值设定为100％生存力。
图4为显示Nec-1不是抗氧剂的图表。将U937细胞接种在96孔培养板中，并用40ng/ml的TNFα、100μM的zVAD.fmk(TNF+zVAD)处理72小时，或者用250μM的氧化刺激诱导剂甲萘醌和2.5mM的N-乙酰半胱氨酸(NAC)、800U/ml的过氧化物歧化酶(SOD)、1400U/ml的过氧化氢酶、5mM的维生素E(vit.E)、100μM的Nec-1处理24小时。TNFα/zVAD/DMSO或甲萘醌/DMSO空白处理细胞的生存力也显示为(-)。使用ATP-Lite-M ATP试验(Packard)测定细胞生存力。数字代表活细胞的百分数。相对于设定为100％生存力的zVAD或DMSO处理对照标准化该值。
图5为一对显示Nec-1与PARP抑制剂的作用不同的图表。在图5A中，用5ng/ml的FasL、1μg/ml的CHX和100μM的zVAD.fmk和指定浓度的(μM)的PARP抑制剂处理JK细胞。使用ATP试验测定细胞生存力。值代表标准化的活细胞对所述化合物处理的缺乏FasL的细胞的百分比。在图5B中，用指定量的MNNG(mM)和30μM的Nec-1或100μM的DPQ处理FADD不足的JK细胞5小时。使用TP试验测定细胞生存力。值代表标准化的活细胞对所述化合物处理的缺少FasL的细胞的百分比。
图6为一组显示对Nec-1系列的化合物关键性改进的结构。
图7为显示7-Cl-O-Nec-1的剂量依赖性响应曲线的图表。用10ng/ml的人TNFα处理FADD不足的Jurkat细胞36小时，人TNFα诱导CICD。使用CellTiter-Glo ATP试验测定用化合物单独或与TNFα组合处理的细胞的生存力。前者的值用于计算毒性。使用在所述孔中的ATP含量与有和没有TNFα的相同的药物浓度的比例来测定所述化合物的特异性保护。
图8为Nec-1的构效关系(SAR)的一览图。
图9为一对显示7-Cl-Nec-1抑制体内大脑局部缺血的图表。图9A显示了在MCAO模型中，在阻塞前或阻塞后递送7-Cl-Nec-1的梗塞体积的剂量依赖性减少。在两小时的MCAO阻塞开始前5分钟和在再灌注时阻塞停止后立即，通过icv注射4μL的4mM  7-Cl-Nec-1进行阻塞前递送(每次注射2μL)。在MCAO两小时后再灌注时和在再灌注开始后两小时进行阻塞后递送(每次注射2μL)。可选地，在阻塞两小时后再灌注时，使用蠕动泵(输注)icv连续地输注20μl的所述化合物的溶液。在阻塞后，允许动物恢复24小时，处死、摘除大脑、固定、切开，并根据切片的2，3，5-三苯基四唑化氯生存力染色确定梗塞体积。也评分动物行为(参见插页)。在每个处理组中，分析至少六只动物。对比赋形剂，**-P＜0.05。误差线反映平均值的误差。在图9B中，在处死动物前，由不知道处理组的研究者评价动物行为并评分3(最差)至0(无缺点)。在每个处理组中，分析四至五只动物。阻塞后进行注射。
图10为一组显示体内MCAO的延时处理窗(extended treatmentwindow)和与zVAD.fmk的累加效应的图表和凝胶。在图10A中，在阻塞前5分钟和阻塞后两小时以及阻塞后六小时通过注射化合物来测定LDN-53064(7-Cl-Nec-1)的治疗窗。图10B显示了在病灶局部缺血后，LDN53064和zVAD.fmk对梗塞面积的累加效应。用管腔内细丝技术(intraluminal filament techniques)使异氟烷麻醉的SV-129小鼠的大脑中动脉(MCA)瞬时阻塞两小时。在局部缺血后两小时或六小时，i.c.v注射LDN53064(4mM)和zVAD.fmk(160ng)(n＝16)的混合物溶液或单独的zVAD.fmk(n＝16)或等量(4μl)的赋形剂(n＝8)。MCA阻塞后二十四小时，用大脑切片TTC染色测定梗塞面积。图10C显示了在两小时MCAO后的堵塞前两小时和五分钟，心室内的zVAD.fmk和或不和7-Cl-Nec-1。在再灌注后三小时采集大脑，细胞溶解和使来自同一动物的梗塞的(+)或对照(-)大脑半球的蛋白质进行使用抗-活性半胱天冬蛋白酶-3或抗微管蛋白抗体的蛋白质印迹法。
图11为一组显示检测培养细胞的CICD和局部缺血的脑损伤中切割的LC3的凝胶。在图11A中，在30μm的Nec-1存在或不存在下，用100μM的zVAD.fmk或10ng/ml的人TNFα处理L929细胞或FADD不足的Jurkat细胞。使等量的细胞蛋白质进行SDS-PAGE和使用抗-LC3和微管蛋白抗体的蛋白质印迹法。箭头指向LC3II。图11B显示了在瞬时病灶局部缺血后LC3II水平的延迟的提高。用管腔内细丝技术使异氟烷麻醉的SV-129小鼠大脑中动脉(MCA)瞬时阻塞两小时。在MCA后指定的时间收集脑的局部缺血区域和对侧区域，在RIPA缓冲液中细胞溶解，并使等量的总蛋白进行使用抗-LC3和微管蛋白抗体的蛋白质印迹法。图11C类似于图11B，不同在于在堵塞后四和六小时时，给小鼠icv注射2μL的4mM 7-Cl-Nec-1，并在堵塞后八小时收集大脑。
图12为一组显示Nec-1的体内SAR的图表。图12A显示出Nec-1i，一种在乙内酰脲部分缺少甲基的Nec-1的非活性的衍生物，不会在体外抑制CICD。用10ng/ml的人TNFα和指定浓度的Nec-1或Nec-1i处理FADD-不足的Jurkat细胞30小时。使用ATP试验测定细胞生存力。数字代表不存在TNFα的情况下，相应化合物/DMSO处理的细胞的生存力标准化的生存力。图12B显示Nec-1i没有体内神经保护活性。在MCAO前五分钟和MCAO后立即，给小鼠注射4μL的4mM7-Cl-Nec-1和7-Cl-Nec-1i。在阻塞后，允许动物恢复24小时，处死、摘除大脑、固定、切开，并根据切片的2，3，5-三苯基四唑化氯生存力染色确定梗塞体积。在每个处理组中，分析至少五只动物。相对于赋形剂**-P＜0.05。图12C显示在体内，7-Cl-O-Nec-1表现出与7-Cl-Nec-1可比较的活性。在阻塞后四小时和六小时，给小鼠icv注射4μl的4mM7-Cl-Nec-1或7-Cl-O-Nec-1(每次注射2μl)。测定梗塞体积，如显示在图12A中。在每个处理组中，分析至少十只动物。**对比赋形剂-P＜0.05。
图13为显示Nec-1保护抗中LPS诱导的CICD的图表。用10ng/ml的LPS550或100μM的zVAD.fmk和30μM的Nec-1或指定的Nec-1处理小鼠RAW264.7细胞。在24小时后，使用ATP试验测定细胞生存力。值代表标准化的活细胞对对照DMSO-处理细胞的百分比。
图14为一对显示Nec-1保护原代皮层神经元抗氧-葡萄糖缺乏诱导的细胞死亡的图表。在图14A中，在谷氨酸拮抗剂：10μM的CNQX/1μMMK801、30μM Nec-1或如指定的TH-Trp(NeeIi)存在下，使成熟的原代皮层-神经胶质混合培养物进行OGD 90分钟。在所述化合物(除了CNQX/MK801之外)存在下，使细胞再生24小时，并使用MAP2cytoblot测定特定神经元的生存力。值代表标准化的活细胞对所述化合物处理的细胞的百分比，所述细胞保存在含葡萄糖的、非去氧培养基中。**-P＜0.02。在图14B中，在30μM的Nec-1和100μM的zVAD.fmk存在下，使成熟的原代皮层-神经胶质混合培养物进行OGD 90分钟。在所述化合物存在下，使细胞再生24小时，并使用MAP2 cytoblot测定特定神经元的生存力。值代表标准化的活细胞对所述化合物处理的细胞的百分比，所述细胞保存在含葡萄糖的、非去氧培养基中。**-P＜0.04。
图15为显示坏死抑制素减弱人SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞中的MPP⁺细胞毒性的图表。在存在或不存在100μM的zVAD.fmk和30μM的坏死抑制素的情况下，用5mM的MPP⁺处理细胞72小时，接着进行ATP试验。值代表用相应的化合物处理的而没有用MPP⁺处理的对照标准化的细胞生存力。
图16为显示Nec-1保护抗抗淀粉状蛋白-β毒性的图表。在zVAD-fmk和Nec-1存在下，用指定浓度的Aβ25-35处理大鼠海马神经元(E 17)使用ATP试验测定生存力。也使用Aβ1-42获得类似的结果。
图17为一对显示Nec-1抑制AICD的图表。通过用1μg/ml的αCD3和1μg/ml的αCD28抗体(CD4⁺)或100U/ml的小鼠IL-2首次刺激细胞，使原代小鼠CD4⁺和CD⁺8T细胞进行AICD 72小时以产生(CD8⁺)抗体，接着静置在100U/ml的mIL-2中数小时，并在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的如指定的Nec-1存在下，用αCD3和(CD8⁺)或不和(CD4⁺)mIL-2再活化48小时。使用在图17A中的Green(分子探针)(CD8)或碘化丙啶排除(CD4)试验或在图17B中的ATP试验评价细胞生存力。数字代表标准化的活细胞对相应的化合物处理的缺乏αCD3的对照的百分比。
图18为一对显示Nec-1使受半胱天冬蛋白酶抑制作用抑制的CTLs恢复正常活化的图表。在图18A中，在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的Nec-1存在下，用1μg/ml的αCD3和100U/ml的小鼠IL-2刺激CD8⁺细胞96小时。使用FACS分析测定细胞数。将细胞数对未刺激的对照中的细胞数标准化，所述对照中的细胞数设定为100％。在图18B中，在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的Nec-1存在下，用10μM的OVA257-264肽(Bachem)刺激从OT-I小鼠中分离的脾细胞72小时。用αCD8⁺-FITC抗体(Pharmingen)染色细胞，并且通过FACS测定CD8⁺细胞数。将细胞数对未刺激的对照中的细胞数标准化，所述对照中的细胞数设定为100％。通过用碘化丙啶共染色细胞测定死细胞(系)的百分数。
图19为一对显示Nec-1恢复CTL增殖的图表。在图19A中，在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的Nec-1存在下，用1μg/ml的αCD3和100U/ml的小鼠IL-2刺激纯化的CD8⁺细胞48小时，之后向所述培养基中加入[³H]-胸苷另外24小时，接着，在闪烁计数器中分析。值代表针对未刺激的对照增加的倍数。在图19B中，在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的Nec-1存在下，用1μg/ml的αCD3和100U/ml的小鼠IL-2刺激纯化的CD8⁺细胞72小时，之后固定细胞，用碘化丙啶染色，通过FACS测定细胞的DNA含量，和使用ModFit程序包(Verity Software House)测定在细胞周期的不同阶段(显示的)中细胞的含量。
图20为显示Nee-Ii不影响T细胞增殖的图表。在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的Nec-1或Nee-1i存在下，用10μM的OVA257-264肽(Bachem)刺激从OT-I小鼠分离的脾细胞72小时。用αCD8⁺-FITC抗体(Pharmingen)染色细胞，并通过FACS测定CD8⁺细胞数。将细胞数对在未刺激的对照中的细胞数标准化，在对照中的细胞数设定为100％。通过用碘化丙啶共染色细胞测定死细胞(系)的百分数。
图21为显示Nec-1促进B细胞活化的图表。在100μM的zVAD.fmk和或不和30μM的Nec-1或Nec-1i存在下，用10μg/m的LPS和25ng/ml的小鼠IL-4刺激脾细胞72小时。用αB220-FITC抗体(Pharmingen)染色细胞，并通过FACS测定B细胞数。将细胞数对在未刺激的对照中的细胞数标准化，在对照中的细胞数设定为100％。
图22为显示在RIP-不足的Jurkat细胞中，用于完整的激酶和用于恢复坏死样凋亡的死亡域的图表。用下述构建物快速地电穿孔RlP-不足的Jurkat细胞：RIP-FKBP 12₃-Myc(pFR)、RIP(1-580)-FKBP12₃-Myc(δDD)、RIP(1-287)-FKBP12₃-Myc(pKD，仅仅激酶域)和FKBP12₃-Myc(pFpk3)，将编码不同域的RIP稠合至FKBP12-基二聚盒(cassette)。可选地，用pFpk3电穿孔野生型Jurkat细胞。在所有的情况下，将pEGFP载体(Clontech)加入到track电穿孔细胞中。用FasL(5ng/ml)、放线菌酮(1μg/ml)、zVAD.fmk(100μM)和Nec-1(30μM)处理细胞48小时。用碘化丙啶染色细胞，其选择性染色死细胞，并测定各个样品中丧失GFP表达且为PI-阳性的细胞的百分数(死亡，％)。
图23为一组显示Nec-1体外抑制RIP自磷酸化作用的凝胶。图23A显示Nec-1抑制RIP1的自磷酸化作用。基本上如所述的进行RIP激酶试验。简言之，使用琼脂糖-结合的抗-RIP抗体(Santa Cruz Biotech)从WT和RIP-不足的Jurkat细胞中免疫沉淀RIP，并在30℃，在指定量(μM)的Nec-1或Nec-1i存在下，用放射性μ-P³²-ATP培养30分钟。使样品进行SDS-PAGE，并通过放射自显影使～70kDa RIP条带显色。图23B显示Nec-1体外抑制转染的RIP1的自磷酸化作用。用pRIP1-FLAG或空的对照载体转染293T细胞，并使用抗-M2 FLAG珠粒(Sigma)进行免测沉淀。在图23A所示进行体外激酶试验。图23C显示RIP1的自磷酸化作用需要其激酶活性化。将flag-标记的WT的表达构建物或RIP1的激酶-死点突变体(K45R)(RIP KD)转染到293T细胞中，如图23B所示进行免测沉淀，并且如图23A所示进行激酶试验。
图24为一对显示Nec-1缺乏对RIP2自磷酸化作用的影响的凝胶。用RIP-FLAG或RIP2-Myc载体转染293T细胞。使用FLAG或Myc抗体分别免疫沉淀蛋白质，并如图23描述的，在指定量的Nec-1(μM)存在下进行激酶反应。在底部培养板上，使与在激酶反应中所使用的那些可比较的一定量的蛋白质进行SDS-PAGE，并通过考马斯蓝染色使蛋白质量显影。显示了相应于磷酸化的RIP、RIP2、星状物和IgG的主要的条带。
图25显示了Nec-1作为坏死样凋亡抑制剂的鉴别。图25A显示了Nec-1的结构。图25B显示Nec-1对用TNF*和zVAD.fmk处理的U937细胞的细胞死亡的抑制。通过ATP-基生存力试验测定在该培养板和随后培养板中的细胞生存力。数字代表标准化的活细胞对在未处理的对照孔中的那些百分比。其中，误差线代表标准偏差。图25C显示在用FasL-CHX-zVAD.fink处理30小时的Jurkat细胞中，Nec-1和非活性的衍生物Nec-1i细胞保护作用的剂量反应曲线(μM)。数字代表对在不存在FasL的情况下，用相应化合物处理的细胞的生存力标准化的生存力。图25D显示在用二聚物AP20187和zVAD.fmk处理48小时小时后，Nec-1对稳定地表达二聚的Jurkat细胞(Jurkat-FF)中细胞死亡的抑制。数字代表对在不存在二聚物的情况下，用相应化合物处理的细胞的生存力标准化的生存力。而且，也在存在或不存在zVAD.fmk而没有Nec-1的情况下，用AP20187处理对照Jurkat细胞。图25E、图25F和图25H显示Nec-1对BALB/c 3T3(E)、SV40-转化的MEF(F)和L929(H)细胞中细胞死亡的抑制。用TNFα(E、F、H)、zVAD.fmk(E、F)或CHX(F)处理细胞16(F)或24(E，H)小时。数字代表对在不存在TNFα的情况下，用所述化合物处理的细胞的生存力标准化的生存力。图25G显示FADD-不足的Jurkat细胞的Nec-1和Nec-1i细胞保护作用的剂量响应，所述细胞用TNFα处理30小时(参见条件C)。
图26显示Nec-1对坏死样凋亡的所有表现的有效抑制。图26A和图26B显示Nec-1对质膜完整性丧失和线粒体异常的抑制。用FasL-CHX-zVAD.fmk(A)或者用TNFK(B)处理野生型(A)和FADD-不足的(B)Jurkat细胞指定的时间段。当指定时，也用Nec-1处理该细胞24小时。用DiOC₆或用膜联蛋白V和PI染色细胞，并显示了具有低PI和高膜联蛋白V、高PI和高膜联蛋白V、高PI和低膜联蛋白V，和低DiOC₆(可能的低线粒体膜)的细胞的百分数。其中，误差线代表标准偏差。图26C显示了在Sytox试验中Nec-1抑制坏死样凋亡的示例。用AP20187-zVAD.fmk和Nec-1处理Jurkat-FF细胞48小时。值代表对所述化合物处理的缺少二聚物的细胞标准化的活细胞的生存力。可选地，用TNFα-zVAD.fmk和40μM的Nec-1处理BALB/c3T3细胞24小时，或者用FasL-CHX-zVAD.fmk和Nec-1处理Jurkat细胞48小时。图26D和图26E显示了Nec-1在(D)用FasL-CHX-zVAD.fmk处理的Jurkat细胞或(E)用TNFot处理36小时的L929细胞中细胞保护作用的明视野显微镜检查。获得40x放大的明视野图像。图26F显示Nec-1在细胞凋亡或分别用FasL和CHX处理16小时或用TNFα处理6小时的坏死样凋亡Jurkat细胞中作用的电子显微镜检查。显示了代表性的EM图像。箭头指示死细胞。Con指示仅有赋形剂的对照。
图27显示Nec-1的特异性。图27A显示Nec-1对用FasL-CHX处理24小时的细胞凋亡性Jurkat细胞没有细胞保护作用。也显示了没有用Nec-1处理的样品中细胞变化的时间过程。在图26A和图26B中描述的，用DiOC₆或膜联蛋白V和EGFP-PI染色细胞。图27B和图27C显示在用TNFα和CHX(仅仅B)不和(细胞凋亡)或和(坏死样凋亡)zVAD.fmk处理48小时(B)或24小时的U937(B)和BALB/3T3(C)细胞中，Nec-1对坏死样凋亡而非细胞凋亡的选择性抑制。通过ATP试验测定细胞生存力。数字代表对在不存在TNFα的情况下，用相应化合物处理的细胞的生存力标准化的生存力。误差线指示标准偏差。图27D显示选择的Nec-1衍生物的结构。
图28显示在坏死样凋亡中氧化应激和自体吞噬的作用。图28A显示坏死样凋亡与氧化应激诱导的细胞死亡不同。在各种抗氧剂和100μM的Nec-1存在下，用40ng/ml人TNFα和zVAD.fmk处理U937细胞72小时，或者用250μM的甲萘醌处理该细胞24小时。在该培养板和随后培养板中，经由ATP试验测定细胞生存力。数字代表对在不存在TNFα和甲萘醌的情况下，DMSO处理的细胞的生存力标准化的生存力。其中，误差线代表标准偏差。图28B显示在用TNFα和或不和10mM的3MA处理12小时的FADD-不足的Jurkat细胞中自噬体的电子显微镜检测。显示了代表性的图像。图28C显示在分别用TNFα和Nec-1处理8和24小时的L929和FADD-不足的Jurkat细胞中，在坏死样凋亡期间LC3-II的诱导作用。用LC3和微管蛋白的抗体使蛋白质溶胞产物进行蛋白质印迹。计算LC3-II与微管蛋白信号的比例(“比率”)，并对对照样品中的值标准化。图28D显示在用TNFα-zVAD.fmk或FasL-zVAD.fmk和Nec-1处理24小时的BALB/c 3T3细胞中，坏死样凋亡期间LC3-II的诱导作用。可选地，用2μM的雷帕霉素处理细胞。图28E、图28F和图28G显示在BALB/c 3T3(E)、FADD-不足的Jurkat(E)、Atg5^-/-MEFs(F)和beclin-1RNAi-表达的BALB/c3T3(G)细胞中，通过抑制自体吞噬不可能抑制坏死样凋亡。用TNF α-zVAD.fmk和3MA或Nec-1处理细胞24或30(Jurkat细胞)小时。数字代表对在不存在TNFα的情况下，所述化合物处理的细胞的生存力标准化的生存力。在图28H中，通过蛋白质印迹分析beclin-1(“Bec”)和微管蛋白(“Tub”)在图28G中的稳定的细胞种群中的表达。星号显示通过beclin的抗体检测的非特异性条带。
图29为显示Nec-1抑制RIP激酶-诱导的坏死样凋亡的图表。用pEGFP和编码单独的FKBP12基二聚化域(pFpk)或稠合至RIP(pFR)和RIP的激酶域(pFR-KD)的载体快速电穿孔FADD-不足的Jurkat细胞，RIP(pFR)是一种RIP的激酶-非活性的K45M突变体(pFR K45M)，并在6小时后，用二聚物AP 1510和或不和zVAD.fmk和Nec-1处理48小时。通过FACS测定PI-阴性细胞、GFP-阳性细胞的百分数(“生存力，％”)。数字代表对在不存在二聚物的情况下，所述化合物处理的细胞的生存力标准化的生存力。误差线代表标准偏差。
图30显示Nec-1对体内局部缺血性损伤的抑制。图30A显示给药Nec-1而不是Nec-1i减少梗塞体积。本文描述的进行该试验；对于每个处理组，n≥5。其中，误差线代表平均标准误差。在所有培养板中，与赋形剂相比较，^**P＜0.05。图30B显示当阻塞前或阻塞后递送(方法)7-Cl-Nec-1时，梗塞体积的剂量依赖性减少和神经病学评分的改善。显示了注射化合物的贮藏浓度；对于每个处理组，n≥6。在插图中，由不知道处理组的研究者在杀死动物前评价家畜行为，并评分3(最差)至0(合格)；在每个处理组中，n＝4-5。图30C显示在大脑局部缺血期间，7-Cl-Nec-1-不会抑制半胱天冬蛋白酶-3活化。在阻塞前递送条件下，递送zVAD.fmk或7-Cl-Nec-1。在再灌注后三小时，收集大脑，并使用活性半胱天冬蛋白酶-3或微管蛋白的抗体对来自同一动物的损伤的(+)或对照的(-)大脑半球的蛋白质进行蛋白质印迹。计算半胱天冬蛋白酶-3与微管蛋白信号的比例，并将其对相应对照大脑半球的值标准化。图30D显示在体内，7-Cl-O-Nec-1具有与7-Cl-Nec-1可比较的活性。在阻塞后四小时和六小时，给小鼠注射7-Cl-Nec-1或7-Cl-O-Nec-1；在每个处理组中，n＞10。在图30E中，通过在阻塞后两小时、四小时或六小时的两小时MCAO的五分钟前或之后立即，通过注射化合物建立在MCAO模型中的7-Cl-Nec-1的治疗时间窗；在每个处理组中，n≥10。图30F显示了在阻塞后六小时，给药时zVAD.fmk没有神经保护作用。在开始后两小时、四小时或六小时进行化合物的递送；在每个处理组中，n≥8。显示了p值。图30G显示在体内大脑局部缺血期间，LC3-II的延迟诱导作用。在阻塞后指定的时间点采集大脑，并用LC3和微管蛋白的抗体进行蛋白质印迹。显示了LC3-II/微管蛋白的比例。图30H显示在阻塞后四小时和六小时，通过缓释给药7-Cl-Nec-1抑制LC3-II新近诱导作用。在阻塞后八小时，收集大脑，并且如图30G所示分析。
图31显示Nec-1特定地和有效地抑制坏死样凋亡。图31A显示Nec-1特定地抑制用TNFα处理24小时的FADD-不足的Jurkat细胞中坏死样凋亡-相关的细胞大小和形状的改变。显示了前向散射和侧向散射FACS的结果。而且，测定每个样品中PI阴性的活细胞的百分数(±SD值)。图31B显示Nec-1抑制在图31A中处理指定的一段时间的坏死样凋亡FADD-不足的Jurkat细胞中增殖能力的丧失。显示了每个样品中PI阴性的活细胞数量(±SD值)。图31C显示了坏死样凋亡和Nec-1细胞保护作用与细胞周期的显著变化无关。在图31A中描述的处理FADD-不足的Jurkat细胞，并通过PI DNA含量FACS分析来分析细胞周期分布。将使用ModFit软件测定的在细胞周期的不同阶段中细胞百分数(±SD值)概括在表中。图31D显示Nec-1(1)不会在FADD-不足的Jurkat细胞中诱导非特异性细胞毒性。用指定浓度(用log换算，μM)的Nec-1 and Nec-1i处理FADD-不足的Jurkat细胞24小时。使用ATP试验测定细胞生存力。数字代表对相应DMSO处理的细胞的生存力标准化的生存力。误差线指示标准偏差值。图31E显示Nec-1不会显著地影响用所述化合物处理六小时的FADD-不足的Jurkat细胞的形态学。固定细胞，包埋并使用电子显微镜检查分析。显示代表性的图像。图31F显示Nec-1部分地抑制在图31A中处理的坏死样凋亡FADD-不足的Jurkat细胞中活性氧簇(ROS)的增加。用dyhydroethydium(分子探针)染色细胞，并通过FACS分析。显示具有ROS水平增加的细胞的百分数(±SD值)。图31G显示Nec-1不会显著地影响Jurkat细胞中的基因表达。使用Nec-1处理16小时的细胞和来自对照(Cy5)的mRNA和Nec-1(Cy3)样品进行Agilent碎片分析。红点为内标准对照。
图32显示Nec-1抑制多个坏死样凋亡-相关的形态学变化。用TNFα、zVAD.fmk和Nec-1处理Balbc 3T3细胞24小时。固定细胞，并用anti-giantin(Golgi，绿色)/抗-KDEL(ER，红色)抗体(图32A)、抗-β-微管蛋白，绿色)/TO-PRO-3染料(核，蓝色/鬼笔环肽-TRITC(肌动蛋白，红色)(图32B)和抗-细胞色素C(线粒体，红色)/TO-PRO-3(核，蓝色)(图32C)染色。
图33显示7-Cl-Nec-1和zVAD.fmk对体内抑制局部缺血-诱导的神经元死亡的累加效应。在两小时阻塞开始后两小时和四小时，单独或与7-Cl-Nec-1组合进行zVAD.fmk的icv递送。显示个体动物中的梗塞。在每个处理组中，分析至少八只动物。显示p值。
图34A为显示在指定量的抗坏死化合物(4)和(5)的存在下，用Fas配体(5ng/ml)、环己酰胺(1μg/ml)和zVAD(100μM)处理Jurkat T细胞的结果。36小时后，使用ATP试验测定生存力。所述生存力值是相对于缺少Fas配体的样品为基准，所述样品用作100％的生存力对照。图34B为类似在图34A中的图表，其中抗坏死化合物为(19)和(20)。
图35A为显示在zVAD(100μM)和化合物(19)(30μM)存在下，用1mM的MPP+处理SH-S Y5Y细胞的结果。使用ATP试验测定细胞生存力。图35B为类似在图35A中的图表，其中在100μM的淀粉状蛋白-β25-35蛋白质而非MPP+存在下处理细胞。
发明详述
本文描述的是用于治疗多种病症的化合物、药物组合物、药盒、筛选试验和方法。虽然本申请集中在其中细胞或组织坏死是诱发因素或结果的病症，但可以使用本发明的方法治疗在表1中列出的任何病症。现在详细地描述用于实施和使用本发明的技术。
化合物
上述定义的Nec-1化合物、Nec-2化合物和Nec-3化合物用于本发明的组合物、药盒和方法。本发明的化合物可以根据本领域已知的方法合成。示例性的Nec-1、Nec-2和Nec-3化合物的合成方法描述在例如美国专利申请公布No.2005/0119260；美国专利No.6,756,394；Teng等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.15：5039-5044，2005；和Degterev等人，Nat.Chem.Bio.1：112-119，2005，本文将其任一个引入作为参考；和下述实施例中。
每个符合上述定义的任一种的Nec化合物都被认为在本文中清楚地和独立地描述了。
本发明的任何化合物或药物组合物都可以与一套说明一起使用，即形成药盒。
减少坏死的化合物的结构衍生物
可以将鉴别为减少坏死的小分子结构上改性，接着将其用于减少坏死或治疗患有其中发生坏死的病症的患者。例如，可以通过任一种下述方法改性所述小分子：还原脂肪双键；还原脂肪酮；用质子、卤化物或硫酸根取代硝基；还原黄酮环中的C＝O双键；消去结合黄酮环的氧；用羟基取代甲氧基；将羟基和氨基结合至苄基环；还原C＝N双键；消去氟化物或用羟基或其它卤化物将其取代；用烷基取代氢；将羟基、甲氧基、氨基和硝基引入苄基环；还原吲哚的位置2的双键；将双键引入吲哚和乙内酰脲部分之间的连接基；还原或烷基化硫脲部分；还原、烷基化或酰化吲哚氨基；用可变长度的直链和支链烷基和用羟基、甲基或羧基功能基取代乙内酰脲3-甲基；和还原乙内酰脲酮部分。可以通过任一种上述方法或上述方法的不同组合改性减少坏死的化合物。通常用于产生减少坏死的小分子的结构衍生物的方法是有机化学和药物化学领域的技术人员易于了解的。
治疗
根据本发明的治疗可以单独进行或与另外的治疗一起进行，并可以在家、医生的办公室、诊所、医院的门诊部或医院提供。可以使用本发明的化合物和方法治疗在表1中列出的任一种病症，单独存在或组合存在。治疗通常从医院开始，以便医生可以密切地观察到治疗作用和进行任何所需的调整。治疗的持续时间取决于患者的年龄和病症、以及患者对该治疗作出怎样的反应。另外，具有发展为在表1中列出的病症的较大危险的人可以接受预防，以抑制或延迟疾病的症状。
表1

  脓肿  呼吸暂停  心肌病  发绀  晕厥  艾滋病病  毒感染及  相关病症  包括与肾衰竭  有关的细胞死  亡的病症  关节炎  骨疡  巨细胞病  毒感染  疲劳  人疱疹病  毒感染  包括心肌细胞  死亡的病症  曲霉病  LPS诱发  的细胞死  亡  退行性疾  病  发热  人乳头状  瘤病毒感  染  包括免疫系统  细胞的细胞死  亡的病症  窒息  脑缺血  延迟缺血  性脑损伤  纤颤  人T细胞  白血病病  毒感染  包括视网膜神  经元细胞死亡  的病症  哮喘  化学失衡  痴呆  眼睛，毛  发，指甲，  或皮肤真  菌感染  亨廷顿氏  疾病  活化-诱导的  细胞死亡  共济失调  着色芽生  菌病  糖尿病  坏疽  水肿  急性神经变性  萎缩  慢性神经  变性疾病  腹泻  气性坏疽  高血压  急性，潜伏的，  或持续的病毒  感染  无血管形成  性坏死  慢性阻塞  性肺病  头晕  胃肠疾病  低血压  急性神经病  无血管形成  性坏死骨  球孢子菌  病  水肿  遗传疾病  黄疸  腺病毒感染  背痛  绞痛  干性坏疽  移植物抗  宿主反应  疾病  免疫缺陷  疟疾  贝克尔(氏)  肌营养不良  导致细胞  或组织死  亡的病症  迪谢内肌  营养不良  头部创伤  消化不良  AIDS及相关  病症  芽生菌病  充血性心  力衰竭  痢疾  出血性卒  中  感染  血管改变  出血  便秘  消化不良  肝炎病毒  感染性脑
  感染  病  阿尔茨海默病 淋病  惊厥  呼吸困难  乙型肝炎  失眠症  肌萎缩性侧索  硬化症 骨无血管形 成性坏死  咳嗽  水肿  丙型肝炎  中断供血  贫血 恶病质  冠心病  瘦弱  单纯疱疹  病毒感染  局部缺血  关节僵硬 癌症  克罗伊茨  费尔特-  雅各布病  EB病毒感  染  高血压  缺血性大  脑病或损  伤  缺氧症 念珠菌病 (过敏性、皮 肤性、粘膜 表皮性或系 统性)  克罗恩病  面肩胛肱  型肌营养  不良症  组织胞浆  菌病  缺血性大  脑病或损  伤  炭疽致死毒素  诱发的败血症  性休克 心肌梗塞  隐球菌病  基底节钙  化症  人类免疫缺  陷病毒伴发  的痴呆  缺血性心  脏病或损  伤  由于器官储藏  引起的缺血性  损伤 低血压  坏死性溃  疡  物理创伤  斑疹皮肤  甲癣  缺血性肾病或  损伤 腰痛  引起坏死  的肌病的  重病特别  护理  毛孢子菌  病  疮  牙齿腐损  缺血性肝病或  损伤 狼疮  神经变性  疾病  变色性皮  癣(花斑  癣)  痉挛  创伤  缺血性肠系膜  损伤 消瘦  神经系  统疾病  中毒  坏疽形成  外伤性脑  损伤  缺血性坏死 麻疹病毒感 染  走马疳  多聚谷氨  酰胺膨胀  疾病  坏死组织  物  结核病  缺血性神经元  损伤 脑膜炎  脑膜炎眼  真菌病  (内源或  伸展)  Pompe 氏  疾病  孢子丝菌  病  肿瘤  缺血性视网膜 门克斯病  甲癣  原发全身  Steinert氏  溃疡性结
  损伤  性感染  疾病  肠炎  缺血性卒中  湿性坏疽  机会性感  染  瘙痒  发作  胃不适  痒  多因子病  (例如，具有  条件性的真  菌感染的  HIV感染)  耳真菌病  放射病  浅表的感  染  水痘-带状  疱疹病毒  感染  黄疸  多发性硬化  症  疼痛  皮疹  全身性感  染  眩晕  肾病  肌肉萎缩  胰腺疾病  视网膜坏  死  痨症  病毒感染  营养和氧供应  不足  肌营养不良  胰腺炎  (慢性的，  急性的，  无菌性急  性引起坏  死的，和  感染性急  性引起坏  死的)  感冒  心动过速  呕吐  landouzy-Deje  rine肌营养不  良  足分支菌病  乳多空病  毒(JC或  BK)感染  鼻孢子菌  病  肌强直性  白内障  消瘦  路易体疾病  真菌性角膜  炎  副球孢子  菌病  硬化  须癣  Wilson氏  疾病  肢节型肌营养  不良症  心肌梗死  瘫痪  癫痫发作  头癣  接合菌病  肝硬化  先天性肌强  直  帕金森氏  疾病  脓毒症  体癣  肝疾病  肌强直性营  养不良  细小病毒  感染  感染性休  克  股癣  肝纤维化  坏死样凋亡  青霉病  电击  黄癣  瘢痕疙瘩性芽  生菌病  坏死  暗色丝孢  霉病  镰状红细  胞病  掌黑癣
表1中列出的病症的典型亚类病症示于表2、3、4中。
表2
  包括视网膜  神经元细胞  死亡的病症  充血性心  力衰竭  移植物抗宿  主反应疾病  肢节型肌  营养不良  症  先天性肌强  直  镰状红细胞  病  活化-诱导的  细胞死亡  克罗恩病  由于器官储  藏引起的缺  血性损伤  肝硬化  肌强直性营  养不良  斯太纳特  (氏)病  急性，潜伏  的，或持续的  病毒感染  延迟缺血  性脑损伤  缺血性的肠  系膜的损伤  肝纤维化  坏死样凋亡  汤姆森病  贝克尔(氏)  肌营养不良  糖尿病  缺血性的神  经元的损伤  狼疮  引起坏死的  肌病的重病  特别护理  外伤性的脑  损伤  心肌病  迪谢内肌  营养不良  缺血性的视  网膜损伤  肌肉萎缩  胰腺炎(慢  性的，急性  的，无菌急  性引起坏死  的，和感染  性急性引起  坏死的)  溃疡性结肠  炎  慢性阻塞性  肺病  面肩胛肱  型肌营养  不良症  兰-代二氏肌  营养不良  肌营养不  良  蓬珀(氏)病
表3
  包括视网膜  神经元细胞  死亡的病症  冠心病  移植物抗宿  主反应疾病  肝硬化  坏死样凋亡  斯太纳特  (氏)病  活化-诱导  的细胞死亡  克罗伊茨费  尔特-雅各布  病  头部创伤  肝病  坏疽的溃疡  形成  汤姆森病  急性，潜伏  的，或持续  的病毒感染  克罗恩病  由于器官储  藏的缺血性  的损伤  狼疮  引起坏死的  肌病的重病  特别护理  外伤性脑损  伤  爱滋病  延迟缺血性  脑损伤  缺血性肠系  膜损伤  门克斯  病  胰腺疾病  结核病  血管改变  糖尿病  缺血性神经  元损伤  多发性  硬化症  胰腺炎(慢  性的，急性  的，无菌急  性引起坏死  的，和感染  性急性引起  坏死的)  溃疡性结肠  炎  贝克尔(氏)  肌营养不良  迪谢内肌营  养不良  缺血性的视  网膜损伤  肌肉萎  缩  多聚谷氨酰  胺膨胀病  威尔逊(氏)  病  心肌病  面肩胛肱型  肌营养不良  症  兰-代二氏肌  营养不良  肌营养  不良  蓬珀(氏)病  慢性阻塞性  肺病  基底节钙化  症  路易体疾病  先天性  肌强直  视网膜坏死  充血性心力  衰竭  胃肠疾病  肢节型肌营  养不良症  肌强直  性营养  不良  镰状红细胞  病
表4
  脓肿  哮喘  着色芽生  菌病  水肿 出血性卒中  失眠  与肾衰竭有关的  细胞死亡状态  共济失调  慢性神经  变性疾病  干性坏疽 肝炎病毒感 染  供血中断  包括心肌细胞死  亡的病症  萎缩  慢性阻塞  性肺病  迪谢内肌营  养不良 乙型肝炎  局部缺血  免疫系统细胞的  细胞死亡病症  无血管形  成性坏死  球孢子菌  病  痢疾 丙型肝炎  由于器官储  藏的缺血性  的损伤  视网膜神经元细  胞死亡病症  无血管形  成性坏死  骨  绞痛  消化不良 单纯疱疹病 毒感染  缺血性肾病  或损伤  活化-诱导的细  胞死亡  背痛  导致细胞  或组织死  亡的病症  呼吸困难 高血压  缺血性肝病  或损伤  急性神经变性  贝克尔  (氏)肌营  养不良  充血性心  力衰竭  水肿 组织胞浆菌 病  缺血性肠系  膜损伤  急性，潜伏的，  或持续的病毒感  染  芽生菌病  便秘  消瘦 人类免疫缺 陷病毒伴发 的痴呆  缺血性坏死  急性神经病  出血  惊厥  EB病毒感染 人疱疹病毒 感染  缺血性神经  元损伤  腺病毒感染  淋病  咳嗽  面肩胛肱型  肌营养不良  症 人乳头状瘤 病毒感染  缺血性视网  膜损伤  疟疾  骨无血管  形成性坏  死  克罗恩病  晕厥 人T细胞白血 病病毒感染  缺血性卒中  贫血  恶病质  隐球菌病  疲劳 水肿  痒  关节僵硬  癌症  发绀  发热 高血压  黄疸  缺氧症  念珠菌病  (过敏性  的，表皮  的，粘膜皮  巨细胞病  毒感染  纤颤 低血压  营养或氧供  应不足
  肤的，或全  身性) 炭疽致死毒素诱 发的败血症性休 克  心肌梗塞  延迟缺血  性脑损伤  眼睛，毛发，  指甲，或皮肤  真菌感染  黄疸  兰-代二氏肌  营养不良 呼吸暂停  心肌病  痴呆  坏疽  免疫缺陷  肢节型肌营  养不良症 关节炎  骨疡  糖尿病  气性坏疽  消化不良  肝硬化 曲霉病  LPS诱发  的细胞死  亡  腹泻  遗传疾病  感染  肝纤维化 窒息  化学失衡  头晕  移植物抗宿  主反应疾病  感染性脑病  瘢痕疙瘩性  芽生菌病 低血压  先天性肌  强直  副球孢子  菌病  放射病  坏死组织  黑糠疹 腰痛  肌强直性  营养不良  麻痹  皮疹  孢子丝菌病  甲癣 狼疮  坏死样凋  亡  帕金森病  疾病  感冒  斯太纳特(氏)  病  牙齿衰变 消瘦  引起坏死  的肌病的  重病特别  护理  细小病毒  感染  鼻孢子菌病  痈疽  创伤 麻疹病毒感染  神经病  青霉病  硬化  全身性感染  外伤性脑损  伤 脑膜炎  走马疳  暗色丝孢  霉病  癫痫发作  痨症  肿瘤 湿性坏疽  眼真菌病  (内源的或  外源的)  物理创伤  败血症  心动过速  溃疡性结肠  炎 多因子病(例如， 具有条件性的真 菌感染的HIV感 染))  甲癣  毛孢子菌  病  电击  汤姆森病  胃肠紊乱 肌肉萎缩  机会性感  染  变色性皮  癣(花斑  癣)  镰状红细胞  病  须癣  水痘-带状疱  疹病毒感染
  肌营养不良  耳真菌病  中毒  斑疹  发癣  眩晕  足分支菌病  疼痛  蓬珀(氏)  病  疮  体癣  呕吐  真菌性角膜炎  胰腺炎  ((慢性的，  急性的，无  菌急性引  起坏死的，  和感染性  急性引起  坏死的))  原发全身  性感染  痉挛  股癣  消瘦  心肌梗死  乳多空病  毒(JC或  BK)感染  瘙痒  坏疽形成  黄癣  接合菌病
虽然本文描述的任何Nec化合物可用于治疗上表中列出的任何病症，但最好是用Nec-1e化合物、Nec-2b化合物或Nec-3b化合物治疗表1中的病症；用任一种Nec化合物治疗表2中的病症；用Nec-1c化合物治疗表3中的病症；和用Nec-1d化合物治疗表4中的病症。
在某些实施方案中，本发明的化合物和方法可用于治疗任何一种下述疾病：中枢或周围神经系统的神经变性疾病、视网膜神经元细胞死亡的结果、心肌细胞死亡的结果、免疫系统的细胞的细胞死亡的结果；中风；肝病，胰腺疾病、与肾衰相关的细胞死亡的结果；心脏、肠系膜、视网膜、肝脏的或大脑局部缺血性损伤、器官储藏期间的局部缺血性损伤、头部创伤、败血症性休克、冠心病、心肌病、骨无血管性坏死、镰状红细胞病、肌肉萎缩、胃肠疾病、结核病、糖尿病、血管改变、肌营养不良、移植物抗宿主反应疾病、病毒感染、克隆氏病、溃疡性结肠炎、哮喘和任何其中细胞增殖、分化或细胞内信号改变为诱发因素的病症。
示例性的神经变性病症为阿尔茨海默病、亨廷顿氏疾病、帕金森症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、HIV-相关性痴呆、脑缺血、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症、路易体疾病、Menke′s疾病、威尔逊氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病和基底节钙化症。
示例性的肌营养不良或相关疾病为贝克尔氏肌营养不良、迪谢内肌营养不良、萎缩性肌强直、肢节型肌营养不良症、Landouzy-Dejerine肌营养不良、面肩肱肌营养不良(斯太纳特氏病)、先天性肌强直、汤姆森病和蓬珀(氏)病。
肌肉萎缩可能与癌症、AIDS、充血性心力衰竭和慢性阻塞性肺病相关，并且包括重症监护的引起坏死的肌病。
其中细胞增殖、分化或细胞内信号为诱发因素的病症包括癌症和感染，例如病毒(例如急性的、潜伏性的和持续性的)、细菌、真菌或其它的微生物感染。
示例性的病毒为人类免疫缺陷性病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒(HHV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人T-细胞白血病病毒(HTLV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、麻疹病毒、乳多空病毒(JC和BK)、肝炎病毒、腺病毒、细小病毒和人乳头状瘤病毒。
本发明的化合物和方法还可用于提高免疫系统，无论接受治疗患者是否患有免疫妥协性(immunocompromising)病症。例如，Nec化合物可用于免疫期间增强免疫系统的方法中，例如通过作为助剂或通过与助剂混合起作用。
药物组合物和制剂的使用
可以利用本发明的Nec-1化合物、Nec-2化合物或Nec-3化合物制备药物组合物和制剂。本发明的药物组合物是按本领域技术人员已知的方式制备的，例如，利用常规的溶解、冷冻干燥、混合、造粒或调制方法。用于制备制剂的本领域众所周知方法可在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版本，A.R.Gennaro编著，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，and Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，J.Swarbrick和J.C.Boylan编著，1988-1999，Marcel Dekker，New York中找到。
可以将使用本文描述的任何方法作为鉴别治疗表1中任何病症的化合物与药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起以单元剂量形式对患者或动物给药。可以通过药物化学领域中那些已知的任何标准技术制备和分离用于这样的治疗的化合物。适用于在本发明的方法中治疗的示例性的化合物为Nec-1化合物、Nec-2化合物和Nec-3化合物。可以应用常规药物实践来提供适当的制剂或组合物，其用于鉴别的化合物对患有其中出现坏死的疾病的患者给药。可以在所述患者有症状前开始给药。
可以应用任何适当的给药途径。例如，可以将治疗剂直接在预测的细胞死亡事件的部位用药(例如，通过注射剂)或者系统给药(例如，通过任何常规给药技术)。所述化合物给药也可以是非肠道、静脉内、动脉内、皮下、肌内、颅内、眼眶内、眼内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂、经由栓剂或口服给药。治疗制剂可以是液体溶液或混悬液的形式；对于口服给药，制剂可以是片剂或胶囊的形式；和对于鼻内制剂，制剂可以是散剂、滴鼻剂或气雾剂的形式。所述治疗化合物在药物可接受的制剂中的剂量取决于许多因素，包括个体患者的尺寸和健康状态。要递送的剂量可以由本领域技术人员确定。
用于非肠道给药的制剂可以，例如包含赋形剂、无菌水或生理盐水、聚亚烷基二醇比如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制所述化合物的释放。对于减少坏死的其它可能有用的非肠道递送系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可包含赋形剂，例如乳糖，或者可以是水溶液，包括例如聚氧乙烯-9-月桂基乙醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐，或者可以是用于给药的滴鼻剂形式的油溶液，或呈凝胶形式。
本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗本文描述的许多疾病。例如，本文描述的方法使通过坏死通路发生的细胞死亡减少。本发明还提供用于治疗其中发生坏死的疾病的化合物和方法。这些化合物和方法可用于治疗病症比如神经变性疾病、中风、肝病、胰腺疾病、心脏局部缺血或脑损伤或其它局部缺血性损伤、头部创伤、败血症性休克、冠心病、胃肠疾病、结核病、血管改变、病毒感染比如HIV或与病毒感染相关的病症比如AIDS。
本发明的任一种药物组合物的用途的实例包括治疗或改善动物的中枢或周围神经系统、视网膜神经元、心肌或免疫系统细胞中的细胞死亡；治疗或预防动物中的多囊性肾病、肾淀粉样变性、急性肾功能衰竭、环胞菌素A诱导的murin管状上皮细胞死亡、HTV-诱导的肾病或贫血/红细胞生成；保护哺乳动物器官或组织抗由正常血液供给丧失引起的细胞死亡；减少或预防在将其移植到宿主后由于宿主免疫细胞的作用引起的供体器官或组织的细胞死亡；减少或预防体外受精过程中所用的哺乳动物的精子或卵子的死亡；延长哺乳动物细胞系的寿命；治疗或改善哺乳动物的脱发或毛发过早发灰；治疗或改善由于对高水平照射、加热或化学品引起的哺乳动物皮肤损伤；治疗或改善动物的败血症；治疗或改善动物的肝炎；治疗或改善动物的1型遗传性高酪氨酸血症；治疗或改善动物的慢性醇摄取诱导的颊粘膜细胞死亡；治疗或改善动物的放射或紫外线-照射诱导的细胞死亡；治疗或改善烧伤后器官细胞死亡；治疗或改善肠道局部缺血-再灌注后小肠组织损伤；和治疗、改善或预防动物的口腔粘膜炎、胃肠粘膜炎、膀胱粘膜炎、直肠炎、骨髓细胞死亡、皮肤细胞死亡或由癌症的化疗或放疗引起的脱发。
如果需要，用根据如上所述的方法鉴别的化合物的治疗可以与许多用于以细胞死亡为特征的疾病的传统治疗组合，所述传统治疗比如用他克林盐酸化物治疗阿尔茨海默病，或用干扰素α-1a治疗多发性硬化症。
剂量
不考虑选择的给药途径，可以以适当的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物可以按本领域技术人员已知的常规方法制剂成药物可接受的剂型。
所述活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以改变，以便对于特定的患者、组合物和给药方式，获得有效地获得期望的治疗响应的活性成分的用量，而对患者没有毒性。
选择的剂量水平将取决于各种因素，包括本发明施用的特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、施用的特定化合物的排泄或新陈代谢速率、治疗的持续时间、与施用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质、要治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和之前的病史，和其它医学领域众所周知的因素。可以使用每日剂量、每周剂量或每月剂量(或其它时间间隔)。
具有本领域常规技术的医师或兽医可以容易地确定并开处方所需药物组合物的有效量。例如，所述医师或兽医可以以低于获得期望治疗效果所需要的水平开始配药在药物组合物中的本发明的化合物，然后，逐渐增加所述剂量直至获得预期效果。
通常，本发明的化合物的适当的日剂量将为产生治疗效果的最低有效剂量的化合物的用量。这样的有效量将通常取决于如上所述的因素。通常，对于患者，当使用用于标明的作用时，本发明的化合物的剂量将从0.0001至约100mg/kg体重/天改变。优选地，所述日剂量将从0.001至50mg的化合物/kg体重，甚至更优选地从0.01至10mg的化合物/kg体重改变。
联合治疗
如果需要，用Nec化合物治疗可以与用于治疗表1的任一种病症，例如涉及坏死或局部缺血的病症的治疗剂组合。这样的治疗包括外科手术、放射疗法、化疗或一种或多种另外的化合物给药。适于与Nec化合物联合治疗的示例性的化合物描述如下。
本发明的化合物可以与细胞凋亡抑制剂的化合物组合给药，所述细胞凋亡抑制剂即抑制细胞凋亡的化合物，包括，但不限于可逆的和不可逆半胱天冬蛋白酶抑制剂。细胞凋亡抑制剂的实例包括zVAD N-苄氧基羰基-Val-Ala-Asp-(OMe)氟甲基酮)、IETD(N-乙酰基-Ile-Glu-Thr-Asp-al)、YVAD(N-苄氧基羰基-Tyr-Val-Ala-Asp-(OMe)氟甲基酮)、DEVD(N-[2-(6-羟基-3-氧-3H-呫吨-9-基)苯甲酰基]-L-α-天冬氨酰基-L-α-谷氨酰基-N-[(1S)-1-(羧甲基)-3-氟-2-氧丙基]-L-缬氨酰胺)和LEHD(N-乙酰基-Leu-Glu-His-Asp-al)。
在某些实例中，将本发明的化合物与PARP聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂组合给药-PARP抑制剂的非限制性实例包括6(5H)-菲啶酮、4-氨基-1，8-萘二酰亚胺、1，5-异喹啉二醇和3-氨基苯甲酰胺。
本发明的化合物也可以与Src抑制剂组合给药。Src蛋白为在信号转导中起广泛作用的哺乳动物细胞质的酪氨酸激酶。Src抑制剂的实例包括，但不限于：PP1(1-(1，1-二甲基乙基)-1-(4-甲苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)、PP2(3-(4-氯苯基)-1-(1，1-二甲基乙基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺)、虎刺醛(3-羟基-1-甲氧基-2-蒽醌羧醛)和SU-5565。
在某些方面，本发明的方法包括细胞坏死的抑制剂的化合物(例如杂环硫乙内酰脲、乙内酰脲、噁唑烷酮(oxazolidinone)、硫代-噁唑烷酮、嘧啶酮或oxazinanone化合物或其组合)与用于治疗心血管病症的试剂的组合。这样的试剂包括消炎药、抗血栓形成剂、抗血小板剂、纤维蛋白溶解剂、脂质还原剂、直接凝血抑制因子、糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂、结合细胞粘附分子和抑制白细胞结合结合这样的分子的能力的试剂(例如抗细胞粘附分子抗体)、钙离子通道阻滞药、β-肾上腺素能受体阻滞药、环氧合酶-2抑制剂、血管紧张素系统抑制剂及其任意组合。一个优选的试剂是阿司匹林。
抗炎药包括阿氯芬酸；阿氯米松二丙酸盐；阿孕奈德；阿法淀粉酶；安西法尔；安西非特；氨芬酸钠；氨普立糖盐酸化物；阿那白滞素；阿尼罗酸；阿尼扎芬；apazorie；巴柳氮二钠；苄达酸；苯噁洛芬；苄达明盐酸化物；菠萝蛋白酶；溴哌莫；布地奈德；卡洛芬；环洛芬；噌戊唑酮；克利洛芬；丙酸氯倍米松；丁酸氯倍他松；氯吡酸；丙酸氯硫卡松；乙酸可米松；可托多松；地夫可特；地奈德；去羟米松；地塞米松二丙酸盐；双氯芬酸钾；双氯酚酸钠；双醋二氟拉松；二氟米酮钠；二氟尼柳；二氟泼尼酯；地弗他酮；二甲亚砜；羟西奈德；甲地松；恩莫单抗；依诺利康钠；依匹唑；依托度酸；依托芬那酯；联苯乙酸；非那莫；芬布芬；芬氯酸；苯克洛酸；芬度柳；苯吡噁二酮；芬替酸；夫拉扎酮；fiuazacort；氟芬那酸；氟咪唑；醋酸氟尼缩松；氟尼辛；氟尼辛葡甲胺；氟考丁酯；氟甲孕松醋酸酯；氟喹宗；氟比洛芬；氟瑞托芬；丙酸氟替卡松；呋喃洛芬；呋罗布芬；哈西奈德；丙酸卤倍他索；醋酸卤泼尼松；异丁芬酸；布洛芬；布洛芬铝；布洛芬吡啶甲醇；伊洛达普；吲哚美辛；吲哚美辛钠；吲哚洛芬；吲哚克索；吲四唑；醋异氟龙；伊索克酸；伊索昔康；酮洛芬；盐酸洛非咪唑；lomoxicam；氯替泼诺碳酸乙酯；甲氯灭酸钠；甲氯灭酸；二丁酸甲氯松；甲芬那酸；美沙拉嗪；美西拉宗；甲泼尼龙磺庚酯；莫尼氟酯；萘丁关酮；萘普生；萘普生钠；萘普索；尼马宗；奥沙拉嗪钠；肝蛋白；奥帕诺辛；奥沙普秦；羟保泰松；盐酸瑞尼托林；戊聚硫钠；甘油保泰松钠；吡非尼酮；吡罗昔康；肉桂酸吡罗昔康；吡罗昔康乙醇胺；吡丙芬；泼那扎特；普立非酮；普罗度酸；普罗喹宗；普罗沙唑；柠檬酸普罗沙唑；利美索龙；氯马扎利；柳胆来司；沙那西定；双水杨酯；水杨酸酯；血根氯铵；司克拉宗；丝美辛；舒多昔康；舒林酸；舒洛芬；他美辛；他尼氟酯；他洛柳酯；特丁非隆；替尼达普；替尼达普钠；替诺昔康；替昔康；苄叉异喹酮；四氢甲吲胺；硫平酸；替可的松新戊酸酯；托美丁；托美丁钠；三氯氟松；三氟氨酯；齐多美辛；糖皮质激素；和苯酰吡酸钠。
抗血栓形成剂和纤维蛋白溶解剂包括纤溶酶原(经由前激肽释放酶、激肽原、因子XII、XIIIa、纤维蛋白溶酶原前激活剂和组织纤溶酶原活化因子(TPA))的相互作用转化成纤溶酶)链激酶；尿激酶；甲氧苯酰化纤溶酶原-链激酶活化剂复合物；尿激酶原(pro-UK)；rTPA(阿替普酶或活化酶)；rPro-UK；雅激酶；依米那酶；sreptase anagrelidehydrochloride；比伐卢定；达特肝素钠；达那肝素钠；盐酸达唑氧苯；硫酸依非加群；依诺肝素钠；伊非曲班；伊非曲班钠；亭扎肝素钠；瑞替普酶；三苯格雷；华法林；和葡聚糖。
抗血小板剂包括clopridogrel；苯磺唑酮；阿司匹林；双嘧达莫；氯贝丁酯；氨基甲氨吡啶；PGE；胰高血糖素；抗血清素药物；咖啡因；茶碱；己酮可可碱；噻氯匹啶；和阿那格雷。
脂质还原剂包括吉非贝齐、cholystyramine、考来替泊、烟酸、普罗布考、洛伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀和cirivastati。
直接凝血抑制剂包括水蛭素、hirugen、水蛭肽、agatroban、PPACK和凝血酶适体。
糖蛋白Ilb/IIIa受体抑制剂包括抗体和非抗体，且包括，但不限于阿昔单抗(abcixamab)、拉米非班和替罗非班。
钙离子通道阻滞药为一类化学多样的化合物，其对于控制多种疾病具有重要的治疗价值，所述疾病包括一些心血管病症，比如高血压、心绞痛和心律失常(Fleckenstein，Cir.Res.52：13-16(1983)；Fleckenstein，Experimental Facts and Therapeutic Prospects，John Wiley，NewYork(1983)；McCaIl5D.，Curr.Pract.Cardiol.10：1-11(1985))。钙离子通道阻滞药一组通过调节细胞钙离子通道抑制或减慢钙进入细胞的异源性药物。(Remington，The Science and Practice of Pharmacy，NineteenthEdition，Mack Publishing Company，Eaton，Pa.，第963页(1995))。目前所用的和根据本发明有用的钙离子通道阻滞药中的大部分属于三个主要化学组药物：二氢吡啶类比如硝苯地平，苯烷基胺比如维拉帕米，和苯并噻氮类比如地尔硫。根据本发明有用的其它钙离子通道阻滞药包括，但不限于氨力农、氨氯地平、苄环烷、非洛地平、芬地林、氟桂利嗪、伊拉地平、尼卡地平、尼莫地平、perhexylene、戈洛帕米、噻帕米和噻帕米类似物(比如1993RO-11-2933)、安替比林、巴比妥酸盐和肽强啡肽、ω-芋螺毒素和ω-agatoxin及其药物可接受的盐。
β-肾上腺素能受体阻滞剂为一类拮抗心绞痛、高血压和心脏心律失常中儿茶酚胺的心血管作用的药物。β-肾上腺素能受体阻滞药包括、但不限于阿替洛尔、醋丁洛尔、阿普洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、布尼洛尔、卡替洛尔、塞利洛尔、hedroxalol、茚诺洛尔、拉贝洛尔、左布诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、metindol、美托洛尔、metrizoranolol、氧烯洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、普拉洛尔、普拉洛尔、sotalolnadolol、替普洛尔、tomalolol、噻吗洛尔、布拉洛尔、喷布洛尔、美替洛尔、2-(3-(1，1-二甲基乙基)-氨基-2-羟基丙氧基)-3-吡啶基腈HCl、1-丁基氨基-3-(2，5-二氯苯氧基-)-2-丙醇、1-异丙基氨基-3-(4-(2-环丙基甲氧基乙基)苯氧基)-2-丙醇、3-异丙基氨基-1-(7-甲基茚满-4-基氧基)-2-丁醇、2-(3-叔丁基氨基-2-羟基-丙硫基)-4-(5-氨甲酰基-2-噻吩基)-噻唑、-7-(2-羟基-3-叔丁基氨基丙氧基)苯酞。可以使用这些化合物的同分异构混合物或它们相应的左旋或右旋形式。
环氧合酶-2(COX-2)为一种存在于大多数从花生四烯酸生成各种前列腺素和血栓烷的组织中的酶复合体。许多选择性的COX-2抑制剂是本领域已知的。这些包括，但不限于在如下美国专利中描述的：Nos.5,474,995、5,521,213、5,536,752、5,550,142、5,552,422、5,604,253、5,604,260、5,639,780、5,677,318、5,691,374、5,698,584、5,710,140、5,733,909、5,789,413、5,817,700、5,849,943、5,861,419、5,922,742、5,925,631和5,643,933。许多上述鉴别的COX-2抑制剂是选择性COX-2抑制剂的前药，并且通过在体内转化成活性和选择性COX-2抑制剂发挥其作用。从上述鉴别的COX-2抑制剂前药形成的活性和选择性COX-2抑制剂详细描述在PCT/WO95/00501、PCT/WO95/18799和美国专利No.5,474,995中。考虑到美国专利No.5,543,297的教导，本领域普通技术人员将能确定一种药剂是否是选择性的COX-2抑制剂或COX-2抑制剂的前体。
血管紧张素系统抑制剂能够干扰血管紧张素II的功能、合成或分解代谢。这些药剂包括，但不限于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂、激活血管紧张素II的分解代谢的药剂和抑制血管紧张素II最终由其衍生的血管紧张素I合成的药剂。所述肾素-血管紧张素系统涉及调节血液动力学及水和电解质平衡。降低血容量、肾灌注压力或血浆中Na⁺的浓度的因素易于活化系统，而增加这些参数的因素易于抑制其功能。
血管紧张素I和血管紧张素II是通过酶的肾素-血管紧张素通路合成的。合成过程是当所述酶肾素对血管紧张素原、血浆中的假球蛋白作用生成十肽血管紧张素I时引发的。血管紧张素I被血管紧张素转换酶(ACE)转化成血管紧张素II(血管紧张素[1-8]八肽)。后者是一种活性增压物质，其已被提及是多种哺乳动物种类例如人类中一些形式的高血压的病原体。
血管紧张素(肾素-血管紧张素)系统抑制剂是起干扰从血管紧张素原或血管紧张素I生成血管紧张素II或干扰血管紧张素II的活性的作用的化合物。这样的抑制剂是本领域普通技术人员所熟知的，包括起抑制参与血管紧张素II最终生成的酶的作用的化合物，包括肾素和ACE。它们也包括干扰血管紧张素II(一旦其生成)的活性的化合物。这样的化合物的种类的实例包括抗体(例如，肾素抗体)、氨基酸及其类似物(包括结合较大分子的)、肽(包括血管紧张素和血管紧张素I的肽类似物)、肾素原相关的类似物等。其中，最有效的和有用的肾素-血管紧张素系统抑制剂为肾素抑制剂、ACE抑制剂和血管紧张素II拮抗剂。在本发明的一个优选的实施方案中，所述肾素-血管紧张素系统抑制剂为肾素抑制剂、ACE抑制剂和血管紧张素II拮抗剂。
血管紧张素II拮抗剂为通过结合血管紧张素II受体和干扰其活性来干扰血管紧张素II的活性的化合物。血管紧张素II拮抗剂是熟知的，包括肽化合物和非肽化合物。大多数血管紧张素II拮抗剂为其中通过用一些其它的氨基酸取代位置8的苯丙氨酸减弱激动剂活性的稍微改性的同源物；可以通过其它减慢其在体内的变性来增加其稳定性。血管紧张素II拮抗剂的实例包括：肽化合物(例如沙拉新，[(San¹)(Val⁵)(Ala⁸)拮抗剂-(1-8)八肽及其相关类似物)；N-取代的咪唑-2-酮(美国专利No.5,087,634)；咪唑乙酸盐衍生物，包括2-正丁基-4-氯-1-(2-氯偶苯酰)咪唑-5-乙酸(参见Long等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.247(1)，1-7(1988))；4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸及类似物衍生物(美国专利No.4,816,463)；N2-四唑β-葡糖苷酸类似物(美国专利No.5,085,992)取代的吡咯、吡唑和tryazoles(美国专利No.5,081,127)；苯基和杂环衍生物，比如1，3-咪唑(美国专利No.5,073,566)；咪唑并稠合的7-元环杂环(美国专利No.5,064,825)；肽(例如美国专利No.4,772,684)；血管紧张素II的抗体(例如美国专利No.4,302,386)；和芳烷基咪唑化合物，比如联苯基-甲基取代的咪唑(例如EP号253,310.，1988年1月20日)；ES8891(N-吗啉乙酰基-(1-萘基)-L-丙氨酰(4，噻唑基)-L-丙氨酰(35，45)-4-氨基-3-羟基-5-环己基戊酰基-N-己酰胺、SankyoCompany，Ltd.，Tokyo，Japan)；SKF 108566(E-α-2-[2-丁基-1-(羧基苯基)甲基]1H-咪唑-5-基[亚甲基]-2-噻吩丙酸，Smith Kline BeechamPharmaceuticals，PA)；氯沙坦(DUP753/MK954，DuPont MerckPharmaceutical Company)；Remikirin(RO42-5892，F.Hoffman LaRocheAG)；A2激动剂(Marion Merrill Dow)和某些非肽杂环(G.D.Searle和Company)。
血管紧张素转换酶(ACE)是一种催化血管紧张素I转化成血管紧张素II的酶ACE抑制剂包括氨基酸及其衍生物，肽包括和三肽及ACE的抗体，该抗体通过抑制ACE的活性从而减少或除去增压物质血管紧张素II形成来干扰肾素-血管紧张素系统。医学上使用ACE抑制剂治疗高血压、充血性心力衰竭、心肌梗死和肾病。用作ACE抑制剂的化合物的分类是已知的，包括酰基巯基和疏基烷酰基脯氨酸类比如卡托普利(美国专利No.4,105,776)和佐芬普利(美国专利No.4,316,906)、羧基烷基二肽比如依那普利(美国专利No.4,374,829)、赖诺普利(美国专利No.4,374,829)、喹那普利(美国专利No.4,344,949)、雷米普利(美国专利No.4,587,258)和培哚普利(美国专利No.4,508,729)、羧基烷基二肽模拟物比如西拉普利(美国专利No.4,512,924)和贝那普利(美国专利No.4,410,520)、膦基烷酰基(phosphinylalkanoyl)脯氨酸类比如福辛普利(美国专利No.4,337,201)和trandolopril。
肾素抑制剂为干扰肾素活性的化合物。肾素抑制剂包括氨基酸及其衍生物、肽及其衍生物和肾素的抗体。作为美国专利主题的肾素抑制剂的实例如下：肽的尿素衍生物(美国专利No.5,116,835)；通过非肽键连接的氨基酸(美国专利No.5,114,937)；二和三肽衍生物(美国专利No.5,106,835)；氨基酸及其衍生物(美国专利Nos.5,104,869和5,095,119)；二醇磺酰胺和亚磺酰(美国专利No.5,098,924)；修饰的肽(美国专利No.5,095,006)；肽基β＝氨酰基氨基二醇氨基甲酸酯(美国专利No.5,089,471)；pyrolimidazolones(美国专利No.5,075,451)；氟和氯他汀类药物或包含肽的statone(美国专利No.5,066,643)；肽基氨基二醇(美国专利Nos.5,063,208和4,845,079)；N-吗琳基衍生物(美国专利No.5,055,466)；胃酶抑素衍生物(美国专利No.4,980,283)；N-杂环醇(美国专利No.4,885,292)；肾素的单克隆抗体(美国专利No.4,780,401)；和多种其它的肽及其类似物(美国专利Nos.5,071,837、5,064,965、5,063,207、5,036,054、5,036,053、5,034,512和4,894,437)。
结合细胞粘附分子并抑制白细胞结合这样的分子的能力的药剂包括多肽药剂。这样的多肽包括根据常规方法制备的多克隆抗体和单克隆抗体。这样的抗体已经是本领域已知的，包括抗-ICAM1抗体以及其它这样的抗体。显著地，本领域熟知的，仅仅一小部分的抗体分子paratrope参与抗体与其抗原决定基的结合(一般而言，参见Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology，Wiley &Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)Essential Immunology，第7版，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。例如，所属pFc′和Fc区域是补体级联的但不参与抗原结合的效应物。一种pFc′区域被从其中酶切或生成不含pFc′区域的抗体，称为F(ab′)₂片段，保持完整抗体两个抗原结合位点。类似地，一种pFc′区域被从其中酶切或生成不含Fc区域的抗体，称为Fab片段，保持完整抗体分子的一个抗原结合位点。进一步地，Fab片段由共价结合的抗体和表示为Fd的一部分抗体重链组成。所述Fd片段为抗体专一性的主要决定子(单个Fd片段可能与至多十个没有改变抗体专一性的不同轻链相关)，并且Fd片段保持独立的抗原决定基-结合能力。
在抗体的抗原-结合部分内，本领域熟知的，存在互补决定区(CDRs)，其直接与抗原的抗原决定基作用，和框架区(Frs)，其保持互补位的三级结构(一般而言，参见Clar，1986；Roitt.1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链两者中，存在分别由三个互补决定区(CDR1至CDR3)分开的四个框架区(FR1至FR4)。所述CDRs，特别是CDR3区，更特别是重链CDR3，主要负责抗体专一性。
现在本领域众所周知可以用异种特异性抗体的同种的相似域置换哺乳动物抗体的非-CDR区域，同时保持原抗体的epitopic特异性。这在发展和使用“人化的”抗体中是最清楚显然的，其中将非人CDRs共价连接至人FR和/或Fc/pFc′区域以制备功能性抗体。因此，例如PCT国际公布号WO92/04381教导制备和使用人化的鼠科RSV抗体，其中至少一部分鼠科的FR区域已经被人来源的FR区域置换。这样的包括具有抗原-结合能力的完整抗体的片段的抗体通常称为“嵌合体的”抗体。
因此，本领域普通技术人员显而易见的是，本发明也提供F(ab′)₂、Fab、Fv和Fd片段；嵌合体的抗体，其中Fc和/或Fr和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源的人或非人序列置换；嵌合体的F(ab′)₂片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源人或非人序列置换；嵌合体的Fab片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源人或非人序列置换；和嵌合体的Fd片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域已经被同源人或非人序列置换。本发明也包括所谓的单链抗体。
因此，本发明包括特异性结合细胞粘附分子的多种大小和类型的多肽。这些多肽还可以是从非抗体技术的来源衍生的。例如，这样的多肽结合剂可以通过肽库简并提供，所述库可以在溶液中容易地制备，其为固定的形式或者如噬菌体展示库。还可以合成包含一种或多种氨基酸的肽的组合库。进一步可以合成类肽和非肽合成性部分的库。
噬菌体展示可能在鉴别根据本发明有用的结合肽中特别有效。简言之，人们使用常规方法由4至约80个氨基酸残基制备噬菌体库(使用例如m13、fd或λ噬菌体)展示插入片段。所述插入片段可代表例如完全简并的或biased array。然后，人们可以选择结合细胞粘附分子的载有噬菌体的插入片段(phage-bearing inserts)。可以通过再选择结合细胞粘附分子的噬菌体的几个周期重复该方法。重复周期导致载有噬菌体的特定序列富集。可以进行DNA序列分析以鉴别表达的多肽的序列。可以测定结合细胞粘附分子的序列的最小直线段。人们可以使用包含插入片段的biased library重复该方法，所述插入片段包含所有最小直线段的一部分和在其上游或下游的一个或多个另外的简并残基。也可使用酵母菌的双杂交筛选方法来鉴别结合细胞粘附分子的多肽。因此，可以使用细胞粘附分子或其片段筛选包括噬菌体展示库的肽库，以鉴别和选择结合细胞粘附分子的配偶体的肽。
预防性治疗
在诊断患有表1中的任一项病症的患者中，所述病症例如心脏病(例如冠心病或局部缺血性心脏损伤)或退行性疾病(例如神经变性疾病比如阿尔茨海默病或亨廷顿氏疾病)，可以在出现所述疾病表型前用任何上述药物。特别地，可以通过任何标准剂量和给药途径(如上所述)使用显示出减少坏死的化合物。
本发明的方法可用于减少细胞坏死或治疗任何患者中的本文描述的病症，所述患者例如人类；驯养的宠物，例如犬科动物或猫科动物；或家畜。
格尔德霉素
格尔德霉素为热激蛋白-90(Hsp90)的抑制剂，其参与多种蛋白质的折叠、活化和装配，细胞周期控制和转录调节，所述蛋白质包括参与信号转导的关键蛋白质。格尔德霉素与Hsp90的结合破坏了Hsp90蛋白质的相互作用、抑制了蛋白质的正确折叠并使其对蛋白酶体-介导的破坏敏感。其中，这些蛋白质为许多参与癌症及其它疾病的突变的或过表达的蛋白质，例如p53、Bcr-Ab1激酶、Raf-1激酶、Akt激酶、Npm-Alk激酶p185ErbB2跨膜激酶、Cdk4、Cdk6、Wee1、HER2/Neu(ErbB2)和可诱导缺氧的因子-1α(参见，例如，美国专利No.6,887,993)。格尔德霉素为一种熟知的天然产物，例如可通过培养产生生物体的吸水链霉菌去势变种NRRL3602获得。格尔德霉素衍生物可以通过化学改性格尔德霉素半合成性制备。
任何一种在表1中列出的病症，例如涉及细胞坏死或局部缺血的病症，都可以使用格尔德霉素或其衍生物单独或与一种或多种Nec化合物组合来治疗。格尔德霉素及其衍生物描述在例如美国专利6,887,993、6,875,863、6,872,715、6,870,049、6,855,705、6,852,496、4,261,989和3,987,035中。
筛选鉴别候选化合物
减少细胞坏死的化合物的鉴别
在细胞接受初始攻击后，可以激活一个或两个细胞死亡的apoptotis或坏死机理。在本发明中，集中于坏死通路。使用几种化学攻击来诱导细胞死亡，包括暴露于肿瘤坏死因子α(TNFα)和β-淀粉状蛋白质。还使用了多种细胞类型，包括人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人Jurkat T细胞。为了阻断细胞凋亡的机理，提供了一种常规半胱天冬蛋白酶抑制剂Cbz-缬氨酸-天冬氨酰基-氟甲酮(zVAD-fmk，Polverino和Patterson，J.Biol.Chem.272：7013-7021，1997)。该化合物抑制所有的半胱天冬蛋白酶，因此破坏细胞凋亡通路。任何形成的细胞死亡都被认为是由坏死机理引起。在给药细胞zVAD-fmk和TNFα至细胞后，将试验化合物应用于所述细胞以尝试拯救它们。因此，使用该试验设计发现能恢复细胞生存力的化合物为坏死通路的抑制剂。
例如，在一个方法中，将zVAD-fmk以高浓度(例如5×10⁵或7.5×10⁵细胞/ml)加入到细胞培养基中，该浓度能使所述细胞响应zVAD-fmk/TNFα进行坏死。将候选分子，例如来自化学品库的化合物以可变浓度加入到所述细胞中，然后，将所述细胞暴露于TNFα，所述化学品库例如来自ChemBridge Research Laboratories，San Diego，CA)的化合物库。
然后，例如通过测定暴露于zVAD-fmk/TNFα的细胞的细胞的ATP水平来测定处理的细胞出现的坏死(Crouch等人，J.Immunol.Methods160：81-8，1993；et al.Storer等人，Mutat.Res.368：59-101，1996；和Cree等人，Toxicol.In Vitro 11：553-556，1997)。将在该候选分子存在下的坏死水平与在不存在该候选分子，所有的其它因素(例如细胞类型和培养条件)相同下的坏死水平进行比较。zVAD-fmk在本发明中的重要性是阻断可能由细胞凋亡发生的细胞死亡，以便可以完全暴露坏死引起的细胞死亡。
在第二种方法中，可以将细胞暴露于减少坏死的候选人分子，同时，将其暴露于zVAD-fmk或TNFα。在第三种方法中，可以首先将细胞暴露于zVAD-fmk和TNFα，然后暴露于候选化合物。如上所述测定每个这些方法之后发生的坏死的水平。
候选分子对细胞死亡刺激物例如TNFα或DMSO诱导的坏死的作用还可以通过其它方法，例如活体染料染色、使用染料比如锥虫蓝或吖啶橙/菲啶溴红来测定。
减少坏死的化合物可以是纯的或基本上纯的，或者可以是化合物的混合物比如化合物池的一个组分。在一个化合物的混合物的试验中，测定坏死的发生对抗逐渐减少的化合物池的亚型(例如，通过标准纯化技术比如HPLC或FPLC制备)，直到单个化合物或最少量的有效化合物被证实能减少坏死。认为促进zVAD-fmk/TNFα诱导的坏死减少的分子对本发明特别有用；可以使用这样的减少坏死的治疗剂，所述患者患有其中发生坏死的病症，比如神经变性疾病。
可以进一步在动物模型中试验在体外系统中通过如上所述的方法发现的有效地减少例如zVAD-fmk/TNFα诱导的坏死的化合物。特别有用的动物模型包括细胞死亡、大脑局部缺血或心脏损伤或其它局部缺血性损伤、头部创伤、神经变性疾病、冠心病和败血症性休克的小鼠和大鼠模型。这样的模型的实例包括SOD或亨廷顿氏疾病基因转基因小鼠及其它已知的模型，比如由Li等人，Hum.MoI.Genet.8：1227-12236，1999；Levine等人，Neurosci.Res.58：515-532，1999；Vukosavic等人，J.Neurochem.73：2460-2468，1999；Gruney，J.Neurol.Sci.152suppl.1：S67-73，1997；Deshmukh等人，Am.J.Physiol.273(4Pt 1)：C1130-1135，1997；和Isibashi等人，J.Immunol.163：5666-5677，1999.描述的。在体内模型中证实具有减少坏死的能力的化合物可用作抑制坏死的治疗剂，视情况而定。
减少zVAD-fmk/DMSO-诱导的细胞坏死的化合物的鉴别
基本上如上所述进行用于鉴别减少细胞坏死的化合物的方法，所述细胞坏死是例如由低细胞密度(例如1×10⁵细胞/ml)的zVAD-fmk/DMSO诱导的，只是，坏死的诱导物是zVAD-fmk/DMSO而不是zVAD-fmk/TNFα。
REP1
我们已经发现Nec化合物能够抑制RIP1(受体相互作用蛋白1)(参见例如实施例10)。因此，本发明提供用于筛选鉴别其中RIP1是目标分子的候选化合物。RIP1是一种包含唯一的死亡域的激酶，其显示出与Fas和TNFR1相互作用。
RIP1包含与Ser/Thr和酪氨酸激酶都具有同源性的N-末端激酶域，所述Ser/Thr和酪氨酸激酶是一种C末端死亡域和中间域(IM)。其激酶活性既不是DR-诱发的细胞凋亡所需的，也不是NFκB活化所需的，NFκB活化受RIP的中间域(IM)调节。RIP有助于宽范围的细胞调节实例(cellular regulatory paradigms)和Toll样受体3和4介导的NFκB的诱导，所述细胞调节例包括细胞因子例如TNFα和iL-1β。
RIP1的激酶活性是FasL、TNFα和TRAIL介导的可选择的坏死性细胞死亡通路所必需的，我们随后将所述通路称为坏死样凋亡。我们已经分析了在Jurkat细胞的RIP-不足的克隆中死亡受体诱导的坏死样凋亡所需的RIP的域，而且，由于缺少RIP，所述域对该通路不敏感。如图22所示，不仅RIP的激酶域需要介导Fas配体(FasL)/环己酰胺和zVAD.fmk触发的坏死样凋亡，而且也需要所述分子的死亡域。而且，我们已经发现二聚作用活化的RIP1激酶足够诱导Nec-1可抑制的坏死样凋亡。因此，RIP1的激酶活性表现坏死样凋亡中主要的上行信号步骤。
基于我们的发现，可以进行筛选试验，其中使用RIP1作为目标，并且测定候选化合物结合或相反抑制RIP1的能力。例如，可以使用测定抑制RIP1自磷酸化作用的试验。可选地，在本发明的方法中使用测定候选化合物结合RIP1的试验。结合试验的许多其它变化是本领域已知的，并且可以应用。RIP1结合试验描述在例如美国专利No.6,211,337中，将其引入本文作为参考。
为了鉴别对RIP1特异性的化合物，可以使用多个目标进行筛选试验。例如，对于考虑的候选化合物，可以测定RIP1和RIP2两者，或者RIP1和RIP3两者的结合、自磷酸化作用或目标活性的其它测量，并比较结果(参见，例如实施例10)。对RIP1比RIP2、RIP3发挥更大作用的候选化合物或另外的同系物或其它用于该目的所选择的分子被认为对RIP1是特异性的，并且在本发明的方法中可能是特别期望的。
可选择的筛选试验
可以使用任一种测定蛋白质相互作用或抑制目标分子(例如RIP1)的活性的方法。这样的方法包括，但不限于荧光偏振测定、质谱法(Nelson和Krone，J.MoI.Recognit.，12：77-93，1999)、表面等离子体共振(surface plasmon resonance)(Spiga等人，FEBS Lett.，511：33-35，2002；Rich和Mizka，J.MoI.Recognit.，14：223-228，2001；Abrantes等人，Anal.Chem.，73：2828-2835，2001)、荧光共振能量转移(FRET)(Bader等人，J.Biomol.Screen，6：255-264，2001；Song等人，Anal.Biochem.291：133-41，2001；Brockhoff等人，Cytometry，44：338-248，2001)、生物发光共振能量转移(BRET)(Angers等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：3684-3689，2000；Xu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：151-156，1999)、荧光猝灭(Engelborghs，Spectrochim.ActaA.MoI.Biomol.Spectrosc，57：2255-2270，1999；Geoghegan等人，Bioconjug.Chem.11：71-77，2000)、荧光活化的细胞扫描/分类(sorting)(Barth等人，J.MoI.Biol.，301：751-757，2000)、ELISA和放射免疫测定(RIA)。
候选化合物
通常，在本发明的筛选试验中所用的候选化合物是根据本领域已知的方法从天然产物、合成(或半合成)提取物或化学库两个大库中鉴别的。
另外的方法
抗体和试剂
FasL(以10ng/ml^-1使用)和zVAD.fmk(以100μM使用)来自AlexisBiochemicals。人或小鼠(使用MEF细胞)TNF(以10ng ml^-1使用)来自Cell Sciences.Sytox Green，TO-PRO-3和DiOC₆来自Molecular Probes.Propidhim iodide来自Roche。所述二聚化药剂API510和AP20187(两者都以100nM使用)是从Ariad Pharmaceuticals获得。CHX(以1μgml^-1使用)、抗氧剂(N-乙酰半胱氨酸(NAC)，以2.5mM使用；过氧化物歧化酶(SOD)，800Uml^-1；过氧化氢酶(cat.)，1,400Uml^-1；维生素E(vit.E)，5mM)、鬼笔环肽-TRITC和所有常见的化学品来自Sigma。使用下述抗体：小鼠抗-β-微管蛋白(Stressgen)、兔子抗-LC3、兔子抗-beclin-1(SantaCruz)、兔子抗-giantin(Covance)、小鼠抗-KDEL(Stressgen)和小鼠抗-细胞色素C(Pharmingen)。二级-辣根过氧化酶(HRP)-结合的抗体来自Southern Biotech。二级Alexa 488-结合的抗体来自Molecular Probes；Cy3-结合的抗体来自Jackson ImmunoResearch。
化学筛选
我们使用Multidrop给料器(Thermo Electron)将U937细胞置于384-孔培养板中，在40μl无酚红的RPMI 1640培养基中，每孔含有5,000-10,000个细胞，所述培养基包含100μM的zVAD.fmk和40ngml^-1的人TNFα。我们使用Seiko-基定制的pin递送机器人(Institute ofChemistry and Cell Biology，Harvard Medical School)加入100nl的DiverSetE(在DMSO中的5mg ml^-1，Chembridge)。在72小时后，我们使用发冷光基ATP试验(ATPLite-M，PerkinElmer)评价细胞生存力。我们还将没有用TNFα处理的细胞分散在各个培养板中作为阳性对照。我们从Chembridge购买Nec-1及其它用于单独的再试验的预备用阳性目标(hits)。
细胞生存力试验
我们将细胞接种在96孔培养板中(白色培养板用于发冷光的试验；黑色培养板用于荧光试验；透明培养板用于MTT试验)，在100μl适当的无酚红的培养基中，对于粘附细胞，密度为每孔5,000-10,000个细胞，对于悬浮细胞，每孔20,000-50,000个细胞。在培养后，使用下述方法测定细胞生存力。对于ATP试验，我们使用发冷光-基商业药盒(CellTiter-GIo，Promega或ATPLite-M，PerkinElmer)，并使用WallacVictor II培养板阅读器(PerkinElmer)分析。对于Sytox试验，我们在37℃，用1μM的Sytox Green试剂培养细胞三十分钟，然后进行荧光阅读。接着，我们将5μl的20％Triton X-100溶液加入各孔中，以产生最大的溶胞，并在37℃培养细胞一小时，之后进行第二次阅读。我们计算Triton处理前后值(每个孔中死细胞的百分数)的比例，将其对没有进行细胞毒素刺激的相关对照标准化，如图例所示。对于MTT试验，我们使用CellTiter 96AQ_ueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay药盒(Promega)。对于PI排除试验，我们将2μg ml^-1的PI加入所述培养基，并立即使用FACSCalibur(BD Biosciences)分析样品。对于PI-annexin V试验，我们使用ApoAlert Annexin V-EGFP Apoptosis药盒(Clontech)。对于DioC₆染色，我们在37℃，用40nM的DiOC₆培养细胞三十分钟，洗涤一次，并在FACSCalibur中分析。对于ROS分析，我们在37℃，用5μM的dihydroethidium(分子探针)培养细胞三十分钟，洗涤一次并在FACSCalibur中分析。我们使用Axiovert 200显微镜(Zeiss)获得细胞的明视野图像。
小鼠的短暂局灶性脑缺血
根据“实验动物的护理和使用指南”(National Research Council1996)饲养动物。我们使成年人雄性SV-129小鼠(19-23g；Taconic Farms)自然呼吸2％的异氟烷麻醉，并使用Fluotec 3汽化器(Colonial Medical)将它们饲养在0.8-1％的异氟烷的70％N₂O和30％O₂中。我们用管腔内的8-0尼龙单丝(Ethicon)堵塞左侧MCA，所述尼龙单丝涂有硅酮树脂的混合物(Xantopren，Bayer Dental)和硬化剂(Elastomer Activator，BayerDental)。该过程持续十五分钟，终止麻醉。简言之，两小时后，我们用异氟烷再麻醉动物，并取出所述细丝。在再灌注十八小时后，我们使用小鼠大脑模型(RBM-2000C；Activational Systems)将前脑分成五个冠状(2-mm)切片，并用2％的2，3，5-三苯基四唑化氯(Sigma)染色切片。我们使用图像-分析系统(Bioquant IV，R & M Biometrics)定量梗塞区域，并通过直接加合各自切片的梗塞体积计算梗塞体积。对于药物的给药，我们将7-Cl-Nec-1或其它衍生物溶于在PBS中的4％的甲基-β-环糊精(Sigma)溶液中，并在指定的时间点经由脑室内给药。典型地，我们进行两份2-μl的4mM储备溶液的注射剂(除非另有说明)。对于阻塞前递送，我们在2小时的MCAO阻塞开始前五分钟和停止阻塞后立即、在再灌注时进行注射。对于阻塞后递送，我们在MCAO两小时后再灌注时以及再灌注开始后两小时进行注射。在输注的情况下，我们经三十分钟的时间周期灌注20μl的化合物。在阻塞后注射六小时的情况下，我们注射单一4-μl的剂量。在给药zVAD.fmk的情况下，我们将其加入至Nec-1制剂中，用药总剂量160ng。
细胞培养
我们按Nakagawa等人，Nature 403：98-103，2000的描述制备小鼠胚胎成纤维细胞，并用SV-40-编码逆转录病毒感染来无限增殖。Atg5-/-MEF细胞为之前已经描述的(参见，例如Kuma等人，Nature 432：1032-1036，2004)。
DNA碎片分析
我们使用Poly(A)Purist药盒使来自所述细胞的纯化mRNA倍增。由Harvard Center for Genomics Research进行Agilent DNA碎片分析。
免疫荧光
我们在PBS中洗涤Balbc3T3细胞，在25℃，将所述细胞固定在4％的甲醛中十五分钟，将其在PBS中漂洗两次，和在25℃下，在0.4％的Triton X-100、在PBS中的10％的正常山羊或驴血清(JacksonImrnunoresearch)中透化/阻断30分钟。我们在4℃，用适当的一级抗体(根据制造商的说明，在0.1％的Triton、在PBS中的1％的血清中稀释)培养所述样品十六小时，接着用PBS洗涤三次，并在25℃，用荧光团-结合的二级抗体(在与一级抗体相同的缓冲液中稀释1∶200)培养三十分钟。在用PBS洗涤两次后，我们在25℃，用TO-PRO-3或鬼笔环肽-TRITC(根据制造商的说明在PBS中稀释)染色细胞十分钟，用PBS将它们洗涤一次，并使用ProLong Antifade药盒(分子探针)固定所述样品。我们使用Nikon旋转盘共焦显微镜获得图像，并使用Metamorph软件(Universal Imaging)分析它们。
碘化丙啶DNA含量分析
在适当的处理后，我们洗涤Jurkat细胞一次，将其再悬浮在PBS5中，并通过加入四体积冰冷的100％乙醇固定细胞。细胞保留在冰上一小时，之后，我们弃去固定溶液，在PBS中洗涤细胞一次，将其再悬浮在补充有50μg/ml的PI和5μgml的RNAse A(Sigma)的PBS中，并在37℃，在暗处培养样品十五分钟，然后在FACSCalibur中分析。我们使用ModFit软件(Verity Software House)分析数据。
免疫印迹
我们在20mM的HEPES、pH7.5、150mM的NaCl、1％的TritonX-100、10mM的焦磷酸四钠、100mM的NaF、17.5mM的补充有Complete Mini Protease Inhibitor片(Roche)的β-磷酸甘油缓冲液中溶解细胞。我们使用Bio-Rad蛋白测定试剂测定蛋白质浓度，并使用在附图说明中描述的抗体使等量的蛋白进行蛋白质印迹。在局部缺血大脑样品的情况下，我们解剖皮层的外部损伤区域，将其溶解在RDPA缓冲液(50mM的Tris-HCl，pH8.0，150mM的NaCl，5mM的EDTA，0.1％的SDS，0.5％的脱氧胆酸钠，1％的NP-40，补充有Complete Mini蛋白酶抑制剂)中，并使等量的蛋白质进行蛋白质印迹。使用ScionImage软件(Scion Corporation)定量蛋白质印迹的结果。
Jurkat细胞的电穿孔
分别将pcDNA3-RIP-(1-580)-Fpk3-Myc、pcDNA3-RIP-(1-287)-Fpk3-Myc(pFR-KD)和pcDNA3-RIP-(1-580)-K45M-Fpk3-Myc、没有DD域的编码RIP蛋白、的激酶域和激酶的死突变体RIP融合到三个FKBP12蛋白质的拷贝和对照载体上，pcDNA3-Fpk3-Myc(pFpk)是一类G.Nunez(University of Michigan的慷慨的赠礼。我们使用相应cDNA扩增全长RIP，并将其克隆成pcDNA3-RIP-(1-580)-Fpk3-Myc，替换截短的RIP，生成全长RIP-编码二聚构建物(pFR)。我们借助于QuikChange诱变药盒(Stratagene)使用该构建物产生激酶的死突变体(pFR-K45M)。
为了生成编码FADD二聚暗盒(cassette)的pFF构建物，所述暗盒由36v突变体FKBP 12(Fv2E)后面的豆蔻酰化的信号和FADD的编码区组成，我们分别pC4M-Fv2E质粒(Ariad Pharmaceuticals)和FADDcDNA来PCR-扩增Fv2E和FADD，并将这些片段克隆到pcDNA6载体(Invitrogen)中。
对于电穿孔，我们将20X₁0⁶个FADD-不足的Jurkat细胞再悬浮在1ml的hypoosmolar缓冲液(Eppendorf)中，其中补充有1.25％的DMSO、含有18μg的RIP载体/和2μg的空的pEGFP载体的混合细胞，并使用Gene Pulser II(Bio-Rad)进行电穿孔。我们使细胞静置五至十分钟，然后将它们转移到4ml的RPMI1640培养基中，其中补充有1.25％的DMSO、1％的谷氨酰胺、1％的抗生素-抗霉菌混合物(Invitrogen)和10％的加热-灭活的胎牛血清。三小时后，我们使用Ficoll-Paque(Pharmacia)分离活细胞，将其洗涤一次，并将其再悬浮在包含二聚化试剂API510(Ariad Pharmaceuticals)和如描述的其它化学品的培养基中。在处理指定的时期后，我们向各个样品中加入2μg/ml的PI，并测定有活力的PI-阴性的GFP-表达细胞的百分数。可选地，我们选择在灭菌素(Invitrogen)中表达可二聚化的FADD(JK-FF)的Jurkat细胞的稳定的克隆。
病毒RNAi载体的生成
我们直接地将包含RNAi序列的寡核苷酸连接到pSRP载体中，其是基于pMSCV-puro(Invitrogen)病毒载体，且包含H1促进剂。我们使用公布的鼠科beclin-1的序列(参见例如Yu等人，Science 304：1500-2502，2004)。我们通过将具有质粒的pSRP-基的载体共转染到人HEK293T细胞中产生病毒，所述质粒编码逆转录Gag/Pol和VSV-G蛋白质。我们用每种病毒感染Balbc 3T3细胞三次，接着用嘌呤霉素选择。我们使用稳定的细胞群分析目标蛋白质的表达和细胞生存力。
实施例
提供下述实施例来阐述本发明。这些实施例不应当构成本发明的限制。
实施例1CICD/坏死样凋亡的小分子抑制剂的特征
使用一个已知在人U937细胞中的死亡受体介导的半胱天冬蛋白酶-无关性细胞死亡的实例，我们在384孔format中建立了用于半胱天冬蛋白酶-无关性细胞死亡(CICD)的小分子抑制剂的高通量筛选。在该系统中，在TNFα和zVAD.fmk的存在下，诱导U937细胞进行CICD，并通过ATP-Lite-M试验，一种测定细胞ATP水平的商业发冷光-基试验(Packard)测定细胞死亡的速率。选择U937细胞，因为当在不存在另外的、应激-诱导的致敏刺激物比如CHX下用TNFα/zVAD处理时，这些细胞可以被诱导进行CICD，使得该系统非常适于可靠地鉴别CICD抑制剂。而且，U937细胞的快速混悬生长动力学引起大量细胞的利用，其转化成理想地用于高通量筛选的强信号。选择ATP-Lite-M试验，因为在测定的所有不同的试验系统中，其给出了最稳定的和最强的信号，其对高通量筛选也是决定性的。U937细胞暴露于单独的TNFα导致部分细胞死亡，而用TNFα和半胱天冬蛋白酶抑制剂zVAD.fmk共处理产生细胞死亡量和ATP损失显著增加，与公布的观测值一致。而且，在zVAD.fmk存在下，由细胞凋亡改变的细胞消亡的形态学和细胞收缩、核碎裂、膜起泡至坏死以细胞膨胀、细胞溶质密度增加和质膜完整性早期丧失为特征。使用其它的细胞死亡试验，比如MTT试验(线粒体新陈代谢)和Sytox试验(质膜的渗透性)作为证实筛选可选择的方式，且持续地产生类似于使用ATP-Lite-M试验获得的那些结果，其证实ATP-Lite-M试验可用于准确地测定CICD的程度。在某些随后的分析中，也使用另一个商业ATP试验，Cell-Titer-Glo(Promega)，因为其比ATP-Lite-M试验更敏感，且产生可比较的结果。
使用U937细胞死亡试验筛选从商业来源和组合化学合成获得的约15,000个小分子的不同化学品集合，选择3个具有最高活性的化合物(坏死抑制素)用于进一步分析(图1)。这些化合物Nec-1、Nec-2和Nec-3分别是Nec-1化合物、Nec-2化合物和Nec-3化合物类别(上述定义的)的示例性的成员。
这些Nec化合物抑制CICD的EC₅₀值可变化，但通常在低(sub/low)微摩尔范围内(表5)。在该表中，EC₅₀值代表拯救用TNFα处理36小时的FADD不足的Jurkat细胞中50％的细胞死亡所需的浓度，如通过ATP试验测定的TNFα诱导CICD，具有如下例外：对于Nec-2，该值为使用表达可二聚化的FADD Jurkat细胞获得的，所述细胞用二聚物/zVAD处理36小时，并测定ATP水平。LD50值是基于在不存在TNFα或二聚物的情况下，用所述化合物处理相应Jurkat细胞来计算的。这些化合物中没有一种引起对照健康细胞的ATP水平增加。
表5
  Nec-1  Nec-2  Nec-3  EC₅₀(μM)  0.494  27.3  0.97  LD50(μM)  374  134  143
在许多细胞试验中进一步表征第一个分离的坏死抑制素Nec-1，其显示出最高的坏死抑制活性。为了测定Nec-1的选择性，检验其对阻断细胞凋亡的无能力。Jurkat细胞的Fas-配体诱发的细胞凋亡用pan半胱天冬蛋白酶抑制剂zVAD.fmk保护，而不用Nec-1(图2A)。用FasL和CHX共处理Jurkat细胞也诱发细胞凋亡，其不能用Nec-1抑制(图2B)。在zVAD.fmk的存在下，用CHX共处理使细胞对FasL的CICD诱导更敏感，并且其能用Nec-1有效地抑制(图2B)。在其它的细胞类型，比如U937、Balbc3T3和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中也观察到免抗DR-诱导的CICD而不是细胞凋亡的类似的保护。而且，其它的坏死抑制素也被认为是特异性CICD抑制剂。这些结果表明选择的化合物是CICD的特异性抑制剂，并可以用于选择性靶向坏死样凋亡信号通路。坏死抑制素抑制细胞凋亡的失败进一步支持CICD表示不同的细胞过程，而不是细胞凋亡缺少某些半胱天冬蛋白酶-依赖性特征的观点。
除了选择性抑制坏死样凋亡而不是细胞凋亡、死亡之外，Nec-1作用的严格的选择性也可通过表明化合物对细胞生理学的多个方面没有作用来证实。我们发现Nec-1在健康的细胞中对ATP水平、线粒体膜电位、质膜完整性、晶胞形状或尺寸、细胞周期分布、增殖、整体的mRNA表达、活性氧簇的细胞内水平、细胞粘附、肌动蛋白和微管细胞骨架或各种细胞腔隙例如核心、高尔基体、ER和线粒体的形态学通常没有作用。
Nec-1证实了抗如下在多种细胞的系统中的CICD一致的活性，包括TNFα/zVAD.fmk诱导的人单核细胞U937和小鼠成纤维细胞Balbc3T3的CICD、在zVAD.fmk存在下二聚化的外源性FADD和/或RIP在Jurkat细胞中诱导的CICD、FasL/CHX/zVAD.fmk诱导的CICD、在Jurkat细胞的FADD不足的突变体克隆中TNFα-诱导的CICD和在小鼠纤维肉瘤L929细胞中TNFα诱导的CICD。之前，已经报道了抑制这些系统中的半胱天冬蛋白酶将细胞凋亡转变成坏死性死亡；例外是L929和FADD不足的细胞，其中之前证实坏死性死亡的诱导是在不存在半胱天冬蛋白酶抑制剂的情况下的一种原代细胞死亡应答，这与我们观察到的在不存在zVAD.fmk的情况下Nec-1抑制死亡一致。Nec-1抑制所有那些系统中的CICD的能力表明其作用不限于用TNFα/z-VAD.fmk处理(该试验用于初次筛选)的U937细胞，并且，响应多种DR-相关性死亡-诱导的刺激，在多个细胞类型中引发类似的坏死样凋亡通路。而且，这些数据表明CICD不仅仅是细胞凋亡失败的副产物，而且至少在某些情况下，其是在不存在细胞凋亡的情况下活化的主要死亡机理。
已经报道了许多化合物，包括抗氧剂PDTC和BHA和hsp90抑制剂格尔德霉素具有抗-CICD活性。而且，我们发现在，某些选择的细胞系中，组织蛋白酶B抑制剂Ca-074-Me和p38抑制剂具有抗-CICD活性。我们比较了这些化合物与Nec-1的活性。感兴趣地是，我们发现Nec-1是在所有细胞基试验中唯一具有抗-CICD活性的化合物。例如，p38抑制剂PD 169316抑制3T3细胞中的CICD，和组织蛋白酶B抑制剂Ca-074-Me抑制Jurkat和3T3细胞中的CICD，但是与Nec-1不同，这些化合物或格尔德霉素都在L929细胞中没有作用(图3)。这些数据突出了高通量筛选方法产生通用的CICD抑制剂的独特的能力。与该观点一致，我们确定在Jurkat和Balbc3T3细胞中的坏死样凋亡细胞死亡不能用小分子抑制这样的因素来阻断，所述因素如线粒体渗透性转变孔(MPTP)、钙蛋白酶、钙内环境稳定微扰、HtrA2/Omi、磷脂酶A2和一氧化氮合酶或RNAi-介导的下调细胞凋亡诱发因素(AIF)。我们也筛选了具有已知生物学活性的489种化合物的Biomol/ICCB化学库，发现没有化合物如Nec-1一样可以阻断所有细胞类型中的CICD。这些结果突出了坏死抑制素的活性在阻断坏死样凋亡细胞死亡中的独特性。
因为之前已提出CICD可能是抗氧剂可抑制的，我们研究TNFα/z-VAD.fmk诱导的U937细胞的CICD是否可以用抗氧剂抑制，和Nec-1是否可以抑制氧化应激诱导的细胞死亡。将U937细胞用TNFα/zVAD.fmk处理72小时，或者用氧化应激诱导剂甲萘醌处理24小时。Nec-1提供了抗TNFα/zVAD.fmk而不是甲萘醌诱导的细胞死亡的预期的保护，而抗氧剂N-乙酰-半胱氨酸、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、维生素E提供了抗甲萘醌的保护而不是抗TNFα/zVAD诱导的细胞死亡的保护(图4)。我们推断尽管活性氧簇(ROS)可能参与某些类型的CICD，ROS不是坏死样凋亡细胞死亡通路的关键介质。而且，其使Nec-1通过抗氧剂机理保护抗TNFα/zVAD.fmk诱导的细胞死亡非常不可能。
PARP-1是一种核内蛋白，其通过催化呼吸性辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化成蛋白-结合ADP-核糖聚合物，相应地释放烟酰胺来响应DNA损害(D′Amours等人，1999)。其除了参与DNA损害之外，PARP-I显示出有助于谷氨酸兴奋性中毒、局部缺血性损伤和MPTP诱导的神经元细胞死亡的半胱天冬蛋白酶无关性组分。因此，我们研究Nec-1可起PARP抑制剂作用的可能性。然而，因为PARP抑制剂，6(5H)-菲啶酮或DPQ(3，4-二氢-5-[4(1-哌啶基)丁氧基]-1-(2H)-异喹啉)不能抑制Jurkat细胞的CICD(图5A)以及如上所述的CICD系统，包括U937和Balbc3T3细胞中任一个，也不不是在坏死样凋亡细胞中检测到生成的PAR-聚合物，我们推断PARP不可能是CICD的关键调节剂。而且，Nec-1不能保护细胞抗DNA烷化剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)-诱导的死亡(图5B)，其通过PARP活化介导。
而且，Nec-1及其它坏死抑制素抑制所有的坏死样凋亡死亡的表现形式，包括：形状和尺寸的改变(前向/侧向散射分析)、ATP损失(ATP试验)、线粒体异常(MTT试验和DiOC₆染色)和质膜透化((Sytox/PI试验)。而且，Nec-1允许TNFα-处理的FADD-不足的细胞按以与未处理的细胞不能区别的速率增殖。与这些结果一致，使用电子显微镜检查(EM)、荧光和明视野显微镜检查的形态分析证实Nec-1抑制所有坏死样凋亡细胞死亡的表现形式。
实施例2.坏死抑制素的药物化学研究
为了改善其功效、减少其毒性和增加其代谢稳定性，进行原始高通量筛选击中物(hit)Nec-1(甲硫乙内酰脲-色氨酸、MTH-Trp)(EC₅₀＝494nM)的系统改良。开始，所述分子的乙内酰脲部分没有改变。反而，研究了对吲哚环的各种改良。将吲哚环替换为苯并噻吩、苯环和吡啶。然而，所有这些变化对所述分子的活性不利。其次，进行了对吲哚环的各种取代基的研究。我们发现在吲哚环的7位引入小的电中性(即甲基)、供电子(即甲氧基)或吸电子(即氯化物)基团增加抗-CICD活性。例如，在这些衍生物中，7-氯衍生物：7-Cl-Nec-1在用TNFα处理的JurkatFADD不足的细胞中具有最高的活性，EC₅₀＝182nM。选择该分子用于在我们体内局部缺血性脑损伤模型中的进一步研究。发现吲哚环的几个位置(包括2-和4-位)不容许任何取代，而5-和6-位的取代没有被完全禁止，但结果是效价丧失。而且，乙内酰脲环和吲哚之间的亚甲桥也不容许任何取代。最后，发现具有吲哚氮未取代的化合物是最好的。然后，考察了具有最佳化分子的吲哚部分硫乙内酰脲部分。特别地，我们研究了硫乙内酰脲向乙内酰脲环的转化，预期后者将具有更少的毒性和提供更大的代谢稳定性。得到的衍生物7-CI-O-Nec-1具有同样有效的抗-CICD活性，但显著地降低了非特异性的毒性LD50＞1mM)。也研究了乙内酰脲环的两个氮上的取代基。发现脲氮仅容许小的非支链烷基(即Me和Et)。剂量-依赖性反应曲线显示在图7中。
乙内酰脲的酰胺氮和酰胺上的α-碳都不容许任何取代。接着，制备7-Cl-O-Nec-1的对映异构体。发现所述(R)-对映异构体(也称为“A异构体”)(EC₅₀＝47nM)比(S)-对映异构体(也称为“B异构体”)在抑制CICD方面更有效约4倍。Nec-1系列抑制CICD的构效关系(SAR)的完全一览图显示在图8中。对Nec-1的SAR的理解引起制备了具有有效的体外和体内抗-CICD活性、非特异性的毒性最小且代谢稳定性可能更大的衍生物。
实施例3.Nec-1衍生物在局部缺血性脑损伤的小鼠模型中的体内功效
进行Nec-1衍生物在小鼠大脑局部缺血的两小时大脑中动脉阻塞(MCAO)/再灌注模型中作用的研究。当icv注射时检测到梗塞体积和行为变化(与局部缺血性损伤有关)的显著地剂量-依赖性降低。(图9)
使用MCA阻塞后两小时局部缺血-再灌注模型，在大脑局部缺血性损伤开始后至多六时间注射7-Cl-Nec-1仍然提供了保护(图10A)，其超过大部分目前追踪药物候选分类报道的治疗窗，所述追踪药物候选分类包括兴奋性中毒抑制剂(例如MK-801、谷氨酸受体拮抗剂，如果在阻塞后一小时之后给药则停止作用)和细胞凋亡抑制剂(zVAD.fmk在阻塞后至多三小时有效)。局部缺血性脑损伤期间细胞凋亡和坏死的诱导预测坏死抑制素将显示出具有天冬酶抑制剂的效应的另外的保护效应。我们通过比较单独或与Nec-1组合的作用研究了该可能性。Nec-1证实了当在局部缺血性损伤开始后两小时与zVAD.fmk一起给药时具有半胱天冬蛋白酶抑制剂的另外的保护效应，当作为半胱天冬蛋白酶抑制剂时的时间窗仍然很有效(图10B)。感兴趣的是，当在局部缺血性损伤开始后六小时给药时，其为当半胱天冬蛋白酶抑制剂不再有效的时间点，Nec-1仍然证实统计上显著的保护(图10B)。而且，7-Cl-Nec-1的神经保护作用与半胱天冬蛋白酶-3活化的降低无关(图10C)。
这些结果支持如下想法，坏死抑制素：1)靶向细胞死亡的独立的非细胞凋亡通路；2)可以提供细胞凋亡抑制剂的另外的保护，和3)显示出延续的机会窗口，由于延迟CICD的诱导，使得该类化合物成为用于治疗局部缺血性脑损伤非常有希望的候选物。在我们的体内试验中检测到的延迟CICD的性质实际上使得CICD可能成为用于抗中风治疗而非具有发病更快的其它形式的局部缺血性细胞死亡更“可药物化(draggable)”的目标。
实施例4LC3II在CICD和在局部缺血性脑损伤中的累积
我们测定了在坏死样凋亡细胞死亡期间自体吞噬、蛋白质降解/分解代谢机理是否被激活，如由涉及自体吞噬在zVAD.fmk-诱导的L929细胞的CICD中的作用的上述报道提出的。我们利用作为标记物的微管-结合蛋白质1轻链3II(LC3II)的磷脂酰乙醇胺-＝结合片段的累积，因为已经证实其是自体吞噬液胞形成中的早期和关键步骤。实际上，在用TNFα/zVAD或FasL/zVAD(图11A)处理的坏死样凋亡Balbc 3T3细胞及其它细胞系例如JK和U937细胞中检测到LC3II累积。而且，LC3II的形态受Nec-1的有效抑制，与Nec-1在抑制CICD中的作用一致(图11A)。也在局部缺血性大脑中检测到LC3II的累积(图12B)。感兴趣地是，与细胞凋亡的标记物相反，LC3II含量的增加出现延迟的动力学，例如半胱天冬蛋白酶-3的活化早期出现并在阻塞后一小时可检测到，而LC3II的水平仅仅在MCA阻塞阻塞后五小时开始升高，并在MCA阻塞后约八小时达到峰值。而且，缓释给药Nec-1抑制LC3II生成，与大脑局部缺血期间CICD的延迟活化一致。这些结果支持观点CICD是一类局部缺血性损伤后延迟的神经元细胞死亡，并提供了关于为什么当在损伤后六小时递送时，Nec-1能减少梗塞体积的理论。而且，这些结果提供了在局部缺血性脑损伤期间发生的分子事件和在细胞培养模型的DR-诱导的CICD中相似性的坏死抑制素无关性证明。
实施例5.Nec-1体内活性的结构-功能分析
为了证实Nec-1体内活性的特异性，我们进行体内保护抗局部缺血性脑损伤的SAR分析。首先，我们在MCAO模型测定了Nec-1i，一种在乙内酰脲部分缺少甲基的Nec-1的非活性衍生物(图12A)。当在再灌注前和之后理解分两次剂量递送时，所述再灌注是其中Nec-1提供最大保护的病症(图10)，Nec-1i不能对梗塞体积发挥统计学显著的作用(图12B)。我们还在MCAO模型中测定了7-Cl-O-Nec-1。如上所示，用氧取代7-Cl-Nec-1的乙内酰脲部分的硫不会引起其体外抗-CICD活性改变(图12C)。类似地，7-Cl-O-Nec-1显示出与7-Cl-Nec-1不能区别的活性，即使我们在比用于Nec-1i试验所使用的那些更严格的条件下(在四和六小时延迟注射)比较这两种化合物(图12C)。总的来说，我们的数据证实7-Cl-Nec-1体外抑制CICD和体内抗局部缺血的活性密切相关，对我们的假设Nec-1的神经保护作用是通过抑制CICD实现的提供了有力的支持。
实施例6Nec-1在免疫细胞调节中的活性
在许多实例中，已经报道半胱天冬蛋白酶，尤其是半胱天冬蛋白酶-8在原代免疫细胞中的pro-survival功能中起作用或起积极地有助于它们响应适当的抗原刺激而活化和分化的作用。在某些情况下，非坏死性死亡细胞死亡机理的活化已直接表明比如活化-诱导T细胞的细胞死亡(AICD)和脂多糖/zVAD.fmk诱导杀死单核细胞/巨噬细胞。我们证实在这些情况下，细胞进行Nec-1依赖性CICD。
已经表明LPS对小鼠巨噬细胞或巨噬细胞细胞系(RAW264.7)的活化使其对半胱天冬蛋白酶抑制-诱导的(zVAD.fmk)死亡敏感。用Nec-1处理有效地抑制RAW264.7细胞对zVAD.fmk的剂量依赖性毒性的LPS-介导的敏化。
实施例7Nec-1保护体外原代神经元抗氧-葡萄糖缺乏诱导的细胞死亡
培养的原代皮层神经元的氧-葡萄糖缺乏(OGD)，其模拟中风期间体内局部缺血性脑损伤的某些方面，已经显示出诱导zVAD.fmk不能保护的坏死。Nec-1减少OGD-诱导的皮层神经元死亡(图14A)。Necli，一种仅仅缺少N-甲基的非活性类似物(在图8中的R₁，参见图14A的活性)不能拯救神经元细胞死亡(图14A)与之前公布的数据一致，我们在该模型中不能检测到zVAD.fmk的任何保护，我们也不能在zVAD.fmk的存在下发现Nec-1保护的任何增强(图14B)。因此，CICD而不是细胞凋亡可表示一种在OGD条件下皮层神经元中的原代细胞死亡，与用TNFα处理的FADD不足的-JK细胞中的类似。
实施例8坏死抑制素在其它神经变性模型中的神经保护活性
如上所述，非坏死性死亡细胞死亡主要参与除局部缺血性损伤之外各种类型的神经元细胞死亡。例如，试验性研究表明在我们的试验中，当半胱天冬蛋白酶抑制时，在半胱天冬蛋白酶-缺乏小鼠中运动神经元的内在坏死样程序的活化恢复(reminiscent)CICD的活化。在帕金森症的情况下，尽管已提出细胞凋亡是MPTP或其代谢物MPP⁺活化的主要机理，在动物模型中引起帕金森样症状、抑制半胱天冬蛋白酶的试剂已显示出引起坏死样死亡，表现出CICD。为此目的，我们观察了体外两个不同的多巴胺能神经元细胞系(人SH-SY5Y和小鼠SN-4741细胞)中坏死抑制素对MPP⁺/zVAD诱导的死亡的抑制(图15)。该作用在Nec-2存在下特别明显，表明该分子靶向对MPP⁺毒性特别重要的步骤。特别地，缺少硝基的Nec-2的非活性类似物不能降低SN-4741细胞中的MPP⁺细胞毒性。
此外，我们观察了Nec-1降低原代大鼠海马神经元中聚集的淀粉状蛋白-β肽(Aβ)的毒性(图16)。作为淀粉样前体蛋白异常处理的结果产生的Aβ聚集是阿尔茨海默病的原发性原因。
感兴趣地是，与OGD-诱导的死亡类似，即使在不存在半胱天冬蛋白酶抑制剂的情况下，Nec-1减弱在其它神经变性的实例中的神经毒性，可能表明神经元群(neuronal populations)内的内源性条件可以对实施细胞凋亡是不允许的，使CICD成为病理性神经元死亡的一个主要机理。
实施例9Nec-1在免疫细胞调节中的活性
T细胞的活化-诱导的细胞死亡(AICD)，一种限制T细胞再活化以抑制自身免疫反应发生的过程，是一个在正常生理条件下半胱天冬蛋白酶-无关性细胞死亡的实例。小鼠CD4⁺的再活化引起有效地诱导细胞死亡(图17)。在不存在zVAD.fmk下，Nec-1显示出对再活化的T细胞的生存力非常弱的作用，单独加入zVAD.fmk仅仅是部分性保护的。然而，Nec-1和zVAD.fmk一起有效地取消(abrogated)了细胞死亡(图17)。在CD8⁺细胞的AICD中获得了非常类似的结果，只是用zVAD.fmk保护很不明显，表明在该T细胞亚型中诱导/进行CICD更有效(图17)。结果表明细胞凋亡是AICD的主要方式，而半胱天冬蛋白酶抑制触发有效地诱导CICD。
许多报道提出在原代小鼠和人T和B淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞中的primary activation和效应物功能发展受zVAD.fmk存在或半胱天冬蛋白酶-8灭活的抑制。虽然该调节在人T细胞的多个亚类中是succeptable，小鼠CD8⁺细胞毒素的淋巴细胞(CTL)而不是辅助细胞CD4⁺细胞似乎取决于半胱天冬蛋白酶对primary activation的活性。我们检验了在这种情况下，根据半胱天冬蛋白酶活性是否能反应参与Nec-1-控制的信号步骤。
用αCD3抗体刺激的主要CTLs的活化受zVAD的抑制，通过细胞数的增加来评价。半胱天冬蛋白酶抑制的该作用完全受Nec-1抑制，在zVAD.fmk的存在下其允许CTLs累积(图18A)。该作用的特异性可通过在未用zVAD处理的细胞中缺少Nec-1作用证实。用对于从转基因的TCR OT-I小鼠系中分离的特定抗原oavlbumin peptide 257-264特异性的CTL T细胞受体(TCR)刺激获得了相同的结果。
zVAD.fmk抑制CTL活化不应归于TCR信号和半胱天冬蛋白酶抑制剂的组合诱导坏死样凋亡细胞死亡，因为细胞数的减少与zV AD.fmk-处理的样品中细胞死亡的增加无关(图18B)。zVAD.fmk的作用应归于细胞增殖的抑制，通过细胞DNA结合[³H]-胸苷评价，并且该细胞增殖的抑制在Nec-1存在下被抑制(图19A)。与该观察结果一致，VAD.fmk抑制TCR信号后CTLs的G1期进入S期，并且该作用可被Nec-1减弱(图19B)。
Nec-1的作用是特异性的，并且与Nec-1i，一种Nec-1的非活性衍生物的CICD-抑制活性一样，与类似的目标相关，不能恢复T细胞增殖(图20)。
最后，与由人半胱天冬蛋白酶-8突变引起的B细胞活化不完全一致，Nec-1还减弱zVAD.fmk对B细胞活化的抑制(图21)。
实施例10Nec-1活性的分子基础
使用可以有效地免疫沉淀内源性RIP蛋白质(Santa Cruz)的商业的RIP抗体和用于免疫沉淀的RIP1自磷酸化作用的激酶试验，我们使用FLAG抗体证实了免疫沉淀的RIP1以及RIP1、IPed在体外进行自磷酸化作用(图23)。在体外，Nec-1的存在抑制RTP1的自磷酸化作用；而Nec-1i，Nec-1的非活性衍生物显著地降低抑制RDP1自磷酸化作用的活性(图23A)。该体外激酶试验的特异性可通过在免测沉淀和体外激酶试验后RIP1不足的Jurkat细胞不能进行这样的自磷酸化作用来证实(图23A)。而且，所述磷酸化作用事件表现出当在293个T细胞中过表达时，RIP(仅仅是野生型RIP，而不是其激酶催化的非活性K45M突变体)激酶的自催化活性显示出自磷酸化作用活性。这些结果表明Nec-1靶向RIP1的激酶活性。因为RIP1的激酶活性对该可选择的细胞死亡通路是主要的和特异性的，该结果与Nec-1特异性靶向坏死样凋亡的能力完全一致。RTP1激酶活性Nec-1的目标的鉴别也给我们的鉴别坏死样凋亡特异性抑制剂的细胞-基筛选提供了一个进一步的证实。
作为用于Nec-1特异性的对照，我们使用在图23B和图23C中描述的相同的试验，比较了Nec-1对RIP及其最接近的同系物RIP2/RICK过表达的抑制，所述同系物与RIP享有＞30％的激酶域的同一性。如图24所示，Nec-1对RIP2自磷酸化作用没有作用，尽管两种蛋白质都以可比较的水平表达(参见底部培养板)。该结果与在REP的情况下缺少Nec-1i作用一起证实了Nec-1抑制RIP激酶活性的特异性。
感兴趣地是，半胱天冬蛋白酶抑制依赖性抑制B和T细胞增殖的最新分析表明其是由NFκB活化丧失引起。因此，我们的数据表明在包括NFκB活化的细胞调节的实例中，在直接涉及Nec-1的半胱天冬蛋白酶-抑制条件下，Nec-1可恢复B和T细胞活化。这些除了免疫调节之外，还包括这样的病理如肌营养不良和本文描述的其它的、以及RIP介导的固有免疫应答和涉及TNFα和IL-β的疾病。
实施例11坏死抑制素-1的进一步表征
坏死性细胞死亡常见于包括中风的多种病理学病症中。然而，研究特异性靶向坏死的治疗剂进行了很少的尝试，因为传统观点是与细胞凋亡不同，坏死性细胞死亡是一种对大多数应激的非调节的应答。在不存在任何细胞损伤的情况下，一种常见的常规DR信号活化的坏死性死亡通路的证实质疑了这一观点，并提出体内坏死性细胞死亡的一部分可能实际上受细胞器调节。这依次可提供选择性靶向病理学坏死性细胞死亡的新机会。
在该实施例和接下来的几个实施例中，我们使用小分子定义了在不存在半胱天冬蛋白酶信号的情况下死亡域受体介导的非坏死性死亡通路。我们鉴别了坏死抑制素-1(Nec-1)，一种特定的和有效的细胞死亡的小分子抑制剂，所述细胞死亡为在多个细胞类型中在半胱天冬蛋白酶抑制的存在下由DR刺激引起。这些结果提供了DR信号触发一种常见的可选择的非坏死性死亡细胞-死亡通路的第一个直接证据，我们将该通路称为术语坏死样凋亡。使用Nec-1，我们证实坏死样凋亡为一种局部缺血性神经元损伤的延迟组分，因此，可能表示一种用于治疗中风的有希望的治疗目标。
因为半胱天冬蛋白酶的化学抑制剂有助于哺乳动物系统中细胞凋亡的表征，我们预期特异性坏死样凋亡抑制剂将同样对证实在多个细胞类型中存在常见的可选择的细胞死亡通路、对于提供区别坏死样凋亡与其它细胞死亡过程的特异性工具和作为用于治疗益处靶向病理性细胞死亡的非坏死性死亡组分的电导向分子(potential lead molecules)同样有用。为了TTSTFα和zVAD.fmk诱导的人单核细胞U937细胞坏死性死亡的化学抑制剂，我们筛选了～15,000个化合物的化学品库，我们将其用作坏死样凋亡的作业定义。该筛选得到Nec-1的选择，其以浓度依赖性方式有效地阻断U937细胞中的坏死样凋亡死亡(图25A和图25B)。
其次，我们使用Nec-1作为研究在不同的细胞类型中观察到的DR-诱导的非坏死性死亡细胞死亡是否由一般机理介导。在半胱天冬蛋白酶抑制剂的存在下，Nec-1抑制所有公开的由DR活化诱导的坏死性细胞死亡的实例，所述实例including(i)FasL、放线菌酮(CHX)和zVAD.fmkFasL-CHX-zVAD.fmk，图25C)诱导的Jurkat细胞，(ii)在化学二聚物AP20187和zVAD.fmk的存在下，稳定地表达融合FKBP12-基二聚体化功能域(JK-FF)的FADD的Jurkat细胞，(iii)用TNFα和zVAD.fmk(TNFαzVAD.fmk)或FasL和zVAD.fmk(FasL-zVAD.fmk图25E)处理的BALB/c 3T3细胞，和(iv)用TNFα-zVAD.fink处理的MEF(图25F)、HT29和IEC-18及HL-60细胞的坏死性死亡。
尽管在筛选中用zVAD.fmk选择Nec-1，其作用不依赖于半胱天冬蛋白酶的药理学抑制。与坏死样凋亡的直接活化一致，Nec-1抑制TNFα-处理的FADD-不足的Jurkat细胞的死亡，其不能响应DR信号而活化半胱天冬蛋白酶，甚至在不存在zVAD.fink的情况下(图25G)。类似地，Nec-1有效地抑制TNFα-诱导的L929细胞的坏死性死亡，其不需要外源性半胱天冬蛋白酶抑制剂(图25H)。总的来说，Nec-1抑制所有这些系统中的细胞死亡的能力提供了存在DR信号介导的常见坏死样凋亡通路的第一个直接的证明。因为在FADD-不足的Jurkat细胞中坏死样凋亡的诱导不依赖其它化学品(CHX，zVAD.fink)的存在，我们使用该系统确定Nec-1的最大应答半数的有效浓度为494±125nM(图25G)。通过几个不同的试验证实了Nec-1有效地保护抗坏死样凋亡，所述试验包括细胞尺寸(图31)、ATP水平(图25)、线粒体异常(图26A和图26B)、质膜透化(图26A-图26C)和细胞增殖(图31)的前向和侧向散射分析。与这些结果一致，基于电子、荧光和明视野显微镜检查的形态分析证实Nec-1抑制所有坏死样凋亡细胞死亡的表现形式(图26D-图26F、图31和图32)。这些结果确证了Nec-1为有效的和有效的坏死样凋亡抑制剂。
实施例12Nec-1的特异性
为了确证Nec-1的特异性，我们比较了其对DR-诱发的细胞凋亡与坏死样凋亡的作用，所述细胞凋亡和坏死样凋亡可以容易地与形态学标准和选择性的染料染色区别。Nec-1对annexin V-阳性和碘化丙啶(PI)阴性细胞(结果表现出细胞凋亡)的FasL-CHX-诱导的累积没有作用(图27A)。Conversely，Nec-1 efficiently inhibited the simultaneous loss ofmitochondrial相反，Nec-1有效地抑制用TNFα处理的FADD-不足的Jurkat细胞(图26A)或用FasL-CHX-zVAD.fmk处理的野生型Jurkat细胞(图26B)中线粒体膜电位和质膜完整性的同时损失。细胞凋亡的开始比响应类似刺激物(分别为FasL-CHX和FasL-CHX-zVAD.fmk，参见图26B和图27A)的坏死样凋亡显著地更快，其可表明在这些细胞中的细胞凋亡通常掩蔽或抢先(preempts)坏死样凋亡，因为其动力学更快。
与该观察结果一致，Nec-1对FasL-CHX-处理的细胞凋亡Jurkat细胞(图26F)中细胞凋亡形态学(细胞质凝聚、染色质边缘化、核碎裂和质膜起泡)没有作用，而其完全抑制TNFα处理的FADD-不足的Jurkat细胞中坏死形态学的外观(有核凝结；细胞器膨胀，质膜完整性的早期丧失和透明细胞溶胶的外观；参见图26D和图26F)。在其它细胞死亡试验中也观察到选择性保护抗DR信号诱导的坏死样凋亡(图25D，图27B和图27C)。这些结果确证了Nec-1在抑制坏死样凋亡和针对这两种细胞死亡的不同调节中的选择性。与该模型一致，BCI-XL在Jurkat细胞中的过表达有效地抑制了细胞凋亡，而不抑制坏死样凋亡。
为了进一步确证Nec-1的特异性，我们分析了其对其它细胞生理参数的可能作用。我们发现Nec-1在健康的细胞中对ATP水平、线粒体膜电位、质膜完整性、晶胞形状或尺寸、细胞周期分布、增殖、在Agilent mRNA碎片分析中反映的整体的mRNA表达、活性氧簇(ROS)的细胞内水平、细胞粘附、肌动蛋白和微管细胞骨架或各种细胞腔隙例如核心、高尔基体、内质网和图32)的形态学通常没有作用。这些观察结果表明Nec-1对坏死样凋亡是特异性的。为了进一步表征Nec-1的特异性，我们进行广泛的构效关系分析，发现我们测定的93个化学改性的Nec-1中大部分基本上或完全丧失活性。例如，在乙内酰脲部分中消去甲基(Nec-1i；图27D)完全消除了anti坏死样凋亡活性(图25C和图25G)。在所有Nec-1改性试验中，仅仅两种改变保持了其anti坏死样凋亡活性。第一，向Nec-1的苯基环上加一个氯(7-Cl-Nec-1；图27D)得到活性增加约2.7倍(EC₅₀＝182±24nM)。第二，将乙内酰脲部分中的硫改变成氧不会影响Nec-1的anti坏死样凋亡活性，乙内酰脲部分中的硫改变对电位变化不利(potential metabolic liability)(7-Cl-O-Nec-1；图27D；EC₅₀＝206±33nM)。这样严格的结果要求针对高度特异性方式的坏死抑制素的细胞保护作用。
最后，我们比较了Nec-1与其它小的分子细胞信号调节剂的活性。我们的分析揭示了在Jurkat和BALB/c3T3细胞中的坏死样凋亡细胞死亡不能通过小分子抑制这样的因子来阻断，所述因子如线粒体渗透性转变孔、钙蛋白酶、钙内环境稳定微扰、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、HtrA2/Omi、磷脂酶A2和一氧化氮合酶或RNAi-介导的下调细胞凋亡-诱发因素。而且，我们筛选了具有已知生物学活性的489种化合物的化学品库(BIOMOL ICCB Known Bioactives library；http://iccb.med.harvard.edu)，发现没有化合物可以如Nec-1的作用阻断所有细胞类型中的坏死样凋亡。这些结果证实了坏死样凋亡调节和Nec-1活性的唯一性。
已经已表明氧化应激在包括U937和L929的某些细胞类型中DR-诱导的半胱天冬蛋白酶-无关性细胞死亡中具有作用。然而，我们发现仅仅小部分的TNFα处理的坏死样凋亡FADD-不足的Jurkat细胞显示出ROS增加(～30％的死细胞；参见图31)，而FADD二聚化触发的坏死样凋亡不伴有氧化应激，如之前报道的。与该观察结果一致，在Jurkat细胞中的坏死样凋亡不能被抗氧剂BHA抑制，也不能被来自一组保护U937细胞抗坏死样凋亡的一般抗氧剂的任何化学品抑制(图28A)，尽管报道BHA在该细胞类型中有保护作用。相反，Nec-1不会阻断由甲萘醌引起的“标准的(classic)”氧化应激-诱导的坏死(图28A)。根据这些结果，我们推断那些氧化应激，尽管在某些系统中很重要，不会在坏死样凋亡信号中起普遍作用，而且Nec-1不会在抑制坏死样凋亡中起抗氧剂作用。
实施例13坏死样凋亡信号对自体吞噬的活化
自体吞噬，一种大规模的蛋白质降解和分解代谢机理，参与半胱天冬蛋白酶-无关性细胞死亡，尽管其功能作用仍是一种有争议的主题。坏死样凋亡Jurkat细胞的EM分析证实存在电子致密物质充满的双层膜-密封的小泡(图28B)，其是自体吞噬的指征。因此，我们进一步研究自体吞噬在坏死样凋亡中的作用。我们使用微管-结合蛋白1轻链3(LC3-II)的磷脂酰乙醇胺(PE)-结合形式的外观作为自体吞噬的标记物，因为它在自噬体的形成中起早期和决定性作用。实际上，在许多坏死样凋亡系统中诱导自体吞噬，如LC3-II的水平增加所指示的，所述坏死样凋亡系统包括用TNFα处理的FADD-不足的Jurkat细胞和L929细胞(图28C)、用TNFα-zVAD.fmk或FasL-zVAD.fmk处理的BALB/c 3T3细胞(图28D)和用TNFzVAD.fmk处理的U937细胞。虽然LC3-II的生成是多步过程的结果，所述过程包括LC3裂解成LC3-I形式，然后其结合PE，我们没有检测每个研究的细胞类型中的中间体LC3-种类；我们提出在某些范围内其可能快速地加工成LC3-II。然而，在自体吞噬缺少的Atg5^-/-MEF细胞(图28F)和在其中自体吞噬因子beclin-1被RNAi攻击的细胞(图28G和图28H)中，在3-甲基腺嘌呤(3MA)，一种自我吞噬的抑制剂(图28E)存在下，坏死样凋亡正常进行。这些结果确证了自体吞噬是坏死样凋亡的常见下游后果，而不是有助于坏死样凋亡细胞死亡的因素。另一方面，尽管抑制自体吞噬对Jurkat细胞的最终死亡没有作用，其结果是显著地累积电子致密细胞质物质(图28B)，表明不能除去细胞碎屑。值得注意的是，虽然用Nec-1处理能有效地阻断坏死样凋亡LC3-II诱导以及自体吞噬小泡的形成(图26F、图28C和图28D)，其对由雷帕霉素，一种自体吞噬的诱导物引起的LC3-II诱导没有作用(图28D)，结果表明Nec-1抑制自体吞噬上游的坏死样凋亡信号步骤，但不会抑制自体吞噬本身。
实施例14坏死抑制素对RIP-诱导的坏死样凋亡的抑制
前述分析表明DR-相互作用蛋白RIP的激酶活性起分离坏死样凋亡与其它DR-依赖性通路的歧点的作用。实际上，二聚化全长的RIP或其激酶域单独足以诱导激酶-依赖性坏死样凋亡细胞死亡，其受Nec-1的抑制(图29)；该结果证实Nec-1特异性影响DR信号的坏死样凋亡分支。综合来看，我们的结果证实Nec-1靶向DRs下游的决定性的常见坏死样凋亡步骤，但不靶向上游的许多破坏事件，包括线粒体异常、质膜完整性丧失和细胞碎屑的自替吞噬清除。
实施例15.坏死样凋亡有助于局部缺血性神经元损伤
Nec-1在抑制坏死样凋亡中严格的特异性促使我们使用它检测以前未知的坏死样凋亡的体内作用。已知由局部缺血性损伤引起的神经元细胞死亡包含实质的非坏死性死亡组分，也已提出了DRs参与局部缺血性脑损伤。因此，我们猜测局部缺血性脑损伤可建立对细胞凋亡nonoptimal而不适于坏死样凋亡的条件。
为了研究坏死样凋亡参与局部缺血性脑损伤，我们测定了Nec-1在小鼠中由大脑中动脉阻塞(MCAO)引起的局部缺血性破坏的作用。脑室内给药Nec-1显著地(p＜0.05)减少MCAO后的梗塞体积，其表明坏死样凋亡可能参与该形式的病理性死亡(图30A)。为了更详细地分析，我们转向7-Cl-Nec-1，其显示出更大的体外活性。7-Cl-Nec-1也提供MCAO后梗塞体积的显著的(p＜0.05)和依赖性减少和神经病学评分的成比例的改善(图30B)。
接着，我们研究了7-Cl-Nec-1体内活性的特异性。与Nec-1在体外阻断坏死样凋亡而不是细胞凋亡的特异性一致，在局部缺血性脑损伤期间，用7-Cl-Nec-1处理不会阻断半胱天冬蛋白酶-3的活化，而zVAD.fmk会阻断(图30C)。而且，共同给药zVAD.fmk和7-Cl-Nec-1得到显著的(p＜0.05)叠加效应(图33)，尽管广泛的最佳化将需要通过联合治疗评价最大程度的神经保护作用。而且，7-Cl-Nec-1不会影响血氧和CO₂水平、体温或脑血流量，表明其不会通过对普通生理学的非特异性效应抑制局部缺血性细胞死亡。
为了证实Nec-1在体内的作用方式，我们进行了其保护抗局部缺血性脑损伤的构效关系分析。首先，Nec-1i，一种缺少单个甲基的Nec-1的非活性衍生物(图27D)没有显著地影响梗塞体积(图30A)。其次，7-Cl-O-Nec-1(图27D)具有类似于7-Cl-Nec-1的体外anti坏死样凋亡活性(图27D)，显示出与于7-Cl-Nec-1不能区分的体内活性(图30D)。这些数据证实7-Cl-Nec-1的体外坏死样凋亡抑制和体内抗局部缺血的活性之间密切相关，对我们的假设Nec-1的神经保护作用是通过抑制坏死样凋亡实现的提供了有力的支持。
值得注意的是，7-Cl-Nec-1的保护效应容易检测，即使当在损伤开始后六小时用所述化合物给药(图30E)，在该时间点给药zVAD.fmk不再减少梗塞体积(图30F)。我们推断7-Cl-Nec-1的体内神经保护作用延长的时间窗可反映出局部缺血性脑损伤期间坏死样凋亡的延迟诱导。为了验证该假设，我们分析了MCAO期间LC3-II的诱导，因为我们的体外分析表明该事件与坏死样凋亡相关。我们观察到尽管在局部缺血性脑损伤后明显地诱导LC3-II，其在阻塞后八小时才会达到最大水平(图30G)。而且，在阻塞后四小时和六小时缓释注射7-Cl-Nec-1仍能有效地阻断在八小时时间点LC3-II的增加(图30H)，证实LC3-II的体内延迟诱导实际上反映出坏死样凋亡的延迟活化。
实施例16Nec-1及其衍生物的制备
Nec-1的制剂是从Sigma-Aldrich市售可获得的。
我们根据本领域已知的方法制备Nec-Ii(参见，例如Suzuki等人，Can.J.Biochem.55：521-527，1977)。我们根据方案1制备7-Cl-Nec-1：
方案1

在氩气下，我们将二甲胺(2.05mL，16.3mmol，40％的溶液)加入到乙酸(13.6mL)和甲醛(0.340mL，4.5mmol，37％的溶液)的混合物中。我们搅拌该反应混合物10分钟，然后，用7-氯吲哚(1-1)(604mg，4.0mmol)处理。我们在室温下搅拌得到的混合物16小时。我们首先用K₂CO₃中和反应混合物，然后用NaOH(2N)将其碱化，然后，将其置于乙酸乙酯中萃取，用水洗涤，干燥并浓缩。我们从乙酸乙酯和己烷中重结晶得到的固体，得到(1-2)：产率86％，mp 136℃-138℃。
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：2.27(s，6H)，3.61(s，2H)，7.04(dd，J＝8.0和8.0Hz，1H)，7.15(d，J＝2.5Hz，1H)，7.18(d，J＝7.5Hz，1H)，7.60(d，J＝7.5Hz，1H)，8.53(s，1H).
我们在氩气下，回流(1-2)(2.8mmol)、2-甲酰氨基-丙二酸二乙酯(3.1mmol)和NaOH(30mg)在甲苯(20mL)中的混悬液三天。我们浓缩该反应混合物，并在硅胶上使用40％的乙酸乙酯-己烷的柱色谱纯化，使洗脱，得到(1-3)：产率65％，mp170℃-174℃。
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.28(t，J＝7.5Hz，6H)，3.87(s，2H)，4.17-4.31(m，4H)，6.80(s，1H)，7.00(d，J＝2.5Hz，1H)，7.02(dd，J＝7.5和8.0Hz，1H)，7.17(d，J＝7.5Hz，1H)，7.40(d，J＝8.0Hz，1H)，8.18(d，J＝1.0Hz，1H)，8.32(s，1H).
我们在室温下，用NaOH(300mg，在10mL的水中)处理(1-3)在THF中的溶液24小时。我们用乙酸(5mL)慢慢地酸化该混合物，然后将其回流24小时。我们在真空下浓缩该反应混合物，并用稀释的HCl(10mL，3M)处理，接着再回流～16小时。我们使该反应冷却至室温，并用2M的KOH调节pH至6.0。我们过滤形成的白色固体，用水洗涤，并在真空下干燥，得到(1-4)：产率83％，mp 236℃-239℃。
¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：2.95-3.00(dd，J＝8.5和15Hz，1H)，3.24-3.28(dd，J＝4.0和15Hz，1H)，3.41-3.43(dd，J＝4.0和8.5Hz，1H)，6.95(dd，J＝7.5和7.5Hz，1H)，7.10(d，J＝7.5Hz，1H)，7.22(s，1H)，7.52(d，J＝7.5Hz，1H)，11.18(s，1H).
我们将亚硫酰氯(0.09mL，1.2mmol)溶解在0℃的3mL的无水甲醇中，然后将该溶液中加入包含粗(1-4)(200mg，0.5mmol)的烧瓶中。在-5℃下搅拌四小时后，我们使该反应混合物加热至室温，并在搅拌过夜，然后浓缩。我们收集白色固体，用乙酸乙酯洗涤并真空干燥。我们直接使用产物(1-5)而无需进一步纯化。
我们向(1-5)(1.0mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三乙基胺(0.1mL)，然后加入异硫氰酸甲酯(7.4mg，0.1mmol)。我们在室温下搅拌该反应混合物一小时，然后浓缩。我们用使用在硅胶上己烷中的30％的乙酸乙酯的柱色谱纯化得到的残余物，得到(7-Cl-Nec-1)：mp 249℃-253℃。
¹H NMR(d₆-DMSO-CDCl₃，500MHz)δ3.02(s，3H)，3.18-3.22(dd，1H，J1＝14.5Hz，J2＝5.5Hz)；3.30-3.34(dd，1H，J1＝14.5Hz，J2＝5.5Hz)；4.35(dd，1H，J1＝5.5Hz，J2＝4.5Hz)；7.00(t，1H，J＝7.5Hz)；7.13(d，1H，J＝7.5Hz)；7.19(d，1H，J＝2.0Hz)；7.52(d，1H，J＝7.5Hz)；9.92(s，1H)，10.45(s，1H)；¹³C NMR，(d₆-DMSO，100MHz)δ25.92，26.61，59.45，108.84，115.64，117.56，119.45，120.46，125.44，129.19，132.59，174.43，182.83；
C₁₃H₁₂ClN₃OS的理论分析：C，53.15；H，4.12；N，14.30。实测值：C，53.16；H，4.21；N，14.01。
根据方案2制备(7-Cl-Nec-1)、(7-Cl-O-Nec-1)的含氧衍生物：
方案2

我们在氩气下，将磷氧氯化物(0.66mL，7mmol)滴加至0℃的无水DMF(5mL)中。接着，我们在室温下滴加(1-1)(1g，6.6mmol)在无水DMF中的溶液，并搅拌得到的混合物两小时。我们将该反应混合物倾入饱和的NaHCO₃中，并用乙酸乙酯萃取。我们用饱和的NaCl(10mL×3)洗涤混合的有机溶液，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到990mg的产物(1-6)，呈橙黄色固体(83％)。
¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ12.22(1H，br s)，9.93(1H，s)，8.34(1H，s)，8.07(1H，d，J＝9.0Hz)，7.57(1H，d，J＝1.5)，7.25(1H，dd，J＝1.8，7.8Hz).
我们在氩气氛下，在110℃，加热(1-6)(1mmol)和1-甲基咪唑-2，5(1，3H)-二酮(其是我们根据Janin等人，Eur.J.Org.Chem.2002：1763-1769，2002的方法合成的)(250mg，2.5mmol)在哌啶(2mL)中的混合物四小时。然后，我们在加入醚(2)的冰箱(～5℃)中冷却该反应混合。我们过滤沉淀物，并用醚洗涤，得到(1-7)。
¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ12.15(1H，br s)，10.26(1H，br s)，8.23(1H，s)，7.79(1H，d，J＝8.0Hz)，7.27(1H，d，J＝8.0Hz，)，7.13(1H，t，J＝7.8Hz)，6.82(1H，s)，2.97(3H，s).
我们将CoCl₂(1.0mmol)和NaBH₄(10mmol)滴加至(1-7)(0.5mmol)在无水MeOH/THF(1∶1，40mL)的混合溶剂中的溶液中。我们在室温下搅拌该混合物过夜，然后用乙酸乙酯(100mL)稀释。我们用饱和的NaHCO₃(30mL)、1N HCl(30mL)、饱和的NaCl(30mL)连续稀释该混合物，然后经无水MgSO4干燥，将其过滤并浓缩。我们用在硅胶上的柱色谱纯化该粗产物，得到(7-Cl-O-Nec-1)：
mp 173℃-175℃；¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ8.43(1H，br s)，7.50(1H，d，J＝8.0Hz)，7.22(1H，d，J＝7.5Hz)，7.13(1H，d，J＝2.0Hz)，7.06(1H，t，J＝7.8Hz)，5.69(1H，br s)，4.27(1H，ddd，J＝1.0，3.5，8.8Hz，)，3.43(1H，dd，J＝3.5，14.5Hz)，3.01(1H，dd，J＝9.3，14.8Hz)，2.95(3H，s)；13C NMR，(CDCl₃，100MHz)δ173.4，157.2，133.6，128.4，123.6，122.0，120.8，117.2，116.9，111.0，58.0，28.1，24.5；
C₁₃H₂₁ClN₃O₂的元素分析：C，56.22；H，4.36；N，15.13。实测值：C，56.19；H，4.41；N，15.10。
实施例17.响应zVAD-fmk和TNFα的细胞坏死
测定细胞系U-937和BALB/c 3T3响应zVAD-fmk(一种半胱天冬蛋白酶抑制剂)和TNFα(一种细胞死亡刺激剂)的坏死发生。将细胞(5×10⁵个细胞/ml)暴露于zVAD-fmk(100μM)和人TNFα(40ng/ml)72小时。通过测定响应TNFα的细胞ATP水平来测定诱导的坏死(Crouch等人，上述，Storer等人，上述和Cree等人，上述)。相对于没有用zVAD-fmk(100μM)单独或人TNFα(40ng/ml)单独处理的对照细胞，进行坏死的细胞显示出细胞ATP水平降低。人们发现细胞响应用zVAD-fmk和TNFα的处理而进行坏死。也从形态学上观察到细胞发生细胞凋亡或坏死，例如通过分析细胞的膜起泡和有核凝结。
实施例18减少坏死的小分子的鉴别
使用U-937细胞系对16,000个小分子化合物库进行筛选，通过将所述细胞暴露于zVAD-fmk和TNFα筛选能减少诱导的坏死的化合物。在该筛选中使用的化合物库为从ChemBridge(ChemB ridgeCorporation，San Diego CA)获得。
在初次筛选中，首先将U937细胞(5×10⁵或7.5×10⁵个细胞/ml)暴露于zVAD-fmk(100μM)。三十分钟后，将同样的细胞暴露于来自库的化合物(5mg/ml，溶于0.1-0.5μl的DMSO中，得到最终DMSO的浓度为0.3％至1.5％)。在另外三十分钟后，将TNFα(40ng/ml)加入到细胞培养的培养基中。然后，将所述细胞在37℃培养72小时，接着测定细胞的ATP水平。没有抑制细胞ATP水平降低的化合物是没有响应用zVAD-fmk和TNFα对细胞处理而抑制坏死的化合物。维持细胞ATP水平的化合物是阻断zVAD-fmk和TNFα触发的坏死的化合物。
作为初次筛选的结果，鉴别50个来自库的化合物来减少zVAD-fmk和TNFα诱导的坏死。选择这些化合物用于筛选减少zVAD-fmk和TNFα诱导的坏死的化合物的第二轮筛选。
在第二次筛选中，鉴别上述来自第一次筛选的化合物，测定它们减少zVAD-fmk和TNFα诱导的坏死的效价。进行每个化合物的连续稀释，并按照初次筛选将所述化合物对U-937细胞给药。各种化合物的浓度为70μM、23μM、8μM和2.5μM。如对于初次筛选的，测定响应zVAD-fmk、TNFa发生坏死的水平和和化学化合物的各种浓度。
作为第二次筛选的结果，鉴别来自ChemBridge库的四个化合物ChemBrige化合物Nos.115807、115681、210227和215686减少响应所述细胞暴露于zVAD-frnk和TNFα的坏死。这些化合物的结构如下：

实施例19保护细胞免于暴露于zVAD-fmk和DMSO的坏死
将低密度U-937细胞(1×10⁵个细胞/ml)暴露于zVAD-fmk(100μM)和DMSO(0.5％)72小时，产生坏死引起的细胞死亡。鉴别所述化合物减少zVAD-fmk和TNFa触发的细胞坏死。也评价来ChemBridge化学品库的化合物115807、115681、210227和215686减少zVAD-fmk和DMSO诱导的细胞坏死的能力。首先，将所述细胞(1×10⁵个细胞/ml)暴露于zVAD-fmk，接着，在三十分钟后，将其暴露于上述鉴别的减少坏死的小分子。在另外30分钟后，将所述细胞暴露于DMSO。在暴露于所述化合物72小时后，如上所述测定细胞的ATP水平。所有四个减少zVAD-fmk/TNFα诱导的坏死的化合物也减少zVAD-fmk/DMSO诱导的坏死。
实施例20.式(XXII)的化合物的制备
一种鉴别为坏死抑制剂的化合物是ChemBridge号210227的化合物(Nec-3)。以前描述了该化合物的类似物(El-Rayyes和Al-Jawhery，J.Heterocyclic Chem.23：135-140，1986；Sinha和Rastogi，Indian J.Chem.308：684-692，1991；Szollosy等人，J.Chem.Soc，Perkin Trans.21991：489-493)，并报道了该结构类的生物学活性包括弱抗阿米巴活性。在本发明中，已经制备了ChemBridge化合物No.210227的新的类似物，表示为式(XXII)。在一个实例中，合成式(XXII)的化合物的起始点是用式(XXIII)的四氢萘酮开始，所述四氢萘酮可以从商业来源获得或可以通过本领域技术人员已知的方法制备(参见例如Zubaidha等人，Tetrahedron 47：5759，1991；Kumar，Organic Preparations and ProceduresInternational 29：477-79，1997；和Cui等人，Tetrahedron Lett.44：4007-4010，2003)。

可以通过在催化量的碱(比如，例如氢氧化钠、氢氧化钾或哌啶)或酸(比如，例如H2SO4、H3PO4或HCl)存在下，分别与在芳香或杂芳醛R₅-CHO缩聚，将式(XXIII)的化合物转化成2-亚芳基或2-heteroarylidine-1四氢萘酮(XXIV)，生成式(XXIV)的化合物。

其中Z为CH₂和R₇为H
然后，将式(XXIV)的化合物与肼和羧酸反应，所述羧酸例如R₉CO₂H5，其中R₉为任选取代的C_1-12烷基、任选取代的C₆或C₁₀芳基、任选取代的C_2-9杂芳基、任选取代的C_7-16芳烷基或任选取代的C_2-15杂芳烷基，生成式(XXII)的化合物：

其中Z为CH₂，R₇为H，R₆为-C(O)R₉，其中R₉为本文之前定义的，(a)指示的键为双键，且R₁、R₂、R₃、R₄和R₅为本文之前定义的。在该反应中，通常形成顺式或反式异构体的混合物，接着，通过本领域已知的色谱技术将其分离。
可选地，可以将式(XXIV)的化合物与单独的肼反应，或者与肼和空间位阻的羧酸例如叔戊酸反应，生成式(XXII)的化合物，其中R₆为H。当在不存在羧酸的情况下，与肼进行反应时，主要形成反式异构体(即，氢在C3和C3a为反式)。在羧酸的存在下，通常形成顺式和反式异构体的混合物，接着，通过色谱技术将其分离。然后，用活化的羧酸或硫代羧酸例如酰基氯酰化载有R₆的氮原子，形成式(XXII)的化合物，其中R₆为-C(O)R₉或-C(S)R₉；与氯甲酸酯反应，生成式(XXII)的化合物，其中R₆为-C(O)OR₉；与光气或硫光气反应，接着与胺反应，生成式(XXII)的化合物，其中R₆为分别为C(O)_nR₉R₁₀或-C(S)_nR₉R₁₀；或者与磺酰氯反应，生成式(XXII)的化合物，其中R₆为-S(O2)R₉，其中R₉和R₁₀为本文之前定义的。为了制备式(XXII)的化合物，其中Z为键、乙烯部分、氧原子、硫原子或包括氮原子；可以使用催化量的碱或酸，以与本文前述的用于将式(XXIII)的化合物转化成式(XXIV)的化合物类似的方法，使芳香醛或杂芳基醛R₅-CHO分别与式(XXV)的1-茚满酮、式(XXVI)的1-苯并环庚酮、式(XXVII)的4-苯并二氢吡喃酮、式(XXVIII)的1-硫-4-苯并二氢吡喃酮或式(XXIX)的喹啉酮在醇的溶剂中反应。然后，使得到的式(XXIV)的α，β-未取代的酮与肼反应，接着与试剂反应，形成R₆取代基，本文前述的。

为了制备式(XXII)的化合物，其中Z为S(O)或S(O₂)，用氧化剂例如二甲基二环氧乙烷处理式(XXVIII)的化合物，和先用R₅-CHO、然后用肼和R₆-CO₂H处理得到的亚砜或砜。可以通过以催化氢化方法还原其中(a)指示双键的式(XXII)的相应化合物，得到其中(a)指示单键的式(XXII)的化合物。
将有必要保护在用于制备式(XXII)的化合物的任何合成步骤中的反应性功能基团不发生不需要的反应，取代基R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆的任一个都可以在下述中描述的被保护：Greene，″Protective GroupsIn Organic Synthesis，第3版″(John Wiley & Sons，New York，1999)，将其引入本文作为参考。式(XXII)的化合物的实例列在表6中。

其中(a)指示的键为双键；R₄和R₇各自为H；R₅为

R₆为-C(O)R₉；和Z、R₂、R₃、R_5a、R_5b、R_5C、R_5d和R₉各自为在表中指定的。





式(XXII)的化合物的其它实例可以选自下组化合物：

^*规定的相对立体化学结构；没有规定绝对立体化学结构

^*规定的相对立体化学结构；没有规定绝对立体化学结构


^*规定的相对立体化学结构；没有规定绝对立体化学结构。所有其它的立构中心是绝对的。



其中氢在C3和C3a的相对立体化学结构如所示的，且在这些手性中心的绝对构型允许两种对映异构体。
实施例21.式(XXII)的化合物对坏死的抑制
通过在实施例18中的第二次筛选所描述的方法，用在该试验中所用的较低浓度的试验化合物和使用人Jurkat T细胞代替U-937细胞，测定式(XXII)的化合物抗坏死的活性。最初，筛选化合物库用于抑制在zVAD存在下，TNFα人B细胞系U-937中诱导的细胞死亡。一种作为坏死抑制剂的化合物是(140)。初期试验样品是diasteromers的混合物。(140)的几个衍生物报道在文献(El-Rayyes，N.R.；Al-Jawhery，A.J.Heterocyclic Chem.1986，23，135-140；Sinha，A.K.；Rastogi，S.N.Indian J.Chem.1991，3OB，684-692；Szollosy，A；Toth，G.；L[omicron]rand.T.；Konya，T.；Aradi，F.；Levai，A.J.Chem.Soc.PerkinTrans.21991，489-493)。在科学文献中报道的该结构类的生物学活性包括弱抗阿米巴活性。

在方案3中列出的制备反式异构体(5)和顺式异构体(4)。开始，在碱(氢氧化钠)存在下，使6-甲氧基四氢萘酮(1-8)与对-氟苯甲醛(1-9)反应，得到查耳酮(1-10)。然后，在过量乙酸存在下，用水合肼处理该物质，生成对映异构体(diasteromers)(5)和(4)。这些化合物是容易分离的。也使用一种在方案4中图解的可选择的合成方法。用4-甲氧苯甲醛(1-11)处理四氢萘酮(1-8)，生成查耳酮(11-12)。接着，在过量的三甲基乙酸存在下，使查耳酮与水合肼反应，得到对映异构体(1-13)和(1-14)，将其分离。在不存在有机酸比如三甲基乙酸的情况下，仅仅形成反式异构体(1-13)。然后，使每个对映异构体与乙酸酐和催化量的DMAP(4-二甲基氨基吡啶)反应，分别得到(20)和(19)。
方案3

方案4

还在另一个坏死试验中测定化合物，所述试验利用人Jurkat T细胞、Fas配体诱导细胞死亡和zVAD抑制细胞凋亡通路。在36小时后，通过商业的CellTiter ATP细胞生存力试验(Promega)测定细胞生存力。在(4)/(5)和(19)/(20)的情况下，发现仅仅顺式异构体(4)(图34A)和(19)(图34B)有效地抑制坏死和得到高细胞生存力。
如上指出的，为了增加抗坏死活性进行构效关系(SAR)研究。制备和测定的化合物包括化合物(1)-(217)(例如，在表6中列出的那些化合物及随后的那些化合物)。利用用于制备(4)、(5)、(19)和(20)所应用的相似的试验设计制备这些化合物。如方案5所示制备化合物(135)、(136)和(137)。
方案5

^*表示试验指定的相对立体化学结构
为了进一步检验(19)可以保护神经元细胞抗坏死，将其在zVAD存在下，使用两种不同的神经毒素在人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y中测定。细胞死亡是由β-淀粉状蛋白诱导的，一种阿尔茨海默病的细胞模型，和甲基吡啶鎓离子(MPP+)诱导的，一种帕金森症的细胞模型。在两种情况下，所述化合物在减少毒性方面有效，如通过细胞ATP水平测定(图35A和35B)。
本文描述的化合物是细胞坏死抑制剂，当用毒素(例如，Fas配体，MPP+或β-淀粉状蛋白)攻击所述细胞和通过加入zVAD阻断细胞凋亡通路时，其在保持细胞生存力中有效。这一保护可在不同的细胞类型，比如人神经元细胞和人T细胞中发现。本文描述的化合物可以用作用于治疗被急性或慢性神经病烦扰的人的治疗剂(单独或与其它化合物组合)。而且，本发明的化合物可能对试验研究诱导坏死性细胞死亡固有的新的分子目标有用。
化合物的制备和表征
用于合成2-亚芳基-1-四氢萘酮和2-(亚芳基)-苯并二氢吡喃-4-酮，举例为2-(4-氟苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮的一般方法：在室温下，向7-甲氧基-1-四氢萘酮(1.760g，0.01mol)和4-氟苯甲醛(1.240g，0.01mol)在乙醇(20mL)的溶液中缓慢地加入NaOH的水溶液(0.012mol，8N)。搅拌该混合物两小时。过滤收集固体沉淀物，然后连续用乙醇、水和再次用乙醇洗涤。在真空中干燥所述固体，得到2-(4-氟苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(2.485g，88％)：mp 129-30℃。
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：2.88-2.91(m，2H)，3.06-3.10(m，2H)，3.87(s，3H)，7.06-7.13(m，3H)，7.17(d，J＝8.4Hz，1H)，7.42(d，J＝5.2Hz，1H)，7.44(d，J＝5.6Hz，1H)，7.61(d，J＝3.2Hz，1H)，7.81(s，1H).HFABMS m/z 283.1134
(C₁₈H₁₆FO₂的理论值，MH⁺，283.1134)。
用于制备3，3a-反式和3，3a-顺式N-乙酰-1-[3-(芳基)-3，3a，4，5-四氢苯并[g]吲唑]和N-乙酰-1-(3-芳基3a，4-二氢-3H-chromeno[4，3-c]吡唑)，举例为(4)和(5)的一般方法：在120℃下，回流2-(4-氟苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(0.300g，0.001mol)、水合肼(0.3mL)在乙酸(3mL)中的溶液15小时。浓缩该反应混合物，然后，将其溶于乙酸乙酯中。连续用水、饱和的NaHCO₃水溶液、水和盐水洗涤有机层，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。通过使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)的硅胶柱纯化得到的残余物，得到(5)(0.051g，21％)和(4)(0.109g，45％)产率是基于起始原料的回收率计(95mg)。
(5)：mp 165-67℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.94-1.99(m，1H)，2.29-2.31(m，1H)，2.32(s，3H)，2.40-2.42(m，2H)，3.16-3.22(m，1H)，3.89(s，3H)，4.95(d，J＝9.6Hz，1H)，6.93-6.96(dd，J＝2.8和8.4Hz，1H)，7.04-7.08(t，J＝8.8Hz，2H)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H)，7.28-7.32(m，2H)，7.46(d，J＝2.4Hz，1H)
C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值：C，70.99；H，5.66；N，8.28。实测值：C，70.75；H，5.63；N，8.17。
(4)：mp 182-85℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.02-1.06(m，1H)，1.75-1.78(m，1H)，2.48(s，3H)，2.81-2.87(m，2H)，3.54-3.57(m，1H)，3.90(s，3H)，5.72(d，J＝12.0Hz，1H)，6.93-7.11(m，6H)，7.56(d，J＝4.0Hz，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：22.13，24.50，28.30，48.77，55.73，62.61，107.83，112.70，115.62，118.72，127.99，128.21，130.26，132.25，132.92，155.79，158.35，161.13，163.58，168.72.
C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值：C，70.99；H，5.66；N，8.28。实测值：C，70.72；H，5.69；N，8.15。
(14)：产率18％，mp 228-30℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.89-2.00(m，1H)，2.24-2.30(m，1H)，2.38(s，3H)，2.88-2.94(m，2H)，3.12-3.19(m，1H)，3.83(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.68(d，J＝2.4Hz，1H)，6.83-6.85(dd，J＝2.4和8.4Hz，1H)，7.00-7.06(m，2H)，7.26-7.29(m，2H)，7.90(d，J＝8.8Hz，1H).
C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值：C，70.99；H，5.66；N，8.28。实测值：C，70.76；H，5.66；N，8.24。
(13)：产率20％，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.00-1.07(m，1H)，1.74-1.76(m，1H)，2.42(s，3H)，2.76-2.89(m，2H)，3.49-3.56(m，1H)，3.81(s，3H)，5.67(d，J＝10.8Hz，1H)，6.65(s，1H)，6.83-6.85(dd，J＝6.0和2.4Hz，1H)，6.94-7.06(m，4H)，7.99(d，J＝9.2Hz，1H).
C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值：C，70.99；H，5.66；N，8.28。实测值：C，70.92；H，5.66；N，8.28。
(16)：产率28％，mp 231-33℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.92-1.97(m，1H)，2.24-2.27(m，1H)，2.40(s，3H)，2.86-2.90(m，2H)，3.11-3.18(m，1H)，3.89(s，3H)，3.96(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.63(s，1H)，7.01-7.06(dd，J＝2.4和8.8Hz，2H)，7.26-7.29(m，2H)，7.38(s，1H).HRFABMS m/z369.5
(C₂₁H₂₂FN₂O₃的理论值，MH⁺，369.4095)。
(15)：产率33％，mp 189-93℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.01-1.08(m，1H)，1.72-1.77(m，1H)，1.44(s，3H)，2.72-2.93(m，2H)，3.48-3.55(m，1H)，3.88(s，3H)，3.95(s，3H)，5.67(d，J＝10.8Hz，1H)，6.60(s，1H)，6.94-6.99(dd，J＝9.2和8.8Hz，2H)，7.04-7.07(m，2H)，7.47(s，1H)。C₂₁H₂₁FN₂O₃的理论值：C，68.46；H，5.75；N，7.60。实测值：C，68.54；H，5.61；N，7.74。
(1)：产率15％，mp 168-71℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：2.00-2.04(m，1H)，2.31-2.35(m，1H)，2.42(s，3H)，2.96-2.99(m，2H)，3.19-3.25(m，1H)，4.97(d，J＝12.0Hz，1H)，7.07(t，J＝8.0Hz，2H)，7.22(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28-7.35(m，4H)，7.99(d，J＝8.0Hz，1H).
C₁₉H₁₇FN₂O的理论值：C，74.01；H，5.56；N，9.08。实测值：C，73.88；H，5.48；N，9.12。
(2)：产率23％，mp 166-68℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.06-1.11(m，1H)，1.77-1.81(m，1H)，2.47(s，3H)，2.87-2.95(m，2H)，3.56-3.63(m，1H)，5.72(d，J＝12.0Hz，1H)，7.00(t，J＝8.0Hz，2H)，7.06-7.10(m，2H)，7.19(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28-7.36(m，2H)，8.09(d，J＝8.0Hz，1H).
C₁₉H₁₇FN₂O的理论值：C，74.01；H，5.56；N，9.08。实测值：C，73.79；H，5.52；N，9.11。
(3)：产率30％，mp 196-99℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.92-1.99(m，1H)，2.27-2.32(m，1H)，2.42(s，3H)，2.86-2.89(m，2H)，3.14-3.20(m，1H)，3.87(s，3H)，4.93(d，J＝7.2Hz，1H)，6.91-7.01(m，3H)，7.08-7.10(m，2H)，7.29-7.34(m，1H)，7.43(d，J＝2.0Hz，1H).HFABMS m/z339.1419
(C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值，MH⁺，339.1509)
(72)：产率39％，mp 176-77℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.00-1.08(m，1H)，1.75-1.80(m，1H)，2.46(s，3H)，2.75-2.83(m，2H)，3.52-3.60(m，1H)，3.87(s，3H)，5.69(d，J＝11.2Hz，1H)，7.76-6.79(dd，J＝2.4和9.6Hz，1H)，6.86-6.95(m，3H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.23-7.28(m，1H)，7.53(d，J＝3.2Hz，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：22.18，24.54，28.97，46.79，55.75，62.97，107.18，113.16，114.65，118.71，121.92，128.05，130.27，132.13，139.57，155.62，156.22，161.60，164.24，168.50.
C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值：C，70.99；H，5.66；N，8.28。实测值：C，71.03；H，5.29；N，8.31。
(20)：产率25％，mp 146-48℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.89-1.95(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.39(s，3H)，2.85-2.87(m，2H)，3.16-3.23(m，1H)，3.79(s，3H)，3.86(s，3H)，4.91(d，J＝9.2Hz，1H)，6.87-6.93(m，3H)，7.09(d，J＝8.4Hz，1H)，7.22-7.25(m，2H)，7.44(d，J＝2.4Hz，1H).
C₂₁H₂₂N₂O₃的理论值：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，71.68；H，6.20；N，7.92。
(19)：产率30％，mp 151-53℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.03-1.11(m，1H)，1.72-1.76(m，1H)，2.44(s，3H)，2.77-2.91(m，2H)，3.47-3.55(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.66(d，J＝11.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.8Hz，2H)，6.89-6.92(dd，J＝3.2和8.8Hz，1H)，6.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.54(d，J＝2.8Hz，1H).).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：22.15，24.42，28.93，48.84，55.42，55.70，63.03，107.76，112.66，114.15，118.56，127.44，127.88，128.39，129.26，130.24，132.32，155.60，158.28，159.14，168.56.
C₂₁H₂₂N₂O₃的理论值：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，72.14；H，6.42；N，7.78。
(76)：产率27％，mp 175-78℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.85-1.89(m，1H)，2.32-2.35(m，1H)，2.38(s，3H)，2.53-2.60(m，1H)，3.09-3.18(m，2H)，3.79(s，3H)，3.84(s，3H)，4.91(d，J＝9.5Hz，1H)，6.86-6.89(m，3H)，7.23-7.27(m，3H)，7.57(d，J＝7.5Hz，1H).).
C₂₁H₂₂N₂O₃的理论值：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，71.72；H，6.35；N，8.02。
(31)：产率43％，mp 203-207℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：0.98-1.07(m，1H)，1.74-1.79(m，1H)，2.43(s，3H)，2.45-2.52(m，1H)，3.04-3.09(m，1H)，3.48-3.54(m，1H)，3.76(s，3H)，3.82(s，3H)，5.68(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.86(d，J＝8.0Hz，1H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，7.24(t，J＝8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝8.0Hz，1H).).
C₂₁H₂₂N₂O₃：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，71.98；H，6.05；N，8.06。
(115)：产率27％，mp 157-60℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.09-1.18(m，1H)，1.67-1.72(m，1H)，2.49(s，3H)，2.83-2.95(m，2H)，3.53-3.59(m，1H)，3.78(s，3H)，3.98(s，3H)，5.57(d，J＝11.0Hz，1H)，6.77(d，J＝7.0Hz，1H)，6.80(d，J＝9.0Hz，2H)，6.84(d，J＝9.0Hz，1H)，7.04(d，J＝9.0Hz，2H)，7.25(t，J＝9.0Hz，1H).).
C₂₁H₂₂N₂O₃的理论值：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，71.25；H，6.44；N，7.94。
(74)：产率20％，mp 260-62℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.91-2.00(m，1H)，2.27-2.32(m，1H)，2.38(s，3H)，2.99-2.95(m，2H)，3.20-3.25(m，1H)，3.78(s，3H)，4.91(d，J＝9.5Hz，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，2H)，7.17(d，J＝2.5Hz，1H)，7.23-7.34(m，4H)，7.86(d，J＝7.0Hz，1H).).
C₂₀H₂₀N₂O₂的理论值：C，74.98；H，6.29；N，8.74。实测值：C，74.15；H，6.18；N，8.58。
(24)：产率30％，mp 257-60℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.01-1.11(m，1H)，1.70-1.75(m，1H)，2.40(s，3H)，2.76-2.89(m，2H)，3.47-3.54(m，1H)，3.71(s，3H)，5.63(d，J＝11.2Hz，1H)，6.76(d，J＝8.4Hz，2H)， 6.96(d，J＝8.8Hz，2H)，7.11(d，J＝6.8Hz，1H)，7.23-7.29(m，2H)，8.02-8.04(dd，J＝1.6和7.6Hz，1H).
C₂₀H₂₀N₂O₂的理论值：C，74.98；H，6.29；N，8.74。实测值：C，74.73；H，6.32；N，8.75。
(73)：产率20％，mp 170-75℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.90-2.01(m，1H)，2.23-2.28(m，1H)，2.38(s，3H)，2.83-2.87(m，2H)，3.10-3.17(m，1H)，3.83(s，3H)，4.98(d，J＝9.2Hz，1H)，6.89-6.91(dd，J＝2.4和7.6Hz，1H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.40(d，J＝2.4Hz，1H)，7.43(d，J＝8.4Hz，2H)，8.19(d，J＝8.4Hz，2H).HFABMS m/z366.1462
(C₂₀H₁₉N₃O₄的理论值，MH⁺，366.1454)。
(23)：产率29％，mp 219-21℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：0.91-1.01(m，1H)，1.71-1.75(m，1H)，2.43(s，3H)，2.75-2.82(m，2H)，3.57-3.64(m，1H)，3.84(s，3H)，5.74(d，J＝11.6Hz，1H)，6.88-6.91(dd，J＝3.2和8.4Hz，1H)，7.22(d，J＝9.6Hz，2H)，7.48(d，J＝3.2Hz，1H)，8.13(d，J＝9.6Hz，2H).
C₂₀H₁₉N₃O₄的理论值：C，65.74；H，5.24；N，11.50。实测值：C，65.48；H，5.09；N，11.38。
(75)：产率11％，mp 149-51℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.88-1.97(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.39(s，3H)，2.86-2.88(m，2H)，3.17-3.22(m，1H)，3.87(s，3H)，4.95(d，J＝9.2Hz，1H)，5.07(s，2H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，6.96(d，J＝9.0Hz，2H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.23(d，J＝8.5Hz，2H)，7.25(s，1H)，7.30-7.43(m，4H).
C₂₇H₂₆N₂O₃的理论值：C，76.03；H，6.14；N，6.57。实测值：C，76.07；H，5.95；N，6.60。
(28)：产率41％，mp 156-61℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.01-1.14(m，1H)，1.72-1.79(m，1H)，2.45(s，3H)，2.75-2.83(m，2H)，3.87(s，3H)，4.99(s，2H)，5.67(d，J＝10.8Hz，1H)，6.87-6.92(m，2H)，6.99(d，J＝8.4Hz，1H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.30-7.40(m，7H)，7.54(d，J＝3.2Hz，1H).
C₂₇H₂₆N₂O₃的理论值：C，76.03；H，6.14；N，6.57。实测值：C，76.01；H，5.87；N，6.60。
(77)：产率21％，mp 165-69℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.87-1.94(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.41(s，3H)，2.86-2.88(m，2H)，3.14-3.19(m，1H)，3.84(s，3H)，4.87(d，J＝9.4Hz，1H)，5.94(s，2H)，6.76-6.78(m，3H)，6.90-6.93(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.09(d，J＝9.0Hz，1H)，7.42(d，J＝2.5Hz，1H).
C₂₁H₂₀N₂O₄的理论值：C，69.22；H，5.53；N，7.69。实测值：C，68.94；H，5.65；N，7.60。
(34)：产率41％，mp 206-209℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.08-1.17(m，1H)，1.75-1.80(m，1H)，2.42(s，3H)，2.76-2.84(m，2H)，3.47-3.53(m，1H)，3.87(s，3H)，5.62(d，J＝11.4Hz，1H)，5.90(s，2H)，6.52(d，J＝1.5Hz，1H)，6.57-6.59(dd，J＝1.5和8.0Hz，1H)，6.72(d，J＝7.5Hz，1H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.07(d，J＝8.2Hz，1H)，7.52(d，J＝2.5Hz，1H).
C₂₁H₂₀N₂O₄的理论值：C，69.22；H，5.53；N，7.69。实测值：C，69.00；H，5.23；N，7.55。
(78)：产率28％，mp 194-97℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.82-1.94(m，1H)，2.25-2.30(m，1H)，2.40(s，3H)，2.82-2.84(m，2H)，3.16-3.20(M，1H)，3.86(s，3H)，4.27(s，4H)，4.82(d，J＝9.0Hz，1H)，6.77-6.81(m，2H)，6.84(d，J＝8.0Hz，1H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，7.42(d，J＝2.5Hz，1H).
C₂₂H₂₂N₂O₄的理论值：C，69.83；H，5.86；N，7.40。实测值：C，68.58；H，5.75；N，7.25。
(36)：产率17％，mp 189-93℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.06-1.15(m，1H)，1.78-1.80(m，1H)，2.41(s，3H)，2.75-2.86(m，2H)，3.46-3.52(m，1H)，3.87(s，3H)，4.22(s，4H)，5.60(d，J＝11.5Hz，1H)，6.55-6.58(m，2H)，6.76(d，J＝8.5Hz，1H)，6.89-6.91(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.06(d，J＝8.0Hz，1H)，7.52(d，J＝3.0Hz，1H).
C₂₂H₂₂N₂O₄的理论值：C，69.83；H，5.86；N，7.40。实测值：C，69.53；H，5.70；N，7.27。
(89)：产率36％，mp 155-57℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.03-1.12(m，1H)，1.72-1.77(m，1H)，2.44(s，3H)，2.74-2.86(m，2H)，3.48-3.54(m，1H)，3.75(s，3H)，5.12(s，2H)，5.66(d，J＝10.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.96(d，J＝3.0Hz，1H)，6.99(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.0Hz，2H)，7.33-7.47(m，4H)，7.64(d，J＝3.0Hz，1H).
C₂₇H₂₆N₂O₃的理论值：C，76.03；H，6.14；N，6.57。实测值：C，76.01；H，5.87；N，6.60。
(95)：产率22％，mp 144-47℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.02-1.09(m，1H)，1.73-1.76(m，1H)，2.43(s，3H)，2.45(s，3H)，2.74-2.86(m，2H)，3.50-3.56(m，1H)，3.87(s，3H)，5.66(d，J＝10.5Hz，1H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.99(d，J＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，7.16(d，J＝8.5Hz，2H)，7.53(d，J＝3.0Hz，1H).
C₂₁H₂₂N₂O₂S的理论值：C，68.82；H，6.05；N，7.64。实测值：C，68.76；H，6.00；N，7.66。
(105)：产率15％，mp 218-20℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：2.36(s，3H)，2.42(s，3H)，3.53-3.57(m，1H)，4.13-4.19(m，1H)，4.60-4.64(m，1H)，4.99(d，J＝8Hz，1H)，6.85(d，J＝8Hz，1H)，7.05-7.09(m，2H)，7.16-7.31(m，3H)，7.63(s，1H).HFABMS m/z325.1354
(C₁₉H₁₇FN₂O₂的理论值，MH⁺，325.1352)。
(104)：产率42％，mp 243-46℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：2.36(s，3H)，2.48(s，3H)，3.29(t，J＝12Hz，1H)，3.72-3.83(m，1H)，4.14-4.18(m，1H)，5.77(d，J＝12Hz，1H)，6.82(d，J＝8Hz，1H)，7.0-7.15(m，5H)，7.78(s，1H).HFABMS m/z325.1359
(C₁₉H₁₇FN₂O₂的理论值，MH⁺，325.1352)。
(121)：产率32％，mp 245℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：2.45(s，3H)，3.21-3.27(m，1H)，3.84(s，3H)，3.82-3.87(m，1H)，4.10-4.14(dd，J＝10.5和12.5Hz，1H)，4.55-4.59(dd，J＝6.0和10.5Hz，1H)，5.75(d，J＝10.5Hz，1H)，6.82(d，J＝9.0Hz，1H)，6.91-6.94(dd，J＝3.5和9.5Hz，1H)，6.98-7.01(dd，J＝8.5和8.5Hz，2H)，7.06-7.08(m，2H).7.33(d，J＝3.5Hz，1H).HFABMSm/z341.1304
(C₁₉H₁₇FN₂O₃的理论值，MH⁺，341.1301)。
(91)：产率33％，mp 122-26℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.02-1.11(m，1H)，1.72(m，1H)，2.44(s，3H)，2.60(t，J＝4.5Hz，4H)，2.76-2.84(m，4H)，3.48-3.54(m，1H)，3.74-3.79(m，7H)，4.16-4.19(m，2H)，5.66(d，J＝10.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90-6.93(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，6.99(d，H＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝9.0Hz，1H)，7.55(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 450.2391
(C₂₆H₃₁N₃O₄的理论值，MH⁺，450.2393)。
(90)：32％产率，mp 185-87℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.01-1.09(m，1H)，1.72-1.77(m，1H)，2.15-2.20(m，2H)，2.44(s，3H)，2.73-2.85(m，2H)，3.48-3.53(m，3H)，3.63-3.68(m，6H)，3.75(s，3H)，4.08-4.12(m，2H)，5.65(d，J＝10.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.88-6.90(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.99(d，J＝8.5Hz，2H)，7.05(d，J＝8.5Hz，1H)，7.53(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 492.2493
(C₂₈H₃₃N₃O₅的理论值，MH⁺，492.2498)。
(11)的制备：在氢气氛下搅拌(23)(0.260mg，0.71mmol)、5％的Pd-C(25mg)在乙醇(10mL)和甲醇(5mL)中的混合物2天。过滤该混合物，连续用乙酸乙酯和乙酸洗涤。浓缩混合的滤液。从乙酸乙酯中重结晶得到的固体，得到(11)(0.205g，86％)：mp 224-26℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：0.79-0.83(m，1H)，1.47-1.50(m，1H)，2.52(m，5H)，3.19-3.26(m，1H)，3.60(s，3H)，5.31(d，J＝10.8Hz，1H)，6.33(d，J＝8.0Hz，2H)，6.55-6.49(m，3H)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.26(m，1H).HFABMS m/z 336.1717
(C₂₀H₂₁N₃O₂的理论值，MH⁺，336.1712)。
(10)的制备：在氢气氛下搅拌(28)(0.370mg，0.86mmol)、5％的Pd-C(10mg)在乙酸乙酯(20mL)中的混合物20小时，然后用celite垫片过滤。然后，连续用乙酸乙酯和乙酸洗涤该celite。浓缩混合的滤液。从乙酸乙酯中重结晶得到的固体，得到(10)(0.185g，63％)：mp 240-41℃，
¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO-CDCl₃)：0.99-1.11(m，1H)，1.72-1.76(m，1H)，2.43(s，3H)，2.67-2.83(m，2H)，3.46-3.53(m，1H)，3.87(s，3H)，5.61(d，J＝10.8Hz，1H)，6.74(d，J＝8.4Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，6.61(m，1H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.43-7.46(m，1H)，7.52(d，J＝3.2Hz，1H).
C₂₀H₂₀N₂O₃的理论值：C，71.41；H，5.99；N，8.33。实测值：C，71.12；H，5.94；N，8.32。
(12)的制备：在氩气氛下，在-78℃，向(10)(0.100g，0.28mmol)在二氯甲烷(5mL)的溶液中加入BBr₃(1.0mL，在二氯甲烷中的1.0M溶液)。在室温下，搅拌该反应混合物1小时，然后将其倾入冰冷的HCl溶液(1.0N)中。在乙酸乙酯中萃取该混合物。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。从乙酸乙酯中重结晶得到的固体，得到(12)：(0.0625g，67％)：mp 164-67℃，
¹H NMR(400MHz，DMSO-CDCl₃)：0.70-0.90(m，1H)，1.41-1.46(m，1H)，2.41-2.57(m，5H)，3.15-3.22(m，1H)，5.29(d，J＝11.2Hz，1H)，6.43(d，J＝6.8Hz，2H)，6.53-6.57(m，3H)，6.68(d，J＝8.4Hz，1H)，7.19(s，1H).HFABMS m/z 323.1399
(C₁₉H₁₈N₂O₃的理论值，MH⁺，323.1396)。
(26)和(25)的制备：在120℃，加热2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(2.0g，0.0068mol)、水合肼(2.0mL)在甲酸(20mL)中的溶液2天。浓缩该反应混合物，然后，用乙酸乙酯萃取。连续用水、饱和的NaHCO₃水溶液、水和盐水洗涤有机层，经无水Na₂SO₄干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱剂，得到化合物(26)(0.740g，32％)和(25)(0.905g，40％)。
(26)：mp 166-68℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.90-1.99(m，1H)，2.27-2.31(m，1H)，2.86-2.90(m，2H)，3.21-3.28(m，1H)，3.80(s，3H)，3.86(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.90-6.98(m，3H)，7.10(d，J＝8.8Hz，1H)，7.25-7.27(m，2H)，7.43(d，J＝2.4Hz，1H)，8.97(s，1H).
C₂₀H₂₀N₂O₃的理论值：C，71.41；H，5.99；N，8.33。实测值：C，71.16；H，6.03；N，8.26。
(25)：mp 155-59℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.01-1.12(m，1H)，1.69-1.74(m，1H)，2.68-2.85(m，2H)，3.49-3.76(m，1H)，3.76(s，3H)，3.81(s，3H)，5.58(d，J＝11.2Hz，1H)，6.78-7.04(m，6H)，7.48(d，J＝3.2Hz，1H)，8.94(s，1H).
C₂₀H₂₀N₂O₃的理论值：C，71.41；H，5.99；N，8.33。实测值：Q71.08；H，5.66；N，8.28。
(79)和(39)的制备：在140℃，回流2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(0.500g，1.7mmol)和水合肼(0.5mL)在丙酸(5mL)中的溶液2天。浓缩该反应混合物，并将残余物溶于乙酸乙酯(25mL)中。连续用水、饱和的NaHCO₃水溶液和水洗涤混合物，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱剂，得到化合物(79)(0.217g，35％)和(39)(0.252g，41％)。(79)：mp 133-36℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.15(t，J＝7.6Hz，3H)，1.85-1.96(m，1H)，2.23-2.29(m，1H)，2.74-2.87(m，4H)，3.15-3.22(m，1H)，3.78(s，3H)，3.86(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.87-6.92(m，3H)，7.08(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44(d，J＝2.4Hz，1H).
C₂₂H₂₄N₂O₃的理论值：C，72.50；H，6.64；N，7.69。实测值：C，72.33；H，6.50；N，7.61。
(39)：mp 150-52℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.05-1.10(m，1H)，1.21(t，J＝8.0Hz，3H)，1.70-1.78(m，1H)，2.74-2.88(m，4H)，3.47-3.52(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.65(d，J＝11.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.4Hz，2H)，6.89-6.92(dd，J＝3.2和8.4Hz，1H)，6.98(d，J＝8.8Hz，2H)，7.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.54(d，J＝3.2Hz，1H).
C₂₂H₂₄N₂O₃的理论值：C，72.50；H，6.64；N，7.69。实测值：C，72.29；H，6.57；N，7.77。
用于制备3，3a-反式和3，3a-顺式-N-取代的-1-[3-(芳基)-3，3a，4，5-四氢苯并[g]吲唑]，举例为(138)和(85)的一般方法：回流2-(4-甲氧苯亚甲基)-1-甲氧基-1-四氢萘酮(1.0g，0.0034mol)、叔戊酸(5.0g)、水合肼(1.0mL)在乙酸(5mL)中的溶液6小时，然后浓缩。将得到的残余物溶于乙酸乙酯(200mL)中，然后用水洗涤。将有机层缓慢地倾入饱和的NaHCO₃溶液(250mL)中。用甲基-5-氯-5-氧戊酸盐(1.410mL，0.01mol)缓慢地处理得到的溶液。在室温下，搅拌该混合物30分钟。分离乙酸乙酯层，连续用水和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱剂，得到化合物(138)(47％)和(85)(23％)。
(138)：mp 145-47℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.89-2.04(m，3H)，2.24-2.29(m，1H)，2.40(t，J＝7.6Hz，2H)，2.83-2.88(m，4H)，3.16-3.21(m，1H)，3.65(s，3H)，3.79(s，3H)，3.87(s，3H)，4.89(d，J＝9.4Hz，1H)，6.87-6.92(m，3H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.23(d，J＝9.0Hz，1H)，7.44(d，J＝2.5Hz，1H).HFABMS m/z 437.2079
(C₂₅H₂₈N₂O₅的理论值，MH⁺，437.2076)。
(85)：mp 159-61℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.08-1.11(m，1H)，1.71-1.76(m，1H)，2.02-2.09(m，2H)，2.44(t，J＝8.0Hz，2H)，2.78-2.96(m，4H)，3.47-3.53(m，1H)，3.66(s，3H)，3.75(s，3H)，3.88(s，3H)，5.64(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝9.0Hz，2H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.98(d，J＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝8.0Hz，1H)，7.53(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 437.2075
(C₂₅H₂₈N₂O₅的理论值，MH⁺，437.2076)。
(80)：产率11％，mp 159-61℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.87-1.98(m，1H)，2.13(s，3H)，2.26-2.31(m，1H)，2.86-2.89(m，2H)，3.17-3.24(m，1H)，3.78(s，3H)，3.86(s，3H)，4.90(d，J＝9.2Hz，1H)，5.09(d，J＝15.6Hz，1H)，5.22(d，J＝15.6Hz，1H)，6.87-6.95(m，3H)，7.10(d，J＝8.8Hz，1H)，7.24(d，J＝8.8Hz，2H)，7.41(d，J＝3.2Hz，1H).
C₂₃H₂₄N₂O₅的理论值：C，67.83；H，5.90；N，6.86。实测值：C，67.32；H，5.88；N，6.97。
(47)：产率68％，mp 201-204℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.05-1.16(m，1H)，1.73-1.77(m，1H)，2.16(s，3H)，2.72-2.89(m，2H)，3.48-3.55(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.16-5.25(m，2H)，5.64(d，J＝11.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.8Hz，2H)，6.91-6.94(dd，J＝2.0和8.4Hz，1H)，6.99(d，J＝8.8Hz，2H)，7.07(d，J＝7.49(d，J＝3.2Hz，1H).
C₂₃H₂₄N₂O₅的理论值：C，67.83；H，5.90；N，6.86。实测值：C，67.38；H.5.87；N，6.91。
(93)：mp 47-50℃，稠油状物。
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.04-1.09(m，1H)，1.27-1.38(m，9H)，1.59-1.64(m，2H)，1.68-1.76(m，2H)，2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，2.72-2.88(m，4H)，3.48-3.64(m，1H)，3.65(s，3H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.64(d，J＝11.0Hz，1H)，6.79(d，J＝9.0Hz，2H)，6.89-6.91(dd，J＝2.5和8.5Hz，1H)，6.98(d，J＝9.0Hz，2H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，7.54(d，J＝2.5Hz，1H).HFABMSm/z507.2853
(C₃₀H₃₈N₂O₅的理论值，MH⁺，507.2859)。
(20)：产率16％，mp 157-59℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.06-1.12(m，1H)，1.75-1.77(m，1H)，2.76-2.88(m，2H)，3.46-3.50(m，1H)，3.51(s，3H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，4.54(d，J＝16.0Hz，1H)，4.66(d，J＝16.0Hz，1H)，5.68(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝9.5Hz，2H)，6.91-6.93(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，6.98(d，J＝9.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.0Hz，1H)，7.50(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z381.1810
(C₂₂H₂₄N₂O₄的理论值，MH⁺，381.1814)。
(97)：产率22％，mp 220-22℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.09-1.18(m，1H)，1.75-1.80(m，1H)，2.77-2.89(m，2H)，3.53-3.59(m，1H)，3.76(s，3H)，3.87(s，3H)，5.68(d，J＝10Hz，1H)，6.84(d，J＝8.5Hz，2H)，6.94-6.97(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.5Hz，1H)，7.56(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 405.1432
(C₂₁H₁₉F₃N₂O₃的理论值，MH⁺，405.1426)。

3，3a-反式和3，3a-顺式2-乙酰氧基-1-[8-甲氧基-3-(4-甲氧基-苯基)-3，3a，4，5-四氢苯并[g]-吲唑-2-基]-丙-1-酮((139)、(100)和(101))的制备：回流2-(4-甲氧基亚苄基)-1-1-四氢萘酮(1.1g，0.0037mol)、叔戊酸(6.0g)、水合肼(1.1mL)在乙酸(5mL)中的溶液6小时，然后在真空下浓缩。将得到的残余物溶于乙酸乙酯(200mL)中，并将其缓慢地倾入饱和的NaHCOs溶液(200mL)中，用(5)-乙酰氧基-丙酰氯(2.350mL，0.018mol)缓慢地处理得到的溶液，并在室温下，搅拌30分钟。分离乙酸乙酯层，用水、盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥并浓缩。使用乙酸乙酯-己烷(35％)在硅胶柱上纯化该残余物。初期洗脱出的级分(139)(0.440g，28％)，和后来洗脱出的级分(100)(0.508g，32％)和(101)(0.130mg，8％)。
(139)：mp.146-150℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.50(d，J＝7.0Hz，3H)，1.58(d，J＝7.0Hz，3H)，1.88-1.99(m，2H)，2.08(s，3H)，2.09(s，3H)，2.24-2.32(m，2H)，2.82-2.92(m，4H)，3.14-3.20(m，2H)，3.79(s，6H)，3.87(s，6H)，4.91-4.98(m，2H)，5.86-5.93(m，2H)，6.86-6.94(m，5H)，7.10(d，J＝8.5Hz，2H)，7.19-7.26(m，5H)，7.41-7.43(m，2H).
C₂₄H₂₆N₂O₅的理论值：C，68.23；H，6.20；N，6.63。实测值：C，67.96；H，6.20；N，6.36
(100)：mp.70-76℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：0.97-1.06(m，1H)，1.56(d，J＝7.0Hz，3H)，1.75-1.79(m，1H)，2.10(s，3H)，2.73-2.86(m，2H)，3.48-3.53(m，1H)，3.74(s，3H)，3.86(s，3H)，5.64(d，J＝11.0Hz，1H)，6.03(dd，J＝7.0和14.0Hz，1H)，6.81(d，J＝9.0Hz，2H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.02-7.06(m，3H)，7.51(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMSm/z 423.1927
(C₂₄H₂₆N₂O₅的理论值，MH⁺，423.1920)。
(101)：mp.139-42℃(dec.)，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.12-1.18(m，1H)，1.60(d，J＝6.8Hz，3H)，1.70-1.74(m，1H)，2.12(s，3H)，2.78-2.85(m，2H)，3.50-3.57(m，1H)，3.75(s，3H)，3.85(s，3H)，5.65(d，J＝11.2Hz，1H)，5.80-5.90(dd，J＝5.6和11.6Hz，1H)，6.79(d，J＝8.4Hz，2H)，6.91-6.97(m，3H)，7.07(d，J＝8.0Hz，1H)，7.52(d，J＝3.2Hz，1H).
C₂₄H₂₆N₂O₅的理论值：C，68.23；H，6.20；N，6.63。实测值：C，67.99；H，6.32；N，6.50。

(102)的制备：在室温下，将(103)(0.50g，0.11mmol)在甲醇(5mL)的溶液中加入NaOH(50％，1mL)。在室温下，搅拌该反应混合物23小时。然后，将其用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱剂，洗脱出(102)(0.027g，60％)：mp 207-211℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.06-1.14(m，1H)，1.50(d，J＝6.4Hz，3H)，1.72-1.80(m，1H)，2.76-2.88(m，2H)，3.50-3.59＝8(m，1H)，3.59(d，J＝8.0Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.85(s，3H)，4.96-4.04(m，1H)，5.63(d，J＝10.4Hz，1H)，6.82(d，J＝8.8Hz，2H)，6.92-7.00(m，3H)，7.08(d，J＝8.4Hz，1H)，7.51(d，J＝2.4Hz，1H).
C₂₂H₂₄N₂O₄的理论值：C，69.46；H，6.36；N，7.36。实测值：C，69.07；H，6.25；N，7.21。
(103)的制备：在室温下，向(101)(0.50g，0.11mmol)在甲醇(5mL)的溶液中加入NaOH(50％，1mL)。在室温下，搅拌该反应混合物23小时。然后，将其用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱剂，洗脱出(103)(0.031g，69％)：
mp83-88℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.07-1.16(m，1H)，1.56(d，J＝7.0Hz，3H)，1.73-1.78(m，1H)，2.77-2.88(m，2H)，3.50-3.56(m，1H)，3.76(s，3H)，3.88(s，3H)，4.88-4.96(m，1H)，5.72(d，J＝13.0Hz，1H)，6.83(d，J＝8.5Hz，1H)，6.93-6.96(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.52(d，J＝3.0Hz，1H).
C₂₂H₂₄N₂O₄的理论值：C，69.46；H，6.36；N，7.36。实测值：C，68.74；H，6.27；N，7.22。
(98)的制备：向(102)(80mg，0.21mmol)、N-甲基吗啉-氧化物盐酸化物(75mg，0.63mmol)在二氯甲烷(5mL)的溶液中加入四丙基铵过钌酸盐(5mg)，并在室温下，搅拌5分钟。然后，将其过滤，浓缩并在硅胶柱上纯化，使用25％的乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂，得到(98)(62mg，78％)：
mp 175-78℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.09-1.13(m，1H)，1.74-1.78(m，1H)，2.76-2.88(m，2H)，3.77(s，3H)，3.84(s，3H)，5.65(d，J＝10.5Hz，1H)，6.85(d，J＝8.5Hz，2H)，6.92-6.94(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.04(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.5Hz，1H)，7.44(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z379.1658
(C₂₂H₂₂N₂O₄的理论值，MH⁺，379.1661)。
(48)的制备：在室温下，向(47)(0.150g，0.36mmol)在甲醇(10mL)的溶液中加入NaOH(50％，2mL)。在室温下，搅拌该反应混合物24小时，之后，用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(4∶6)作为洗脱剂，洗脱出(48)(0.105g，78％)：
mp 163-64℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.06-1.17(m，1H)，1.72-1.78(m，1H)，2.76-2.89(m，2H)，3.76(s，3H)，3.87(s，3H)，4.55-7.70(m，2H)，5.66(d，J＝10.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.2Hz，2H)，6.92-6.95(dd，J＝2.4和8.8Hz，1H)，6.99(d，J＝9.2Hz，2H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(d，J＝2.4Hz，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：24.38，28.90，48.57，55.46，55.76，61.40，69.61，108.02，114.34，119.12，127.53，127.84，128.47，130.32，132.61，157.67，158.36，159.42，168.66.
C₂₁H₂₂N₂O₄的理论值：C，68.84；H，6.05；N，7.65。实测值：C，68.98；H，6.04；N，7.58。
用于制备3，3a-顺式-1-[3-(芳基)-3，3a，4，5-四氢-苯并[g]吲唑]的N-酰基羧酸，举例为(86)的一般方法：在室温下，向(85)(0.185g，0.42mmol)在甲醇(10mL)和THF(5mL)的溶液中加入NaOH(10N，1mL)。在室温下，搅拌该反应混合物3小时，之后，用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。从乙酸乙酯-己烷中重结晶得到的固体，得到(86)(0.154g，86％)：
mp 170-76℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.07-1.10(m，1H)，1.70-1.75(m，1H)，2.05-2.09(m，2H)，2.42-2.48(m，2H)，2.76-3.02(m，4H)，3.48-3.54(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.64(d，J＝13.75Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90-6.93(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.98(d，J＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，7.52(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z423.1926
(C₂₄H₂₆N₂O₅的理论值，MH⁺，423.1920)。
(83)：产率95％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.05-1.08(m，1H)，1.32-1.38(m，8H)，1.59-1.78(m，4H)，2.32(t，J＝8.0Hz，2H)，2.79-2.89(m，4H)，3.46-3.52(m，1H)，3.74(s，3H)，3.83-3.85(m，1H)，3.87(s，3H)，5.65(d，J＝11.5Hz，1H)，6.79(d，J＝8.5Hz，2H)，6.89-6.91(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.97(d，J＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，7.54(d，J＝3.0Hz，1H)，8.65(s，1H)，HFABMS m/z 493.2707
(C₂₉H₃₆N₂O₅的理论值，MH⁺，493.2702)。
用于制备3，3a-顺式-1-[3-(芳基)-3，3a，4，5-四氢-苯并[g]吲唑]的N-酰基甲酰胺，举例为(87)的一般方法：在室温下，在氩气氛下，向(86)(0.120g，0.28mmol)、HUBT(0.108g，0.28mmol)、1-[3-二甲氨基)丙基-3-乙基-碳二亚胺(0.085g，0.28mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.1mL，0.56mmol)在CH₂Cl₂(10mL)的溶液中加入吗啉(0.050mL，0.58mmol)。在室温下，搅拌该反应混合物16小时。用二氯甲烷(20mL)稀释该反应混合物，并连续用HCl(1N)、水、盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(8∶2)作为洗脱剂，得到(87)(0.106g，75％)：
mp 163-66℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.04-1.10(m，1H)，1.70-1.78(m，1H)，2.01-2.07(m，2H)，2.41-2.45(m，2H)，2.77-3.00(m，6H)，3.44-3.53(m，3H)，3.61-3.64(m，6H)，3.75(s，3H)，3.88(s，3H)，5.64(d，J＝13.75Hz，1H)，6.80(d，J＝9.0Hz，2H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.98(d，J＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，7.52(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 492.2491
(C₂₈H₃₃N₃O₅的理论值，MH⁺，492.2498)。
(94)：产率72％，
mp112-16℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.03-1.12(m，2H)，1.32-1.40(m，8H)，1.60-1.64(m，2H)，1.68-1.76(m，2H)，2.27-2.31(dd，J＝7.5和8.0Hz，2H)，2.74-2.88(m，4H)，3.44-3.52(m，3H)，3.60-3.62(m，2H)，3.66(m，4H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.64(d，J＝11.0Hz，1H)，6.79(d，J＝8.0Hz，2H)，6.89-6.91(dd，J＝2.5和8.0Hz，1H)，6.97(d，J＝8.0Hz，2H)，7.06(d，J＝8.0Hz，1H)，7.54(d，J＝2.5Hz，1H).HFABMS m/z 562.3271
(C₃₃H₄₄N₃O₅的理论值，MH⁺，562.3281)。
用于制备3，3a-反式和3，3a-顺式1-[3-(芳基)-3，3a，4，5-四氢苯并[g]吲唑]的N-硫脲或N-脲，例证为(117)的一般方法：回流2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(0.850g，0.0028mol)和氨基硫脲(0.790g，0.0084mol)在乙醇(30mL)和浓HCl(2mL)中的混悬液六小时。将得到的溶液冷却至室温。过滤固体沉淀物，用乙醇洗涤，并从乙醇中重结晶，得到(117)(0.985g，96％)：mp 236-39℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.04-1.13(m，1H)，1.76-1.81(m，1H)，2.75-2.87(m，2H)，3.60-3.66(m，1H)，3.76(s，3H)，3.85(s，3H)，6.07(d，J＝10.5Hz，1H)，6.83(d，J＝9.0Hz，2H)，6.93-6.95(dd，3.0和8.5Hz，1H)，6.99(d，J＝9.0Hz，2H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，7.49(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 368.1439
(C₂₀H₂₁N₃O₂S的理论值，MH⁺，368.1433)。
(118)：产率28％，mp 199-200℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.02-1.11(m，1H)，1.76-1.81(m，1H)，2.75-2.86(m，2H)，3.21(d，J＝5.0Hz，3H)，3.56-3.62(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，6.10(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.91-6.94(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.96(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.5Hz，1H)，7.46(m，1H)，7.48(d，J＝3.0Hz，1H).
HFABMS m/z 382.1579
(C₂₁H₂₃N₃O₂S的理论值，MH⁺，382.1589)。
(120)：产率75％，mp 217-20℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.02-1.11(m，1H)，1.74-1.79(m，1H)，2.73-2.86(m，2H)，3.54-3.60(m，1H)，3.75(s，3H)，3.86(s，3H)，5.58(d，J＝10.5Hz，1H)，6.81(d，J＝8.5Hz，2H)，6.88-6.90(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H)，7.05(d，J＝8.5Hz，1H)，7.47(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 352.1663
(C₂₀H₂₁N₃O₃的理论值，MH⁺，352.1663)。
(119)的制备：回流(117)(0.5g，1.3mmol)和碘代甲烷(1.0mL)在乙醇(10mL)中的溶液两小时。当将该反应混合物浓缩至其体积四分之一时，形成固体沉淀物。过滤该混合物，并用冷的乙醇洗涤，得到顺式-8-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)-3，3a，4，5-四氢苯并[g]吲唑-2-亚甲胺硫代酸甲酯氢碘酸(565mg，85％)，使用其而无需进一步纯化。在60℃，搅拌顺式-8-甲氧基-3-(4-甲氧基苯基)-3，3a，4，5-四氢苯并[g]吲唑-2-亚甲胺硫代酸甲酯氢碘酸(175mg，0.34mmol)和氨水(在乙醇中2.0N的溶液，15mL)在乙醇(15mL)中的溶液16小时。浓缩该反应混合物。从甲醇-乙醚中重结晶该固体，得到(119)(105mg，88％)：mp 170-75℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.07-1.15(m，1H)，1.74-1.78(m，1H)，2.76-2.89(m，2H)，3.77(s，3H)，3.79-3.84(m，1H)，3.88(s，3H)，6.19(d，J＝10.5Hz，1H)，6.86(d，J＝8.5Hz，2H)，6.97-6.99(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.10(d，J＝8.5Hz，2H)，7.50(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 351.1825
(C₂₀H₂₂N₄O₂的理论值，MH⁺，351.1821)。
(135)的制备：在氩气氛下，向(19)(800mg，2.2mmol)在乙腈(10mL)的溶液中加入三甲基硅烷基叠氮化物(1.517mL，5.0当量)，然后缓慢加入[二(三氟乙酰氧基)碘]-苯(2.948g，3.0当量)。在室温下，搅拌该反应混合物24小时。浓缩该反应混合物，得到暗褐色残余物，将其通过硅胶柱色谱纯化，使用乙酸乙酯-己烷(1∶3)作为洗脱剂，得到(135)(252mg，29％)，并回收起始原料(19)(45mg)。
(135)：稠油状物，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.82-1.88(m，1H)，3.74(s，3H)，3.86-3.89(m，2H)，3.91(s，3H)，4.66(m，1H)，5.70(d，J＝11.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.96(d，J＝2H)，7.0-7.02(dd，J＝3.0 nd 9.0Hz，1H)，7.19(d，J＝9.0Hz，1H)，7.60(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z392.1722
(C₂₁H₂₂N₅O₃的理论值，MH⁺，392.1723)。
(136)的制备：在氢气(80psi)下，搅拌(135)(0.240g，0.61mmol)和10％的Pd-C(50mg)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液24小时。通过短的celite柱过滤该反应混合物。将滤液与乙酸水溶液(50％，10ml)研磨。从乙酸乙酯-水中重结晶该固体，得到(136)(0.153g，59％)：
mp 116-19℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.68-1.72(m，1H)，2.10-2.12(m，1H)，2.62(s，3H)，3.75(s，3H)，3.88(s，3H)，4.01-4.07(m，1H)，4.14-4.16(m，1H)，5.69(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.95-6.98(m，3H)，7.19(d，J＝9.0Hz，1H)，7.53(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 366.1818
(C₂₁H₂₄N₃O₃的理论值，MH⁺，366.1818)。
(137)的制备：在0℃，向(136)(210mg，0.57mmol)在THF(10mL)的溶液中加入甲酸(0.150mL)，然后缓慢地加入甲醛水溶液(37％)。回流该反应混合物24小时。使该溶液冷却，用NaOH水溶液(25％)冷却，并用乙酸乙酯萃取。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，使用乙酸乙酯作为洗脱剂，得到(137)(105mg，47％)：
mp 123-28℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：0.9-1.02(m，1H)，2.21(s，6H)，2.43(s，3H)，3.23(m，1H)，3.73(s，3H)，3.89(s，3H)，4.03-4.09(m，1H)，5.66(d，J＝11.0Hz，1H)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90-6.92(dd，J＝2.5和8.5Hz，1H)，6.96(d，J＝8.5Hz，2H)，7.12(d，J＝8.5Hz，1H)，7.58(d，J＝2.5Hz，1H).
C₂₃H₂₇N₃O₃的理论值：C，70.21；H，6.92；N，10.68。实测值：C，69.93；H，7.14；N，10.45。
(122)的制备：在室温下，(19)(180mg，0.51mmol)在THF(5mL)的溶液中加入LiAlH₄(2.056mL，2.056mmol；在THF中1M)。在室温下，搅拌该反应混合物1小时，然后用甲醇淬灭，接着用冰淬灭。用乙酸乙酯萃取该反应混合物。用水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化得到的残余物，使用25％的乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂，得到(122)(30mg，17％)：稠油状物，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：1.40(t，J＝7.0Hz，3H)，1.72-2.04(m，2H)，2.62-2.85(m，2H)，3.87(s，6H)，4.15(q，J＝7.0Hz，2H)，4.75(d，J＝10.5Hz，1H)，6.75-6.77(dd，J＝8.0和3.0Hz，1H)，7.01(d，J＝8.0Hz，2H)，7.12(d，J＝8.5Hz，1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H)，7.44(d，J＝3.0Hz，1H).LRMS m/z 336.3
(C₂₁H₂₄N₂O₂的理论值，M⁺，336.2)。
使用与本文描述的那些类似的方法制备其它化合物，例如
(6)，(7)，(8)，(9)，(17)，(18)，(21)，(27)，(29)，(30)，(32)，(33)，(35)，(37)，(38)，(40)，(41)，(42)，(43)，(44)，(45)，(46)，(81)，(83)，(88)，(96)，(99)，(106)，(107)，(108)，(109)，(110)，(111)，(112)，(114)，和(116)。
实施例22.Fas-结合死亡域蛋白在zVAD-fmk/TNFα或zVAD-fmk/DMSO-诱导的坏死中的作用
表达蛋白Fas-结合死亡域(FADD)的显性负相形式的细胞也可以抑制细胞响应用zVAD-fmk/TNFα-或zVAD-fmk/DMSO的处理而进行坏死。FKBP融合构建物稳定地转染Jurkat细胞(Kawahara等人，Cell Biol.143：1353-60，1998)。通常，当FADD为多聚化时，这样的细胞进行细胞凋亡。然而，在半胱天冬蛋白酶抑制剂zVAD-fmk存在下，这些细胞被保护抗细胞凋亡，而进行坏死，因此，在该系统中建立半胱天冬蛋白酶活性的细胞凋亡的在不存在半胱天冬蛋白酶的情况下诱导坏死的相关性。
用在100μM的zV AD-fmk(处理前1小时)存在下的100nMFKBP二聚物和来自所述库的鉴别减少坏死的化合物(溶于DMSO中，得到最终DMSO浓度为0.5％；在zVAD-fmk后加入30分钟)处理稳定地转染的Jurkat细胞(500,000个细胞/ml)(Ariad Pharmaceuticals；用于刺激FADD多聚化)48小时。和然后，通过测定细胞ATP水平评价细胞生存力。所述小分子提供保护抗在zVAD-fmk存在下的坏死，而不抗在不存在zVAD-fmk下FADD二聚二聚诱导的细胞凋亡。这些结果表明FADD可能参与调节响应zVAD-fmk/TNFα-或zVAD-fmk/DMSO的坏死。所述减少坏死的小分子可通过与FADD相互作用并破坏促进坏死的FADD的正常功能起作用，所述坏死为当用zVAD-fmk/TNFα或zVAD-fmk/DMSO处理细胞时出现的。
实施例23.减少坏死的小分子的细胞内目标的鉴别
可以使用许多不同的策略鉴别与减少坏死的小分子化合物相互作用的细胞内的分子。各种策略包括检测来自细胞的各种蛋白质和减少坏死的小分子之间的相互作用，根据如上所述的方法鉴别。为了鉴别与减少坏死的小分子相互作用的蛋白质，可以使用本领域技术人员已知的方法使小分子结合珠粒。各种策略应当使用来自已经暴露于zVAD-fmk/TNFα或zVAD-fmk/DMSO的细胞的蛋白质进行。
在一个策略中，可以使用本领域技术人员已知的标准技术免疫沉淀包含FADD与其它蛋白质的信号复合物。然后，将该复合物加入到包含期望的减少坏死的小分子化合物的珠粒中。可以通过蛋白质印迹检测包含在该复合物中的蛋白质，或者分子生物学领域的技术人员已知的其它技术来鉴别与减少坏死的小分子相互作用的蛋白质。任何检测的结合相互作用都表明减少坏死的小分子目标存在于免疫沉淀的FADD复合物中。
在用于鉴别减少坏死的小分子的目标的第二种策略中，可以分离出细胞，并且可以使用标准分子生物学技术测定各种分离的池与所述化合物的相互作用。与减少坏死的小分子相互作用的蛋白质的池显示出该池包含为减少坏死的小分子的目标的蛋白质。可以使用本领域技术人员已知的技术分离减少坏死的小分子的目标。
第三个策略包括小的池表达筛选系统。可以从任何其中小分子保护细胞抗zVAD-fmk/TNFα或zVAD-fmk/DMSO触发的坏死的细胞中鉴别减少坏死的小分子的目标。用于鉴别减少坏死的小分子的目标的该方法可以根据例如Lustig等人的方法(Methods in Enzymology 283：83-99，1997)进行。在该方法中，cDNA库由期望的细胞系或任何其它期望的来源组成。然后，将所述cDNA库分成100个克隆的池，转录cDNAs并翻译，形成用于检测蛋白质和减少坏死的小分子之间相互作用的蛋白质池。减少坏死的小分子和库蛋白质池之间的相互作用可以使用标准的分子生物学技术，例如SDS-PAGE来检测。
实施例24.减少坏死的小分子的结构衍生物
可以进行减少坏死的的下述改性，并评价其在减少坏死中的功效，所述坏死例如通过zVAD-fmk/TNFα或zVAD-fmk/DMSO诱导的坏死。
可以例如通过将羟基、甲基、羧基、甲氧基、氨基或硝基引入苄基环(例如，在式(VII)的R₁-R₄中任一个位置或全部位置)改性化合物115807。可以将双键引入吲哚和乙内酰脲部分之间的连接基(例如，在式(VII)中，键(a)、(b)或(c)可以是双键，条件是键(a)和(b)不同时为双键)。所述硫脲部分可以被还原或烷基化(例如，所述部分可以是-SH或SR8，其中R8为烷基)。所述吲哚氨基可以被还原、烷基化或酰化(例如，在式(VII)中，R₅可以是CH₃、CH₃(CH₂)_n，其中n为1至4，和HOOC-(CH₂)_n，其中n为1至4，
或或
而且，所述乙内酰脲3-甲基可以被可变长度的直链或支链烷基和羟基、甲基或酰基功能基取代；例如，下述基团可以存在于式(VII)的R₇位置：CH₃、CH₃(CH₂)_n，其中n为1至4，OH或HOOC-(CH₂)_n-，其中n为1至4。而且，吲哚和乙内酰脲部分之间的连接基CH2基团可以被烷基化、酰化卤化或羟基化；例如，在式(VII)中，R₇可以是CH₃、CH₃(CH₂)_n，其中n为1至4，和HOOC-(CH₂)_n，其中n为1至4，
或或
最后，乙内酰脲酮部分可以被还原成羟基或氢。
可以例如通过将卤化物或羟基或氨基结合至苄基环(例如，在式(XX)的位置R-R₂或R₄-R₉中的任一个上)改性化合物210227。C＝N双键可以被还原，或者所述氟化物可以被消去或被羟基或其它卤化物取代。
可以例如通过一起或各自独立地还原两个中间的脂肪双键来改性化合物215686。酮也可以被还原，或者甲氧基可以被羟基取代，各自独立地或一起进行。所述化合物115681可以被例如以下述方式改性。脂肪双键或脂肪酮可以被还原。硝基可以被质子、卤化物或硫酸根取代。黄酮环中的C＝O双键可以被还原。结合所述黄酮的一个或两个氧也可以被消去。
实施例25.Nec-2化合物的合成方案
Nec-2化合物可以通过通过本领域已知的方法制备(参见，例如Revue Roumaine de Chimie，30：245-8，1985；Indian Journal of Chemistry.Section B：Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry，42B：145-149，2003；和Russian Journal of Organic Chemistry(Translation ofZhurnal Organicheskoi Khimii)，35：1516-1524，1999)。例如，可以使用方案6：
方案6

注：反应物：2，试剂：1，溶剂：1，步骤：1，阶段：1
如果使用4-羟基-3-硝基苯甲醛(可以从Matrix Scientific或WakoPure Chemicals获得)作为原料，可以用上述方案制备Nec-2：

用于制备本发明的Nec-2化合物，特别是式(XVIII)的化合物的三个另外的合成方案显示在下述方案7、8和9中：
方案7

注：立体选择性，反应物：2，试剂：1，溶剂：1，步骤：1，阶段：1
方案8

注：反应物：3，试剂：2，溶剂：3，步骤：2，阶段：2，在任一个步骤中的主要阶段：
方案9

注：反应物：1，试剂：1，溶剂：2，步骤：1，阶段：1
实施例26.Nec-3化合物的构效关系
进行一组式(XXX)的Nec-3三环化合物的构效关系(SAR)研究，所述化合物抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的坏死样凋亡。

化学
根据在方案10中的方法分别从1-四氢萘酮、4-苯并二氢吡喃酮和4-硫代苯并二氢吡喃酮制备式(XXX)的化合物，比如3-苯基-3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑(X＝CH₂)、3-苯基-2，3，3a，4-四氢[1]苯并吡喃[4，3-c]吡唑(X＝O)和3-苯基-2，3，3a，4-四氢[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑(X＝S)。例如，在氢氧化钠的存在下，将式(XXXI)的化合物(X＝CH₂、O或S)与芳香醛稠合，得到式(XXXII)的查耳酮化合物。在酸性条件下，进行7-硝基-1-四氢萘酮和7-甲氧基-4-苯并二氢吡喃酮与4-茴香醛的缩聚。在乙酸中的水合肼处理式(XXXII)的化合物，得到式((XXXIII)[即(3R，3aS-rel-异构体]和式(XXXIV)[即(3R，3aR-rel-异构体]的容易分离的混合物。5，5-二氧代-3-苯基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑(X＝SO₂)化合物是通过用间-氯过苯甲酸(MCPBA)氧化式(XXXIII)相应3-苯基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑制备的。
方案10

用于方案10的试剂和条件：X＝CH₂、O或S；(a)ArCHO，8N NaOH，EtOH，室温，两小时；(b)CH₃CO₂H、NH₂NH₂·xH₂O，120℃，15小时。
使用¹H-NMR、1D nOe和HH-COSY试验证实立体化学结构归属。例如，由于在3a-位(δ3.47-3.55)和3-位(δ5.66)之间的质子的强nOe，和大的耦合常数(J＝11.2Hz)，将化合物(141)归属于(3R，3aR)-rel-异构体。所述(3R，3aS)-rel-异构体(142)具有在3a-位(δ3.16-3.23)和3-位(δ4.91)之间质子的弱nOe，较小的耦合常数(J＝9.2Hz)，和与在(3R，3aR)-rel-异构体中相应的质子相比，在3a-位的质子(δ3.20)被4′-甲氧基苯基环屏蔽。

(3R，3aR)-rel-异构体               (3R，3aS)-rel-异构体
如方案11所示，改性(141)的3.3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑环系的5-位。按Kita等人的方法(Synlett 427-428，1994)进行在[二(三氟乙酰氧基)碘]-苯的存在下，向该苄基的位置引入叠氮化物，得到(143)，产率29％。该反应也可通过消去反应实现，得到(144)，产率31％。接着，通过氢化将所述叠氮化物(143)还原成胺(145)，然后通过还原性胺化将其转化成叔胺(146)。通过¹H-NMR和HH-COSY试验确认(146)的5-位的相对立体化学结构。(146)(δ2.21)的二甲胺质子具有与在3a-位(δ4.03-4.09)的强偶合相互作用，表明顺式关系。
方案11

方案2的试剂和条件：(a)Me₃SiN₃，[CF₃CO₂]₂PhI，室温，24小时(29％的9和31％的10)；(b)H₂(80psi)，10％的Pd-C，EtOAc，室温，24小时(59％)；(c)CH₂O、HCO₂H₅、THF水溶液，Δ，24小时(47％)。
也制备具有在三环核的2-位的多个取代基的衍生物。根据方案10合成化合物(147)和(148)，不同在于分别使用甲酸和丙酸作为溶剂代替乙酸。当在叔戊酸的存在下，使查耳酮(1-15)与水合肼反应时，如方案12所示，分离作为非对映体的混合物的胺(149)(接着直接使用所述物质而无需纯化)。与使用乙酸的情况不同，利用立体要求的酸如叔戊酸直接抑制酰胺的形成，并分离所述胺。用多种酰基氯处理(149)，得到式(XXXV)和式(XXXVI)的化合物。接着，当用在甲醇中的NaOH处理时，从(150)得到酰胺(151)。用多种氨基脲和氨基硫脲环化(1-15)，如方案12所示，得到式(XXXVII)和式(XXXVIII)的化合物。例如，(152)、(153)和(154)是通过该环化方法得到的所有化合物。在所有本发明报道的环化反应中，在硅胶上的柱色谱分离后，分离出(3R，3aR)-rel-和(3R，3aS)-rel-异构体。接着，通过包括用MeI烷基化得到中间体(156)，接着用在乙醇中的氨水处理，将化合物(152)转化成(157)(方案13)。最后，通过用氢化铝锂还原，从(141)制备化合物(213)。
方案12

方案12的试剂和条件：(a)NH₂NH₂·XH2O，叔-BuCO₂H，EtOH，Δ，六小时；(b)RC(O)Cl，EtOAc₅，饱和的NaHCO₃水溶液，室温，三十分钟；(c)NH₂NHC(O)NHR或NH₂NHC(S)NHR，EtOH，浓HCl，Δ，六小时。
方案13

方案13的试剂和条件：(a)MeI，EtOH，Δ，两小时(85％)；(b)NH₃(在EtOH中2.0N)，60℃，16小时(88％)
使用本文描述的用TNFα处理的人Jurkat T细胞的FADD-不足的变体进行坏死样凋亡抑制活性的评价。利用这些条件，所述细胞有效地进行坏死样凋亡，作为阳性对照，其被Nec-1(EC₅₀＝0.050μM)完全和选择性抑制。对于EC₅₀值的确定，在存在提高浓度的试验化合物存在下，用10ng/mL的人TNFα处理细胞24小时，接着进行ATP-基生存力评价。对于几个关键的衍生物，在三个单独的试验中独立地获得EC₅₀值，以验证准确性和重现性。显示了EC₅₀值±标准偏差。
表7.在用TNFα处理的FADD-不足的Jurkat T细胞中抑制坏死样凋亡的EC₅₀的测定

     A＝(3R，3aS)-rel-异构体           B＝(3R，3aR)-rel-异构体
  化合物  R¹  R²  X  Rel-异构体  EC₅₀(μM)^a  160  8-OMe  4’-F  CH₂  A  3.7±0.75  161  8-OMe  4’-F  CH₂  B  0.96±0.085  162  7-OMe  4’-F  CH₂  A  ＞100  163  7-OMe  4’-F  CH₂  B  ＞100  164  7，8-di-OMe  4’-F  CH₂  B  ＞100  165  H  4’-F  CH₂  B  5.4±1.1  166  8-OMe  3’-F  CH₂  B  0.68±0.0090  142  8-OMe  4’-OMe  CH₂  A  6.4±2.3  141  8-OMe  4’-OMe  CH₂  B  0.29±0.068  167  H  4’-OMe  CH₂  B  0.84±0.32  168  8-NO₂  4’-OMe  CH₂  A  ＞100  169  8-NO₂  4’-OMe  CH₂  B  3.5±1.5  170  8-F  4’-OMe  CH₂  A  2.7±0.82  171  8-F  4’-OMe  CH₂  B  0.28±0.032  172  8-OMe  4’-NO₂  CH₂  B  1.8±0.38  173  6-OMe  4’-OMe  CH₂  B  ＞100  174  8-OMe  4’-OBn  CH₂  B  ＞100  175  8-OMe  4’-OH  CH₂  B  5.9±1.4  176  8-OH  4-OH  CH₂  B  ＞100  177  8-OMe  3’，4’-  OCH₂O-  CH₂  B  2.6±1.3  178  8-OMe  3’，4’-  O(CH₂)₂O-  CH₂  B  2.1±0.65  179  8-OMe  2’-OMe  CH₂  B  ＞100  180  9-OMe  4’-OMe  CH₂  B  ＞50  181  8-OBn  4’-OMe  CH₂  B  5.0±0.70  182  8-OMe  4’-SMe  CH₂  B  1.1±0.69  183  8-O(CH₂)₂R^b  4’-OMe  CH₂  B  ＞50  145^c  8-OMe  4’-OMe  CHNH₂^d  B  1.2±0.38  146  8-OMe  4’-OMe  CHNMe₂^d  B  5.1±2.2
^a从至少两个独立的实验测定EC₅₀±SD；
^bR＝吗啉；^c草酸盐；^d(5S)-rel
在用3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑环系研究的五个实例中，所述(3R，3aR)-rel-异构体比相应(3R，3aS)-rel-异构体在抑制坏死样凋亡中的活性更强(表7)。例如，(141)的功效是(142)的28倍。而且，在三环环的8-位引入甲氧基得到活性提高，例如(165)vs.(161)和(167)vs.(141)。
将甲氧基的位置改变至三环环的6-、7-或9-位，例如(173)、(163)和(180)，导致活性丧失。增加大小(181)或在三环环的8-位的醚(183)上引入胺也导致活性降低。吸电子氟(171)在三环环的8-位是容许的。然而，用硝基(169)代替氟降低了抑制活性。与氟或硝基取代基相比，在未定的苯基环的4′-位上的供电子甲氧基提高了活性，例如(141)vs(161)和(172)。然而，增加醚(174)的尺寸、移位至2′-位(179)，将其用羟基(175)或硫醚(182)取代，都不同程度地对活性不利。在三环环的5-位引入伯胺(145)或叔胺(146)，也导致活性显著地损失(＞10倍)。
表8.在用TNFα处理的FADD-不足的Jurkat T细胞中抑制坏死样凋亡的EC₅₀的测定

A＝(3R，3aS)-rel-异构体        B＝(3R，3aR)-rel-异构体
  化合物 R¹ R² X  Rel-异构体  EC₅₀(μM)^a  184 Me F O  A  ＞100  185 Me F O  B  11.6±6.1  186 OMe F O  B  4.8±1.3  187 OMe OMe O  A  9.9±0.047  188 OMe OMe O  B  0.46±0.0012  189 F OMe O  A  ＞100  190 F OMe O  B  0.70±0.13  191 OMe OMe S  A  5.1±1.5  192 OMe OMe S  B  0.28±0.070  193 OMe OMe SO₂  A  ＞100  194 OMe OMe SO₂  B  0.75±0.13
^a根据至少两个独立实验测定EC₅₀±SD。
用2，3，3a，4-四氢[1]苯并吡喃[4，3-c]吡唑环代替3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑环仅导致活性稍微降低，例如(141)vs.(188)和(171)vs.(190)。然而，在某些情况下，在(3R，3aR)-rel和(3R，3aS)-rel-异构体活性之间的差异似乎在2，3，3a，4-四氢-[1]苯并吡喃[4，3-c]吡唑环系中更显著，(189)vs.(190)。所述未定的苯基的SAR似乎与所述两个环系是可比较的。用3-苯基-2，3，3a，4-四氢[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑或5，5-二氧代-3-苯基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑环代替3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑导致活性更显著地降低，例如(141)vs.(192)和(194)。接着，研究在3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑环的2-位上的多种氮取代基的SAR(表9)。一般而言，酰胺比乙基、羟甲基和三氟甲基酰胺更有利，即(148)、(191)和(159)比(141)更有利。在三环环的2-位引入脲或硫脲对活性不利。而且，用烷基取代酰胺(213)导致坏死样凋亡抑制活性完全丧失。
表9.在用TNFα处理的FADD-不足的Jurkat T细胞中抑制坏死样凋亡的EC₅₀的测定

  化合物  R  EC₅₀(μM)^a  147  HC＝O  0.92±0.091  148  C(＝O)Et  0.15±0.0035  150  C(＝O)CH₂OAc  3.1±0.17  151  C(＝O)CH₂OH  0.16±0.023  158  C(＝O)CH₂OMe  0.44±0.24  159  C(＝O)CF₃  0.39±0.18  153  C(＝O)NH₂  4.3±2.9^b  152  C(＝S)NH₂  8.8±3.0  154  C(＝S)NHMe  7.9±2.0  157  C(＝NH)NH₂  ＞100  213  Et  ＞100
^a从至少两个独立的实验测定EC₅₀±SD。
发现三环化合物3-苯基-3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑和3-苯基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并吡喃[4，3-c]吡唑是有效的坏死抑制素。SAR研究揭示了对于两个环系而言，(3R，3aR)-rel-非对映体比相应的(3R，3aS)-rel-非对映体的活性更强。将氟或甲氧基引入三环环的8-位提高了活性，而在6-、7和9-位的取代不利。而且，将甲氧基引入未定的苯基环的4-位提高了活性，而将甲氧基置于苯基环的2-位消除了活性。在三环环系统的2-位的酰胺是最好的。而且，用3-苯基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑或5，5-二氧代-3-苯基-2，3，3a，4-四氢[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑环代替3，3a，4，5-四氢-2H-苯并[g]吲唑环导致活性显著地降低。目前正在进行研究来评价这些化合物在其中坏死样凋亡可能起重要作用的疾病(即缺血性卒中)的动物模型中的作用。而且，这些化合物可能起进一步探索(interrogate)坏死样凋亡细胞死亡的机理的分子工具(即infinity reagents)的作用。
实施例27.方法
化学物质和方法
使用Bruker 400MHz，Varian 400MHz或500MHz光谱仪获得NMR光谱。所有的¹H NMR光谱以δ单位ppm报道，并且如果在CDCl₃中进行参照四甲基硅烷(TMS)，对于在CD₃OD中的样品，参照在3.30ppm的五重峰的中线，对于在d₆-DMSO中的样品，参照在2.49ppm的五重峰的中线。所有的¹³C NMR光谱以δ单位ppm报道，并且如果在CDCl₃中进行，参照在77.23ppm的三重峰的中线，对于在CD₃OD中的样品，参照在49.0ppm的七重峰的中线，对于在d₆-DMSO中的样品，参照在39.5ppm的七重峰的中线。耦合常数(J值)以Hz报道。在硅胶(Merck，等级60、230-400目)上，或者利用Co mbiFlash Sg 100c分离系统(ISCO)与RediSep易处理的硅胶柱(ISCO)进行柱色谱。通过使用SX-102A质谱仪(JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)或LCT质谱仪(Micromass Inc.，Beverly，MA)获得高分辨率质谱。在Mel-Temp(R)装置上的玻璃毛细管管中获得所有的熔点，且未校正。所述化合物的元素成分在理论值的±0.4％内。
化合物的制备和表征
用于在碱性条件下，合成2-亚芳基-1-四氢萘酮、2-(亚芳基)苯并二氢吡喃-4-酮和2-(亚芳基)硫代苯并二氢吡喃-4-酮，举例为2-(4-氟苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮的一般方法：在室温下，向7-甲氧基-1-四氢萘酮(1.760g，0.01mol)和4-氟苯甲醛(1.240g，0.01mol)在乙醇(20mL)的溶液中慢慢地加入NaOH的水溶液(0.012mol，8N)。搅拌该混合物两小时。过滤收集固体沉淀物，然后连续用乙醇、水和再次用乙醇洗涤。在真空中干燥所述固体，得到2-(4-氟苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(2.485g，88％)：mp 129-30℃。
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.88-2.91(m，2H)，3.06-3.10(m，2H)，3.87(s，3H)，7.06-7.13(m，3H)，7.17(d，J＝8.4Hz，1H)，7.42(d，J＝5.2Hz，1H)，7.44(d，J＝5.6Hz，1H)，7.61(d，J＝3.2Hz，1H)，7.81(s，1H).HFABMS m/z283.1134
(C₁₈H₁₆FO₂的理论值，MH⁺，283.1134)。
用于在酸性条件下合成2-亚芳基-1-四氢萘酮和2-(亚芳基)-苯并二氢吡喃-4-酮，距离为2-(4-甲氧苯亚甲基)7-硝基-1-四氢萘酮的一般方法：加热回流7-硝基-1-四氢萘酮(0.382g，2.0mmol)、4-甲氧苯甲醛(0.243mL，2.0mmol)和浓HCl(10mL)在甲醇(5.4mL)中的混合物四小时。使得到的混合物冷却至室温，然后过滤。用少量甲醇洗涤残余物，并在真空中干燥，得到2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-硝基-1-四氢萘酮(2.485g，88％)，呈浅黄色固体：
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ3.04-3.9(m，2H)，3.19-3.22(m，2H)，3.87(s，3H)，6.96-6.99(m，2H)，7.44-7.47(m，3H)，7.93(s，1H)，8.32(dd，J₁＝8.5Hz，J₂＝2.5Hz，1H)，8.94(d，J＝2.0Hz，1H).
对于其它的2-亚芳基-1-四氢萘酮、2-(亚芳基)苯并二氢吡喃-4-酮和2-(亚芳基)硫代苯并二氢吡喃-4-酮的表征，参见实施例28。
用于制备(3R，3aS)-rel-和(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(芳基)-2H-苯并[g]吲唑、2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并吡喃[4，3-c]吡唑和2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑的一般方法。举例(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(160)和(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(161)：在120℃下，回流2-(4-氟苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(0.300g，1.0mmol)、水合肼(0.3mL)在乙酸(3mL)中的溶液15小时。浓缩该反应混合物，然后，将其溶于乙酸乙酯中。连续用水、饱和的NaHCO₃水溶液、水和盐水洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)的硅胶柱纯化得到的残余物，得到(160)(0.051g，21％)和(161)(0.109g，45％)。产率是基于起始原料的回收率计(95mg)。
(160)：
mp 165-67℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.94-1.99(m，1H)，2.29-2.31(m，1H)，2.32(s，3H)，2.40-2.42(m，2H)，3.16-3.22(m，1H)，3.89(s，3H)，4.95(d，J＝9.6Hz，1H)，6.93-6.96(dd，J＝2.8和8.4Hz，1H)，7.04-7.08(t，J＝8.8Hz，2H)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H)，7.28-7.32(m，2H)，7.46(d，J＝2.4Hz，1H).
(C₂₀H₁₉FN₂O₂)的分析：C，H，N。
(161)：
mp 182-85℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.02-1.06(m，1H)，1.75-1.78(m，1H)，2.48(s，3H)，2.81-2.87(m，2H)，3.54-3.57(m，1H)，3.90(s，3H)，5.72(d，J＝12.0Hz，1H)，6.93-7.11(m，6H)，7.56(d，J＝4.0Hz，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ22.13，24.50，28.30，48.77，55.73，62.61，107.83，112.70，115.62，118.72，127.99，128.21，130.26，132.25，132.92，155.79，158.35，161.13，163.58，168.72.
(C₂₀H₁₉FN₂O₂)的分析：C，H，N。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-7-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(162)：产率18％，mp 228-30℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.89-2.00(m，1H)，2.24-2.30(m，1H)，2.38(s，3H)，2.88-2.94(m，2H)，3.12-3.19(m，1H)，3.83(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.68(d，J＝2.4Hz，1H)，6.83-6.85(dd，J＝2.4和8.4Hz，1H)，7.00-7.06(m，2H)，7.26-7.29(m，2H)，7.90(d，J＝8.8Hz，1H).
(C₂₀H₁₉FN₂O₂)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-7-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(163)：产率20％，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.00-1.07(m，1H)，1.74-1.76(m，1H)，2.42(s，3H)，2.76-2.89(m，2H)，3.49-3.56(m，1H)，3.81(s，3H)，5.67(d，J＝10.8Hz，1H)，6.65(s，1H)，6.83-6.85(dd，J＝6.0和2.4Hz，1H)，6.94-7.06(m，4H)，7.99(d，J＝9.2Hz，1H).
(C₂₀H₁₉FN₂O₂)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-7，8-二甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(164)：产率33％，
mp 189-93℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.01-1.08(m，1H)，1.72-1.77(m，1H)，1.44(s，3H)，2.72-2.93(m，2H)，3.48-3.55(m，1H)，3.88(s，3H)，3.95(s，3H)，5.67(d，J＝10.8Hz，1H)，6.60(s，1H)，6.94-6.99(dd，J＝9.2和8.8Hz，2H)，7.04-7.07(m，2H)，7.47(s，1H).
(C₂₁H₂₁FN₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-2H-苯并[g]吲唑(165)：产率23％，mp 166-68℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.06-1.11(m，1H)，1.77-1.81(m，1H)，2.47(s，3H)，2.87-2.95(m，2H)，3.56-3.63(m，1H)，5.72(d，J＝12.0Hz，1H)，7.00(t，J＝8.0Hz，2H)，7.06-7.10(m，2H)，7.19(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28-7.36(m，2H)，8.09(d，J＝8.0Hz，1H).
(C₁₉H₁₇FN₂O)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(3-氟苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(166)：产率39％，mp 176-77℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.00-1.08(m，1H)，1.75-1.80(m，1H)，2.46(s，3H)，2.75-2.83(m，2H)，3.52-3.60(m，1H)，3.87(s，3H)，5.69(d，J＝11.2Hz，1H)，7.76-6.79(dd，J＝2.4和9.6Hz，1H)，6.86-6.95(m，3H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.23-7.28(m，1H)，7.53(d，J＝3.2Hz，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ22.18，24.54，28.97，46.79，55.75，62.97，107.18，113.16，114.65，118.71，121.92，128.05，130.27，132.13，139.57，155.62，156.22，161.60，164.24，168.50.
(C₂₀H₁₉FN₂O₂)的分析：C，H，N。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(142)：产率25％，
mp 146-48℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.89-1.95(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.39(s，3H)，2.85-2.87(m，2H)，3.16-3.23(m，1H)，3.79(s，3H)，3.86(s，3H)，4.91(d，J＝9.2Hz，1H)，6.87-6.93(m，3H)，7.09(d，J＝8.4Hz，1H)，7.22-7.25(m，2H)，7.44(d，J＝2.4Hz，1H).
(C₂₁H₂₂N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(141)：产率30％，mp 151-53℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.03-1.11(m，1H)，1.72-1.76(m，1H)，2.44(s，3H)，2.77-2.91(m，2H)，3.47-3.55(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.66(d，J＝11.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.8Hz，2H)，6.89-6.92(dd，J＝3.2和8.8Hz，1H)，6.99(d，J＝8.4Hz，2H)，7.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.54(d，J＝2.8Hz，1H).).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ22.15，24.42，28.93，48.84，55.42，55.70，63.03，107.76，112.66，114.15，118.56，127.44，127.88，128.39，129.26，130.24，132.32，155.60，158.28，159.14，168.56.
(C₂₁H₂₂N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-2H-苯并[g]吲唑(167)：产率30％，mp 257-60℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.01-1.11(m，1H)，1.70-1.75(m，1H)，2.40(s，3H)，2.76-2.89(m，2H)，3.47-3.54(m，1H)，3.71(s，3H)，5.63(d，J＝11.2Hz，1H)，6.76(d，J＝8.4Hz，2H)，6.96(d，J＝8.8Hz，2H)，7.11(d，J＝6.8Hz，1H)，7.23-7.29(m，2H)，8.02-8.04(dd，J＝1.6和7.6Hz，1H).
(C₂₀H₂₀N₂O₂)的分析：C，H，N。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-硝基-2H-苯并[g]吲唑(168)：产率25％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.94-2.05(m，1H)，2.34-2.38(m，1H)，2.42(s，3H)，2.97-3.09(m，2H)，3.23-3.29(m，1H)，3.71(s，3H)，4.98(d，J＝9.5Hz，1H)，6.90(d，J＝9.0Hz，2H)，7.24(d，J＝7.0Hz，2H)，7.36(d，J＝8.5Hz，1H)，8.14(dd，J＝8.5和2.5Hz，1H)，8.79(d，J＝2.0Hz，1H).HFABMS m/z 366.1467
(C₂₀H₂₀N₃O₄的理论值，MH⁺，366.1454)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-硝基-2H-苯并[g]吲唑(169)：产率45％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.07-1.16(m，1H)，1.81-1.86(m，1H)，2.47(s，3H)，2.95-2.97(m，2H)，3.56-3.62(m，1H)，3.76(s，3H)，5.72(d，J＝11.5Hz，1H)，6.82(d，J＝9.0Hz，2H)，6.97(d，J＝8.5Hz，2H)，7.33(d，J＝8.5Hz，1H)，8.13(dd，J＝8.5和2.5Hz，1H)，8.89(d，J＝2.5Hz，1H).HFABMS m/z 366.1467
(C₂₀H₂₀N₃O₄的理论值，MH⁺，366.1454)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-氟-2H-苯并[g]吲唑(170)：需要使用在CH₂Cl₂中的2％MeOH的第二个硅胶柱色谱纯化；产率26％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.89-1.99(m，1H)，2.27-2.32(m，1H)，2.38(s，3H)，2.85-2.95(m，2H)，3.18-3.24(m，1H)，3.70(s，3H)，4.92(d，J＝9.0Hz，1H)，6.88-6.91(m，2H)，7.01-7.05(m，1H)，7.14-7.16(m，1H)，7.23-7.25(m，2H)，7.63(dd，J＝9.5和2.5Hz，1H).HFABMS m/z 339.1523
(C₂₀H₂₀FN₂O₂的理论值，MH⁺，339.1509)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-氟-2H-苯并[g]吲唑(171)：产率29％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.03-1.12(m，1H)，1.74-1.79(m，1H)，2.44(s，3H)，2.78-2.89(m，2H)，3.49-3.55(m，1H)，3.76(s，3H)，5.67(d，J＝11.0Hz，1H)，6.81(d，J＝9.0Hz，2H)，6.97-7.04(m，3H)，7.11-7.13(m，1H)，7.72(dd，J＝9.5和3.0Hz，1H).HFABMS m/z 339.1493
(C₂₀H₂₀FN₂O₂的理论值，MH⁺，339.1509)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-硝氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(172)：产率29％，mp 219-21℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ0.91-1.01(m，1H)，1.71-1.75(m，1H)，2.43(s，3H)，2.75-2.82(m，2H)，3.57-3.64(m，1H)，3.84(s，3H)，5.74(d，J＝11.6Hz，1H)，6.88-6.91(dd，J＝3.2和8.4Hz，1H)，7.22(d，J＝9.6Hz，2H)，7.48(d，J＝3.2Hz，1H)，8.13(d，J＝9.6Hz，2H).
(C₂₀H₁₉N₃O₄)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-6-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(173)：产率43％，mp 203-207℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ0.98-1.07(m，1H)，1.74-1.79(m，1H)，2.43(s，3H)，2.45-2.52(m，1H)，3.04-3.09(m，1H)，3.48-3.54(m，1H)，3.76(s，3H)，3.82(s，3H)，5.68(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.86(d，J＝8.0Hz，1H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，7.24(t，J＝8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝8.0Hz，1H).).
(C₂₁H₂₂N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-苄氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(174)：产率41％，mp 156-61℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.01-1.14(m，1H)，1.72-1.79(m，1H)，2.45(s，3H)，2.75-2.83(m，2H)，3.87(s，3H)，4.99(s，2H)，5.67(d，J＝10.8Hz，1H)，6.87-6.92(m，2H)，6.99(d，J＝8.4Hz，1H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.30-7.40(m，7H)，7.54(d，J＝3.2Hz，1H).
(C₂₇H₂₆N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(3，4-亚甲基二氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(177)：产率41％，mp 206-209℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.08-1.17(m，1H)，1.75-1.80(m，1H)，2.42(s，3H)，2.76-2.84(m，2H)，3.47-3.53(m，1H)，3.87(s，3H)，5.62(d，J＝11.4Hz，1H)，5.90(s，2H)，6.52(d，J＝1.5Hz，1H)，6.57-6.59(dd，J＝1.5和8.0Hz，1H)，6.72(d，J＝7.5Hz，1H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.07(d，J＝8.2Hz，1H)，7.52(d，J＝2.5Hz，1H).
(C₂₁H₂₀N₂O₄)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(3，4-亚乙基二氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(178)：产率17％，mp 189-93℃，
¹H MR(500MHz，CDCl₃)：δ1.06-1.15(m，1H)，1.78-1.80(m，1H)，2.41(s，3H)，2.75-2.86(m，2H)，3.46-3.52(m，1H)，3.87(s，3H)，4.22(s，4H)，5.60(d，J＝11.5Hz，1H)，6.55-6.58(m，2H)，6.76(d，J＝8.5Hz，1H)，6.89-6.91(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.06(d，J＝8.0Hz，1H)，7.52(d，J＝3.0Hz，1H).
(C₂₂H₂₂N₂O₄)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-9-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(180)：产率27％，mp 157-60℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.09-1.18(m，1H)，1.67-1.72(m，1H)，2.49(s，3H)，2.83-2.95(m，2H)，3.53-3.59(m，1H)，3.78(s，3H)，3.98(s，3H)，5.57(d，J＝11.0Hz，1H)，6.77(d，J＝7.0Hz，1H)，6.80(d，J＝9.0Hz，2H)，6.84(d，J＝9.0Hz，1H)，7.04(d，J＝9.0Hz，2H)，7.25(t，J＝9.0Hz，1H).).
(C₂₁H₂₂N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-苄氧基-2H-苯并[g]吲唑(181)：产率36％，mp 155-57℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.03-1.12(m，1H)，1.72-1.77(m，1H)，2.44(s，3H)，2.74-2.86(m，2H)，3.48-3.54(m，1H)，3.75(s，3H)，5.12(s，2H)，5.66(d，J＝10.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.96(d，J＝3.0Hz，1H)，6.99(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.0Hz，2H)，7.33-7.47(m，4H)，7.64(d，J＝3.0Hz，1H).
(C₂₇H₂₆N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-硫代甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(182)：产率22％，mp 144-47℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.02-1.09(m，1H)，1.73-1.76(m，1H)，2.43(s，3H)，2.45(s，3H)，2.74-2.86(m，2H)，3.50-3.56(m，1H)，3.87(s，3H)，5.66(d，J＝10.5Hz，1H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.99(d，J＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝8.5Hz，1H)，7.16(d，J＝8.5Hz，2H)，7.53(d，J＝3.0Hz，1H).
(C₂₁H₂₂N₂O₂S)的分析：C，H，N。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-氟苯基)-8-甲基-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(184)：产率15％，mp 218-20℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ2.36(s，3H)，2.42(s，3H)，3.53-3.57(m，1H)，4.13-4.19(m，1H)，4.60-4.64(m，1H)，4.99(d，J＝8Hz，1H)，6.85(d，J＝8Hz，1H)，7.05-7.09(m，2H)，7.16-7.31(m，3H)，7.63(s，1H).HFABMS m/z325.1354
(C₁₉H₁₇FN₂O₂的理论值，MH⁺，325.1352)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-(4-吗啉基)乙氧基-2H-苯并[g]吲唑(183)：产率33％，mp 122-26℃，
¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.02-1.11(m，1H)，1.72(m，1H)，2.44(s，3H)，2.60(t，J＝4.5Hz，4H)，2.76-2.84(m，4H)，3.48-3.54(m，1H)，3.74-3.79(m，7H)，4.16-4.19(m，2H)，5.66(d，J＝10.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90-6.93(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，6.99(d，H＝8.5Hz，2H)，7.06(d，J＝9.0Hz，1H)，7.55(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 450.2391
(C₂₆H₃₁N₃O₄的理论值，MH⁺，450.2393)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-氟苯基)-8-甲基-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(185)：需要使用己烷/EtOAc/MeCN(65∶25∶10)的第二个硅胶柱色谱纯化；产率42％，mp 243-46℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ2.36(s，3H)，2.48(s，3H)，3.29(t，J＝12Hz，1H)，3.72-3.83(m，1H)，4.14-4.18(m，1H)，5.77(d，J＝12Hz，1H)，6.82(d，J＝8Hz，1H)，7.0-7.15(m，5H)，7.78(s，1H).
HFABMS m/z 325.1359
C₁₉H₁₇FN₂O₂的理论值，MH⁺，325.1352)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-氟苯基)-8-甲氧基-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(186)：产率32％，mp 245℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.45(s，3H)，3.21-3.27(m，1H)，3.84(s，3H)，3.82-3.87(m，1H)，4.10-4.14(dd，J＝10.5和12.5Hz，1H)，4.55-4.59(dd，J＝6.0和10.5Hz，1H)，5.75(d，J＝10.5Hz，1H)，6.82(d，J＝9.0Hz，1H)，6.91-6.94(dd，J＝3.5和9.5Hz，1H)，6.98-7.01(dd，J＝8.5和8.5Hz，2H)，7.06-7.08(m，2H).7.33(d，J＝3.5Hz，1H).HFABMS m/z341.1304
(C₁₉H₁₇FN₂O₃的理论值，MH⁺，341.1301)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(187)：产率39％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.39(s，3H)，3.53-3.59(m，1H)，3.80(s，3H)，3.84(s，3H)，4.11(dd，1H，J＝10.3，12.8Hz)，4.57(dd，1H，J＝6.0，10.5Hz)，4.95(d，1H，J＝10.0Hz)，6.86(d，1H，J＝9.0Hz)，6.88-6.91(m，2H)，6.93(dd，1H，J＝2.8，9.3Hz)，7.21-7.24(m，2H)，7.26-7.27(m，1H).HFABMS m/z353.1485
(C₂₀H₂₁N₂O₄的理论值，MH⁺，353.1501)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(188)：产率50％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.45(s，3H)，3.30(dd，1H，J＝11.0，13.0Hz)，3.76(s，3H)，3.78-3.83(m，1H)，3.85(s，3H)，4.13(dd，1H，J＝5.8，10.8Hz)，5.72(d，1H，J＝11.0Hz)，6.81-6.84(m，3H)，6.91(dd，1H，J＝3.0，9.5Hz)，7.00-7.02(m，2H)，7.34(d，1H，J＝3.5Hz).HFABMS m/z353.1492
(C₂₀H₂₁N₂O₄的理论值，MH⁺，353.1501)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-氟-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(189)：产率33％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.38(s，3H)，3.53-3.59(m，1H)，3.80(s，3H)，4.13(dd，1H，J＝10.3，12.8Hz)，4.60(dd，1H，J＝5.8，10.3Hz)，4.97(d，1H，J＝9.5Hz)，6.87-6.91(m，3H)，7.02-7.06(m，1H)，7.21-7.24(m，2H)，7.49(dd，1H，J＝3.0，8.0Hz).HFABMS m/z 341.1312
(C₁₉H₁₈FN₂O₃的理论值，MH⁺，341.1301)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-氟-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(190)：产率53％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.44(s，3H)，3.31(dd，1H，J＝11.0，13.0Hz)，3.76(s，3H)，3.78-3.84(m，1H)，4.16(dd，1H，J＝5.8，11.3Hz)，5.73(d，1H，J＝11.0Hz)，6.82-6.86(m，3H)，6.98-7.05(m，3H)，7.57(dd，1H，J＝3.0，8.5Hz).HFABMS m/z341.1310
(C₁₉H₁₈FN₂O₃的理论值，MH⁺，341.1301)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-[1]-苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑(191)：产率36％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.39(s，3H)，3.07(dd，1H，J＝4.5，12.3Hz)，3.33(dd，1H，J＝12.3Hz)，3.57-3.62(m，1H)，3.79(s，3H)，3.86(s，3H)，)，5.02(d，1H，J＝8.5Hz)，6.87-6.90(m，2H)，7.09(d，1H，J＝9.0Hz)，7.20-7.23(m，2H)，7.52(d，1H，J＝3.0Hz).HFABMS m/z 369.1273
(C₂₀H₂₁N₂O₃S的理论值，MH⁺，369.1273)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-[1]-苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑(192)：产率52％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.41-2.51(m，2H)，2.45(s，3H)，3.77(s，3H)，3.86(s，3H)，3.89-3.95(m，1H)，5.67(d，1H，J＝11.0Hz)，6.83-6.85(m，2H)，6.88(dd，1H，J＝3.0，8.8Hz)，7.00-7.03(m，2H)，7.09(d，1H，J＝9.0Hz)，7.65(d，1H，J＝3.0Hz).HFABMS m/z 369.1267
(C₂₀H₂₁N₂O₃S的理论值，MH⁺，369.1273)。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-羟苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(175)的制备：在氢气氛下搅拌(174)(0.370mg，0.86mmo1)和5％的Pd-C(10mg)在乙酸乙酯(20mL)中的混合物20小时，然后用celite垫片过滤。然后，连续用乙酸乙酯和乙酸洗涤该celite。浓缩混合的滤液。从乙酸乙酯中重结晶得到的固体，得到(175)(0.185g，63％)：
mp 240-41℃，¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO-CDCl₃)：δ0.99-1.11(m，1H)，1.72-1.76(m，1H)，2.43(s，3H)，2.67-2.83(m，2H)，3.46-3.53(m，1H)，3.87(s，3H)，5.61(d，J＝10.8Hz，1H)，6.74(d，J＝8.4Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，6.61(m，1H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.43-7.46(m，1H)，7.52(d，J＝3.2Hz，1H).
(C₂₀H₂₀N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-羟苯基)-8-羟基-2H-苯并[g]吲唑(176)的制备：在氩气氛下，在-78℃，向(175)(0.100g，0.28mmol)在二氯甲烷(5mL)的溶液中加入BBr₃(1.0mL，在二氯甲烷中的1.0M溶液)。在室温下，搅拌该反应混合物1小时，然后将其倾入冰冷的HCl溶液(1.0N)中。在乙酸乙酯中萃取该混合物。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。从乙酸乙酯中重结晶得到的固体，得到(176)：(62mg，67％)：mp 164-67℃，
¹H NMR(400MHz，DMSO-CDCl₃)：δ0.70-0.90(m，1H)，1.41-1.46(m，1H)，2.41-2.57(m，5H)，3.15-3.22(m，1H)，5.29(d，J＝11.2Hz，1H)，6.43(d，J＝6.8Hz，2H)，6.53-6.57(m，3H)，6.68(d，J＝8.4Hz，1H)，7.19(s，1H).HFABMS m/z323.1399
(C₁₉H₁₈N₂O₃的理论值，MH⁺，323.1396)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-5，5-二氧-8-甲氧基-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑(193)和(3R，3aR)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-5，5-二氧-8-甲氧基-[1]苯并硫代吡喃[4，3-c]吡唑(194)的制备：在0℃，用MCPBA(60mg)处理(191)(21mg，0.057mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。在室温下搅拌该反应混合物16小时，然后用乙酸乙酯(50mL)稀释，连续用饱和的NaHCO₃和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，使用乙酸乙酯-己烷(2∶3)作为洗脱剂，得到呈白色固体的(193)(96％)。按类似的方法从(192)制备(194)(92％)。
(193)：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.41(s，3H)，3.54-3.62(m，2H)，3.81(s，3H)，3.95(s，3H)，4.09-4.15(m，1H)，5.03(d，1H，J＝10.5Hz)，6.89-6.92(m，2H)，7.14(dd，1H，J＝2.3，8.8)，7.21-7.24(m，2H)，7.56(d，1H，J＝2.5Hz)，7.88(d，1H，J＝9.0Hz).HFABMS m/z401.1159
(C₂₀H₂₁N₂O₅S的理论值，MH⁺，401.1171)。
(194)：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.48(s，3H)，2.68(dd，1H，J＝13.8Hz)，3.11(dd，1H，J＝4.3，13.8Hz)，3.77(s，3H)，3.95(s，3H)，4.40-4.46(m，1H)，5.80(d，1H，J＝11.5Hz)，6.84-6.86(m，2H)，6.96-6.98(m，2H)，7.14(dd，1H，J＝3.0，9.0Hz)，7.64(d，1H，J＝2.5Hz)，7.86(d，1H，J＝9.5Hz).HFABMS m/z401.1160
(C₂₀H₂₁N₂O₅S的理论值，MH⁺，401.1171)。
(3R，3aS)-rel-2-甲酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(195)和(3R，3aR)-rel-2-甲酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(147)的制备：在120℃，加热2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(2.0g，0.0068mol)、水合肼(2.0mL)在甲酸(20mL)中的溶液2天。浓缩该反应混合物，然后，用乙酸乙酯萃取。连续用水、饱和的NaHCO₃水溶液、水和盐水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，.使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱液，得到化合物(195)(0.740g，32％)和(147)(0.905g，40％)。
(195)：mp 166-68℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.90-1.99(m，1H)，2.27-231(m，1H)，2.86-2.90(m，2H)，3.21-3.28(m，1H)，3.80(s，3H)，3.86(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.90-6.98(m，3H)，7.10(d，J＝8.8Hz，1H)，7.25-7.27(m，2H)，7.43(d，J＝2.4Hz，1H)，8.97(s，1H).
(C₂₀H₂₀N₂O₃)的分析：C，H，N。
(147)：mp 155-59℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.01-1.12(m，1H)，1.69-1.74(m，1H)，2.68-2.85(m，2H)，3.49-3.76(m，1H)，3.76(s，3H)，3.81(s，3H)，5.58(d，J＝11.2Hz，1H)，6.78-7.04(m，6H)，7.48(d，J＝3.2Hz，1H)，8.94(s，1H).
(C₂₀H₂₀N₂O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aS)-rel-2-丙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(196)和(3R，3aR)-rel-2-丙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(148)的制备：在140℃下，回流2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(0.500g，1.7mmol)和水合肼(0.5mL)在丙酸(5mL)中的溶液2天。浓缩该反应混合物，并将残余物溶于乙酸乙酯(25mL)中。连续用水、饱和的NaHCO₃水溶液和水洗涤混合物，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，使用乙酸乙酯-己烷(3∶7)作为洗脱液，得到(196)(0.217g，35％)和(148)(0.252g，41％)。
(196)：mp 133-36℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.15(t，J＝7.6Hz，3H)，1.85-1.96(m，1H)，2.23-2.29(m，1H)，2.74-2.87(m，4H)，3.15-3.22(m，1H)，3.78(s，3H)，3.86(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.87-6.92(m，3H)，7.08(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44(d，J＝2.4Hz，1H).
(C₂₂H₂₄N₂O₃)的分析：C，H，N。
(148)：mp 150-52℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.05-1.10(m，1H)，1.21(t，J＝8.0Hz，3H)，1.70-1.78(m，1H)，2.74-2.88(m，4H)，3.47-3.52(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.65(d，J＝11.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.4Hz，2H)，6.89-6.92(dd，J＝3.2和8.4Hz，1H)，6.98(d，J＝8.8Hz，2H)，7.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.54(d，J＝3.2Hz，1H).
(C₂₂H₂₄N₂O₃)的分析：C，H，N。
用于制备2-取代的(3R，3aS)-rel-和(3R，3aR)-rel-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑，举例为(3R，3aS)-rel-2-乙酰氧基乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(197)和(3R，3aR)-rel-2-乙酰氧基乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(150)的一般方法：回流2-(4-甲氧苯亚甲基)-1-四氢萘酮(1.0g，3.4mmol)、三甲基乙酸(5.0g)、水合肼(1.0mL)在乙醇(5mL)中的溶液6小时，然后浓缩。将得到的残余物溶于乙酸乙酯(10mL)中，然后用水洗涤。将有机层慢慢地倾入饱和的NaHCO₃溶液(10mL)中。用乙酰氧基乙酰基氯化物(1.83mL，17mmol)缓慢地处理得到的溶液。在室温下，搅拌该反应混合物30分钟。分离乙酸乙酯层，连续用水和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(2∶3)作为洗脱剂，得到化合物(197)(11％)和(150)(68％)。
(197)：mp 159-61℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.87-1.98(m，1H)，2.13(s，3H)，2.26-2.31(m，1H)，2.86-2.89(m，2H)，3.17-3.24(m，1H)，3.78(s，3H)，3.86(s，3H)，4.90(d，J＝9.2Hz，1H)，5.09(d，J＝15.6Hz，1H)，5.22(d，J＝15.6Hz，1H)，6.87-6.95(m，3H)，7.10(d，J＝8.8Hz，1H)，7.24(d，J＝8.8Hz，2H)，7.41(d，J＝3.2Hz，1H).
(C₂₃H₂₄N₂O)的分析：C，H，N。
(150)：mp 201-204℃，¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.05-1.16(m，1H)，1.73-1.77(m，1H)，2.16(s，3H)，2.72-2.89(m，2H)，3.48-3.55(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，5.16-5.25(m，2H)，5.64(d，J＝11.2Hz，1H)，6.80(d，J＝8.8Hz，2H)，6.91-6.94(dd，J＝2.0和8.4Hz，1H)，6.99(d，J＝8.8Hz，2H)，7.07(d，J＝7.49(d，J＝3.2Hz，1H).
(C₂₃H₂₄N₂O₅)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-2-甲氧基乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(158)：产率16％，mp 157-59℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.06-1.12(m，1H)，1.75-1.77(m，1H)，2.76-2.88(m，2H)，3.46-3.50(m，1H)，3.51(s，3H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，4.54(d，J＝16.0Hz，1H)，4.66(d，J＝16.0Hz，1H)，5.68(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝9.5Hz，2H)，6.91-6.93(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，6.98(d，J＝9.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.0Hz，1H)，7.50(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMSm/z 381.1810
(C₂₂H₂₄N₂O₄的理论值：MH⁺，381.1814)。
(3R，3aR)-rel-2-三氟乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(159)：产率22％，mp 220-22℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.09-1.18(m，1H)，1.75-1.80(m，1H)，2.77-2.89(m，2H)，3.53-3.59(m，1H)，3.76(s，3H)，3.87(s，3H)，5.68(d，J＝10Hz，1H)，6.84(d，J＝8.5Hz，2H)，6.94-6.97(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.5Hz，1H)，7.56(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 405.1432
(C₂₁H₁₉F₃N₂O₃的理论值，MH⁺，405.1426)。
(3R，3aR)-rel-2-羟基乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(151)的制备：在室温下，向150(0.150g，0.36mmol)在甲醇(10mL)的溶液中加入NaOH(50％，2mL)。在室温下，搅拌该反应混合物24小时，之后，用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱柱色谱纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯-己烷(2∶3)作为洗脱剂，洗脱出(151)(0.105g，78％)：mp163-64℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.06-1.17(m，1H)，1.72-1.78(m，1H)，2.76-2.89(m，2H)，3.76(s，3H)，3.87(s，3H)，4.55-7.70(m，2H)，5.66(d，J＝10.0Hz，1H)，6.82(d，J＝9.2Hz，2H)，6.92-6.95(dd，J＝2.4和8.8Hz，1H)，6.99(d，J＝9.2Hz，2H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(d，J＝2.4Hz，1H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)：δ24.38，28.90，48.57，55.46，55.76，61.40，69.61，108.02，114.34，119.12，127.53，127.84，128.47，130.32，132.61，157.67，158.36，159.42，168.66.
(C₂₁H₂₂N₂O₄)的分析：C，H，N。
用于制备(3R，3aR)-rel-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑的2-硫代酰胺和2-甲酰胺的一般方法。举例为(3R，3aR)-rel-2-硫代酰胺-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(152)：回流2-(4-甲氧苯亚甲基)-7-甲氧基-1-四氢萘酮(0.850g，0.0028mol)和氨基硫脲(0.790g，0.0084mol)在乙醇(30mL)和浓HCl(2mL)中的混悬液6小时。将得到的溶液冷却至室温。过滤分离固体沉淀物，用乙醇洗涤，然后从乙醇中重结晶，得到(152)(0.985g，96％)：mp 236-39℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.04-1.13(m，1H)，1.76-1.81(m，1H)，2.75-2.87(m，2H)，3.60-3.66(m，1H)，3.76(s，3H)，3.85(s，3H)，6.07(d，J＝10.5Hz，1H)，6.83(d，J＝9.0Hz，2H)，6.93-6.95(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.99(d，J＝9.0Hz，2H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，7.49(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 368.1439
(C₂₀H₂₁N₃O₂S的理论值，MH⁺，368.1433)。
(3R，3aR)-rel-2-甲酰胺-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(153)：产率75％，mp 217-20℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.02-1.11(m，1H)，1.74-1.79(m，1H)，2.73-2.86(m，2H)，3.54-3.60(m，1H)，3.75(s，3H)，3.86(s，3H)，5.58(d，J＝10.5Hz，1H)，6.81(d，J＝8.5Hz，2H)，6.88-6.90(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H)，7.05(d，J＝8.5Hz，1H)，7.47(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z352.1663
(C₂₀H₂₁N₃O₃的理论值，MH⁺，352.1663)。
(3R，3aR)-rel-2-硫代酰胺-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-N-甲基-2H-苯并[g]吲唑(154)：产率28％，mp 199-200℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.02-1.11(m，1H)，1.76-1.81(m，1H)，2.75-2.86(m，2H)，3.21(d，J＝5.0Hz，3H)，3.56-3.62(m，1H)，3.75(s，3H)，3.87(s，3H)，6.10(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.91-6.94(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，6.96(d，J＝8.5Hz，2H)，7.07(d，J＝8.5Hz，1H)，7.46(m，1H)，7.48(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z382.1579
(C₂₁H₂₃N₃O₂S的理论值，MH⁺，382.1589)。
(3R，3aR)-rel-2-carboxamidine-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(156)的制备：回流(152)(0.5g，1.3mmol)和碘代甲烷(1.0mL)在乙醇(10mL)中的溶液2小时。当将该反应混合物浓缩至其体积四分之一时，形成固体沉淀物。过滤该混合物，并用冷的乙醇洗涤固体，得到(156)(565mg，85％)，使用而无需进一步纯化。在60℃，搅拌(156)(175mg，0.34mmol)和氨水(在乙醇中的2.0N溶液，15mL)在乙醇(15mL)中的溶液16小时。浓缩该反应混合物。从甲醇-乙醚中重结晶该固体，得到(157)(105mg，88％)：mp 170-75℃；
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.07-1.15(m，1H)，1.74-1.78(m，1H)，2.76-2.89(m，2H)，3.77(s，3H)，3.79-3.84(m，1H)，3.88(s，3H)，6.19(d，J＝10.5Hz，1H)，6.86(d，J＝8.5Hz，2H)，6.97-6.99(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.10(d，J＝8.5Hz，2H)，7.50(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 351.1825
(C₂₀H₂₂N₄O₂的理论值，MH⁺，351.1821)。
(3R，3aR，5S)-rel-2-乙酰基-5-叠氮-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(143)和2-乙酰基-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(144)的制备：在氩气氛下，向(141)(800mg，2.2mmol)在乙腈(10mL)的溶液中加入三甲基硅烷基叠氮化物(1.517mL，5.0当量)，然后缓慢加入[二(三氟乙酰氧基)碘]-苯(2.948g，3.0当量)。在室温下，搅拌该反应混合物24小时。浓缩该反应混合物，得到暗褐色残余物，将其通过硅胶柱色谱纯化，使用乙酸乙酯-己烷(1∶3)作为洗脱剂，得到(143)(252mg，29％)、(144)(239mg，31％)，并回收起始原料(141)(45mg)。
(143)稠油状物，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.24-1.28(m，1H)，1.82-1.88(m，1H)，2.46(s，3H)，3.74(s，3H)，3.86-3.89(m，1H)，3.91(s，3H)，4.66(m，1H)，5.70(d，J＝11.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.96(d，J＝8.5Hz，2H)，7.0-7.02(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.19(d，J＝9.0Hz，1H)，7.60(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 392.1722MH⁺，392.1723).
(C₂₁H₂₂N₅O₃的理论值，MH⁺，392.1723)。
(144)：mp 169-73℃，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ3.02(s，3H)，3.91(s，3H)，4.04(s，3H)，7.10(d，J＝8.5Hz，2H)，7.27-7.29(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.74(d，J＝2.5Hz，2H)，7.87(d，J＝8.5Hz，1H)，7.92(d，J＝8.5Hz，2H)，8.96(d，J＝2.5Hz，1H).HFABMS m/z 347.1365
(C₂₁H₁₉N₂O₃的理论值，MH⁺，347.1396)。
(3R，3aR，5S)-rel-2-乙酰基-5-氨基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(145)的制备：在氢气(80psi)下，搅拌(143)(0.240g，0.61mmol)和10％的Pd-C(50mg)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液24小时。通过短的celite柱过滤该反应混合物。将滤液与乙酸水溶液(50％，10ml)研磨。然后，从乙酸乙酯-水中重结晶该固体，得到(145)(0.153g，59％)：mp 116-19℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.68-1.72(m，1H)，2.10-2.12(m，1H)，2.62(s，3H)，3.75(s，3H)，3.88(s，3H)，4.01-4.07(m，1H)，4.14-4.16(m，1H)，5.69(d，J＝11.0Hz，1H)，6.80(d，J＝8.5Hz，2H)，6.95-6.98(m，3H)，7.19(d，J＝9.0Hz，1H)，7.53(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 366.1818
(C₂₁H₂₄N₃O₃的理论值，MH⁺，366.1818)。
(3R，3aR，5S)-rel-2-乙酰基-5-(N，N-二甲氨基)-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(146)的制备：在0℃，向(145)(210mg，0.57mmol)在THF(10mL)的溶液中加入甲酸(0.150mL)，然后缓慢地加入甲醛水溶液(37wt％)。在室温下，回流该反应混合物24小时。将该溶液冷却，用NaOH水溶液(25wt％)碱化，并用乙酸乙酯萃取。用水洗涤有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，使用乙酸乙酯作为洗脱剂，得到(146)(105mg，47％)：mp123-28℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ0.9-1.02(m，1H)，2.21(s，6H)，2.43(s，3H)，3.23(m，1H)，3.73(s，3H)，3.89(s，3H)，4.03-4.09(m，1H)，5.66(d，J＝11.0Hz，1H)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90-6.92(dd，J＝2.5和8.5Hz，1H)，6.96(d，J＝8.5Hz，2H)，7.12(d，J＝8.5Hz，1H)，7.58(d，J＝2.5Hz，1H).
(C₂₃H₂₇N₃O₃)的分析：C，H，N。
(3R，3aR)-rel-乙基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(157)的制备：在室温下，向(141)(180mg，0.51mmol)在THF(5mL)的溶液中加入LiAlH₄(2.056mL，2.056mmol；在THF中1M)。在室温下，搅拌该反应混合物1小时，然后用甲醇淬灭，接着用冰淬灭。用乙酸乙酯萃取该反应混合物。用水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化该残余物，使用25％的乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂，得到(157)(30mg，17％)：稠油状物，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.40(t，J＝7.0Hz，3H)，1.72-2.04(m，2H)，2.62-2.85(m，2H)，3.87(s，6H)，4.15(q，J＝7.0Hz，2H)，4.75(d，J＝10.5Hz，1H)，6.75-6.77(dd，J＝8.0和3.0Hz，1H)，7.01(d，J＝8.0Hz，2H)，7.12(d，J＝8.5Hz，1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H)，7.44(d，J＝3.0Hz，1H).LRMS m/z 336.3
(C₂₁H₂₄N₂O₂的理论值，M⁺，336.2)。
化合物198-212的表征
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-7，8-二甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(198)：产率28％，mp 231-33℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.92-1.97(m，1H)，2.24-2.27(m，1H)，2.40(s，3H)，2.86-2.90(m，2H)，3.11-3.18(m，1H)，3.89(s，3H)，3.96(s，3H)，4.89(d，J＝9.6Hz，1H)，6.63(s，1H)，7.01-7.06(dd，J＝2.4和8.8Hz，2H)，7.26-7.29(m，2H)，7.38(s，1H).HRFABMS m/z 369.5
(C₂₁H₂₂FN₂O₃的理论值，MH⁺，369.4095)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-氟苯基)-2H-苯并[g]吲唑(199)：产率15％，mp 168-71℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ2.00-2.04(m，1H)，2.31-2.35(m，1H)，2.42(s，3H)，2.96-2.99(m，2H)，3.19-3.25(m，1H)，4.97(d，J＝12.0Hz，1H)，7.07(t，J＝8.0Hz，2H)，7.22(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28-7.35(m，4H)，7.99(d，J＝8.0Hz，1H).
C₁₉H₁₇FN₂O的理论值：C，74.01；H，5.56；N，9.08。实测值：C，73.88；H，5.48；N，9.12。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(3-氟苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(200)：产率30％，mp 196-99℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.92-1.99(m，1H)，2.27-2.32(m，1H)，2.42(s，3H)，2.86-2.89(m，2H)，3.14-3.20(m，1H)，3.87(s，3H)，4.93(d，J＝7.2Hz，1H)，6.91-7.01(m，3H)，7.08-7.10(m，2H)，7.29-7.34(m，1H)，7.43(d，J＝2.0Hz，1H).HFABMS m/z 339.1419
(C₂₀H₁₉FN₂O₂的理论值，MH⁺，339.1509)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-2H-苯并[g]吲唑(201)：产率20％，mp 260-62℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.91-2.00(m，1H)，2.27-2.32(m，1H)，2.38(s，3H)，2.99-2.95(m，2H)，3.20-3.25(m，1H)，3.78(s，3H)，4.91(d，J＝9.5Hz，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，2H)，7.17(d，J＝2.5Hz，1H)，7.23-7.34(m，4H)，7.86(d，J＝7.0Hz，1H).).
C₂₀H₂₀N₂O₂的理论值：C，74.98；H，6.29；N，8.74。实测值：C，74.15；H，6.18；N，8.58。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-硝氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(202)：产率20％，mp 170-75℃，
¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ1.90-2.01(m，1H)，2.23-2.28(m，1H)，2.38(s，3H)，2.83-2.87(m，2H)，3.10-3.17(m，1H)，3.83(s，3H)，4.98(d，J＝9.2Hz，1H)，6.89-6.91(dd，J＝2.4和7.6Hz，1H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.40(d，J＝2.4Hz，1H)，7.43(d，J＝8.4Hz，2H)，8.19(d，J＝8.4Hz，2H).HFABMS m/z366.1462
(C₂₀H₁₉N₃O₄的理论值，MH⁺，366.1454)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-6-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(203)：产率27％，mp 175-78℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.85-1.89(m，1H)，2.32-2.35(m，1H)，2.38(s，3H)，2.53-2.60(m，1H)，3.09-3.18(m，2H)，3.79(s，3H)，3.84(s，3H)，4.91(d，J＝9.5Hz，1H)，6.86-6.89(m，3H)，7.23-7.27(m，3H)，7.57(d，J＝7.5Hz，1H).).
C₂₁H₂₂N₂O₃的理论值：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，71.72；H，6.35；N，8.02。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-苄氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(204)：产率11％，mp 149-51℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.88-1.97(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.39(s，3H)，2.86-2.88(m，2H)，3.17-3.22(m，1H)，3.87(s，3H)，4.95(d，J＝9.2Hz，1H)，5.07(s，2H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，6.96(d，J＝9.0Hz，2H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.23(d，J＝8.5Hz，2H)，7.25(s，1H)，7.30-7.43(m，4H).
C₂₇H₂₆N₂O₃的理论值：C，76.03；H，6.14；N，6.57。实测值：C，76.07；H，5.95；N，6.60。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(3，4-亚甲基二氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(205)：产率21％，mp 165-69℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.87-1.94(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.41(s，3H)，2.86-2.88(m，2H)，3.14-3.19(m，1H)，3.84(s，3H)，4.87(d，J＝9.4Hz，1H)，5.94(s，2H)，6.76-6.78(m，3H)，6.90-6.93(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.09(d，J＝9.0Hz，1H)，7.42(d，J＝2.5Hz，1H).
C₂₁H₂₀N₂O₄的理论值：C，69.22；H，5.53；N，7.69。实测值：C，68.94；H，5.65；N，7.60。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(3，4-亚乙基二氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(206)：产率28％，mp 194-97℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.82-1.94(m，1H)，2.25-2.30(m，1H)，2.40(s，3H)，2.82-2.84(m，2H)，3.16-3.20(M，1H)，3.86(s，3H)，4.27(s，4H)，4.82(d，J＝9.0Hz，1H)，6.77-6.81(m，2H)，6.84(d，J＝8.0Hz，1H)，6.90-6.92(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，7.42(d，J＝2.5Hz，1H).
C₂₂H₂₂N₂O₄的理论值：C，69.83；H，5.86；N，7.40。实测值：C，68.58；H，5.75；N，7.25。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-9-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(207)：产率14％，mp 158-62℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.91-1.99(m，1H)，2.23-2.28(m，1H)，2.42(s，3H)，2.95-2.97(m，2H)，3.19-3.24(m，1H)，3.79(s，3H)，3.98(s，3H)，4.84(d，J＝9.0Hz，1H)，6.79-6.80(dd，J＝1.0和8.5Hz，1H)，6.84(d，J＝8.5Hz，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，2H)，7.25-7.28(m，3H).).
C₂₁H₂₂N₂O₃的理论值：C，71.98；H，6.33；N，7.99。实测值：C，71.91；H，6.38；N，7.96。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-苄氧基-2H-苯并[g]吲唑(208)：产率19％，mp 144-46℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.88-1.97(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.38(s，3H)，2.86-2.88(m，2H)，3.17-3.22(m，1H)，3.79(s，3H)，4.90(d，J＝9.5Hz，1H)，5.12(s，2H)，6.89(d，J＝9.0Hz，2H)，6.97-6.99(dd，J＝2.0和8.5Hz，1H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.24(d，J＝9.0Hz，2H)，7.33-7.36(m，1H)，7.39-7.42(m，2H)，7.46-7.47(m，2H)，7.53(d，J＝2.0Hz，1H).HFABMS m/z427.2029
(C₂₇H₂₆N₂O₃的理论值，MH⁺，427.2022)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-硫代甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(209)：产率19％，mp 144-45℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.89-1.98(m，1H)，2.25-2.30(m，1H)，2.40(s，3H)，2.46(s，3H)，2.85-2.88(m，2H)，3.15-3.21(m，1H)，3.86(s，3H)，4.90(d，J＝9.5Hz，1H)，6.90-6.93(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.09(d，J＝9.0Hz，1H)，7.22-7.25(m，4H)，7.43(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 367.1471
(C₂₁H₂₂N₂O₂S的理论值，MH⁺，367.1480)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-(4-吗琳基)-乙氧基-2H-苯并[g]吲唑(210)：产率30％，mp 97-99℃，
¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.88-1.96(m，1H)，2.25-2.29(m，1H)，2.38(s，3H)，2.60(t，J＝3.6Hz，4H)，2.82-2.87(m，4H)，3.17-3.22(m，1H)，3.75(t，J＝4.5Hz，4H)，3.79(s，3H)，4.17(d，J＝5.5Hz，2H)，4.90(d，J＝9.5Hz，1H)，6.88(d，J＝9.5Hz，2H)，6.91-6.93(dd，J＝3.0和9.0Hz，1H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，7.24(d，J＝9.0Hz，2H)，7.45(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z450.2393
(C₂₆H₃₁N₃O₄的理论值，MH⁺，450.2393)。
(3R，3aS)-rel-2-乙酰基-2，3，3a，4-四氢-3-(4-氟苯基)-8-氟-甲氧基-[1]-苯并吡喃[4，3-c]吡唑(211)：产率34％，mp 174-76℃，
¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.40(s，3H)，3.50-3.56(m，1H)，3.84(s，3H)，4.10-4.14(dd，J＝10.5和12.5Hz，1H)，4.55-4.59(dd，J＝6.0和10.5Hz，1H)，4.97(d，J＝9.5Hz，1H)，6.86(d，J＝8.5Hz，1H)，6.92-6.94(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.05(dd，J＝8.5和9Hz，2H)，7.25-7.28(m，3H).HFABMS m/z 341.1306
(C₁₉H₁₇FN₂O₃的理论值，MH⁺，341.1301)。
(3R，3aS)-rel-2-甲氧基乙酰基-3，3a，4，5-四氢-3-(4-甲氧基苯基)-8-甲氧基-2H-苯并[g]吲唑(212)：产率49％，mp 124-27℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.87-1.96(m，1H)，2.26-2.30(m，1H)，2.86-2.88(m，2H)，3.15-3.21(m，1H)，3.48(s，3H)，3.78(s，3H)，3.87(s，3H)，4.50(d，J＝16.0Hz，1H)，4.56(d，J＝16.0Hz，1H)，4.93(d，J＝9.5Hz，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，2H)，6.91-6.94(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.10(d，J＝8.5Hz，1H)，7.22(d，J＝9.0Hz，2H)，7.40(d，J＝3.0Hz，1H).
坏死样凋亡抑制活性的评价
使用本文描述的用TNFα处理的人Jurkat T细胞的FADD-不足的变体进行坏死样凋亡活性评价。为了测定EC₅₀值，在提高浓度的试验化合物存在下，用10ng/mL的人TNFα处理细胞(500,000个细胞/mL，在96孔培养板中，每孔100μL)24小时，接着进行ATP-基生存力评价。化合物测定浓度为0.03-100μM。使用商业的发冷光的ATP-基试验药盒(CellTiter-Glo，Promega，Madison，WI)进行细胞生存力评价。对于非特异性毒性，调节计算细胞生存力值，在大多数情况下，其为＜10％。使用非线性回归分析来自log[I]比生存力值的曲线图的S形剂量-反应(可变斜率)曲线计算EC₅₀值。
实施例28.四氢萘酮的合成

7-苄氧基-1-四氢萘酮的制备：在室温下，在氩气氛下，向7-羟基-1-四氢萘酮(1.0g，0.0061mol)和K₂CO₃(5.5g)在DMF(20mL)中的混悬液中加入溴化苄(0.725mL，0.0061mol)。然后，在室温下，搅拌该反应混合物18小时，之后，倾入到冰上。用乙酸乙酯萃取该水溶液，用水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥。通过硅胶柱色谱纯化该残余物，使用乙酸乙酯-己烷(15％)作为洗脱剂，得到化合物7-苄氧基-1-四氢萘酮(1.395g，90％)：稠油状物，¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.09-2.14(m，2H)，2.63(d，J＝6.5Hz，2H)，2.90(d，J＝6.0Hz，2H)，5.75(s，2H)，7.11-7.13(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.17(d，J＝8.5Hz，1H)，7.31-7.45(m，5H)，7.62(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 253.1231
(C₁₇H₁₆O₂的理论值，MH⁺，253.1229)。

7-(2-吗琳基-4-基-乙氧基)-1-四氢萘酮的制备：在室温和在氩气氛下，向7-羟基-1-四氢萘酮(0.900g，5.5mol)吗啉盐酸化物K₂CO₃(5g)在DMF(20mL)中的混悬液中加入4-(-氯-乙基)吗啉盐酸化物(1.035gL，5.5mol)。在室温下，搅拌该反应混合物～16小时，之后倾到在冰上。在乙酸乙酯萃取该水溶液，用水洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化该残余物，使用乙酸乙酯-己烷(2∶8)作为洗脱剂，得到化合物7-(2-吗琳基-4-基乙氧基)-1-四氢萘酮(1.260g，83％)：稠油状物，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.08-2.14(m，2H)，2.56-2.58(m，4H)，2.63(t，J＝7.0Hz，2H)，2.80(t，J＝5.0Hz，2H)，2.88(t，J＝6.5Hz，2H)，3.73(t，J＝5.0Hz，2H)，4.14(t，J＝6.0Hz，2H)，7.06-7.08(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.17(d，J＝8.5Hz，1H)，7.51(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z276.1599
(C₁₆H₂₁NO₃的理论值，MH⁺，276.1600)。

7-(3-乙氧基羰基丙氧基)-1-四氢萘酮的制备：在室温和氩气氛下，向7-羟基-四氢萘酮(0.870g，5.3mmol)和K₂CO₃(5g，过量)在DMF(20mL)中的混悬液中加入乙基-4-溴丁酸酯(0.770mL，5.3mmol)。在室温下，搅拌该反应混合物～16小时，之后倾到在冰上。在乙酸乙酯中萃取该水溶液，用水洗涤，并用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化该残余物，使用乙酸乙酯-己烷(2∶8)作为洗脱剂，得到7-(3-乙氧基羰基丙氧基)-1-四氢萘酮(1.180g，80％)：mp 62-63℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ1.26(t，J＝7.0Hz，3H)，2.08-2.14(m，4H)，2.48-2.51(dd，J＝7.00和7.5Hz，2H)，2.62-2.64(dd，J＝6.0和6.5Hz，2H)，2.88-2.90(dd，J＝6.0和6.5Hz，2H)，4.02-4.05(dd，J＝6.0和6.5Hz，2H)，4.15(q，J＝7.0Hz，2H)，7.03-7.05(dd，J＝3.0和8.0Hz，1H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，7.49(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 277.1436
(C₁₆H₂₀O₄的理论值，MH⁺，277.1440)。

4-(8-氧-5，6，7-四氢-萘-2-基氧基)丁酸的制备：将7-(3-乙氧基羰基丙氧基)-1-四氢萘酮(1.100g，3.9mmol)溶于甲醇(20mL)中，用NaOH(2mL，10N)处理，并在室温下搅拌30分钟，和用稀HCl(1.0N)酸化。然后，在乙酸乙酯中萃取该反应混合物，用水洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。从乙酸乙酯-己烷中重结晶在乙酸乙酯浓缩后获得的残余物，得到4-(8-氧-5，6，7-四氢-萘-2-基氧基)丁酸(0.970g，99％)：mp 119-20℃，
¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.10-2.15(m，4H)，2.56-2.59(m，2H)，2.63(t，J＝6.5Hz，2H)，2.89(t，J＝6.5Hz，2H)，4.06(t，J＝6.5Hz，2H)，7.03-7.05(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.15(d，J＝8.5Hz，1H)，7.49(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMS m/z 249.1132
(C₁₄H₁₆O₄的理论值，MH⁺，249.1127)。

7-(4-吗啉-4-基-4-氧-丁氧基)-四氢萘酮的制备：在室温和氩气氛下，向7-(3-乙氧基羰基丙氧基)-1-四氢萘酮(07925g，3.7mmol)、HUBT(1.415g，3.7mmol)、N，N-二异丙基乙胺(1.3mL)在CH₂Cl₂(20mL)中的混悬液中加入吗啉(0.330mL，3.7mmol)。然后，在室温下，搅拌该反应混合物24小时，之后浓缩。将该残余物溶于乙酸乙酯(50mL)中，并用稀HCl、水、盐洗涤有机层，并用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。通过硅胶柱纯化该残余物，使用乙酸乙酯-己烷(8∶2)作为洗脱剂，得到7-(4-吗啉-4-基-4-氧-丁氧基)-1-四氢萘酮(1.010g，86％)：mp 88-90℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.07-2.15(m，4H)，2.50(t，J＝7.5Hz，2H)，2.61(T，J＝7.5Hz，2H)，2.88(t，J＝6.0Hz，2H)，3.46(t，J＝5.0Hz，2H)，3.59-3.66(m，6H)，4.04(t，J＝6.0Hz，2H)，7.01-7.03(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.15(d，J＝8.5Hz，1H)，7.48(d，J＝3.0Hz，1H).HFABMSm/z 318.1706
(C₁₈H₂₃NO₄的理论值，MH⁺，318.1705)。
使用碱性条件制备其它的2-亚芳基-1-四氢萘酮、2-(亚芳基)苯并二氢吡喃-4-酮和2-(亚芳基)硫代苯并二氢吡喃-4-酮的表征，除非其中标明。

R₁＝He；R₂＝4′-F：产率：70％，mp 114-17℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.95(t，J＝6.5Hz，2H)，3.09-3.12(m，2H)，7.09-7.13(dd，J＝9.0和8.5Hz，2H)，7.24-7.26(m，1H)，7.31-7.52(m，4H)，7.81(s，1H)，8.18(d，J＝9.00Hz，1H)，HFABMS m/z 253.1026
(C₁₇H₁₄FO的理论值，MH⁺，253.1029)。
R₁＝6-OMe；R₂＝4′-F：产率75％，mp 104-8℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.90-2.93(dd，J＝6.0和6.5Hz，2H)，3.06-3.10(m，2H)，3.87(s，3H)，6.71(d，J＝3.0Hz，1H)，6.87(dd，J＝2.5和9.0Hz，1H)，7.08-7.11(dd，J＝9.0和8.5Hz，2H)，7.39-7.42(dd，J＝8.5Hz each，2H)，7.76(s，1H)，8.11(d，J＝9.0Hz，1H).HFABMS m/z283.1132
(C₁₈H₁₆FO₂的理论值，MH⁺，283.1134)。
R₁＝6，7-二-OMe；R₂＝4′-F：产率89％，mp 151-53℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.88-2.91(dd，J＝6.5和7.0Hz，2H)，3.07-3.10(m，2H)，3.95(s，6H)，6.67(s，1H)，7.08-7.12(dd，J＝9.0和8.5Hz，2H)，7.39-7.42(m，2H)，7.62(s，1H)，7.77(s，1H).HFABMS m/z313.1237
(C₁₉H₁₈FO₃的理论值，MH⁺，313.1240)。
R₁＝7-OMe；R₂＝3′-F：产率57％，mp 95-97℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.89-2.91(m，2H)，3.07-3.10(m，2H)，3.87(s，3H)，7.03-7.21(m，4H)，7.39-7.40(m，1H)，7.61(d，J＝2.4Hz，1H)，7.78(s，1H).HFABMSm/z283.1230
(C₁₈H₁₆FO₂的理论值，MH⁺，283.1134)。
R₁＝5-OMe；R₂＝4′-OMe：产率69％，mp 97-101℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.91-2.98(m，2H)，3.09-3.12(m，2H)，3.85(s，3H)，3.87(s，3H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，7.04(d，J＝7.5Hz，1H)，7.31(t，J＝7.5Hz，1H)，7.43(d，J＝9.0Hz，2H)，7.74-7.76(dd，J＝1.0和7.5Hz，1H)，7.80(s，1H).HFABMS m/z295.1335
(C₁₉H₁₈O₃的理论值，MH⁺，295.1334)。
R₁＝7-OMe；R₂＝4′-OMe：产率78％，mp 133-37℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.87-2.90(dd，J＝6.0和7.0Hz，2H)，3.10-3.13(m，2H)，3.85(s，3H)，3.87(s，3H)，6.94-6.96(dd，J＝2.5和7.00Hz，2H)，7.05-7.07(dd，J＝2.5和8.00Hz，1H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，7.42-7.44(dd，J＝2.0和7.0Hz，2H)，7.61(d，J＝2.5Hz，1H)，7.83(s，1H).HFABMS m/z295.1339
(C₁₉H₁₉O₃的理论值，MH⁺，295.1339)。
R₁＝8-OMe；R₂＝4′-OMe：产率70％，mp 117-20℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.83-2.86(m，2H)，3.01-3.04(m，2H)，3.87(s，3H)，3.92(s，3H)，6.81-6.82(d，J＝7.0Hz，1H)，6.88(d，J＝8.5Hz，1H)，6.92(d，J＝9.0Hz，2H)，7.37-7.40(dd，J＝8.0和8.5Hz，1H)，7.42(d，J＝9.0Hz，2H)，7.82(s，1H).HFABMS m/z295.1335
(C₁₉H₁₉O₃的理论值，MH⁺，295.1334)。
R₁＝7-OMe；R₂＝4′-NO₂：产率86％，mp 158-62℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.91-2.94(dd，J＝6.5和6.0Hz，2H)，3.06-3.09(m，2H)，3.87(s，3H)，7.09-7.12(dd，J＝2.5和8.0Hz，1H)，7.19(d，J＝8.0Hz，1H)，7.57(d，J＝9.0Hz，2H)，7.62(d，J＝2.5Hz，1H)，7.83(s，1H)，8.27(d，J＝9.0Hz，2H).HFABMS m/z310.1081
(C₁₈H₁₆NO₄的理论值，MH⁺，310.1079)。
R₁＝H；R₂＝4′-OMe：产率64％，mp 110-13℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.94-2.96(t，J＝6.5Hz，2H)，3.13-3.16(m，2H)，3.87(s，3H)，6.94-6.97(m，2H)，7.25(d，J＝9.0Hz，1H)，7.34-7.37(dd，J＝7.5和7.0Hz，1H)，7.43(d，J＝9.0Hz，2H)，7.46-7.50(m，1H)，7.85(s，1H)，8.21(d，J＝8.0Hz，1H).HFABMS m/z265.1223
(C₁₈H₁₇O₂的理论值，MH⁺，265.1229)。
R₁＝7-OMe；R₂＝4′-OBn：产率53％，mp 119-24℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.87-2.89(dd，J＝6.0和7.0Hz，2H)，3.10-3.13(m，2H)，3.87(s，3H)，5.11(s，2H)，7.01-7.05(m，2H)，7.06(d，J＝3.0Hz，1H)，7.07(d，J＝3.0Hz，1H)，7.16(d，J＝8.5Hz，1H)，7.33-7.45(m，6H)，7.61(d，J＝3.0Hz，1H)，7.83(s，1H).HFABMS m/z371.1651
(C₂₅H₂₃O₃的理论值，MH⁺，371.1647)。
R₁＝7-OMe；R₂＝3′，4′-OCH₂O：产率57％，mp 134-35℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.87-2.90(dd，J＝6.0和7.0Hz，2H)，3.09-3.12(m，2H)，3.87(s，3H)，6.01(s，2H)，6.86(d，J＝8.5Hz，1H)，6.95-6.99(m，2H)，7.06(d，J＝2.5Hz，1H)，7.07(d，J＝2.5Hz，1H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，7.60(d，J＝3.0Hz，1H)，7.78(s，1H).HFABMS m/z309.1120
(C₁₉H₁₆O₄的理论值，MH⁺，309.1127)。
R₁＝7-OMe；R₂＝3′，4′-OCH₂CH₂O：产率61％，mp 128-34℃，
¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.87-2.89(dd，J＝6.0和6.5Hz，2H)，3.10-3.13(m，2H)，3.87(s，3H)，4.28-4.31(m，4H)，6.90(d，J＝8.0Hz，1H)，6.97-7.01(m，2H)，7.05-7.07(dd，J＝3.0和8.8Hz，1H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，7.60(d，J＝3.0Hz，1H)，7.76(s，1H).HFABMS m/z323.1279
(C₂₀H₁₉O₄的理论值，MH⁺，323.1283)。
R₁＝7-OBne；R₂＝4′-OMe：产率60％，mp 100-104℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.87-2.90(m，2H)，3.11-3.14(m，2H)，3.85(s，3H)，5.13(s，3H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，7.11-7.18(m，3H)，7.33-7.47(m，6H)，7.71(d，J＝2.5Hz，1H)，7.83(s，1H).HFABMS m/z371.1642
(C₂₅H₂₂O₃的理论值，MH⁺，371.1647)。
R₁＝7-OCH₂CH₂吗啉；R₂＝4′-OMe：产率79％，mp 62-65℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.59(t，J＝4.5Hz，4H)，2.82(t，J＝5.5Hz，2H)，2.88(t，J＝5.5Hz，2H)，3.10-3.13(m，2H)，3.74(t，J＝4.5Hz，4H)，3.85(s，3H)，4.18(t，J＝6.0Hz，2H)，6.95(d，J＝9.0Hz，2H)，7.07-7.09(dd，J＝2.5和8.0Hz，1H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，7.43(d，J＝9.0Hz，2H)，7.62(d，J＝3.0Hz，1H)，7.83(s，1H).HFABMS m/z394.2012
(C₂₄H₂₇NO₄的理论值，MH⁺，394.2018)。
R₁＝7-OCH₂CH₂CH₂C(O)吗啉；R₂＝4′-OMe：产率92％，mp：128-31℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.14-2.19(m，2H)，2.53(t，J＝6.5Hz，2H)，2.88(t，J＝6.5Hz，2H)，3.10-3.13(m，2H)，3.49(t，J＝5.0Hz，2H)，3.62-3.68(m，6H)，3.85(s，3H)，4.10(t，J＝6.5Hz，2H)，6.93-6.96(m，2H)，7.03-7.06(dd，J＝3.0和8.5Hz，1H)，7.16(d，J＝8.0Hz，1H)，7.43(d，J＝8.5Hz，2H)，7.60(d，J＝3.0Hz，1H)，7.83(s，1H).HFABMS m/z436.2119
(C₂₆H₂₉NO₅的理论值，MH⁺，436.2124)。
R₁＝7-OMe；R₂＝4′-SMe：产率68％，mp 104-6℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.52(s，3H)，2.87-2.90(m，2H)，3.09-3.12(m，2H)，3.87(s，3H)，7.06-7.08(dd，J＝3.0和8.0Hz，1H)，7.16(d，J＝9.0Hz，1H)，7.27(d，J＝8.5Hz，1H)，7.38(d，J＝8.5Hz，1H)，7.62(d，J＝3.0Hz，1H)，7.81(s，1H).HFABMS m/z311.1115
(C₁₉H₁₈O₂S的理论值，MH⁺，311.1106)。
R₁＝7-F；R₂＝4′-OMe：产率63％，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.91-2.93(m，2H)，3.13-3.16(m，2H)，3.88(s，3H)，6.96(d，J＝9.0Hz，2H)，7.16-7.24(m，2H)，7.44(d，J＝9.0Hz，2H)，7.78(dd，J₁＝9.0Hz，J₂＝2.5Hz，1H)，7.86(s，1H).

R₁＝7-OMe；R₂＝4′-F；X＝O：产率60％，mp 120-25℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ3.84(s，3H)，5.28(s，2H)，6.91(d，J＝9.0Hz，2H)，7.10-7.16(m，3H)，7.29-7.32(m，2H)，7.44(d，J＝3.5Hz，1H)，7.83(s，1H).
R₁＝7-Me；R₂＝4′-F；X＝O：产率53％，mp 145-49℃，
¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ2.34(s，3H)，5.90(s，2H)，6.87(d，J＝8.0Hz，1H)，7.11-7.16(m，2H)，7.28-7.31(m，3H)，7.80-7.81(m，1H).
R₁＝7-OMe；R₂＝4′-OMe；X＝O：利用酸性条件制备，产率62％，
¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ3.79(s，3H)，3.83(s，3H)，5.38(d，2H，J＝2.0Hz)，7.02(d，1H，J＝8.5Hz)，7.05-7.08(m，2H)，7.21(dd，1H，J＝3.3，9.3Hz)，7.30(d，1H，J＝3.5Hz)，7.43-7.46(m，2H)，7.72(1H，br s).
R₁＝7-F；R₂＝4’-OMe；X＝O：¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ3.83(s，3H)，5.43(d，2H，J＝2.0Hz)，7.05-7.08(m，2H)，7.13(dd，1H，J＝4.5，9.0Hz)，7.44-7.47(m，2H)，7.49(dd，1H，J＝3.5，9.0Hz)，7.55(dd，1H，J＝3.3，8.3Hz)，7.74(1H，br s).
R₁＝7-OMe；R₂＝4’-OMe；X＝S：¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ3.85(s，3H)，3.86(s，3H)，4.13(d，2H，J＝1.0Hz)，6.95-6.98(m，2H)，7.01(dd，1H，J＝2.8，8.8Hz)，7.22(d，1H，J＝9.0Hz)，7.37-7.40(m，2H)，7.69(d，1H，J＝3.0Hz)，7.76(s，1H).
燃烧分析
表10

HPLC方法和纯度评价
一般的HPLC信息：仪器：Agilent 1100。柱；DiscoveryC18，25cm×4.6mm，5μm。Inection volume：5-10μL。样品浓度：在100％乙腈中1-2mg/ml。λ：254nm
HPLC方法A：洗脱溶剂：66％甲醇；34％水。洗脱速率；0.75mL/分钟.
HPLC方法B：洗脱溶剂：50％乙腈；50％水。洗脱速率；1.00mL/分钟.
表11

实施例29.与Nec-3相关的化合物
合成下述Nec-3类化合物：

  编号 顺式或反式*  R  214 反式  CH₂OH  215 顺式  CH₂OH  216 反式  CH₃  217 顺式  CH₃
*指C3-芳基和C3a-甲基的相对立体化学结构。
使用下述合成方案制备化合物216)和(217)：
方案14

通常，可以通过给C3a位加入甲基或其它烷基或杂烷基来改性任一种Nec-3化合物。
其它实施方案
将上述说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请引入本文作为参考。本发明描述的方法和系统的各种修饰和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的，而没有背离本发明的范围和精神。尽管本发明已经描述了具体实施方案，应当理解，本发明将不限于这样的具体实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见地是，用于实施本发明所描述的各种改进都包括在本发明的范围内。其它实施方案在权利要求书中。