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1、10申请公布号CN104111339A43申请公布日20141022CN104111339A21申请号201410294733022申请日20140626G01N33/68200601C12Q1/6820060171申请人武汉市畜牧兽医科学研究所地址430208湖北省武汉市江夏区金口街纸金路长山2号72发明人程蕾王定发刘晓华向敏凌明湖胡修忠夏瑜74专利代理机构北京捷诚信通专利事务所普通合伙11221代理人魏殿绅庞炳良54发明名称基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途57摘要本发明公开了一种基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，涉及蛋白质检测领域。基于BRC。
2、A2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法包括以下步骤分别采集待检测奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、C2，判定C2大于等于16C1，确定待检测奶牛已经妊娠。BRCA2蛋白的用途，用于诊断奶牛是否妊娠。本发明能够在奶牛人工授精后18天进行妊娠诊断，只需要采集少量的奶牛血液就可以进行诊断，能够减少对奶牛生殖系统的损伤，节约劳动力，能够有效降低饲养管理的成本，提高奶牛场的经济效益。51INTCL权利要求书1页说明书13页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页附图2页10申请公布号CN。
3、104111339ACN104111339A1/1页21一种基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于，包括以下步骤分别采集待检测奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2，判定C2大于等于16C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。2如权利要求1所述的基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于所述测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2之后，还包括以下步骤判定C2小于16C1时，重复执行所有步骤。。
4、3如权利要求1或2所述的基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于采用蛋白质印迹法测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2。4一种BRCA2蛋白的用途，其特征在于用于诊断奶牛是否妊娠分别采集待检测奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2，判定C2大于等于16C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。5一种基于BRCA2蛋白对应的MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于，包括以下步骤采集待检测奶牛人工授精0天。
5、的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天的血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D2，判定D2大于等于2D1时，确定待检测奶牛已经妊娠。6如权利要求5所述的基于BRCA2蛋白对应的MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于所述分别检测第二血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D1、第一血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D2之后，还包括以下步骤判定D2小于2D1时，重复执行所有步骤。7如权利要求5或6所述的基于BRCA2蛋白对应的MRNA诊。
6、断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于，所述提取第一血液样本中的RNA并反转录成CDNA包括以下步骤提取第一血液样本中的RNA，将第一血液样本中的RNA反转录成对应的CDNA。8如权利要求7所述的基于BRCA2蛋白对应的MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，其特征在于，所述提取第二血液样本中的RNA并反转录成CDNA包括以下步骤提取第二血液样本中的RNA，将第二血液样本中的RNA反转录成对应的CDNA。9一种BRCA2蛋白对应的MRNA的用途，其特征在于用于诊断奶牛是否妊娠采集待检测奶牛人工授精0天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天的血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本。
7、中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D2，判定D2大于等于2D1时，确定待检测奶牛已经妊娠。权利要求书CN104111339A1/13页3基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途技术领域0001本发明涉及蛋白质检测领域，具体涉及一种基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途。背景技术0002快速诊断奶牛是否妊娠是改善牛场饲养管理、提高奶牛繁殖率的有效途径。现有的奶牛妊娠诊断方法包括直肠触诊法、直肠超声波法、孕酮测定诊断法、妊娠相关蛋白测定法和乳胶凝集实验法。0003现有的奶牛妊娠诊断方法存在以下缺陷。
8、00041直肠触诊法是通过实践经验丰富的工作人员触摸奶牛直肠、检测奶牛的胚胎，能够判断妊娠时间为4050天的奶牛是否妊娠，直肠超声波法是通过专职技术人员操作B超仪，对待检测奶牛进行检测，能够判断妊娠时间为27天的奶牛是否妊娠。0005直肠触诊法和直肠超声波法的劳动强度较大，不仅工作效率较低，而且难以在奶牛妊娠早期进行诊断，容易造成奶牛的产犊间隔延长、繁殖率降低、产奶量减少，增加了饲养管理的成本，降低了奶牛养殖的经济效益。0006采用直肠触诊法进行诊断时，容易触及子宫和胎膜，对早期胚胎造成伤害，甚至导致母牛直肠组织破坏。00072孕酮测定诊断法是通过采集配种2124天后的奶牛的奶样，通过测定奶样。
9、中孕酮的含量判断对应的奶牛是否妊娠。0008孕酮测定诊断法包括放射免疫测定法和酶免疫测定法，放射免疫法的标记物具有放射性，检测设备价格较高，检测周期较长；酶免疫测定法时，存在假阳性问题，难以判断奶牛是否妊娠。发明内容0009针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，能够降低劳动强度强度，提高工作效率，能够在奶牛妊娠早期进行诊断，不仅成本较低，而且比较准确。0010为达到以上目的，本发明采取的技术方案是一种基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，包括以下步骤0011分别采集待检测奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本；测定奶。
10、牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2，判定C2大于等于16C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。0012在上述方案的基础上，所述测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2之后，还包括以下步骤判定C2小于16C1时，重复执行所有步骤。0013在上述方案的基础上，采用蛋白质印迹法测定奶牛人工授精0天的血液样本中说明书CN104111339A2/13页4BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2。0014一种BRCA2蛋白的用途，。
11、用于诊断奶牛是否妊娠分别采集待检测奶牛人工授精0天、人工授精18天的血液样本；测定奶牛人工授精0天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C1、奶牛人工授精18天的血液样本中BRCA2蛋白的含量C2，判定C2大于等于16C1时，确定待检测奶牛已经妊娠。0015一种基于BRCA2蛋白对应的MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，包括以下步骤采集待检测奶牛人工授精0天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天的血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D2，判定D2大于等于2D1时，确定待检。
12、测奶牛已经妊娠。0016在上述方案的基础上，所述分别检测第二血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D1、第一血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D2之后，还包括以下步骤判定D2小于2D1时，重复执行所有步骤。0017在上述方案的基础上，所述提取第一血液样本中的RNA并反转录成CDNA包括以下步骤提取第一血液样本中的RNA，将第一血液样本中的RNA反转录成对应的CDNA。0018在上述方案的基础上，所述提取第二血液样本中的RNA并反转录成CDNA包括以下步骤提取第二血液样本中的RNA，将第二血液样本中的RNA反转录成对应的CDNA。0019一种BRCA2蛋白对应的MRN。
13、A的用途，用于诊断奶牛是否妊娠采集待检测奶牛人工授精0天的血液样本，作为第一血液样本；采集待检测奶牛人工授精18天的血液样本，作为第二血液样本；分别检测第一血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D1、第二血液样本中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量D2，判定D2大于等于2D1时，确定待检测奶牛已经妊娠。0020与现有技术相比，本发明的优点在于00211本发明提供的基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，能够在人工授精后18天，通过检测奶牛血液样本中的BRCA2蛋白、MRNA的相对表达量，诊断该奶牛是否妊娠，与现有的直肠触诊法相比，不仅能够减少对奶牛生殖系统的。
14、损伤，而且能够在奶牛妊娠早期进行诊断，有效降低饲养管理的成本，提高奶牛养殖的经济效益。00222本发明提供的基于BRCA2蛋白、MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法及用途，能够通过测定奶牛血液样本中的BRCA2蛋白和MRNA的相对表达量，判断待测奶牛妊娠18天BRCA2蛋白的含量是否高于奶牛人工授精后0天BRCA2蛋白的含量的16倍以上；或者判断奶牛妊娠18天后BRCA2蛋白对应的MRNA的表达量，是否高于2倍的奶牛人工授精0天BRCA2蛋白对应的MRNA的表达量。与现在生产中常见的妊娠诊断技术相比，不仅操作比较简单，而且准确度较高。附图说明0023图1为本发明中不同妊娠时间下奶牛血清中BRCA2蛋。
15、白的含量示意图；0024图2为本发明实施例中不同妊娠时间下奶牛的血清中BRCA2蛋白对应的MRNA在妊娠牛外周血中的表达规律示意图；0025图3为本发明实施例中通过灰度法检测奶牛血清中BRCA2蛋白的表达结果示意说明书CN104111339A3/13页5图。具体实施方式0026以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。0027本发明实施例提供一种基于BRCA2蛋白诊断奶牛是否妊娠的方法，包括以下步骤0028分别采集待检测奶牛人工授精后0天、18天的尾静脉血，在转速为5000R/MIN的条件下离心15MIN，得到对应的血清样本，将血清样本放置于体积为15ML的离心管中，将0天对应的血清样本记。
16、录为第一样本，将18天对应的血清样本记录为第二样本，将第一样本和第二样本放置于温度为20的条件下保存；0029采用WESTERNBLOT技术蛋白质印迹法检测第一样本中BRCA2蛋白的含量C1，检测第二样本中BRCA2蛋白的含量C2，判断C2是否大于等于16C1，若是，确定待检测奶牛已经妊娠；若否，采集下一头待检测奶牛的血液样本，重复执行所有步骤。0030本发明实施例还提供一种基于BRCA2蛋白对应的MRNA诊断奶牛是否妊娠的方法，包括以下步骤0031采集待检测奶牛人工授精后0天的尾静脉血作为第一血液样本、采集待检测奶牛人工授精后18天的尾静脉血作为第二血液样本，将第一血液样本、第二血液样本放置。
17、于EDTA抗凝管中；0032采用天根生化科技北京有限公司的RNAPREPPURERNA预纯化血液总RNA提取试剂盒分别提取第一血液样本、第二血液样本中的RNA，分别取500NGRNA，使用REVERTAIDTMFIRSTSTRANDCDNASYNTHESISKIT反转录成对应的CDNA，将第一血液样本对应的CDNA作为第一CDNA，将第二血液样本对应的CDNA作为第二CDNA；0033利用定量PCR分别检测第一CDNA、第二CDNA中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量判断第一CDNA中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达量是否大于等于第二CDNA中BRCA2蛋白对应的MRNA的相对表达。
18、量的2倍，若是，确定待检测奶牛已经妊娠；若否，采集下一头待检测奶牛的血液样本，重复执行所有步骤。0034下面对上述2种方法的可靠性进行验证。0035S1采集样本0036S101对若干头奶牛进行人工授精，采集每头奶牛人工授精0天、14天、18天、21天、28天后的血样，每次采集血样后，均将血样在转速为5000R/MIN的条件下离心15MIN，分离离心后的血样，得到血清。将血清收集到15ML离心管中并标记，放置于20的条件下保存。0037S102采用直肠检测法判断人工授精60天的奶牛是否已经妊娠，若是，采集9头妊娠奶牛的血清作为妊娠奶牛血清；若否，采集12头未妊娠奶牛的血清作为空怀奶牛血清。003。
19、8S103等量量取9头妊娠奶牛人工授精14天的血清样本，并混合均匀，得到第一待测样本A1；等量量取9头妊娠奶牛人工授精18天的血清样本，并混合均匀，得到第二待测样本A2；等量量取9头妊娠奶牛人工授精21天的血清样本，并混合均匀，得到第三待测样本A3；等量量取9头妊娠奶牛人工授精28天的血清样本，并混合均匀，得到第四待测样本A4。说明书CN104111339A4/13页60039S104等量量取12头空怀奶牛人工授精14天的血清样本，并混合均匀，得到第一对比样本B1；等量量取12头空怀奶牛人工授精18天的血清样本，并混合均匀，得到第二对比样本B2；等量量取12头空怀奶牛人工授精21天的血清样本，。
20、并混合均匀，得到第三对比样本B3；等量量取12头空怀奶牛人工授精28天的血清样本，并混合均匀，得到第四对比样本B4。0040S105等量量取9头妊娠奶牛、12头空怀奶牛人工授精0天的血清样本，并混合均匀，得到第一空白样本AB1。0041S2去除所有血清样本中的高丰度蛋白，对所有血清样本的体积进行定量。0042分别量取20L第一待测样本A1、20L第二待测样本A2、20L第三待测样本A3、20L第四待测样本A4、20L第一对比样本B1、20L第二对比样本B2、20L第三对比样本B3、20L第四对比样本B4和20L第一空白样本AB1。0043向上述所有样本中分别加入450LBINDINGBUFFE。
21、R结合缓冲溶液并混合均匀，得到对应的样本稀释液。0044将850LBINDINGBUFFER溶液加入去血清高丰度蛋白柱后，将所有的样本混合液依次加入去血清高丰度蛋白柱，并收集对应的穿流液，得到对应的样本穿流液。0045分别将所有的样本穿流液放入型号为10KD蛋白质分子量单位的超滤离心管中离心至100L，得到对应的样本浓缩液，采用由BRADFORD美国伯乐生产的BIORADPROTEINASSAYKIT蛋白质含量测定试剂盒测定每个样本浓缩液的浓度。0046S3对每个所有样本进行SDSPAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳0047分别取20G所有样本的样本浓缩液，向每份样本浓缩液中加入4G上样缓。
22、冲液，置于沸水中保温5MIN后，在离心力为14000GG为离心力单位的条件下离心20MIN，取上清液，将上清液加入浓度为125的SDSPAGE中，在横流电流为14MA的条件下电泳90MIN后，使用考马斯亮蓝一种染料名称进行染色，得到所有样本的样本浓缩液的电泳图谱。0048S4酶解、肽段定量和肽段标记0049分别取200G所有样本的样本浓缩液，向每份样本浓缩液中加入30LSDT溶液，SDT溶液由4SDS十二烷基硫酸钠、100MMTRISHCL三羟甲基氨基甲烷、100MMDTT二硫苏糖醇混合后调节PH至76而制成，并混合均匀，置于沸水中保温5MIN后，冷却至室温并加入200LUABUFFER尿素缓。
23、冲溶液尿素缓冲溶液由浓度为8M的UREA和浓度为150MM、PH为80的三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液配置而成混合均匀，放入型号为30KD的超滤离心管中，在离心力为14000G的条件下离心30MIN，去除滤液后，加入100L浓度为50MM的IAAINDOLYL3ACETICACID，吲哚乙酸溶液，在转速为600RPM的条件下震荡1MIN，并于室温下避光放置30MIN后，在离心力为14000G的条件下离心20MIN，加入100LUABUFFERSODIUMHYPOCHLORITEBUFFER，次氯酸钠缓冲溶液，在离心力为14000G的条件下离心20MIN后，再次加入100LUABUFFER，在离心力为。
24、14000G的条件下离心20MIN后，加入40LTRYPSINBUFFER胰酶缓冲溶液，由2G的胰酶溶解于40L的分散液中制成，在震荡速度为600RPM的条件下振荡1MIN后，在温度为37的条件下静置1618H，在离心力为14000G的条件下离心10MIN后，得到滤液，滤液为OD280肽段溶液。0050定量分析所有OD280肽段溶液，测定所有OD280肽段溶液中OD280肽段的浓度。说明书CN104111339A5/13页70051分别取100G所有的OD280肽段溶液，分别加入由ABI公司生产的型号为ITRAQREAGENT8PLEXMULTIPLEXKIT的试剂盒一种用于对肽段进行同位素相。
25、对标记与绝对定量的试剂盒进行标记。ITRAQREAGENT8PLEXMULTIPLEXKIT的试剂盒中的ITRAQ试剂包括肽反应标记试剂基团、8个报告基团和8个质量平衡基团。00528个报告基团的相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121，与上述报告基团对应的8个平衡基团的相对分子质量分别为32、31、30、29、28、27、26和24，所有OD280肽段溶液中的多肽通过ITRAQREAGENT8PLEXMULTIPLEXKIT的试剂盒下文中简称为试剂盒KIT标记后均能形成8种相对分子质量为145的等量异位标签。0053参见表1、表2所示，第一空白样本AB。
26、1对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量为113的报告基团标记。0054第一待测样本A1对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量分别为114、118的报告基团标记；第二待测样本A2对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量分别为115、119的报告基团标记；第三待测样本A3对应的OD280肽段溶液被ITRAQREAGENT8PLEXMULTIPLEXKIT的试剂盒中相对分子量分别为116、118的报告基团标记；第四待测样本A4对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量分别为117、119的报告基团标记。0055第二待测样本A2对应的OD280肽段溶液被试剂。
27、盒KIT中相对分子量分别为115、119的报告基团标记；第一对比样本B1对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量为114的报告基团标记；第二空白样本B2对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量为115的报告基团标记；第三对比样本B3对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量为116的报告基团标记；第四对比样本B4对应的OD280肽段溶液被试剂盒KIT中相对分子量为117的报告基团标记。0056表1、第一样本标记00570058表2、第二样本标记00590060S5对所有标记后的OD280肽段进行阳离子交换SCX分级0061将表1中的所有OD280肽段溶液混合加入SC。
28、X分级仪器AKTAPURIER100，每组根据SCX色谱图收集穿流洗脱液若干份，作为标记肽段溶液。将所有的标记肽段溶液冻干后加入型号为C18色谱柱中脱盐，得到对应的脱盐多肽溶液0062S6液质分析0063S601高效液相色谱分析0064将所有的脱盐多肽溶液分别加入型号为EASYNLC的高效液相色谱进行分离。高效液相色谱分离过程中，选用浓度为01的甲酸水溶液作为第一流动相，选用浓度为01说明书CN104111339A6/13页8的甲酸乙腈水溶液作为第二流动相。0065向高效液相色谱的色谱柱中加入体积分数为95的第一流动相和体积分数为5的第二流动相，冲洗至高效液相色谱的基线水平。0066分次取5U。
29、G的脱盐多肽溶液加入高效液相色谱的进样器，脱盐多肽溶液经过进样器和上样柱进入分析柱后，调整高效液相色谱的洗脱液流速至250NL/MIN进行洗脱。0067当洗脱时间为0100MIN时，采用体积分数为035的第一流动相和体积分数为65100的第二流动相作为洗脱液；当洗脱时间为100108MIN时，采用体积分数为065的第一流动相和体积分数为35100的第二流动相作为洗脱液；当洗脱时间为108120MIN时，采用体积分数为100的第二流动相作为洗脱液。0068每份脱盐多肽溶液经过高效液相色谱分离后，均得到对应的分离纯化多肽。0069S602质谱分析0070将所有的分离纯化多肽依次导入型号为QEXAC。
30、TIVE的质谱仪进行正离子、母离子分析，每份分离纯化蛋白的分析时间均为120MIN，正离子、母离子扫描的范围均为3001800M/ZM离子的质量数，Z离子携带的电荷数，一级质谱的分辨率为70000半峰处峰宽，得到每个分离纯化蛋白的MS/MS数据。0071以AGC模式进行扫描，离子源参数设置为电喷雾电压，3E6，扫描范围为1，动态排除时间为40S。0072多肽和多肽碎片的质量电荷比按照以下方式进行采集每次全扫描后以动态排除方式获得10个强度最高的峰进行串联质谱MS/MS扫描，得到二级质谱扫描数据。0073二级质谱的分辨率为17500半峰处峰宽，二级质谱的电喷雾电源为27EV。0074S7蛋白鉴定。
31、0075将质谱分析得到的所有二级质谱扫描数据输入PROTEOMEDISCOVERER13蛋白组学分析软件，通过名称为MASCOT的搜索引擎搜索UNIPROT一种蛋白质数据库名称中的牛蛋白数据库，确定与牛蛋白数据库中数据匹配的二级质谱扫描数据，并将该二级质谱扫描数据队员的蛋白作为鉴定蛋白，控制蛋白鉴定的假阳性率在1以内FDR1。0076将所有鉴定蛋白对应的二级质谱扫描数据使用ISOBARICLABELINGMULTIPLEFILEDISTILLERANDIDENTIEDPROTEINITRAQSTATISTICBUILDER一种分析软件分析软件进行分析，将妊娠奶牛血清中的所有鉴定蛋白表达情况，与。
32、空怀奶牛血清中对应的鉴定蛋白的表达情况进行对比，得到同一鉴定蛋白在妊娠奶牛、空怀奶牛中的差异表达情况，将人工授精后表达量上升的蛋白作为上调蛋白；将人工授精后表达量降低的蛋白作为下调蛋白。将上调或者下调15倍以上的鉴定蛋白作为差异表达蛋白，本发明实施例中的差异表达蛋白包括BRCA2蛋白。0077采用蛋白质印记法测得所有待测样本中BRCA2蛋白的含量。0078参见图1所示，本发明实施例中，与空白样本中的BRCA2蛋白的含量相比，奶牛妊娠18天时，其血清中BRCA2蛋白的含量上调16倍；妊娠28天时，其血清中BRCA2蛋白的含量上调27倍。0079因此，BRCA2蛋白能够用于诊断奶牛是否妊娠。008。
33、0将无法在牛蛋白数据库中获取名称的差异表达蛋白作为待鉴定蛋白，将待鉴定蛋白的二级质谱扫描数据与UNIPROTUNIVERSALPROTEIN，一个蛋白质数据库数据库中与说明书CN104111339A7/13页9人或鼠中的同源蛋白进行比，得到待鉴定蛋白的注释结果。0081S8选取BRCA2蛋白作为判断蛋白，检测BRCA2蛋白在妊娠奶牛体内的表达规律0082对妊娠牛的外周血中的总RNA进行QPCRREALTIMEQUANTITATIVEPCRDETECTINGSYSTEM，实时荧光定量核酸扩增检测系统检测。0083S801采集3头妊娠奶牛在人工授精后0天，14天，18天，21天和28天的外周血血样。
34、，采用由天根生化科技北京有限公司生产的RNAPREPPURE血液总RNA提取试剂盒提取所有外周血血样中的RNA。0084S802将所有的RNA通过REVERTAIDTMFIRSTSTRANDCDNASYNTHESISKIT第一链CDNA合成试剂盒进行逆转录，得到每个RNA对应的DNA。0085S803采用牛内参基因ACTIN进行常规PCR扩增，判断逆转录是否成功。0086参见表3所示，牛内参基因ACTIN的引物的上游基因序列F为5CTGGACTTCGAGCAGGAGAT3，下游基因序列R为5GGATGTCGACGTCACACTTC3。0087牛内参基因ACTIN的引物退火温度为63，扩增长度为。
35、208BP。0088参见表3所示，BRCA2蛋白的引物序列为F为5TTCCGCTGTCTTCTCCCAGTAGT3，下游基因序列R为5GTGGGGGTACAGGCAGTCTACT3。0089BRCA2蛋白的引物退火温度为62，扩增长度为87BP。0090表3、定量PCR扩增所用引物的序列及特征00910092S8031将25L内切酶缓冲溶液，125UTAQDNAPOLYMERASE耐热DNA聚合酶，2UL三磷酸脱氧核糖核苷酸，100NG互补脱氧核糖核酸，1L浓度为10M的上游引物，1L浓度为10M的下游引物加入第一DNA扩增体系，加水至25L。0093S8032在温度为94的条件下预变性5MI。
36、N后，在温度为94C的条件下变性30S，在温度为60的条件下退火30S，然后在温度为72的条件下延伸30S，0094S8033重复执行35次步骤S8031后，得到变性蛋白，将变性蛋白在温度为72的条件下放置10MIN后，在温度为25的条件下放置5MIN，记录牛内参基因ACTIN的内参循环阈值CT1。0095S804利用定量PCR检测BRCA2在MRNA水平的表达规律0096S8041将10L核酸染料SYBRGREEN，2550PMOL引物，100NG模板DNA放入第二DNA扩增体系，加水至20L。0097S8042在温度为95的避光条件下预变性60S，并在温度为95的条件下变性15S后，在温度。
37、为63的条件下退火15S，然后在温度为72的条件下延伸30S。0098S8043重复执行40次步骤S8042，记录每个样本的循环阈值CT2。说明书CN104111339A8/13页100099计算CT对应样本循环阈值CT2的均值内参照循环阈值CT1的均值。0100计算CTCT随机阴性对照样本循环阈值CT3的均值内参照循环阈值CT1的均值。根据每个样本的CT值，计算所有待测样本中，BRCA2在MRNA水平的表达结果。0101参见图2所示，BRCA2在MRNA水平的表达结果为BRCA2蛋白对应的MRNA在奶牛妊娠18天上调2倍，BRCA2蛋白对应的MRNA在奶牛妊娠21天上调5倍，BRCA2蛋白对。
38、应的MRNA在奶牛妊娠28天上调10倍，表达趋势与BRCA2蛋白在血清中的表达规律大致一致。0102因此，BRCA2蛋白对应的MRNA能够用于诊断奶牛是否妊娠。0103S9采用蛋白质印迹法检测奶牛血清中BRCA2蛋白的表达规律0104测定血清样本蛋白AB1、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4中的BRCA2蛋白的浓度。每个样本均取25UG总蛋白上样进行电泳，并在电泳中加入预染MARKER，选用8的PAGE胶电泳。0105根据预染MARKER预染标记物的显示，判定目的蛋白充分分离后，停止电泳。取出凝胶，根据MARKER显示的条带切下目的条带，用蒸馏水冲洗目的条带。0106预制大小与PA。
39、GE凝胶相同的PVDF膜聚偏氟乙烯膜和若干滤纸，将PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和若干滤纸一同放置于电转缓冲液中浸泡2H后取出。0107将凝胶、纤维垫、黑色板、白色板、浸泡后的PVDF膜和若干滤纸，按照黑色板纤维垫滤纸凝胶PVDF膜滤纸纤维垫白色板的顺序依次放好，夹紧黑色板和白色板后，按照黑色板的一面对照黑色负极的顺序放入转膜仪内，先在转膜电流为200MA的条件下转膜10MIN，再在转膜电流为300MA的条件下转膜30MIN至转膜完成，得到印记PVDF膜。0108将印记PVDF膜放入含有5脱脂奶粉的TBST缓冲溶液中，在室温下震荡2H进行封闭。0109按照TBST缓冲溶液与一抗的体积比为11000。
40、的条件制备一抗孵育液，将封闭后的印记PVDF膜放入一抗孵育液中，在温度为4的条件下孵育12H，得到第一孵育PVDF膜，使用TBST缓冲溶液冲洗第一孵育PVDF膜，冲洗次数为56次，每次冲洗的时间均为5MIN。0110按照TBST缓冲溶液和二抗体积比为15000的条件制备二抗孵育液，将冲洗后的第一孵育PVDF膜放入二抗孵育液中，在室温下震荡2H得到第二孵育PVDF膜，使用TBST缓冲溶液按照冲洗次第二孵育PVDF膜，冲洗次数为56次，每次冲洗的时间均5MIN。0111在每张冲洗后的第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜上滴加ECLELECTROCHEMILUMINESCENCE，化学发光底物化学。
41、发光底物，孵育至第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜有明显的荧光后，用滤纸吸去第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜上的ECL化学发光底物，用保鲜膜包裹第一孵育PVDF膜、第二孵育PVDF膜后，进行X光胶片压片，依次放入显影液显影、定影液定影，得到第一胶片和第二胶片，利用BANDSCAN软件，分析所有第一胶片、第二胶片的灰度值，得到所有样本中BRCA2蛋白的表达结果。0112参见图3所示，受精0天后的奶牛血清中的BRCA2蛋白的表达量为1；妊娠奶牛的血清中BRCA2蛋白的表达量随着奶牛妊娠时间的延长而增加，妊娠18天的奶牛血清中，BRCA2蛋白上调16倍以上；妊娠21天、妊娠28天的奶牛血清。
42、中，BRCA2蛋白上调15倍左右。0113空怀奶牛的血清中BRCA2蛋白的表达量，除人工授精后第14天时，空怀奶牛的血说明书CN104111339A109/13页11清中BRCA2蛋白的表达量有轻微上调，其他时间空怀奶牛的血清中BRCA2蛋白的表达量一直表现为下调趋势。0114S10利用IPAINGENUITYPATHWAYANALYSIS，生物医学分析研发软件体暨资料库挖掘牛BRCA2的生物学意义及分子网络0115根据妊娠奶牛人工授精后的18天，妊娠奶牛血清中的BRCA2蛋白相对于人工授精后0天血清中的BRCA2蛋白的表达量上调15倍以上，BRCA2在MRNA水平的表达量上调2倍以上。011。
43、6利用IPA在线商业软件与USDA/ARS/APDL合作深入系统地挖掘了该差异蛋白的生物学意义，具体方法参见软件主页相关说明WWWINGENUITYCOM。0117S1001参见表4所示，通过分析可知，妊娠18天的奶牛血清中BRCA2蛋白含量变化带来的生物学功能改变，包括胚胎发育和繁殖系统功能。0118妊娠18天奶牛血清中BRCA2作为一种转录调节因子参与调节MORPHOLOGYOFGENITALORGAN生殖器形态、MORPHOLOGYOFREPRODUCTIVESYSTEM生殖系统形态结构和GROWTHOFORGANISM器官生长发育等有关生物学功能。0119妊娠18天奶牛血清中BRCA2。
44、作为一种转录调节因子能够显著地增强CELLVIABILITY细胞活性、CELLSURVIVAL细胞寿命和促进SURVIVALOFORGANISM器官的生存，对PROLIFERATIONOFBROBLASTS成纤维细胞增殖和PROLIFERATIONOFCONNECTIVETISSUECELLS结缔组织细胞增殖能起到一定的正调控作用。同时，该蛋白还能够显著地抑制NECROSIS坏死，对CELLDEATHOFCONNECTIVETISSUECELLS结缔组织细胞凋亡和DNADAMAGEDNA损伤也能起到一定的抑制作用。0120妊娠18天的奶牛血清中的BRCA2作为一种转录调节因子能够促进细胞的存活。
45、、发育、增殖，器官的存活，抑制DNA的损伤、坏死，抑制肿瘤细胞的增殖，控制生殖器官和繁殖系统的结构形态，参与器官的生长和减数分裂，综上所述，BRCA2蛋白在早期胚胎的形成与发育过程中发挥了重要的作用。0121由于生物体内，每种蛋白需要与体内其他物质共同作用，才能发挥其生物学功能。0122本发明实施例分析得到BRCA2蛋白协同多种相关复合物、细胞生长因子、转录调节因子和反应调节因子才能发挥其生物学功能，其中，雌激素能够激活BRCA2蛋白，细胞因子IFN与该蛋白紧密关联，与此同时，转录因子TP53也是该蛋白产生作用的一个重要上游元件。0123S1002妊娠18天牛BRCA2参与的繁殖系统发育与功能。
46、及其分子网络/信号通路构建。0124妊娠作为一种特殊的生理生殖现象离不开蛋白质的参与，通过系统生物学分子网络分析不仅能够了解关键蛋白的作用，还能够了解内源化合物如非含氮生殖激素和小分子的作用。0125除此之外，网络分析能够直观地将不同的信号通路联结在一起，有助于深入揭示信号与信号之间的关系。通过同位素标记相对和绝对定量的方法鉴定得到妊娠牛18天血清中差异表达蛋白参与的基因网络共4个，其中，包含BRCA2的基因网络为“细胞周期，DNA复制，重组和修复，细胞的凋亡与存活”。0126BRCA2基因/蛋白主要通过参与胚细胞的修饰、雌性动物繁殖器官发育、调节胚胎说明书CN104111339A1110/1。
47、3页12干细胞的敏感性和繁殖系统的形态结构等过程来调节胚胎发育和繁殖系统发育与功能。0127表4、妊娠18天奶牛血清中BRCA2蛋白参与的生物学功能01280129说明书CN104111339A1211/13页130130说明书CN104111339A1312/13页140131本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护说明书CN104111339A1413/13页15范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。说明书CN104111339A151/2页16图1图2说明书附图CN104111339A162/2页17图3说明书附图CN104111339A17。