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1、(10)申请公布号 CN 103554297 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103554297 A (21)申请号 201310492955.9 (22)申请日 2013.10.21 C08B 37/02(2006.01) A61K 31/737(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 兰州大学 地址 730070 甘肃省兰州市城关区天水路 222 号 (72)发明人 封士兰 赵良功 郭龙 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代。
2、理人 陆菊华 (54) 发明名称 一种高硫代度红芪多糖硫酸酯的制备方法及 其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 包括如下步骤 ： 1） 采用水提 醇沉法提取红芪多糖中硫酸酯葡聚糖 （SHG） ； 2） 对 步骤 1） 中提取的硫酸酯葡聚糖进行纯化 ； 3） 对纯 化后的硫酸酯葡聚糖进行硫酸化修饰。本发明采 用改良氯磺酸吡啶法对红芪多糖中硫酸酯葡聚糖 进行硫酸化修饰， 能够使其硫代度由 0.02 提高到 0.44.4， 硫酸化后的高硫代度红芪多糖硫酸酯与 未硫酸化修饰的红芪多糖中硫酸酯葡聚糖相比， 其抗凝血活性、 抗补体活性、 抗肿瘤活性都。
3、有显著 性提高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图8页 (10)申请公布号 CN 103554297 A CN 103554297 A 1/1 页 2 1. 一种高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： 1） 采用水提醇沉法提取红芪多糖中硫酸酯葡聚糖 （SHG） ； 2） 对步骤 1） 中提取的硫酸酯葡聚糖进行纯化 ； 3） 对纯化后的硫酸酯葡聚糖进行硫酸化修饰 搅拌下， 将纯化后的硫酸酯葡聚糖分散液加入酯化剂中， 。
4、在 3090下反应 0.510h， 冷却， 分离纯化， 得到高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 。 2. 根据权利要求 1 所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 3） 中， 所述硫酸酯葡聚糖分散液采用多糖浓度为 150mg/ml 的二甲基甲酰胺 （DMF） 分散液。 3. 根据权利要求 1 所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3） 中， 所述酯化剂采用吡啶氯磺酸酯化剂， 其中， 酯化剂中无水吡啶与氯磺酸的体 积比为 （110） ： 1。 4. 根据权利要求 1-3 任一项所述的高硫代度红芪多。
5、糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其 特征在于 ： 所述步骤 3） 中， SHG 的 DMF 分散液与酯化剂的体积比为 （0.58.5） ： 1。 5. 根据权利要求 4 所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3） 中， 分散液中 SHG 浓度为 7.5mg/mL ； 酯化剂中无水吡啶与氯磺酸的体积比为 4 ： 1 ； SHG 的 DMF 分散液与酯化剂的体积比为 1 ： 1。 6. 根据权利要求 1 或 2 或 3 或 5 任一项所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制 备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3） 中， 反应时， 。
6、在 60下反应 6h。 7. 根据权利要求 1 所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3） 中， 所述分离纯化过程为 ： 向反应液中加入浓度为 0.1-1mol/L 的 NaOH 溶液调 节 pH 值到中性， 流水透析 1272h， 转蒸馏水透析 436h， 冷冻干燥， 即可。 8. 根据权利要求 7 所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 其特征在于 ： 所述流水透析采用分子截流量为 100010000Da 的透析袋流水透析。 9. 根据权利要求 1 所述的高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 在抗凝血药物、 抗免疫异 常。
7、药物或抗肿瘤活性药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103554297 A 2 1/6 页 3 一种高硫代度红芪多糖硫酸酯的制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种高硫代度红芪多糖硫酸酯的制备及其应用， 属于天然产物结构改 造及应用技术领域。 背景技术 0002 红芪多糖硫酸酯 （SHG） 是一种由传统中药红芪 （Hedysarum polybotrysHand.-Mazz） 中提取分离出的天然低硫代度的葡聚糖硫酸酯， 其结构是由-D（1-4） 吡喃葡萄糖构成主 链 ； 每隔8个糖残基在O-6 位上有一个非还原末端分支 ； 每隔38个糖残基O-6 位上有一个 硫酸基。SHG 。
8、已获发明专利， 专利名称 ： 红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖及其制备方法和应用， 专利号 ： ZL 201110203348.7 多糖硫酸酯又称作硫酸脂多糖， 广泛存在于自然界中， 其作为多糖的一种衍生物， 在分 子的识别， 细胞的生长、 分化， 细胞间的相互影响上起重要作用。大量的天然硫酸脂多糖研 究表明这种多糖具有显著的生物活性， 如抗凝血、 抗血栓、 防止血管增生、 抗氧化、 抗炎、 抗 肿瘤、 抗病毒等。 多糖硫酸酯硫代度的高低往往是决定其生物活性的重要因素， 采用化学修 饰法对多糖进行硫酸衍生化处理是得到高硫代度硫酸脂多糖的重要途径之一， 因此人们寻 求化学修饰的方法来提高硫酸脂多糖的硫代。
9、度， 从而提高多糖的生物活性。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷， 提供了一种硫代度更高的高硫代度 红芪多糖硫酸酯的制备方法 ； 本发明的另一目的是提供上述高硫代度红芪多糖硫酸酯在制药中的应用。 0004 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现 ： 一种高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 的制备方法， 包括如下步骤 ： 1） 采用水提醇沉法提取红芪多糖中硫酸酯葡聚糖 （SHG） ； 2） 对步骤 1） 中提取的硫酸酯葡聚糖进行纯化 ； 3） 对纯化后的硫酸酯葡聚糖进行硫酸化修饰 搅拌下， 将纯化后的硫酸酯葡聚糖分散液加入酯化剂中， 在 3090下反应 0.510h。
10、， 冷却， 分离纯化， 得到高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 。 0005 上述步骤 1） 和 2） 制备纯化的 SHG 已获发明专利， 专利名称 ： 红芪多糖中的硫酸酯 葡聚糖及其制备方法和应用， 专利号 ： ZL 201110203348.7。具体操作概括如下 ： 所述步骤 1） 中， 水提醇沉法提取红芪多糖中硫酸酯葡聚糖的具体操作方法为 ： 将脱酯 后的红芪药材粉碎， 加入 626 倍量水， 4070提取 15 次， 每次提取 0.54.5h， 提取液浓 缩， 将浓缩液首先用终浓度为 10 30% 乙醇沉淀， 过滤， 沉淀为红芪多糖 1 ； 上清液用终浓 度为 35% 65% 乙醇。
11、沉淀， 过滤， 取终浓度为 35%65% 乙醇沉淀部分。 0006 所述步骤 2） 的纯化过程为 ： 将步骤 1） 的乙醇沉淀部分脱蛋白除色素后， 经离子交 换树酯及葡聚糖凝胶柱色谱分离纯化， 得到均一物质的硫酸酯葡聚糖 SHG。 说 明 书 CN 103554297 A 3 2/6 页 4 0007 优选的， 所述步骤 3） 中， 所述硫酸酯葡聚糖分散液采用多糖浓度为 150mg/ml 的 二甲基甲酰胺 （DMF） 分散液 ； 所述酯化剂采用吡啶氯磺酸酯化剂， 其中， 酯化剂中无水吡啶 与氯磺酸的体积比为 （110） ： 1 ； SHG 的 DMF 分散液与酯化剂的体积比为 （0.58.5）。
12、 ： 1。 0008 更优为， 分散液中 SHG 浓度为 7.5mg/mL ； 酯化剂中无水吡啶与氯磺酸的体积比为 4 ： 1 ； 反应时， 在 60下反应 6h ； SHG 的 DMF 分散液与酯化剂的体积比为 1 ： 1。 0009 所述步骤3） 中， 所述分离纯化过程为 ： 向反应液中加入浓度为0.1-1mol/L的NaOH 溶液调节 pH 值到中性， 流水透析 1272h， 转蒸馏水透析 436h， 冷冻干燥， 即可。 0010 优选的， 所述流水透析采用分子截流量为 100010000Da 的透析袋流水透析。 0011 上述高硫代度红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） 在抗凝血药物、 抗免。
13、疫异常药物或抗肿瘤 活性药物中的应用。 0012 本发明的有益效果 ： SHG 是一个低硫代度的多糖硫酸酯， 本发明首次对 SHG 进行硫酸化修饰， 建立了 SHG 的 硫酸化修饰方法， 优化了修饰条件， 得到高硫代度的红芪多糖硫酸酯 （S-SHG） ， 并且能显著 提高 SHG 的抗凝血、 抗补体及抗肿瘤活性。 0013 本发明采用改良氯磺酸吡啶法对红芪多糖中硫酸酯葡聚糖进行硫酸化修饰， 能够 使其硫代度由 0.02 提高到 0.44.4， 硫酸化后的高硫代度红芪多糖硫酸酯与未硫酸化修 饰的红芪多糖中硫酸酯葡聚糖相比， 其抗凝血活性、 抗补体活性、 抗肿瘤活性都有显著性提 高。 0014 用。
14、改良的氯磺酸吡啶法对红芪多糖中硫酸酯葡聚糖进行硫酸化修饰， 修饰后的产 物产量及硫代度高， 生物活性好。本发明修饰的红芪多糖硫酸酯葡聚糖 - 高硫代度红芪多 糖硫酸酯产物抗凝血、 抗补体及抗肿瘤活性显著高于红芪多糖中硫酸酯葡聚糖。 附图说明 0015 附图用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与本发明的实 施例一起用于解释本发明， 并不构成对本发明的限制。在附图中 ： 图 1 为时间和温度对产物比率交互影响的曲线图 ； 图 2 为时间和酯化剂比例对产物比率交互影响的曲线图 ； 图 3 为温度和酯化剂比例对产物比率交互影响的曲线图 ； 图 4 为时间和温度对硫元素含量交互影响。
15、的曲线图 ； 图 5 为时间和酯化剂比例对硫元素含量交互影响的曲线图 ； 图 6 为温度和酯化剂比例对硫元素含量交互影响的曲线图 ； 图 7 为投料比单因素结果图 ； 图 8 为 SHG 抗凝血活性结果图 ； 图 9 为 S-SHG 抗凝血活性结果图 ； 图 10 为 SHG 和 S-SHG 抗补体活性结果图。 具体实施方式 0016 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明， 应当理解， 此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明， 并不用于限定本发明。 说 明 书 CN 103554297 A 4 3/6 页 5 0017 实施例 1 ： SHG 的硫酸化修饰 本实验先采用中心组合设计。
16、考察了反应时间 （A） ， 反应温度 （B） ， 酯化剂中吡啶氯磺酸 比例 （C） 三个因素对硫代度的影响， 按照方程 ci=（Xi-X0） / X 对自变量进行编码， 其中 ci 为变量的编码值， Xi 为变量的真实值， X0 为实验中心点变量的真实值， X 为变化量的 变化步长， 各变量水平见表 1， 再由此为基础， 以物料比做单因素考察实验最终确定优化条 件。 0018 。 0019 实验过程 ： 冰盐浴冷凝及干燥条件下， 将氯磺酸缓慢滴入无水吡啶中， 制备酯化 剂 ； 将100mg硫酸酯葡聚糖于20mlDMF中充分分散后， 将此多糖分散液加入酯化剂中一定温 度下反应一定时间， NaOH。
17、 调 pH 至中性， 流水透析 1272h 后转蒸馏水透析 436h 后， 冷冻干 燥， 即得。 0020 采用元素分析测定硫元素含量。 0021 采用氯化钡明胶比浊法测定硫酸基含量。 0022 中心组合设计方案及实验结果见表 2。 说 明 书 CN 103554297 A 5 4/6 页 6 0023 。 0024 采用中心组合法对上述结果进行分析 ： 1. 以产物比率做回归分析， 综合方程回归拟合度及方差分析结果， 得到修正后产物比 率的回归方程为 ： Y=325-27.2A-19.0B-11.0C-27.3AC-23.8A2-75.8B2-35.7C2 并得出这三个因素对产物比率影响大小。
18、为 ABC。 0025 2. 以硫元素含量做回归分析， 硫元素含量回归方程为 ： Y=17.3-1.41A-1.30B-1.31C-0.32AB-1.40AC-1.11BC-1.26A2-3.87B2-1.86C2 其中， 硫元素含量方差分析结果得出影响硫元素含量因素的大小顺序为 ACB。 0026 最终的方程曲面图见附图 1- 图 6， 此结果说明所选取的影响因素为主要影响因 素， 所选取的各影响因素反应条件理想， 最终方程能达到很好的拟合。 0027 结合两者回归方程做结果最优处理， 即硫代度和产物比率同时达最大值的回归模 拟水平结果见表 3。 说 明 书 CN 103554297 A 6。
19、 5/6 页 7 0028 。 0029 按照最优模拟水平分析及结合实际可操作性得到三个因素最佳条件为 ： 反应时间 6h ； 反应温度 60 ； 酯化剂中氯磺酸与吡啶的比例为 1:4. 按照上述条件做投料量单因素分析实验。 0030 只改变 SHG 的 DMF 分散液中 SHG 浓度， 以产物比率及硫元素含量为分析指标结果 见附图 7。由结果最终确定 SHG 硫酸化最优的修饰条件为 ： 当 SHG 的 DMF 分散液与酯化剂 体积比为 1:1 时， 分散液 SHG 浓度为 7.5mg/ml， 反应时间 6h， 反应温度 60； 酯化剂中氯磺 酸与吡啶的比例为 1:4。 0031 实施例 2 。
20、SHG 和 S-SHG 的生物活性 按照实施例1中确定的最佳硫酸化条件制得S-SHG， 所得产物中硫元素含量为17.9， 与 模拟结果相符， 硫酸基取代度 DS=2.1， 并应用于下述生物活性实验。 0032 （一） 抗凝血实验 实验动物 ： 家兔 实验方法 ： 家兔心脏取血， 低温制备除血小板血浆， 用生理盐水作为空白对照， 进行体 外抗凝血实验， 采用凝血酶原时间 （PT） 、 活化部分凝血活酶时间 （APTT） 、 血浆凝血酶时间 （TT） 值进行评价。 0033 抗凝血结果见附图 8、 附图 9 结果所示， SHG 有较低的抗凝血活性， 经硫酸化修饰的 S-SHG 抗凝血活性明显增加，。
21、 并 表现出一定的量效关系。 0034 ( 二 ) 抗补体实验 实验方法 ： 体外经典的细胞溶血实验测定抗补体活性。 0035 补体经典途径的溶血活性 （CH50） 测定。通过补体测试， 1:40 豚鼠血清作为最低 溶血浓度的补体浓度， 与供试品混匀， 按表 4 加各试剂， 37 水浴 30 min 后低温离心 10 min， 取每管上清液0.2 mL， 用酶标仪在405 nm 下测定吸收度。 以浓度作为X 轴， 溶血抑制 率作为 Y 轴作图， 得出抗补体趋势图。 0036 。 0037 抗补体实验结果见附图 10 由抗补体实验结果可知， SHG 无抗补体活性， S-SHG 具有明显的抗补体活。
22、性。 0038 （三） 抗肿瘤实验 说 明 书 CN 103554297 A 7 6/6 页 8 实验细胞 ： 肝癌细胞 实验方法 ： 将贴壁生长的肿瘤细胞用 0.25% 的胰蛋白酶消化后接种于 96 孔板中， 实验 组加入各浓度的 SHG 及 S-SHG， 空白组加入氨基酸高糖 （DMEM） 培养基， 于二氧化碳培养箱中 培养 2d， 噻唑蓝 （MTT） 法进行抗肿瘤活性测试。 0039 实验设七个组， 分组情况如下 ： 第一组 ： 对照组即不加SHG也不加S-SHG ； 第二四组 ： SHG组， 分别为高中低三个浓度， 每个浓度平行试验6份 ； 第五七组 ： S-SHG组， 分别为高中低三。
23、个浓度， 每个浓度平行试验 6 份 ； 试验结果见表 5。 0040 。 0041 * 表示与空白组比较 P0.05， a 表示同等剂量下， S-SHG 与 SHG 比较 P0.05。 0042 结果表明经硫酸化修饰后的高硫代度红芪多糖硫酸酯对肝癌细胞的抑制作用明 显强于相同剂量未经修饰的低硫代度红芪多糖硫酸酯， 而且具有量效关系。 0043 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精 神和原则之内。
24、， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103554297 A 8 1/8 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 9 2/8 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 10 3/8 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 11 4/8 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 12 5/8 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 13 6/8 页 14 图 6 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 14 7/8 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 15 8/8 页 16 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103554297 A 16 。