内耳毛细胞的治疗方法 发明背景
【发明领域】
本发明申请涉及诱导、促进、或提高内耳组织，尤其是内耳上皮毛细胞的生长、增殖或再生。此外，本发明提供了预防和治疗内耳疾病和病症(尤其是听力损伤)的方法、组合物和装置。该方法包括施用胰岛素样生长因子-I(IGF-1)和/或成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，或它们的激动剂(agonist)。
相关公开内容的描述
听力损伤是影响数百万人的严重残疾。听力损伤可以由各种不同原因造成，其中包括感染、物理性损伤、很响的声音、年龄老化、和化学物质所致的耳毒性(它破坏了外周听觉系统的神经元和/或毛细胞)。外周听觉系统由听觉受体即柯蒂器官(organ of Corti)中的毛细胞，以及主听觉神经元即耳蜗中的螺旋神经节神经元所构成。螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron，简称为“SGN”)是主要的传入听觉神经元，它们将信号从外周听觉受体即柯蒂器官中的毛细胞通过耳蜗神经传递给脑。第八神经将螺旋神经节中的主听觉神经元与脑干相连。第八神经还将前庭神经节神经元(vestibular ganglion neuron，简称为″VGN″)与脑干相连。VGN是负责平衡的主要传入感觉神经元，并且将信号从内耳的椭圆囊(utricle)、球囊(saccule)和壶膜(ampullae)传递给脑。螺旋神经节的主传入神经元和毛细胞受到破坏，是听力损伤的主要原因。外周听觉系统的受损是造成大多数听力下降的原因(Dublin，1976；Rybak，1986；Lim 1986；Pryor，1994)。
丧失听力或听力损伤对哺乳动物而言是经常发生的。在从外部听觉管道到中枢神经系统的听觉路径上任何位置发生地损伤，都可能导致丧失听力。听觉器官可以被分成外耳和中耳，内耳和听觉神经，以及中枢听觉通路。尽管在不同物种之间有些差异，但是总体特征对所有哺乳动物而言是共同的。听觉刺激机械地通过外听觉管、鼓膜和听小骨链(ossicular chain)传递至内耳。中耳和乳突在正常情况下充满空气。外耳和中耳的疾病通常会因干扰这一机械传递过程而导致传导性听力损失。传导性听力损失的常见原因包括：外听觉管受阻塞(这可由耳闭锁或耳垢而造成)；鼓膜的增厚或穿孔(这可由创伤或感染造成)；听小骨链构成部分的固定或吸收；以及耳咽管受阻(这导致中耳空间为液体所充满)。通过内耳中神经-上皮细胞(毛细胞)和SGN的作用，听觉信息被从机械信号转换为神经传导的电脉冲。SGN的所有中央纤维构成了脑桥脑干的耳蜗核中的突触。耳蜗核的听觉凸起是双侧的，主核位于下丘、丘脑的内侧膝状体和颞叶的听觉皮质。从耳蜗到听觉脑干和听觉皮质，涉及听觉的神经元数目急剧增加。所有的听觉信息由数目有限的毛细胞传导，这些毛细胞是内耳的感觉受体，其中所谓的内耳毛细胞(其数目相对更少)是至关重要的，因为它们与约90％的主听觉神经元形成突触。与之相比，在耳蜗核水平，所涉及的神经单元的数目有数十万。因此，听觉外周中较少数细胞的受损会导致严重的听力损失。所以，感觉神经性听力损失的许多原因可归咎于内耳的损伤。听力损失可以是渐进的。随着动物的年龄增大，耳的解剖结构的变化会使听力明显变得更不灵敏。
在胚胎发生过程中，前庭神经节、螺旋神经节和耳泡起源于同一神经原性外胚层，即耳基板。因此，前庭和听觉系统具有许多共同的特征，其中包括毛细胞的外周神经元的神经分布以及伸向脑干核的中央凸起。这两个系统都对各种耳毒素敏感，其中包括治疗药物、抗肿瘤药、食品或药物中的污染物、以及环境和工业污染物。耳毒性药物包括：广泛使用的化学治疗剂顺铂及其类似物(Fleischman等人，1975；Stadnicki等人，1975；Nakai等人，1982；Berggren等人，1990；Dublin，1976；Hood和Berlin，1986)，常用的氨基糖苷抗生素(例如用于治疗革兰氏阴性菌感染的庆大霉素)(Sera等人，1987；Hinojosa和Lerner，1987；Bareggi等人，1990)，奎宁及其类似物，水杨酸盐及其类似物，和袢(loop)利尿药。
这些药物对听觉细胞和螺旋神经节神经元的毒性作用，通常成为其治疗用途的限制因素。例如，抗菌的氨基糖苷类物质如庆大霉素、链霉素、卡那霉素、托布拉霉素等，已知它们具有严重的毒性，尤其是耳毒性和肾脏毒性，这降低了这些抗微生物药的用途(见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics，6版，A.Goodman Gilman等人编辑，Macmillan Publishing Co.，Inc.，New York，pp.1169-71(1980)或最新版本)。氨基糖苷类抗生素通常被用作广谱的抗微生物剂，以有效地对抗例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和耐酸细菌。易感的微生物包括：埃希氏菌属(Escherichia spp.)，嗜血杆菌属(Hemophilus spp.)，李斯特菌属(Listeria spp.)，假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，诺卡氏菌属(Nocardia spp.)，耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)，克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)，肠杆菌属(Enterobacter spp.)，沙门氏菌属(Salmonella spp.)，葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)，链球菌属(Streptococcus spp.)，分枝杆菌属(Mycobacteria spp.)，志贺氏菌属(Shigella spp.)和沙雷菌属(Serratia spp.)。此外，氨基糖苷类化合物主要被用于治疗革兰氏阴性菌造成的感染，而且例如与青霉素一起使用以便产生协同效应。正如该类物质的分类名称所暗示的那样，所有的氨基糖苷类抗生素都含有以糖苷键相连的氨基糖。中耳炎是用于描述中耳感染的专门术语，这种感染是相当普遍的，尤其在儿童中。对于中耳感染，通常抗生素是全身给药的，例如以应答(responsive)方式或预防方式进行给药。为了与中耳感染战斗而用抗生素进行全身给药时，常常会为了在中耳内达到治疗浓度而导致所需的滞后时间更为延长，而且需要很高的初始剂量以便达到该浓度。这些缺点使得获得所需治疗浓度的能力变得复杂化了，而且使得某些抗生素不可能同时使用。当感染已到晚期时，全身给药通常是最有效的，但是此时可能早已对中耳和内耳结构产生了永久性损伤。很清楚，耳毒性是施用抗生素所造成的且受剂量限制的副作用。例如，在给药60-120天且每天施用2克链霉素的的病人中近75％表现出前庭受损，而剂量为1克/天时，该发生率降低至25％(美国专利5,059,591)。观察到如下听力损伤情况：4-15％接受1克/天且时间超过1周的病人，会患有可测量的听力损失(而且慢慢地变得更糟)，而且如果治疗继续的话可能导致永久性耳聋。
耳毒性也是顺铂引起的严重的、受剂量限制的副作用。顺铂是一种铂配位配合物，已证明它对多种人类癌症(包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌)有效。顺铂会破坏听力和前庭系统(Fleischmen等人，1975；Stadnicki等人，1975；Nakai等人，1982；Carenza等人，1986；Sera等人，1987；Bareggi等人，1990)。水杨酸化合物(例如阿斯匹林)因其消炎、镇痛、退热和抗血栓作用而成为最常用的治疗药。不幸的是，它们具有耳毒性副作用。它们常导致耳鸣(“耳内的鸣响”)和暂时性听力损失(Myers和Bernstein，1965)。然而，如果长期和高剂量地使用药物，听力损伤会变成永久性和不可逆转，正如临床上所报道的那样(Jarvis，1966)。
因此，对于涉及内耳组织(尤其是内耳毛细胞)及任选的相关听觉神经的内耳疾病和听力损伤，需要一种预防、降低或治疗其发病率和/或严重程度的手段。特别感兴趣的是那些由具耳毒性的治疗药物(包括顺铂及其类似物、氨基糖苷类抗生素、水杨酸盐及其类似物、或袢利尿剂)的不良副作用所引起的病症。此外，需要一种方法，这种方法可使这些导致耳毒性的药物能够以更高剂量因而更有效地被使用，同时又防止或减少这些药物所引起的耳毒性副作用。所需要的是一种能够安全、有效、和长期地预防性或治疗性处理听力损伤的方法，其中该听力损伤与内耳组织受损、丧失、或退化有关，尤其是耳毒性物质所导致的听力损伤，以及尤其是涉及内耳毛细胞的听力损伤。本发明提供了实现这些目的和其他目的的组合物和方法。
发明概述
本发明部分基于本文所公开的发现：即内耳毛细胞在体内产生FGF-2，椭圆囊上皮细胞在体外表达FGF受体，以及施用某些生长因子可通过诱导支持细胞(supporting cell)的增殖而刺激新产生的内耳毛细胞。该支持细胞是毛细胞的祖细胞。在受试的30种生长因子中，FGF-2是最强的促细胞分裂剂。IGF-1也有效。因此，本发明的一个目的是提供在体外或活体外、或体内，诱导、促进、或提高内耳组织，尤其是内耳上皮毛细胞的生长、增殖或再生的方法。此外，本发明的另一目的是提供一种处理哺乳动物的方法，以预防、减少或治疗内耳毛细胞相关性听力损伤或疾病(或平衡性受损)的发病或严重程度，尤其是耳毒素所导致的或可导致的听力损伤，其中该方法通过向需要治疗的哺乳动物施用预防有效量或治疗有效量FGF-2、IGF-1、它们的激动剂(agonist)、它们的功能片段或衍生物、含有FGF-2或IGF-1的嵌合生长因子、或其小分子或抗体激动剂，或上述物质的混合物。任选地，在听觉或前庭神经元损伤存在或怀疑存在时，还可以施用trkB或trkC激动剂，较佳地是神经营养蛋白，更佳地是NT-4/5、NT-3或BDNF，最佳地是NT-4/5，或者它们的功能片段或衍生物，嵌合的神经营养蛋白、泛嗜神经营养蛋白(pantropic neurotrophin)，或其小分子或抗体激动剂。根据本发明方法，可以按合适的间隔施用本发明的组合物，给药可以在施用或暴露于听力损伤诱导性内耳组织损伤(尤其是耳毒素所诱导或可诱导的听力损伤)之前，之后或几乎同时进行。
对于需要给予具有耳毒性、有损害听力副作用的药物进行治疗，还提供了改进的组合物和方法，其中该改进包括施用(预防性或治疗性地)治疗有效量的FGF-2、IGF-1、它们的激动剂、它们的功能片段或衍生物、含有FGF-2或IGF-1的嵌合生长因子、或其小分子或抗体激动剂，或上述物质的混合物，以治疗或预防所述药物引起的耳毒性。因此，本发明的一个目的是提供一种改进的组合物，它含有FGF-2、IGF-1、它们的激动剂、或它们的混合物，以及施用于哺乳动物的会损害听力的耳毒性药物，这些混合形式的组合物还可含有药学上可接受的载体。药物组合物与单独的耳毒性药物相比有更低的耳毒性，而且较佳的是可使用比通常更高剂量的耳毒性药物。这类改进的组合物的例子包括：与FGF-2、IGF-1、它们的激动剂、或它们的混合物合用的顺铂或其他耳毒性肿瘤药物，或者氨基糖苷类抗生素。当怀疑、预计或已存在神经元损伤时，可任选地将trkB或trkC激动剂配制在一起或一起施用。
此外，本发明涉及在细菌感染情况下，本发明组合物在药物中的用途。对于长期以来一直在寻求疗法和药物的本领域而言，其中该疗法和药物可治疗目前与某些抗生素(尤其是非常流行和常用的氨基糖苷类抗生素)相关的耳毒性效应但又不牺牲氨基糖苷类的抗微生物效果，本发明提供了解决方案。
此外，本发明还涉及在癌症情况下，本发明组合物在药物中的用途。对于长期以来一直在寻求疗法和药物的本领域而言，其中该疗法和药物可治疗目前与某些化疗剂(尤其是非常流行和常用的顺铂化疗剂)相关的耳毒性效应但又不牺牲顺铂或其类似物的抗肿瘤效果，本发明提供了解决方案。
此外，本发明还涉及在需要利尿剂的情况下，本发明组合物在药物中的用途。对于长期以来一直在寻求疗法和药物的本领域而言，其中该疗法和药物可治疗目前与某些利尿剂(尤其是非常流行和常用的袢利尿剂)相关的耳毒性效应但又不牺牲它们的利尿效果，本发明提供了解决方案。
此外，本发明还涉及在需要奎宁或奎宁类化合物的情况下，本发明组合物在药物中的用途。对于长期以来一直在寻求疗法和药物的本领域而言，其中该疗法和药物可治疗目前与某些奎宁类化合物相关的耳毒性效应但又不牺牲它们的效果，本发明提供了解决方案。
通过下面的详细描述和所附的权利要求书，并结合附图，本领域技术人员可轻易地理解本发明的额外目的和特征。
附图简述
图1A-1G是椭圆囊上皮细胞培养和免疫染色图。图1A显示了从P4-5大鼠分离出的2片完整的椭圆囊上皮细胞片。图1B显示了在平板接种时部分解离的上皮细胞片。相差照片(图1C)和荧光照片(图1D)显示了用抗波形蛋白抗体标记的2-天上皮细胞培养物。还显示了2-天培养物用下列物质免疫染色的情况：用抗ZO1抗体(图1E)，用鬼笔环肽-FITC偶连物(图1F)，和用抗泛细胞角蛋白(pan-cytokeratin)抗体(图1G)。对于图1A和1B，标尺杆等于200微米；对于图1D-1G，标尺杆为100微米。
图2显示了氚化胸苷掺入P4-5椭圆囊上皮细胞的情况。在每种情况下，将等量的悬浮细胞接种于补充有5％胎牛血清的培养基中，存在或不存在100ng/ml生长因子。在平板接种后24小时加入3H-胸苷，并且再过24小时测量掺入情况。收集5或10个培养孔的数据以平均值±均方差(s.e.m.)的形式表示。星号表示与对照培养物相比，胸苷掺入量显著增加(p＜0.05)。相对于仅含有FGF-2的培养物，FGF-2与IGF-1或与TGF-α组合时可导致胸苷掺入量明显更高(p＜0.05)。
图3A和3B显示了椭圆囊上皮细胞培养物的BrdU免疫细胞化学图。图3A为对照培养物。图3B代表了含100ng/mlFGF-2的培养物。在培养24小时时加入BrdU，在48小时时固定培养物进行免疫细胞化学分析。注意，FGF-2的存在使BrdU-阳性细胞的数目大大增加。标尺杆等于200微米。
图4显示了FGF-2、IGF-1和TGF-α的剂量依赖型的促细胞分裂效应。如实施例所述，在含有浓度为0.1-100纳克/毫升(ng/ml)的FGF-2、IGF-1和TGF-α培养物以及对照培养物中，进行3H-胸苷掺入分析。符号*和**分别表示与对照培养物相比p＜0.05和p＜0.01。相对于IGF-1和TGF-α，在1-100纳克/毫升的浓度范围内FGF-2更为有效(p＜0.01)。
图5A-5F显示了用针对FGF、IGF-1和NGF受体的抗体，对椭圆囊上皮细胞培养物进行的免疫细胞化学分析结果。显示的是用下列物质对2-天椭圆囊上皮细胞培养物标记的荧光照片(图5A、5C、5E)和相差照片(图5B、5D、5F)：用抗FGF受体的抗体进行标记(图5A、5B)，用抗IGF-1受体b的抗体进行标记(图5C、5D)，和用抗TrkA(一种NGF高亲和性结合受体)的抗体进行标记(图5E、5F)。注意，尽管许多培养的细胞表达高水平的FGF受体和IGF-1受体，但是没有观察到可检测的TrkA受体。标尺杆相当于100微米。
图6A和6B显示了用抗FGF-2的单克隆抗体对P5大鼠椭圆囊切片进行免疫组织化学显微镜分析的荧光照片(图6A)和相差(图6B)照片。注意，尽管毛细胞在感觉上皮组织中清楚地被FGF-2抗体所标记，但是位于毛细胞下方和周围的支持细胞和基底膜细胞却没有被标记(图6A)。缩写：HC，毛细胞；SC，支持细胞；SE，感觉上皮组织；BM，含有基底膜和下方结缔组织的基底膜区域。标尺杆相当于50微米。
图7显示了抗-FGF-2或抗-IGF-1中和抗体对氚化胸苷掺入P4-5椭圆囊上皮细胞的抑制作用。在每种情况下，将等量的悬浮细胞平板接种于补充有1％胎牛血清的培养基中，其中培养基中存在或不存在抗-FGF-2抗体、抗-IGF-1抗体、抗-TGF-α抗体，或抗-CNTF抗体、或者TGF-α(100纳克/毫升)和抗-FGF-2抗体的组合，或TGF-α(100纳克/毫升)和抗-IGF-1抗体的组合。在平板接种后24小时加入3H-胸苷，并且再过24小时测量掺入情况。收集10个培养孔的数据以平均值±均方差的形式表示。注意，抗FGF-2抗体和抗IGF-1抗体表现出明显的抑制作用，但是抗-TGF-α抗体和抗-CNTF抗体没有抑制作用。TGF-α的促细胞分裂作用不因抗-FGF-2抗体或抗-IGF-1抗体的存在而受影响。
优选例的详细描述
定义
如本文所用，出于治疗目的，“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，其中包括人，家畜或农场动物，以及动物园动物、运动动物和宠物如狗、马、猫、羊、猪、牛等。此处，优选的哺乳动物是人。
如本文所用，“IGF-1”指任何物种(其中包括牛、羊、猪、马，较佳的是人)的胰岛素样生长因子，它可以是天然序列形式，也可以是变异形式，而且可以取自任何来源，无论是天然的、人工合成的或是重组的。此处优选的用于动物的是来自待治疗的动物物种的IGF-1形式，例如治疗猪时用猪的IGF-1，治疗羊时用羊的IGF-1，治疗牛时用牛的IGF-1等。此处优选的用于人用途的是具有天然序列的人成熟IGF-1，更佳地是没有N端甲硫氨酸的IGF-1，它们可通过例如1987年8月5日出版的EP230,869、1984年12月19日出版的EP128,733或1988年10月26日出版的EP288,451中所所述的方法进行制备。其他的优选的IGF-1变异形式是在美国专利No.5,077,276、5,164,370或5,470,828或者WO87/01038中所述的形式，即那些在成熟分子的N端至少第3位上没有谷氨酸的变异形式，或者在N端缺失5个以内氨基酸的变异形式。最优选的变异蛋白其N端的前3个氨基酸被缺失(多重命名为脑IGF、tIGF-I、des(1-3)-IGF-1、或des-IGF-1)。天然序列的IGF-1可重组产生，并且可从Genentech，Inc.，South San Francisco，CA获得，以用于临床研究。
如本文所用，“FGF-2”指任何物种(其中包括牛、羊、猪、马，较佳的是人)的成纤维细胞生长因子-2，它可以是天然序列形式，也可以是变异形式，而且可以取自任何来源，无论是天然的、人工合成的或是重组的。此处优选的用于动物的是来自待治疗的动物物种的FGF-2形式，例如治疗猪时用猪的FGF-2，治疗羊时用羊的FGF-2，治疗牛时用牛的FGF-2等。此处优选的用于人用途的是具有天然序列的人成熟FGF-2。美国专利5,352,589提供了FGF-2的合适的缺失蛋白及其生产方法。美国专利5,514,566提供了生产重组FGF-2的方法。美国专利5,464,943提供编码糖基化FGF-2的DNA及其生产方法。用基因工程技术生产FGF的方法是众所周知。使用基因工程技术的生产方法在下列文献中有报道：生物化学生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)146：470(1987)；生物技术(Biotechnology)，5：960(1987)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：16471(1988)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：18452(1988)；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：16297(1988)等。
“处理(治疗)(treatment)”指治疗性处理和预防性或防止性处理，其中目的是防止或减缓(减轻)与内耳组织损伤有关的听力疾病或听力损伤(或平衡性损伤)，较佳地是由耳毒素所诱导或可诱导的而且涉及内耳毛细胞的损伤。需要治疗的对象包括那些已受到听力损伤的对象，那些有受损伤倾向的对象，以及那些要防止受损伤的对象。听力损伤被归咎于内耳毛细胞受损或丧失，其中该受损或受损可由感染、物理性创伤、很响的声音、年龄老化、以及尤其是化学物质所导致，其中耳毒素包括治疗药物(包括抗肿瘤药、水杨酸盐、奎宁和氨基糖苷类抗生素)、食品或药物中的污染物、以及环境和工业污染。一般，为了防止或减低耳毒性，尤其是因施用治疗药物而导致或预计会导致的耳毒性，而进行治疗。较佳地，在暴露于耳毒素之后立刻给予治疗上有效的本组合物，以防止或减轻耳毒素作用。更佳地，治疗是预防性地进行，这可以在施用耳毒性药物即暴露于耳毒素的同时或之前给予本发明组合物。
在本发明上下文中，“耳毒性物质”指通过其化学作用会损害、破坏或抑制与听力有关的神经系统组成部分的活性，并从而损害听力(和/或平衡能力)的物质。在本发明上下文中，耳毒性包括对内耳毛细胞的有害作用。可造成听力损伤的耳毒性物质(耳毒素)包括(但并不限于)：肿瘤药物如长春新碱、长春花碱、顺铂、红豆杉醇、双脱氧化合物(如双脱氧肌苷)；醇；金属；在职业或环境中接触的工业毒素；食物或药品中的污染物质；或剂量过大的维生素或治疗药物，比如抗生素，如青霉素和氯霉素，或超高剂量的维生素A、D或B6，水杨酸盐，奎宁或袢利尿剂。其他可引起耳毒性诱导型听力损伤的耳毒性物质，可用此处所讲授的方法加以鉴别和定性分析。“暴露于耳毒性物质”指耳毒性物质能够或已与哺乳动物接触。暴露于耳毒性物质的发生，可通过直接施用，例如摄入或施用食物、药品或治疗剂(如化疗剂)，也可通过偶然性的污染，或通过环境接触(如暴露于空气或水)。
如本文所用，“慢性”指疾病不是急性的，而是或重或轻地持续发生。“疾病”指能够因用本发明的因子和组合物治疗而受益的任何状态。被治疗的疾病可以是二种或多种上述疾病的组合，而且可以包括听觉或前庭神经元的损伤或丧失。
实施本发明的方式
可用本发明进行治疗的病人，包括那些患此处所述的内耳毛细胞相关病症的病人。
与本发明有关的听力损伤重要是涉及内耳毛细胞的末端器官损伤而导致的感觉听力损失，例如声损伤、病毒性内淋巴内耳炎、梅尼埃(Meniere)氏病。听力损伤包括耳鸣，即在没有声音刺激的情况下感觉到声音，耳鸣可以是间断的或持续的，它被诊断为感觉神经丧失。听力丧失可由细菌或病毒感染造成，例如带状疱疹耳病(herpes zoster oticus)、由急性中耳炎引起的化脓性内耳炎、化脓性脑膜炎、慢性中耳炎、暴聋(包括由病毒引起的，例如由包括腮腺炎、麻疹、流感、水痘、单核白细胞增多症和腺病毒等病毒所引起的病毒性内淋巴内耳炎)。听力损失可以是先天的，例如由下列情况所造成：风疹、出生时缺氧、在分娩时因外伤而导致血流入内耳、母亲服用耳毒性药物、胎儿成红细胞增多症和遗传病症(包括Waardenburg氏综合症和Hurler氏综合症)。听力损失可以是由噪音造成的，通常是由于大于85分贝(db)会损害内耳的噪音所造成。听力损失还包括：老年性耳聋(这是作为年龄老化的正常一部分而发生的感觉神经性听力损失)、颞骨骨折延伸入中耳并破坏鼓膜以及可能破坏听小骨链、影响耳蜗的骨折、以及声学神经鞘瘤(这通常是起源于从第8神经的听觉或前庭分支产生的Schwann细胞的肿瘤)。较佳地，听力损失是由影响内耳听觉部分尤其是内耳毛细胞的耳毒性药物所引起的。关于听力和平衡损伤的描述和诊断，在此引用作为参考的是《(Merck诊断和治疗手册》(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)，14版，(1982)，MerckSharp & Dome Research Laboratories，N.J.中的第196、197、198和199章，以及最新的16版中的相应章节(包括第207和210章)。
诊断听力损伤的测试方法是已知的并且可供使用。可使用神经-耳科学的、神经-眼科学的、神经学的检查方法，以及使用电子-眼成像技术(Wennmo等人，耳鼻喉科学报(Aeta Otolaryngol)(1982)94：507-15)。已有灵敏和特异性的手段可鉴别患有听觉损伤的病人。例如，可用音叉测试来区分传导听力损失和感觉神经性听力损失，并确定损失是否是单侧性的。可用听力计来定量地按分贝测定听力损失情况。每个耳朵的听力用该设备来测量，通常为从125-8000Hz，然后绘制成听力图。也可进行语言测听。可确定在各种不同语言频率下的语言识别阈值，即语言被识别为有意义的符号时的强度。还可以确定语言或音素区分情况并作为感觉神经性听力损失的指标，因为对语言声音的分析依赖于内耳和第8神经。还可以用鼓室测压法(tympanometry)来诊断传导性听力损失并协助诊断患感觉神经性听力损失的病人。还可以在病人尤其是婴儿和儿童或患感染神经性听力损失的病因不详的病人中，使用耳蜗电图法(electrocochleography)(它测量耳蜗的传声反应和第8神经的反应潜力)和皮层诱发反应测听法(它测量脑干和听觉皮质因声学刺激而诱发的反应)。这些测试方法可起诊断作用以及在评估治疗效应时起临床作用。
感觉性和神经性听力损失可以根据复聪试验(对强音感知的异常增加，或尽管听力损失但可听见正常响声的能力)、对强度小幅增加的敏感性、和病理适应(包括镫骨肌反射衰变(stapedial reflex decay))加以区分。复聪在神经性听力损失中通常是没有的。在感觉性听力损失中，与正常耳相比，患病耳对响度的感知会随着强度的每次增加而增加得更多。对强度小幅增量的敏感度可以通过如下方式来证明：提供比听力阈值高20分贝的连续音调，按1分贝的幅度短暂而间歇地增加强度。被觉察到的小幅增量的百分比，就是“短增量灵敏度指数”数值。高数值(80-100％)是感觉性听力损失的特征，而神经性损伤病人和听力正常的人觉察不到强度上的这种小幅变化。当病人不能继续感知高于听力阈值的持续音调时，会表现出病理性适应现象；也就是所知的音调衰变(tone decay)。可用Beskesy氏自动听力计或类似设备来确定这些临床上和诊断上的症状；II型、III型和IV型听力图模式表示是优选的适合于本发明治疗方法的听力损失类型。因为听力损失常伴随着前庭损伤，因此可以测试前庭功能，尤其是具有原因不明的感觉神经性听力损失时。如果可能，应在暴露(指给药)之前对听力损失进行诊断(例如测听试验)，以便获得病人的正常听力基线。一旦暴露(尤其是暴露于耳毒性药物)，测听试验应每周进行2次，而且即使在停止药物治疗之后仍应继续进行，因为听力损失可能在停药后数天才发生。美国专利5,546,956提供了测试听力的方法，它可用于诊断病人和监测治疗情况。美国专利4,637,402提供了一种定量地测定听力缺陷的方法，它可用于诊断病人和监测治疗情况。
在低等脊椎动物和鸟类系统中的研究表明，内耳中的支持细胞是毛细胞的祖细胞(参见例如27和49)，作为对受伤的反应，支持细胞会被诱导增殖并分化成新的毛细胞。然而，在哺乳动物系统中，支持细胞增殖和毛细胞再生的发生频率比鸟类系统低得多(48，92，127)。哺乳动物椭圆囊上皮支持细胞表达上皮抗原，其中包括紧密连接蛋白(ZO1)、细胞角蛋白和F-肌动蛋白，但是不表达成纤维细胞抗原(波形蛋白和Thy 1.1)或神经胶质细胞和神经元抗原。作为特征，在培养时支持细胞需要细胞-对-细胞的接触以便存活，这可通过其他支持细胞或成纤维细胞单层(如用解离的小鸡耳蜗上皮细胞所见)来提供。对毛细胞发育和再生的分子和细胞机理的鉴别工作，受到了下列因素的阻碍：组织尺寸小、内耳的骨结构复杂、以及缺乏毛细胞祖细胞培养系统。
椭圆囊上皮细胞由中枢、感觉上皮和外周的边缘区所构成(Lambert 1994)。在此处获得的结果主要反映了感觉上皮细胞的增殖，因为在培养椭圆囊细胞的实施例中，某些实施例仅在感觉-边缘区交界处发生过渡细胞(transitional cell)的极少延续(carryover)和增殖，或者在其他实施例中获得了完全没有外周非感觉上皮细胞的感觉上皮。此外，此处所给出的体内分析与体外结果是一致的。
在一个实例中，本发明是一种治疗已有或倾向有听力(或平衡)损伤的哺乳动物，或者预防性治疗哺乳动物以防止或减少听力(或平衡)损伤的发生或严重程度的方法，所述损伤由内耳细胞受伤、丧失或退化造成，尤其是由耳毒性物质所造成，其中治疗有效量的本发明的内耳支持细胞生长因子或激动剂，是促进毛细胞再生、生长、增殖的化合物，或者是防止或降低对毛细胞的细胞毒性的化合物，它们通过诱导上皮支持细胞的增殖而导致产生新的毛细胞。这些分子是椭圆囊上皮细胞FGF-高亲和性和IGF-1-高亲和性结合受体的激动剂，而这些结合受体经本文鉴定表明在感觉上皮细胞表面有表达。优选的的化合物是FGF-2、IGF-1、它们的激动剂、它们的功能片段或衍生物、含有FGF-2或IGF-1的嵌合生长因子(例如含有FGF-2或IGF-1的受体结合序列的嵌合生长因子)、FGF-2或IGF-1的小分子模拟物(mimic)、或其抗体激动剂，或上述物质的混合物。任选地，当怀疑或预计有神经元细胞损伤时，还可以给哺乳动物施用trkB或trkC激动剂。较佳地，trkB或trkC激动剂是神经营养蛋白，更佳地是神经营养蛋白NT-4/5、NT-3或BDNF，它们的功能片段、融合蛋白或衍生物，例如嵌合的神经营养蛋白(具有trkB和trkC两者的激动性)、泛嗜神经营养蛋白，或其小分子或抗体激动剂，正如此处详细所述的那样。最佳地，激动剂是NT-4/5，或它们的具有至少trkB和trkC两者的激动活性的嵌合变异体或泛嗜(pantropic)变异体。优选的嵌合或泛嗜神经营养蛋白，具有赋予NT-3-受体结合特异性的区域和赋予NT-4/5-受体结合特异性的区域。一种优选的泛嗜神经营养蛋白是MNTS-1。在优选例中，嵌合的或泛嗜的神经营养蛋白与神经营养蛋白受体的结合程度至少为天然神经营养蛋白配体与受体结合程度的80％。当病者是人时，这些生长因子和神经营养蛋白宜为人的生长因子和神经营养蛋白，或衍生自人基因序列，以部分避免或减少将激动剂识别为外来物质的可能性。当听力损伤是耳毒素所导致或可由耳毒素导致时，本发明方法特别有效。
本发明的另一目的是提供一种治疗哺乳动物的方法，以预防、减少或治疗听力损伤、听力疾病或失衡，尤其是与耳毒素所导致的听力病症，该方法向需要治疗的哺乳动物给予本发明的组合物。一个例子是治疗听力疾病或损伤的方法，其中耳毒性是因使用了治疗有效量的耳毒性药物造成的。典型的耳毒性药物是化疗剂(如抗肿瘤药)和抗生素。其他可能的候选药物包括袢利尿剂、奎宁或奎宁类化合物、水杨酸盐或水杨酸类化合物。
当耳毒性化合物是抗生素(尤其是氨基糖苷类抗生素)时，本发明方法特别有效。耳毒性氨基糖苷类抗生素包括(但并不限于)：新霉素、巴龙霉素、核糖霉素、利维霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、紫霉素、庆大霉素、西索米星、奈替米星、链霉素、地贝卡星、福提霉素、和二氢链霉素，或它们的混合物。具体的抗生素包括新霉素B、卡那霉素A、卡那霉素B、庆大霉素C1、庆大霉素C1a、和庆大霉素C2。
由氨基糖苷类所导致的听力损伤可以用本发明方法来预防或减轻。尽管氨基糖苷类因其对可疑微生物感染有快速杀菌作用而特别有用，但是因为耳毒性和肾毒性副作用而使其在更严重复杂的感染中的用途受到了限制。出于该原因，与其他全身使用的抗生素相比，氨基糖苷类被认为其治疗/风险之比较低。
氨基糖苷类是一类特征为能够干扰微生物蛋白质合成的化合物。氨基糖苷类由两个或多个氨基糖通过糖苷键连于己糖(或氨基环醇)核所构成。目前已知的己糖核是链霉胍或2-脱氧链霉胺，尽管预计还有其他种类。例如，新霉素族含有连于中央2-脱氧链霉胺的3个氨基糖。卡那霉素和glutamicin族只有连于氨基环醇的两个氨基糖。氨基糖苷类包括：新霉素(如新霉素B及其类似物和衍生物)、巴龙霉素、核糖霉素、利维霉素、卡那霉素(如卡那霉素A、卡那霉素B，以及它们的类似物和衍生物)、阿米卡星、妥布霉素、紫霉素、庆大霉素(如庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2，以及它们的类似物和衍生物)、西索米星、奈替米星、链霉素、地贝卡星、福提霉素和二氢链霉素。
能够与本发明的抑制耳毒性组合物一起使用的氨基糖苷类抗生素可以是任何一种氨基糖苷类抗生素。这些氨基糖苷类抗生素的例子包括：卡那霉素(Merck索引，9版，#5132)、庆大霉素(Merck索引，9版，#4224)、阿米卡星(Merck索引，9版，#A1)、地贝卡星(Merck索引，9版，#2969)、妥布霉素(Merck索引，9版，#9193)、链霉素(Merck索引，9版，#8611/8612)、巴龙霉素(Merck索引，9版，#6844)、西索米星(Merck索引，9版，#8292)、异帕米星和奈替米星，这些都是本领域中已知的。可使用的抗生素包括上述化合物的数种结构变异体(如卡那霉素A、B和C；庆大霉素A、C1、C1a、C2和D；新霉素B和C等)。也可采用这些氨基糖苷类抗生素的游离碱形式及其药学上可接受的酸加成盐形式。
出于本公开的目的，术语“药学上可接受的酸加成盐”指通过氨基糖苷类抗生素一个分子与一个或多个摩尔的药学上可接受的酸反应而形成的一元或多元盐。在这些酸中包括：乙酸、盐酸、硫酸，马来酸、磷酸、硝酸、溴酸、抗坏血酸、苹果酸和柠檬酸，以及常用于制造含胺药物盐的其他酸。
因此，本发明方法和组合物可用于预防和治疗动物及人的机会感染，这些动物及人因先天或后天免疫缺陷或因化疗剂治疗的副作用而遭免疫抑制。根据本发明的另一实例，本发明组合物可有利地与已知的抗微生物剂一起使用，以提供预防和/或治疗疾病的改进方法和改进的组合物，其中该疾病可由下列细菌所导致：革兰氏阳性菌，它包括但并不限于：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌；革兰氏阴性菌，它包括但并不限于：大肠杆菌、肠炎杆菌、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)；耐酸细菌，它包括但并不限于：结核分支杆菌和麻风分支杆菌。联合使用抗微生物剂和本发明组合物，对于抗菌的氨基糖苷类药物如庆大霉素、链霉素等是有利的，而这些氨基糖苷类药物已知具有严重的耳毒性并因而降低了其抗微生物药的用途。将本发明组合物与这些抗微生物药联合使用，便可用更低剂量的毒性抗微生物药，并且仍将达到治疗(抗菌)效果。
在某些实例中，本发明组合物可与耳毒素一起给药。例如，提供了一种通过施用氨基糖苷类抗生素治疗哺乳动物感染的改进方法，该改进包括：给需要治疗的病人施用治疗有效量的FGF-2、IGF-1或它们的激动剂，以减少或预防与该抗生素有关的耳毒性所诱导的听力损伤。在另一实例中，提供了一种通过施用化疗剂化合物治疗哺乳动物肿瘤的改进方法，该改进包括：给需要治疗的病人施用治疗有效量的本发明组合物，以减少或预防与该化疗药物有关的耳毒性所诱导的听力损伤。
此处，还提供了促进新的内耳毛细胞的方法，即在接触能导致听力或平衡损伤或疾病的物质或作用，或之前、或之后，诱导内耳支持细胞增殖再生或生长。这些物质和作用是本文已描述过的。该方法包括步骤：向内耳毛细胞施用有效量的FGF-2、IGF-1或它们的激动剂，或者此处公开的有用的因子。较佳地，该方法是在一旦暴露于对听力有损害的耳毒素，或之前，或之后使用的。
在另一例子中，该治疗方法被用于因使用化疗剂而导致的听力损伤，以对付化疗剂的耳毒性副作用。适用于本发明方法的耳毒性化疗剂包括(但并不限于)：抗肿瘤药物，它包括顺铂或顺铂类化合物、红豆杉醇或红豆杉醇类化合物，和其他据信会造成耳毒素诱导型听力损伤的化疗剂，如长春新碱、用于治疗血液恶性肿瘤和肉瘤的抗肿瘤药物。
在另一实例中，本发明方法用于治疗服用奎宁或其合成替代品(它们通常用于治疗疟疾)而导致的听力损伤，以对付其耳毒性副作用。
在另一实例中，本发明治疗方法用于服用利尿剂而导致的听力损伤，以对付利尿剂的耳毒性副作用。利尿剂，尤其是“袢”利尿剂，即那些主要在汉勒氏袢(Loop of Henle)中起作用的利尿剂，是候选的耳毒素。其代表性的，不限制于本发明的例子包括：呋塞米、利尿(ethacrynic)酸和汞制剂。利尿剂通常用于预防和消除水肿。利尿剂也用于非水肿状态，例如高血压、高血钙、特发性高钙尿(hypercalciuria)、和肾原性糖尿病(nephrogenic diabetes insipidus)。
在另一实例，本发明组合物可与促进神经细胞生长、增殖或再生的药物一起施用。如本领域中所知，低浓度的庆大霉素会优先杀死毛细胞而对神经节神经元的破坏却不明显。然而，高浓度的庆大霉素会诱导神经节神经元和毛细胞的退化。因此，氨基糖苷类的这种双重毒性可用本发明方法加以处理，较佳地是用本发明组合物进行处理。
FGF-2和/或IGF-1，或其激动剂可直接通过合适的技术给予病人，其中包括肠胃外给药、鼻内给药、肺内给药、口服或通过皮肤吸收。如果它们被一起给药，那么它们没有必要按同一途径进行给药。它们可以局部给药或全身给药。肠胃外给药的例子包括：皮下、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、和耳蜗内给药，可每天皮下注射给药，可植入给药，可以液滴滴入耳道中，送到内耳的鼓室阶，或以耳蜗听力植入物的可扩散膜形式提供。
IGF-1和FGF-2，或其激动剂可合用，直接通过合适的技术给予哺乳动物，包括输液和注射。具体的给药途径将取决于例如病人的病史，包括单独使用FGF-2或IGF-1时任何觉察到的或预计的副作用，以及待纠正的具体病症。肠胃外给药的例子包括：皮下、肌内、静脉内、动脉内和腹膜内给药。最佳地，给药是通过连续输注(例如使用缓释装置，或小型泵如渗透泵，或皮肤贴剂)，或通过注射(例如使用静脉内或皮下注射方式)。还可以单个丸药或缓释储存制剂形式给药。激动剂可通过多种途径按需要以急性或慢性方式给药，以用于预防或治疗用途，这些途径包括：静脉内、腹膜内、脑内、肌内、皮内、眼内、动脉内、皮下途径的注射或输注或病灶内，或局部给药，或口服(如果采用口服活性小分子)，采用下述的缓释系统，或通过使用连续给药装置(如泵)的留置导管，通过贴剂(patch)，或植入物系统(例如植入缓释载体或分泌生长因子和/或神经营养蛋白的且免疫上隔离的细胞)。激动剂可通过如下方式连续给药：通过输注，或通过定期注射丸药(如果清除速度足够慢)，或通过将药输送到血流、淋巴、CNS或脊髓液中。一种优选的给药方式是直接导向耳朵或前庭的患病部位(例如通过植入物局部给药)，而且较佳地针对患病的毛细胞、它们的支持细胞，并可(任选地)针对相关的神经元，以便将分子导向病源并尽量减少激动剂的副作用。
正如所指出的那样，组合物可以通过长期植入的套管(cannulas)而进行注射，或者在小型渗透泵的帮助下长期输注。已有将蛋白质通过小管输送到合适区域的皮下泵。高度完善的泵可以通过皮肤再灌充(refill)，而且它们的输送速度可以无需手术来设定。涉及皮下泵装置或通过完全植入的药物输送系统作连续输注的合适给药方案和输送系统，是那些用于将多巴胺、多巴胺激动剂和胆碱能激动剂输送给阿尔茨海墨病(Alzheimer)病人和帕金森(Parkinson)病动物模型的种类，如Harbaugh，J.Neural Transm.Suppl.，24：271-277(1987)和DeYebenes等人，运动疾病(Mov.Disord.)，2：143-158(1987)所述，这些文献公开的内容在此引用作为参考。在构思范围内的是，可以将活跃地产生激动剂的细胞引入到需要使激动剂浓度更高的区域。
在治疗中所用的激动剂有效量将取决于例如，治疗目的、给药途径和病人种类和病人的状况。因此，治疗专家有必要测定剂量的效价并按需要对给药途径进行修改，以便获得最佳的治疗效果。如本领域中众所周知，需要根据年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病严重程度等情况加以调节，这可由该领域的技术人员通过常规试验而确定。一种单独使用激动剂的典型日剂量约为1微克/千克至100毫克/千克病人体重或更高，这取决于上述的因素，较佳地为10微克/千克/天-10毫克/千克/天。典型地，临床医师会施用激动剂，直至到达的剂量可修复、维持或最佳地可重建神经元功能以便缓解听力损伤。通常，激动剂按如下剂量配制和输送至靶位点，此剂量使得在靶位点处激动剂的浓度大于约0.1纳克/毫升，更通常约0.1纳克/毫升-5毫克/毫升，较佳地约1-2000纳克/毫升。在本发明的具体实施例中，有效的药物组合物可以提供局部浓度为约1-100纳克/毫升，较佳地5-25纳克/毫升，更佳地10-20纳克/毫升。该治疗进程可轻易地用常规试验以及听力或平衡诊断方法进行监视。
如果同时给予两种激动剂，没有必要以同一途径给药，也没有必要在同一制剂中给药。然而，如果需要，它们可以合并在一个制剂中。在一个优选例中，FGF-2可任选地与IGF-1联合或一起施用。可将两种激动剂施用于病人，每种都为其有效量，或者每种的剂量为其次佳剂量但联合施用时有效。较佳地，这种剂量为每种约10微克/千克/天至10毫克/千克/天，更佳地100至200微克/千克/天。在另一优选实例中，两种激动剂靠使用可进入内耳的装置(这取决于所用的激动剂类型)，通过注射而局部给药。更佳地，给药是通过植入物或贴剂。通常，临床医师会给予激动剂直至剂量达到可实现所需的治疗听力损伤的效果。该治疗进程可用常规试验容易地加以监视。
在治疗中所用的FGF-2和/或IGF-1可按符合优良药物制备规矩(GMP)的方式进行配制和制成剂型，并考虑到各病人的临床状况(尤其是单独用FGF-2或IGF-1治疗时的副作用)、IGF-1或FGF-2组合物的输送部位、给药方法、给药时间安排、和医师知晓的其他因素。出于本申请目的，每种组份的“有效量”由这些考虑因素所决定，有效量是防止内耳细胞功能受损或退化的量，或是恢复内耳细胞功能的量。
FGF-2还可这样施用，使得它持续地存在于内耳并且在施用FGF-2期间维持存在。这最好是通过连续输注方式实现，例如通过小型泵如小型渗透泵。或者，也可通过经常注射或局部施用FGF-2(即超过每天一次，如每天2或3次)来实现。
在另一例子中，FGF-2可以用长效FGF-2制剂给药，该长效制剂或者延缓FGF-2从内耳被清除的速度，或者使FGF-2从(例如)注射或给药位点缓慢地释放。延长FGF-2的血浆清除时间的长效制剂可以是FGF-2与大分子共价偶连(可逆或不可逆地结合)，或复合的形式，例如该大分子是选自以下的水溶性聚合物(即在室温下可溶于水的物质)：PEG和聚丙二醇均聚物和聚氧乙烯多羟基化合物。或者，FGF-2可以复合或结合于聚合物以增加其循环半衰期。用于该目的的聚乙烯多羟基化合物和聚氧乙烯多羟基化合物包括：聚氧乙烯甘油、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇、聚氧乙烯葡萄糖等。聚氧乙烯甘油的甘油骨架与(例如)动物和人中的甘油骨架相同，可处于甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯状态。
聚合物不必具有特定的分子量，但是较佳地分子量约为3500-100,000之间，更佳地为5000-40,000之间。较佳地PEG均聚物是未取代的，但是它也可以在一端用烷基进行取代。较佳地，烷基是C1-C4烷基，最佳地是甲基。最佳地，聚合物是未取代的PEG均聚物、单甲基取代的PEG均聚物(mPEG)或聚氧乙烯甘油(POG)，而且分子量约为5000-40,000。
在另一例子中，上述病人用有效量的IGF-1进行治疗。作为一般规律，肠胃外给药的每剂IGF-1的总药物有效量约为10微克/千克/天-10毫克/千克病人体重/天，较佳地100-200微克/千克/天，尽管如上所述这可以有具体治疗情况而定。
IGF-1可以通过任何方式进行给药，正如对FGF-2或它们的混合物所阐述的那样，包括注射和输注。与FGF-2相同，IGF-1可以被配制成能够在治疗过程中持续存在于内耳中，正如上面对FGF-2所阐述的那样。因此，可将IGF-1共价连于一种聚合物，制成缓释制剂，或通过植入产生该因子的细胞来提供。
此外，IGF-1可以适当地与一种或多种它的结合蛋白一起施用，例如那些目前已知的结合蛋白如IGFBF-1、IGFBF-2、IGFBF-3、IGFBF-4、IGFBF-5、或IGFBF-6。IGF-1也可偶连于受体或抗体或抗体片段，然后再给药。本文优选的IGF-1结合蛋白是IGFBF-3，它在美国专利No.5,258,287和Martin等人生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，261：8754-8760(1986)中有描述。糖基化的IGFBF-3蛋白是在人血浆中发现的125-150千道尔顿糖蛋白复合物(该复合物携带大多数内源的IGF并且也受GH调控)的一个酸稳定组份，该组份在非还原性SDS-PAGE凝胶上约为53千道尔顿。
将IGF结合蛋白与IGF-I一起施用，可通过例如美国专利NO 5,187,151和5,407,913中所述的方法实施。简而言之，施用有效量的且摩尔比约为0.5∶1至3∶1的IGF-I和IGFBP。几乎所有血液中的IGF-1都结合于IGFBF-3，而且IGF-1/IGFBP-3通常以复合物形式在人和其他哺乳动物体内循环。该复合物与第三种蛋白质(ALS)缔合，该第三种蛋白质(ALS)的存在量超过IGF和IGFBP-3的正常浓度。因此，发现的ALS既与IGF-1/IGFBP-3复合物缔合，也有游离形式。形成的三元复合物的大小约为150kD。施用IGF和IGFBP-3的复合物(无论是天然来源的还是重组来源的)，会导致与通常过量的ALS形成三元复合物。这种治疗方式看来可使循环中的IGF的浓度长期增加，而IGF从三元或二元复合物中逐渐释放。这种给药方式避免了施用游离IGF-1相关的有害副作用(例如低血糖，抑制生长激素和ALS的产生，以及使内源IGF-II从内源IGFBP-3中释放出，因为所给予的游离IGF-1会将正常循环的IGF-1I/IGFBP-3复合物中的内源IGF-1I置换出来)。IGFBP-4和IGFBP-6是体内广泛分布的糖基化蛋白。IGFBP-4的一级结构由Shimasaki等人报道(分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)，(1990)4：1451-1458)。IGFBP-6[其cDNA由Shimasaki等人分离(分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)，(1991)4：938-48)]，对IGF-1I的亲和力远大于对IGF-1的亲和力。IGFBP-5是非糖基化的252个氨基酸的结合蛋白。Shimasaki等人(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1991)266：10646-53)从人胎盘文库中克隆出了人的IGFBP-5 cDNA。
依据在IGF/IGFBP复合物制剂中所需的结合、代谢和药物动力学特性，可以将这些结合蛋白以不同比例加至复合物制剂中。这些IGFBP可以与IGF-1和/或IGF-1I以各种不同比例进行联合施用。因为IGF和IGFBP-3天然是以1∶1摩尔比进行复合，因此，如上所述，等摩尔量的IGF和IGFBP-3构成的组合物是优选的。可以在IGF：IGFBP-3的摩尔比为0.5-1.5范围内配制产品。较佳地，该摩尔比为0.9-1.3；最佳地，产品是以接近1∶1的摩尔比进行配制的。当使用其他IGFBP时，IGFBP与IGF之比可以改变。IGF和IGFBP宜为天然来源或重组来源得到的人蛋白。最佳地，IGF和IGFBP是用重组手段制得的人IGF-1和IGFBP-3，它们分别被命名为rhIGF-1和rhIGFBP-3。rhIGFBP-3可以糖基化或非糖基化方式给药。大肠杆菌是一种获得重组的非糖基化IGFBP-3的来源。可从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞获得重组形式的糖基化IGFBP-3。
应注意，医师在计划IGF-1和FGF-2两者剂量时应考虑用这些因子治疗时已知的副作用。IGF-1的主要明显副作用是低血糖。Guler等人美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86：2868-2872(1989)。
样品中IGF-1的浓度可在酸性乙醇抽提之后，用RIA或ELISA法测定(IGF-1 RIA试剂盒，Nichols Institute，San Juan Capistrano，CA)。FGF-2可类似地或用其他合适的灵敏而特异的方法进行测定。
根据内耳的组织结构(例如在颞骨内所含的耳部分，颞骨是整个人体中最致密的骨组织)，将治疗剂以受控和有效方式进行输送是已知的。非常重要的代表性内耳组织结构包括(但并不限于)：耳蜗、内淋巴囊/内淋巴管、前庭迷路、和包含这些部分的所有腔室(compartment)。通常可通过各种不同结构而进入上述内耳组织区域，这些结构包括：圆窗膜、卵形窗/镫骨垫板(footplate)和环韧带。中耳可以被定义为鼓膜(例如耳鼓)后、内耳前的含气生理组织区域。还应注意到，进入内耳可以通过内淋巴囊/内淋巴管和耳囊(otic capsule)而实现。内耳组织的尺寸很小，通过要通过显微外科手术才可接近。通常用于治疗内耳组织的代表性药物包括(但并不限于)：脲、甘露醇、山梨糖醇、甘油、木卡因、肾上腺素、免疫球蛋白、氯化钠、类固醇、肝素、透明质酸酶、氨基糖苷类抗生素(链霉素/庆大霉素)和适合治疗人体组织的其他药物、生物材料和药物组合物。同样，对内耳组织和/或液体的治疗可能会涉及其压力、体积和温度特性的改变。这类液体压力水平的失衡可能引起各种问题，其中包括(但并不限于)各种已知的病症：内淋巴水肿、内淋巴高压、外淋巴高压和外淋巴水肿，这些将在下面详细阐述。
将治疗剂输送到患者的内耳中可这样进行：通过与内耳的接触，或通过外听觉道和中耳(如通过注射或导管)，或如美国专利5,476,446那样(它提供了一种专门设计用于治疗和/或诊断人内耳的多功能装置)。用于本发明实践的装置可具有多种功能，其中包括但并不限于：(1)将治疗剂输送到内耳或中耳-内耳界面组织；(2)从内耳中抽出液体物质；(3)导致内耳液体液体腔中温度、压力和体积变化。和(4)使内耳结构受到电生理方法监测。此外，还可使用其他系统来输送本发明的因子和组合物，这些系统包括但并不限于：在Kingma，G.G.等人，“将药物慢性输注至豚鼠的鼓阶”，神经学方法杂志(Journal of Neuroscience Methods)，45：127-134(1992)中所描述的渗透泵。一种代表性的可购得的渗透泵，可从Alza Corp.，Palo Alto，CA，USA获得。美国专利No.4,892,538提供了一种植入装置，它可用于输送本发明的因子和制剂。遗传改造过从而能报道FGF-2或IGF-1或两者(还可任选地表达其他增强或促进因子或治疗剂(如trkB或trkC激动剂))的细胞，可以被植入宿主中以提供有效水平的因子。这些细胞可以按例如美国专利No.4,892,538和5,011,472、WO92/19195、WO95/05452、或Aeiseher等人，自然(Nature)2：696-699(1996)中所述的那样进行制备、装入胶囊和植入。美国专利5,350,580中提出了一种适用于本发明的、含有可生物降解载体的装置，在该载体中掺入了治疗有效释放量的至少一种适合用于本发明的活性物质；将该装置通过手术插入中耳，从而能长期释放活性物质供给中耳。
IGF-1、FGF-2或其激动剂还适合通过缓释系统一起给药。合适的缓释组合物的例子包括：一定形状制品形式(例如膜或微囊)的半渗透性聚合物基质。缓释基质包括聚交酯(美国专利No.3,773,919、EP58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人，生物聚合物(Biopolymers)，22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)，15：167-277(1981)和Langer，化学技术(Chem.Tech.)，12：98-105(1982))，乙烯乙烯基乙酸酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP133,988)。缓释的IGF-1组合物还包括用脂质体包裹的IGF-1。含有IGF-1的脂质体可用众所周知的方法制备：DE3,218,121；Epstein等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，77：4030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和4,544,545；和EP102,324。通常，脂质体是小(约200-800埃)单室形式，其中脂类含量大于约30摩尔％的胆固醇(为了获得最佳的IGF-1和FGF-2治疗，可以调节选定的比例)。
对于肠胃外给药，在一个例子中，IGF-1、FGF-2或其激动剂通常可这样配制：将具有所需纯度的每种组份与药学上或肠胃外可接受的载体(即在所用剂量和浓度下对接受者无毒性而且与制剂中其他成分相容的物质)相混合，形成单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)。例如，制剂宜不含有氧化剂和其他已知对多肽有害的物质。
一般，制剂的制备可通过：将IGF-1、FGF-2或其激动剂均匀而充分地与液态载体或细分固体载体或两者相混合。载体可以是肠胃外给药载体，较佳地是与接受者血液等渗的溶液，更佳地是配制成能够局部施用于内耳。载体材料的例子包括水、盐水、Ringer氏溶液、缓冲溶液、和葡萄糖溶液。非水性载体如固定油和油酸乙酯也可用于此处。
载体可合适地含有少量添加剂(例如增加等渗性和化学稳定性的物质)，而且在局部给药时对耳朵(尤其内耳)的细胞和结构无毒。这些材料在所用剂量和浓度下对接受者无毒，而且可含有：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或其盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、海藻糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子如钠；非离子型表面活性剂如聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)、或聚乙二醇(PEG)；和/或中性的盐如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙等。
IGF-1和FGF-2通常可在这些载体中被配制成pH约为4.5-8。全长IGF-1在pH不超过约6.5时通常是稳定的，较佳地配制成pH5-5.5；而des(1-3)-IGF-1在pH约3.2-5是稳定的。应了解，使用上述的某些赋形剂、载体或稳定剂可导致形成IGF-1或胰岛素盐。最终的制剂可以是稳定的液体或冻干的固体。优选的稳定剂是苄醇或苯酚，或两者，而优选的缓冲溶液是乙酸盐缓冲溶液。海藻糖和甘露糖也是优选的稳定剂。更佳地，渗透调节剂(osmolyte)是氯化钠，而乙酸盐是乙酸钠。此外，制剂可含有表面活性剂，较佳地是聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)。
“渗透调节剂”指等渗改变剂或渗透调节物质，它赋予缓冲溶液克分子渗透压浓度(osmolality)。克分子渗透压浓度指由离子和非离子化的分子导致的溶液的总渗透活性。例子包括：无机盐如氯化钠和氯化钾、甘露醇、PEG、聚丙二醇、甘氨酸、蔗糖、海藻糖、甘油、氨基酸和糖醇如甘露醇，在本领域中已知它们通常被认为是安全的(generally regarded as safe，GRAS)。此处优选的渗透调节剂是氯化钠或氯化钾，尤其是局部给药时。
“稳定剂”指任何能起到下列作用的物质：保护制剂中活性成分(即FGF-2和IGF-1)，从而使它们在合理长的时间内不降解，否则经过一段时间后它们会失活或产生病原体或毒素以致不能使用。稳定剂的例子包括防止细菌、病毒和真菌在制剂中繁殖的防腐剂、抗氧化剂和以各种方式保持制剂稳定性的其他物质。
例如，季铵盐是有用的稳定剂，其中分子结构包括与4个有机基团(通常为烷基或芳基)相连的中央氮原子以及负电荷的酸根。这些盐可用作许多病原性非孢子细菌和真菌的表面活性杀菌剂，还可用作稳定剂。例子包括氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化己烷甲铵、氯化苯烷鎓(氯化烷基苄基二甲基铵的混合物，其中烷基是长链化合物)和氯化苯乙铵。其它类型的稳定包括芳香醇如苯酚和苯甲醇，对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，和间甲酚。
通常，稳定剂可包含在稳定的液体形式的制剂中，但是不包含在冻干形式的制剂中。在后一种情况下，稳定剂存在于用于重建(reconstitution)的注射用抑菌水(BWFI)中。然而，海藻糖或甘露糖醇等可以而且较佳地存在于冻干形式中。表面活性剂还可存在于重建稀释剂中。
“无机盐”是没有基于烃的阳离子或阴离子的盐。例子包括：氯化钠、氯化铵、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钙、磷酸镁、磷酸钾、磷酸铵、硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾、硫酸镁、硫酸钙等。较佳地，阳离子是钠，而阴离子是氯离子或硫酸根。最佳的无机盐是氯化钾或氯化钠。
“表面活性剂”的作用是增加IGF-1和FGF-2在pH4-7下的溶解性。较佳地是非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、60或80，或是泊洛沙姆如泊洛沙姆184或188，或是该领域已知的通常认为是安全的种类。较佳地，表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆，较佳地是聚山梨醇酯，最佳地是聚山梨醇酯20。
″缓冲剂″可以是任何通常认为安全的适当缓冲剂，而且可赋予NPH胰岛素+IGF-1制剂pH约4.8-8，较佳地pH约5-7，更佳地pH约5-6；对于IGF-1制剂，宜赋予pH约5-6，较佳地pH约5-5.5。例子包括乙酸盐缓冲剂(它可以是乙酸的任何盐，包括乙酸钠和乙酸钾)、琥珀酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、或本领域已知具有所需效果的缓冲剂。最佳的缓冲剂是乙酸钠，并可任选地与磷酸钠一起使用。
最终制剂，如果是液态，宜在约2-8℃的温度下储藏不超过4周。或者，此制剂可冻干并以粉末形式提供，以便与注射用水(注射用水按液体制剂所述方式储藏)进行重建。
美国专利5,482,929提供了有用的稳定化的FGF-2组合物，它含有硫酸环糊精的铝盐以使FGF稳定化。重组的人碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)的使用浓度可大于0.1纳克/毫升，较佳地约0.5-40纳克/毫升，更佳地约2纳克/毫升，尤其是体外使用时。
用于治疗给药的IGF-1和FGF-2宜无菌。这可通过无菌过滤膜(约0.2微米膜)过滤来实现。治疗用IGF-1和FGF-2组合物通常置于有无菌入口的容器中，例如静脉输液袋或小瓶(具有可被皮下注射针头刺穿的塞头)。
IGF-1和FGF-2以水溶液形式，或以可重建的冻干制剂形式储藏在单剂或多剂的容器中，例如密封的安瓿或小瓶中。作为一种冻干制剂的例子，在10毫升小瓶中注入5毫升无菌过滤过的1％(w/v)IGF-1和FGF-2水溶液，然后将形成的混合物冻干。输注溶液可通过将冻干的IGF-1和FGF-2用抑菌注射用水重建而制得。
本文的组合物还可适当地含有其他生长因子，最佳地是听觉和前庭神经元细胞生长因子，或者这些因子的混合物，或其他毛细胞再生因子例如维甲酸，或维甲酸与TGF-α的混合物。这些生长因子(包括肽生长因子)可适当地以能够有效实现下述目的的量存在，例如需要时可促进神经元细胞的存活、生长、增殖、再生、重建或恢复，而且可任选地增强听觉或前庭神经元的生长或恢复。
用本发明方法治疗听力损伤的有效性，可以通过下列恢复征兆加以评估，包括正常听力功能的恢复(这可用已知的诊断技术(包括此处所述的技术)进行评估)，和神经传导速度恢复正常(这可用电生理方法进行评估)。
在另一例子中，本发明激动剂组合物可在临床器官植入或移植时使用，以便保持或增加内耳毛细胞的活力。较佳地，如此处所述，可与植入物或移植物一起联合使用多种因子(包括trkB和trkC激动剂)。
试剂盒也在本发明的构思之内。一种典型的试剂盒包括：用于装IGF-I制剂的容器(较佳地是小瓶)，该IGF-I制剂含有处于药学上可接受缓冲液中的IGF；和/或用于装药学上可接受FGF-2的容器(较佳地是小瓶)；以及用于指导用户如何使用容器，尤其是如何将两个容器的内含物(即两种制剂)混合以提供药物制剂的说明书，如产品插页或标签。较佳地，该药物制剂是用于治疗听力损伤的。
在此处实施例章节所提供的试验中，用酶法和/机械法联合分离出完整的椭圆囊上皮片，基本上仅含有支持细胞和毛细胞(Corwin等人，1995)。培养细胞的上皮身份用各种特异性细胞标记得以证实。尽管这些细胞表达上皮抗原(其中包括紧密结合蛋白(ZO1)、细胞角蛋白和F-肌动蛋白)，但是不表达成纤维细胞抗原(波形蛋白和Thy 1.1)或神经胶质细胞和神经元抗原。因为对酶消化和机械研碎(trituration)敏感，大多数毛细胞(具有立体纤毛束的细胞)会受伤，它们中的许多在培养2天后死亡。因此，这些培养物基本上代表了椭圆囊支持细胞群，它们是毛细胞的祖细胞(Corwin和Cotanche，1988；Balak等人，1990；Rapheal，1992；Weisleder和Rubel，1992)。这些培养物提供了用于研究内耳支持细胞的增殖和分化的体外系统。
培养的内耳上皮细胞需要与邻近的上皮细胞发生细胞-对-细胞式的接触才能存活和增殖。最初试图培养完全解离的上皮细胞，但基本上导致所有细胞死亡。上皮祖细胞的存活和增殖需要细胞-细胞接触，这是前所未知的，而且该现象以前在脑胚区域祖细胞(Gao等人，1991)和E9大鼠神经上皮细胞(Li等人，1996)中曾观察到。神经上皮细胞的增殖在体内仅发生在高度致密的CNS室区域，在体外仅发生于祖细胞重聚集部(reaggregates)(Gao等人，1991)或神经球部(Reynolds和Weiss，1992)，这一事实提示，对于神经上皮细胞的生长存在一种膜结合因子。与这一想法相一致，已表明C6神经胶质瘤细胞系的膜结合组份是解离的单个皮质祖细胞增殖和存活所必需的(Davis和Temple，1994)。与器官培养相反(Warchol和Corwin，1993)，部分解离的上皮细胞在无血清培养基中生长得很差，这提示除了膜结合分子之外，血清中的可溶性因子也促进这些细胞的生长。已报道，单层的成纤维细胞足以支持完全解离的鸡耳蜗上皮细胞的生长(Finley和Corwin，1995)。
应注意，椭圆囊上皮细胞由中枢感觉上皮和外周边缘区域(Lambert 1994)构成。曾经尝试仅收集解离时的感觉上皮。然而，在最初的试验中，位于感觉上皮和边缘区交界处的某些过渡细胞(transitional cell)中的一小部分被包括在收集之中，因为难以将它们完全从小而脆弱的上皮片上去除。将部分解离的上皮片悬浮后，可以将这些细胞均匀地等分加入各培养孔中。获得的数据主要反应了感觉上皮细胞的增殖，尽管小部分过渡上皮细胞可能也作了少许贡献。尽管来自两个区域的上皮细胞可能在胚胎发生期间衍生自至同一前体细胞(例如原感觉细胞(prosensory cell)，参见例如Kelley等人，1993)，但是它们在毛细胞分化或再生过程中似乎起着不同作用。假设感觉上皮中的细胞比边缘区域中的细胞分化程度更高，因为与椭圆囊感觉上皮中的外周毛细胞相比，中央毛细胞在发育过程中出现得更早(Sans和Chat，1982)。此外，以前的试验(Lambert，1994)报道，一旦暴露于氨基糖苷类或受到TGF-α的诱导作用，椭圆囊上皮的感觉区域和边缘区域两者中都观察到相等的增殖现象。
如此处的实施例中所公开的那样，已解剖出完全不含外周非感觉上皮细胞的感觉上皮(尽管只有少得多的细胞被获得并置于培养孔)。与最初试验一样，获得了几乎相同的FGF-2、IGF-1，EGF和TGF-α的促细胞分裂效应。测得的氚化胸苷掺入量(cpm)如下：对照＝671±92；FGF-2处理＝1787±221；IGF-1处理＝1592±174；EGF处理＝1168±130；TGF-α处理＝1483±109(n＝10/组)。
此纯上皮细胞培养物(结合氚化胸苷分析)，是一种快速而方便的方法，可评估各种生长因子对内耳上皮祖细胞增殖所起作用。在较短时间内，可以检测而且已经检测了大量的物质。氚化胸苷试验的结果得到了BrdU免疫细胞化学数据的支持。在这些试验中，在30种生长因子中，有几个FGF家族成员即IGF-1、IGF-2、TGF-α和EGF是椭圆囊支持细胞增殖的促细胞分裂剂。
随着越来越多的精力投向早期毛细胞标记的发现和发育(Holley和Nishida，1995)，本发明的培养物也可用于直接研究毛细胞分化。与体内或器官培养相比，用本文所公开的纯椭圆囊上皮细胞培养物，大大促进和简化了祖细胞增殖和毛细胞分化药物的测试。例如，因为本发明，现在就可以在这些培养物中使用特异性的抑制剂或激活剂，以进一步剖析涉及毛细胞分化的某个生长因子的信号传导通路。
尽管此处观察到TGF-α和EGF的促细胞分裂效应与以前的报道(Lambert，1994；Yamashita和Oesterle，1995)相一致，但是FGF家族的几个成员、IGF-1、IGF-2以及FGF-2和TGF-c或IGF-1的组合所获得的结果是新颖而出人意料的。这些本文后面的发现与Yamashita和Oesterle(1995)所报道的在完整器官培养物中的研究结果是相反的。导致这些结果之间不一致的一种可能性是，在本发明解离的椭圆囊上皮细胞培养物中毛细胞的剥除(deprivation)可能触发了FGF和IGF-1受体的上调，并增强了对FGF和IGF-1的应答反应。如果这样的话，这可能反映了在内耳受伤或遭损害时所发生的情况。最近，Lee和Cotanche(1996)报道噪音损伤鸡耳蜗上皮会导致支持细胞中FGF受体mRNA的上调。Finley和Corwin(1995)报道，FGF-2可促进已完全解离并平板接种于成纤维细胞单细胞层上的鸡耳蜗支持细胞的增殖。在剥除毛细胞和用针对FGF-2或IGF-1的中和抗体抑制细胞增殖之后，在内耳上皮细胞中存在高水平的FGF受体和IGF-1受体，这支持如下观点：即在除去毛细胞之后，FGF-2和IGF-1就直接作用于内耳支持细胞并诱导它们增殖。FGF-2和IGF-1是调控内耳支持细胞增殖的候选分子，尤其是在受氨基糖苷类或噪音伤后后毛细胞的再生过程中。
或者，在内耳上皮的成熟过程中，对包括FGF-2和IGF-1在内的生长因子有发育性应答变化。可能成熟内耳毛细胞的应答不同于发育中的上皮。加入的外源FGF-2或IGF-1，可能与它们在未成熟椭圆囊中的表现不同，不能在完整而成熟的椭圆囊中(Yamashita和Oesterle，1995)或用极低浓度氨基糖苷类药物(1nM)处理的鸡组织中(Oesterle等人，1995)引发增殖。一旦因噪音或药物而造成严重损伤(毛细胞的大规模退化)，就可能触发未成熟的上皮返回到更早期的发育阶段。这种受伤所诱导的状态转变(status shift)已见于发育中的神经元中注意到(Gao和Macagno，1988)。本发明研究是在仍处于成熟化过程中的产后大鼠内耳细胞上进行的，然而据信这证明了在成年哺乳动物遭到听觉损伤或接触高剂量的氨基糖苷类之后，FGF-2和IGF-1对毛细胞退化的影响力。
令人感兴趣的是，尽管几种FGF家族成员是促细胞分裂源，但是FGF-1和FGF-5却不引发可检测到的效应。因为至少有4种不同的FGF受体亚型而且有该受体的不同剪接形式(Johnson和Williams，1993)，因此不知道何种亚受体(subreceptor)介导该信号传导通路。特别有趣的是，注意到FGF-1没有作用，而FGF-1存在于螺旋神经节中并已提出它是毛细胞的营养因子(Pirvola等人，1995)。
以前曾报道，在个体发育早期，IGF-1刺激耳泡的增殖生长(Leon等，1995)。在此处报道的工作表明，除此之外，IGF-I还调控稍晚阶段(支持细胞增殖阶段)内耳上皮的发育。因为已表明IGF-1可在神经元发育的多个阶段中发挥作用，其中包括增殖(Gao等人，1991)、分化和存活(Neff等人，1993；Beck等人，1995)，因此令人感兴趣的是应确定它是否还在毛细胞发育更晚阶段起作用，或是否可与其他生长因子协同作用。Gray等人(1996)的初步研究报道，IGF-1可保护毛细胞免受氨基糖苷类所诱导的凋亡(apoptosis)。因为IGF-1受体是由培养的椭圆囊上皮细胞所表达(图5)，因此很可能IGF-1作用于IGF-1受体。然而，还不能排除IGF-1与胰岛素受体之间的交叉反应，因为胰岛素也可引发促细胞分裂效应(数据未给出)。
椭圆囊上皮细胞表达FGF-2及其受体这一发现揭示，FGF-2是毛细胞发育、维持和/或再生所需的生理生长因子。FGF-2可通过自分泌机制而发挥其作用。在这种模型中，产自毛细胞的FGF-2可提供它们自身的营养支持。最近的研究表明，在神经系统中，细胞分化和存活可能受生长因子所介导的自分泌作用所调控。例如，发现了神经营养蛋白及其mRNA共同定位于大鼠前脑中(Miranda等人，1993)，而BDNF自分泌环调控培养的背根神经节细胞的存活(Acheson等人，1995)。Low等人(1995)提出，FGF-2可保护产后大鼠耳蜗毛细胞免受氨基糖苷类诱导的损伤。或者，还可假定有旁分泌作用，其中由毛细胞产生的FGF-2可能局部影响相邻毛细胞的维持和支持细胞的增殖。在这种情况下，毛细胞的退化可导致FGF-2的爆发性释放，这刺激了内耳上皮支持细胞的增殖。后一种假设可解释因声音损伤或接触氨基糖苷类而造成细胞死亡后支持毛细胞的增殖现象，因为FGF-2没有信号肽而且细胞受伤是导致释放FGF-2的主要途径。此处的资料，即抗-FGF-2抗体(而不是抗-TGF-α抗体)可显著地抑制细胞增殖(图7)，在某种程度上支持这一假设。抗-FGF-2抗体部分但不完全的阻断作用，可归咎于在培养物中可能存在其他促细胞分裂剂、在解离过程中FGF-2的丧失(因为毛细胞受损)和/或在解离后上皮中解脱了接触抑制。
包括NGF、BDNF、NT-3和NT-4/5在内的神经营养蛋白是神经系统发育的重要分子。尤其是，BDNF和NT-3被据道是螺旋和前庭神经节神经元的体内和体外存活因子(Zheng等人，1995a，1995b)。这些分子还保护两种类型的神经元在培养中对抗耳毒素(Zheng等人，1995a，1995b)。然而它们对于毛细胞存活并不关键(Ernfors等人，1995；Fritzsch等人，1995)，而且不能保护毛细胞对抗耳毒素(Zheng和Gao，1996)。本发明的观察结果揭示，神经营养蛋白并不直接影响祖细胞的增殖，但是不能排除它们对毛细胞分化更后阶段施加某些影响的可能性。在缺乏BDNF和NT-3两种基因的小鼠(Ernfors等人，1995)或缺乏trkB和trkC两种基因的小鼠(Minnichiello等人，1995)中，已经观察到I型椭圆囊毛细胞表型和椭圆囊上皮厚度某种程度的异常。此外，已阐明了神经营养蛋白在小脑粒细胞发育中的阶段特异性作用。其中，特异性的神经营养蛋白不在增殖阶段而在分化后阶段起作用(Gao等人，1995)。
与神经营养蛋白相类似，在本发明实验中受检测的许多其他生长因子对椭圆囊支持细胞没有明显的促细胞分裂作用。然而，它们仍可能涉及毛细胞再生的更晚阶段。例如，维甲酸可能在发育的耳蜗中诱导额外毛细胞的产生而不涉及细胞增生(Kelley等人，1993)。另一方面，早期分化因子也许抑制祖细胞增殖并促使祖细胞脱离细胞周期而成为后有丝分裂(postmimotic)细胞。在这一方面，令人感兴趣的是注意到TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β5显示对内耳上皮细胞的增殖有抑制作用。这一观察结果是否暗示TGF-β可能涉及毛细胞分化。
FGF-2和IGF-1或TGF-α有附加的促细胞分裂作用这一发现，提示在毛细胞发育中有数种生长因子可能协同作用。例如，已表明，FGF-2和TGF-β1在耳囊形成期间可协同地调控软骨形成(Frenz等人，1994)。可能有来自毛细胞的抑制信号，它阻止支持细胞增殖并诱导新的毛细胞分化。很有可能有多种生长因子一起对毛细胞的分化或再生起作用。它们可能依次地或以多步骤形式起作用。TGFα、IGF-1和维甲酸的组合物可促进椭圆囊上皮细胞的修复或再生。
总而言之，我们建立了哺乳动物椭圆囊上皮细胞的纯培养物，它可快速地检测生长因子对支持细胞增殖(新的毛细胞正常发育和再生过程中的早期)的作用。在我们检测过的30种生长因子中，FGF-2是最有效的促细胞分裂剂。内耳毛细胞在体内产生FGF-2以及椭圆囊上皮细胞在体外表达FGF受体这些观察结果提示，FGF-2在毛细胞发育、维持或再生中起着生理作用。
下面实施例以阐述方式而不是以限制方式提供。在说明书中所有引用文献的公开内容都明确地在此引用作为参考。
实施例
实施例1
毛细胞的特性研究
确定培养的椭圆囊上皮细胞被确定为表现出上皮细胞的特征，而非成纤维细胞、胶质细胞或神经元细胞的特征。
用0.5毫克/毫升嗜热菌蛋白酶(Sigma；于Hank氏无钙无镁平衡盐溶液中)在37℃30分钟，根据以前报道的方法(Corwin等人，1995)，从产后4-5天(P4-5)的Wistar大鼠中分离出椭圆囊上皮片。然后，在0.125％胰蛋白酶和0.125％胶原酶的混合物中，37℃孵育上皮片8分钟(图1A)。用0.005％大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)和0.005％DNase(Worthington)的混合物灭活酶活性，然后用1毫升移液管尖头将其在0.05％Dnase BME液中吸上吸下10次。通过这种方式，上皮片被部分解离成含约10-80细胞的小片(图1B)。因为我们发现这些细胞在无血清的培养基中生长得很差，因此使用添加有5％胎牛血清的培养基。细胞悬浮液最后以约70细胞/mm2的密度，平板接种于涂有聚赖氨酸(500微克/毫升)的96孔板(用于含氚化胸苷试验)或16孔LabTek载玻片(用于BrdU标记和其他免疫细胞化学分析)上的200微升含血清的培养基中(添加有5％胎牛血清的DMEM，4.5毫克/毫升葡萄糖、2mM谷氨酰胺，25纳克/毫升两性霉素B(fungizone)和10单位/毫升青霉素)。通常，从4窝幼畜(40只P4-5大鼠)制备被平均分入80孔中。
尽管大多数分离出的单细胞在培养2天后死亡，但是含约10-80个细胞的细胞集落存活良好，而在添加有血清的培养基中长成小斑块(图1C)。用不同类型的细胞标记物进行免疫细胞化学染色揭示，这些培养细胞表达了上皮的胞抗原，其中包括紧密连接蛋白(ZO1，图1E)、F-肌动蛋白(图1F)和细胞角蛋白(图1G)。它们不表达其他细胞的抗原，例如神经胶质纤丝蛋白(glial filament protein，GFAP)、少突胶质细胞(oligodendrocyte)抗原(髓磷脂)、神经丝蛋白，或成纤维细胞的抗原，如波形蛋白(图1C、1D)和Thy 1.1。这些结果总结于表1。
表 1
培养的椭圆囊上皮细胞的免疫细胞化学特性研究
标记物 免疫阳性
普通上皮细胞抗原
ZO1(紧密结合蛋白) +
F-肌动蛋白 +
细胞角蛋白 +
成纤维细胞抗原
波形蛋白 -
Thy1.1 -
胶质细胞抗原
GFAP -
髓磷脂(少突胶质细胞抗原) -
神经元抗原
NF -
椭圆囊上皮细胞是从P4-5大鼠中制备的，并接种于涂有聚赖氨酸的16孔Lab-Tek培养载玻片上以添加5％FBS的培养液培养。培养物用4％多聚甲醛固定，然后用鬼笔环肽-FITC偶联物或上述抗体进行染色。
这些结果提示，培养的细胞是纯上皮细胞。如鬼笔环肽染色(图1F)所示，可看见少数具有立体纤毛束(stereocilliary bundle)的细胞(毛细胞)，这提示大多数毛细胞受伤并且其中的许多毛细胞在该培养条件下于培养2天后死亡。目前，我们没有特异性的毛细胞标记或支持细胞标记。因为椭圆囊上皮片主要含有支持细胞和毛细胞，所以培养物中的绝大多数存活细胞是椭圆囊支持细胞的群体。
实施例II
刺激毛细胞的再生
为了检验目前已知的生长因子是否能刺激椭圆囊支持细胞的增殖，我们用氚化胸苷掺入试验来测定DNA的合成情况。为了测定DNA合成，在培养24小时后，加入3H-胸苷(2μCi/孔)24小时，然后用Tomtec细胞收集器收集细胞。因为上皮细胞在聚赖氨酸基质上生长，因此在37℃向培养孔中加入胰蛋白酶(1毫克/毫升)25分钟，以便使细胞脱离然后收集细胞。按以前所述的方法(Gao等人，1995)，用Matrix9600型气相计数器(Packard Instrument Company，IL)进行计数(Cpm/孔)。收集每个试验组5-10孔的数据，并以平均值±均方差(s.e.m.)的形式表示。用双尾、非配对t-试验法进行统计分析。在对照培养条件下，检测到中等水平的胸苷摄入。
在细胞接种时，将FGF家族的成员加至培养物中，其中包括FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5、FGF-6和FGF-7(R&D Systems)、IGF-1、IGF-2(R&DSystems)、TGF-α(R&D Systems)、EGF(Collaborative Research)、人重组神经营养蛋白(Genentech)、TGF-β1(Genentech)、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5(R&DSystems)、活化素、抑制素、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、heregulin、Gas-6、血管内皮生长因子(VEGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、心营养蛋白-1(cardiotrophin-1)、c-kit配体(Genentech)、血小板衍生生长因子(PDGF)(Gibco)和维甲酸(Sigma)。在100纳克/毫升(测试范围为0.1-100纳克/毫升)时，观察到FGF-2、IGF-1和TGF-α的最大效果，因此除了TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β5是在1纳克/毫升，以及神经营养蛋白是在20纳克/毫升浓度下(Zheng等人，1995a)测试之外，所有的生长因子都在100纳克/毫升浓度下进行测试。维甲酸的浓度为10-8M(Kelley等人，1993)。
当包括FGF-2、FGF-4、FGF-6和FGF-7在内的数种FGF家族成员加入培养物中时，观察到胸苷摄入量显著上升(p＜0.05；图2)。其中，FGF-2是最强的促细胞分裂剂。与之相反，FGF-1和FGF-5不表现出显著作用(p＞0.05；图2)。在培养物中加入IGF-1和IGF-2也可显著增加胸苷的掺入量(p＜0.05)。作为阳性对照，我们向培养物中加入TGF-α或EGF，这两种以前报道过的支持细胞的促细胞分裂剂(Lambert，1994；Yamashita和Oesterle，1995)。TGF-α和EGF分别使DNA合成增加了约1.7倍和1.5倍(图2)。
为了确定胸苷摄入量的上升是否反映了分裂细胞数目的增加，我们进行了溴-脱氧尿苷(BrdU)免疫细胞化学分析。BrdU标记按以前报道的方法(Gao等人，1991)进行。简而言之，在培养1天后，将BrdU(1：400；Amersham的细胞增殖试剂盒)加入培养液中24小时。培养物用4％多聚甲醛固定(30分钟)，用2N盐酸处理(40分钟)，然后与抗-BrdU单克隆抗体(Becton-Dickinson，1：40，于含0.1％Triton-X100的磷酸盐缓冲液中)一起4℃孵育过夜。然后，培养物用VectorABC试剂盒进行处理。在二氨基联苯胺-过氧化物酶反应之后，用乙醇使细胞脱水，在Histoclear(American Histology)中澄清，然后置于Permount(Fisher)。计数每个试验组10个或更多个培养孔的全部区域中的BrdU阳性细胞。数据以平均值±均方差(s.e.m.)形式表示。用双尾、非配对t-试验法进行统计分析。
如图3所示，在含FGF-2的培养物中观察到极其大量的BrdU-阳性细胞。对对照培养物和含100纳克/毫升FGF-2培养物的细胞计数证实了FGF-2可显著增加椭圆囊支持细胞的增殖(p＜0.01，表2)。与对照培养物相比，在含100纳克/毫升IGF-1(p＜0.05)或TGF-α(P＜0.01)的培养物中，也观察到明显更多数量的BrdU-阳性细胞(表2)。
表 2在椭圆囊上皮细胞培养中BrdU-阳性细胞的细胞计数试验组 BrdU-阳性细胞/培养物对照 218±29FGF-2 795±32**IGF-1 367±30*TGF-α 421±16**FGF-2+IGF-1 940±47**FGF-2+TGF-α 1051±40**
椭圆囊上皮细胞是从P4-5大鼠中制备的，并培养在涂有聚赖氨酸的16孔Lab-Tek培养载玻片上，于对照培养液或含浓度100纳克/毫升的FGF-2、TGF-α、IGF-1，或FGF-2与TGF-α或IGF-1的组合的培养液中48小时。培养24小时时加入BrdU 24小时。培养物用4％多聚甲醛固定再用抗-BrdU抗体免疫染色。BrdU阳性细胞的计数按“材料和方法”中所述的方法进行。每试验组10个或更多个培养孔获得的数据以平均值±均方差(s.e.m.)形式表示。与对照相比，单个星号表p＜0.05，两个星号表示p＜0.01。与仅含FGF-2的培养物相比，含FGF-2和IGF-1，或含FGF-2和TGF-α两种因子的培养物表现出明显更多数目的BrdU阳性细胞。
实施例III
促细胞分裂剂的比较
为了比较FGF-2与IGF-1和TGF-α的效能，在0.1-100纳克/毫升范围内在椭圆囊上皮细胞培养物中进行了剂量依赖性研究(图4)。在0.1纳克/毫升浓度下，这三种生长因子都不表现出可检测的效应(p＞0.05)。在1纳克/毫升浓度下，FGF-2表现出显著的促细胞分裂效应(p＜0.01)而IGF-1和TGF-α没有可检测的效应。在更高剂量(10-100纳克/毫升)下，与对照培养物相比，所有三种生长因子都表现出显著的促细胞分裂效应(p＜0.05)。然而，FGF-2比IGF-1或TGF-α更有效(p＜0.01；图4)。用BrdU免疫细胞化学分析也观察到了FGF-2比IGF-1或TGF-α有更高的效能(表2)。
为了确定FGF-2与IGF-1或FGF-2是否协同地发挥作用，将FGF-2与IGF-1，或与TGF-α一起加至培养物中。氚化胸苷掺入和BrdU免疫细胞化学分析两种方法都证实，FGF-2和IGF-1的组合或FGF-2和TGF-α的组合导致了明显更高的细胞增殖(p＜0.05，图2和表2)。FGF-2是比IGF-1或TGF-α更强的促细胞分裂剂。
除了FGF家族成员IGF-1、IGF-2、TGF-α和EGF之外，已报道有许多其他生长因子可影响细胞的增殖和分化。这些因子包括神经营养蛋白、TGF-β超家族、胶质细胞促细胞分裂剂如heregulin和Gas-6、内皮细胞促细胞分裂剂如VEGF和表3中所列的其他因子。检查它们的培养物时，上述这些生长因子中没有一种对椭圆囊上皮细胞表现出可检测到的促细胞分裂效应(p＞0.05)(表3)。事实上，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β5表现出对细胞增殖有30-67％的抑制作用。受检测的神经营养蛋白和其他生长因子不促进所培养的椭圆囊上皮细胞的增殖。
表 3
在含不同生长因子的椭圆囊上皮细胞培养中氚化胸苷的掺入情况试验组 cpm/培养物(平均值±s.e.m.)对照 2461±215神经营养蛋白
NGF 2056±106106
BDNF 2352±227
NT-3 2259±211
NT-4/5 2296±126TGF-β超家族成员
TGF-β1 1524±75
TGF-β2 1729±115
TGF-β3 929±126
TGF-β5 807±59
活化素 2383±186
抑制素 1959±183
GDNF 2383±186Schwann氏细胞促细胞分裂剂
Heregulin 2854±1 79
Gas-6 2588±95内皮细胞促细胞分裂剂
VEGF 2156±211其他生长因子
PDGF 2387±299
CNTF 2918±404
LIF 2003±206
心营养蛋白-1 2065±295
c-kit配体 2729±346
维甲酸 2466±297
椭圆囊上皮细胞是从P4-5大鼠中制备的，并平板接种于涂有聚赖氨酸的96孔板上，于对照培养液或含不同生长因子的培养液中(参见“材料和方法”)。培养24小时时加入3H-胸苷(2μCi/孔)24小时，然后用Tomtec细胞收集器收集细胞。如“材料和方法”中所述，用Matrix9600型气相计数器计数cpm/孔。收集每个试验组5个培养孔的数据，并以平均值±均方差(s.e.m.)形式表示。注意，在该表中所列出的因子中不表现出显著的促细胞分裂效应(p＞0.05)，尽管TGF-βs可导致抑制细胞增殖(p＜0.05)。
实施例IV
培养的椭圆囊上皮细胞表达FGF受体和IGF-1受体
为了提供FGF家族成员和IGF-1直接作用于这些上皮细胞的进一步证据，我们用抗FGF受体和IGF-1受体的抗体，对椭圆囊组织切片和从P4-5大鼠制备的培养的上皮细胞两者进行了免疫染色。培养2天后，细胞用4％多聚甲醛(在0.1M磷酸盐缓冲液中，pH7.4)固定30分钟。制备物先用含0.1％Triton-X100、10％正常山羊血清的磷酸盐缓冲液(PBS)封闭20分钟，然后与针对下列物质的单克隆抗体(N52)：波形蛋白(10微克/毫升，Boehringer)、Thy1.1(1∶200，Chemicon)、神经丝200kd(5微克/毫升，Boehringer)、髓磷脂(1∶200，Cedar Lane Labortories)和细胞角蛋白(1∶50，Sigma)，或者与抗紧密结合蛋白(ZO1，1∶200，Zymed)和GFAP(1∶500，Dako)的兔抗血清一起在含3％正常山羊血清和0.1％Triton-X100的PBS中孵育过夜。然后用FITC-偶连的第二抗体(二级抗体)(1∶200；Cappel)来显示标记模式。为了检查F-肌动蛋白的染色模式，将制备物与0.5微克/毫升鬼笔环肽-FITC偶联物的PBS在室温下一起孵育45分钟。为了确定培养的细胞是否表达生长因子受体，将针对FGF受体的单克隆抗体(1∶200，Chemicon)和抗IGF-1受体b(1∶100，Santa Cruz Biotech.)和trkA(1∶10,000，由UCSF的Dr.L.Reichardt友善提供)的抗血清作为第一抗体(一级抗体)。用FITC-偶连的第二抗体(1∶200，Cappel)来显示染色模式。尽管在椭圆囊切片的感觉上皮中的免疫反应很低(数据未出)，但是大多数培养的椭圆囊上皮细胞表达了高水平的FGF受体(图5A，5B)和IGF-1受体(图5C，5D)，推测这归咎于毛细胞的剥脱。与之相反，抗TrkA(TrkA是NGF的一种高亲和性受体)抗血清不能使培养细胞染色(图5E，5F)。这些结果提示，FGFs和IGF-1的促细胞分裂作用可能是通过激活它们在这些培养细胞上的高亲和性结合受体。
实施例V
椭圆囊上皮细胞在体内产生FGF-2
为了确定FGF-2是否在生理上存在于椭圆囊中，我们用抗FGF-2的单克隆抗体在P5大鼠椭圆囊切片上进行了免疫组织化学分析。为了进行免疫组织化学分析，P5大鼠椭圆囊在4％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中固定1小时。制备物用PBS淋洗，用30％蔗糖溶液防冻，然后包埋在OCT中。切取25微米的切片，并在低温恒温器中加以收集。然后，通过FITC偶连的第二抗体(1∶200，Vector)，用抗FGF-2的单克隆抗体(3微克/毫升，UBI)对切片进行免疫染色。阴性对照通过省略第一抗体步骤制备。将制备物置于含防衰变剂(antifading agent)的Fluoromount-G(Southern Biotech.Assoc.，AL)中，用Zeiss Axiophot表荧光(epifluorescent)显微镜进行观察。如图6所示，在椭圆囊感觉上皮中，毛细胞(而不是支持细胞)表达中等水平的FGF-2。在基底膜区域没有这种免疫反应性。FGF-2抗体标记是特异性的，因为当椭圆囊切片仅与二级抗体孵育时未见染色。在椭圆囊感觉上皮中毛细胞在体内表达FGF-2，这提示FGF-2是一种生理生长因子。
实施例VI
抗FGF-2或IGF-1的中和抗体可显著抑制椭圆囊上皮细胞的增殖
为了明确椭圆囊细胞的增殖是否会因从培养物中去除内源性FGF-2或IGF-1而被阻断或抑制我们向培养物加入中和抗体。将部分解离的P4-5大鼠椭圆囊片接种于涂有聚赖氨酸(500微克/毫升)的96孔板上100微升1％补充有FBS的培养基中。在接种时，向培养物中加入抗-FGF-2(20微克/毫升，UBI)、抗-IGF-1(40微克/毫升，UBI)、抗-TGF-α(20微克/毫升，R&D Systems)或抗-CNTF(20微克/毫升，R&D Systems)中和抗体。如前所述，培养24小时后，加入3H-胸苷(1μCi/孔)再24小时，收集细胞。因为这些细胞在无血清培养基中生长得很差，所以我们将它们置于补充有较少胎牛血清(1％)的培养基中。在这些条件下，椭圆囊上皮细胞增殖因抗-FGF-2或抗-IGF-1抗体的存在而显著受抑制(p＜0.01)。与之相反，作为阴性对照的抗-CNTF抗体或抗-TGF-α抗体都不表现出抑制效应。抗-FGF-2或抗-IGF-1抗体的抑制作用是部分性的(约25％)，推测在培养基中还可能存在其他的促细胞分裂剂，例如其他FGF成员、EGF和IGF-2(参见上面的论述)。然而，这些结果提供了进一步支持证据，即在培养物中有内源性FGF-2和IGF-1，它们刺激椭圆囊上皮细胞的增殖。抗-FGF-2或抗-IGF-1抗体对细胞增殖的抑制作用并不是由一般的毒性所造成的，因为抗-TGF-α抗体或抗-CNTF抗体不影响细胞的增殖，而且存在抗-FGF-2或抗-IGF-1抗体时TGF-α的促细胞分裂活性不受影响。
引用文献
1. Acheson等人，自然(Nature)374：450-453(1995).
2. Adler等人，耳鼻喉科学研究协会文摘(Assoc Res Otolaryngol Abstr)，p4
(1996).
3. Anderson，神经元(Neuron)3，1-12(1989).
4. Balak等人，神经科学杂志(J Neurosci)10：2505-2512(1990).
5. Beck等人，神经元14：717-730(1995).
6. Bianchi等人，耳鼻喉科学研究协会文献(Assoc Res Otolaryngol Abstr)，
p108(1995).
7. Cattaneo等人，自然(Nature)347：762-765(1990).
8. Corwin等人，科学(Science)240：1772-1774(1988).
9. Corwin等人，耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，
18：87(1995).
10.Cotanche，耳朵研究(Hear Res)30：181-196(1987).
11.Cotanche等人，目前神经生物学观点(Curr Opinion Neurobiol)4：509-
514(1994).
12.Davis等人，自然(Nature)372：263-266(1994).
13.Emfors等人，自然(Nature)368：147-150(1994).
14.Emfors等人，神经元(Neuron)14：1153-1164(1995).
15.Farinas等人，自然(Nature)369：658-661(1994).
16.Finley等人，耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，p84(1995).
17.Forge等人，科学(Science)259：1616-1619(1993).
18.Frenz等人，发育(Development)120：415-424(1994).
19.Fritzsch N等人，听觉神经科学(Auditory Neurosci)1：401-417(1995).
20.Gao等人，神经元(Neuron)1：269-277(1988).
21.Gao等人，神经元(Neuron)6：705-715(1991).
22.Gao等人，神经科学杂志(J Neurosci)15：2656-2667(1995).
23.Ghosh等人，神经元(Neuron)15：89-103(1995).
24.Gray等人，耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，pl98(1996).
25.Holley等人，(1995)神经细胞学杂志(J Neurocytol)24：853-864.
26.Johnson等人，(1993)高级癌症研究(Adv Cancer Res)60：1-41.
27.Jones等人，(1996)神经科学杂志(J Neurosci)16：649-662.
28.Kelley等人，(1993)发育(Development)119：1041-1053.
29.Kopke等人，(1996)耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，
p198.
30.Lambert等人，(1994)喉镜(Laryngoscope)104：701-717.
31.Lee等人，(1996)耳朵研究(Hear Res)94：1-13.
32.Lefebvre等人，(1994)神经报道(Neuroreport)5：865-868.
33.Leon等人，(1995)内分泌学(Endocrinology)136：3494-3503.
34.Li等人，(1996)耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，p7.
35.Li等人，(1996)内分泌(Endocrine)，印刷中.
36.Low等人，(1995)耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，p200
37.Minichiello等人，(1995)发育(Development)121：4067-4075.
38.Miranda等人，(1993)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
90：6439-6443.
39.Neff等人，(1993)神经生物学杂志(J Neurobiol)24：1578-1588.
40.Oesterle等人，(1996)耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘，
p198.
41.Pirvola等人，(1995)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92：9269-
9273.
42.Rapheal等人，(1992)神经细胞学杂志(J Neurocytol)21：663-671.
43.Reynold等人，(1992)科学(Science)255：1707-1710.
44.Ryals等人，(1988)科学(Science)240：1774-1776.
45.Sans等人，(1982)综合神经学杂志(J Comp Neurol)206：1-8.
46.Vicario-Abejon等人，(1995)神经元(Neuron)15：105-114.
47.Warchol等人，(1993)耳朵研究(Hear Res)71：28-36.
48.Warchol等人，(1993)科学(Science)259：1619-1622.
49.Weisleder等人，(1992)实验神经学(Exp Neurol)115：2-6.
50.Yamashita等人，(1995)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
92：3152-3155.
51.Zheng等人，(1996)欧洲神经科学杂志(Eur J Neurosci)，8：1897-1905.
52.Zheng等人，(1995a)神经科学杂志(J Neurosci)15：5079-5087.
53.Zheng等人，(1995b)神经生物学杂志(J.Neurobiol.)28：330-340.
54.Anniko等人，(1986)美国耳鼻喉科学杂志(Am J Otolaryngol)7：276-293.
55.Apfel等人，(1991)神经学年报(Ann.Neurol.)29：87-89.
56.Ard等人，(1985).神经科学(Neurosci.)16：151-170.
57.Au等人，(1987)生物化学生理学学报(Biochem Biophys Acta)902：80-86.
58.Baired等人，(1992)神经科学杂志(J Neurosci)12：619-634.
59.Barbacid等人，(1993).神经系统肿瘤的分子遗传学(In Molecular Genetics
of Nervous System Tumors).(New York：Wiley-Liss)，pp123-136.
60.Barde等人，(1982)欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)1：549-553.
61.Bareggi等人，(1990).药物学研究(Pharmcol.Research)22：635-644.
62.Barker等人，(1994).神经元(Neuron)13：203-215.
63.Berggren等人，(1990)耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol.)(Stockh)109：57-65.
64.Berkemeier等人，(1991)神经元(Neuron)7：857-866.
65.Boettcher等人，(1989)耳朵研究(Hear Res)42：129-142.
66.Boettcher等人，(1990)耳鼻喉科头颈外科文献(Arch Otolaryngol Head Neck
Surg)116：681-684.
67.Boettcher等人，(1991)美国耳鼻喉科学杂志(Am J Otolaryngol)12：33-47.
68.Carenza(1986).妇科肿瘤(Gynecol.Omcol)25：244-249.
69.Chao等人，(1986)科学(Science)232：518-521.
70.Chao等人，(1992).细胞(Cell)68：995-997.
71.Clary等人，(1994).美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91：11133-
11137.
72.Clary等人，(1994).分子生物细胞(Mol.Biol.Cell)5：549-563.
73.Cohen等人，(1994)神经生物学杂志(J.Neurobiol.)25：953-959.
74.Cordon-Cardo等人，(1991)，细胞(Cell)，66，173-183.
75.Corwin等人，(1991)神经科学年度回顾(Ann Rev Neurosci)14：301-333.
76.Cotanche等人，(1994)目前神经生物学观点(Curr Opinion Neurobiol)
4：509-514.
77.Davies等人，(1993)神经元(Neuron)11：565-574.
78.Davies等人，(1993b)神经科学杂志(J Neurosci)13：4961-4967.
79.Davies等人，(1986)自然(Nature)319：497-502.
80.De Moura等人，(1968)耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol)87：60-64.
81.Dublin等人，(1976)：C.C.Thomas.
82.Duckert等人，综合神经学杂志(J Comp Neurol)331：75-96.
83.Ernfors等人，(1990)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：5454-
5458.
84.Ernfors等人，(1994).自然(Nature)368：147-150.
85.Ernfors等人，(1995)耳鼻喉科学研究协会(Assoe Res Otolaryngol)文摘
p190.
86.Escandon等人，(1994)神经科学杂志(J Neurosci)14：2954-2068.
87.Falbe-Hansen等人，(1941)耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol)(增补)44：1-
216.
88.Farinas等人，(1994).自然(Nature)369：658-661.
89.Fischer等人，(1994)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
91：8607-8611.
90.Fleischman等人，(1975)药物学(Pharmacol.)33：320-332.
91.Forge等人，(1993)科学(Science)259：1616-1619.
92.Fritzsch等人，(1995).耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)文摘
p190.
93.Furley等人，(1990)细胞(Cell)61：157-170.
94.Gao al(1991)神经元(Neuron)6：705-715.
95.Gao等人，(1995b)神经学年报(Ann Neurol)(1995)38：30-37.
96.Gao al(1995)神经科学(J.Neurosci.)15：2656-2667.
97.Garner等人，(1994)神经元(Neuron)13：457-472.
98.Gotz等人，(1994)自然(Nature)372：266-269.
99.Grotz等人，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)204：745-749(1992).
100.Guild等人，(1931).耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol)(Stockh)15：269-308.
101.Hefti等人，(1986)神经科学杂志(J Neurosci)6：2155-2162.
102.Hinojosa等人，(1987).传染病杂志(J.Infect.Dis.)156：449-455.
103.Hohn等人，(1990)自然(Nature)344：339-341.
104.Hood等人，神经生物学在人类听力评估中的当前应用(Contemporary
applications of neurobiology in human hearing assessment)(Raven Press，New
York，1986).
105.Hulme等人，E.C.和Birdsall，M.J.M.，受体结合研究的策略和战术
(Strategy and Tactics in Receptor Binding Studies)，p63-212受体-配体相互
作用，Ed.E.C.Hulme.
106.Hyman等人，(1991)自然(Nature)350：230-233.
107.Hynes等人，(1994)神经科学研究(J.Neurosci(Res.)37：144-154.
108.Ip等人，(1993)神经元(Neuron)110：137-149.
109.Ip等人，(1992)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：3060-
3064.
110.Jarvis等人，(1966)喉科杂志(J Laryngol)80：318-320.
111.Jones等人，(1990)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：8060-
8064.
112.Kaplan等人，(1991)科学(Science)252，554-558.
113.Kaplan等人，(1991)自然(Nature)350：158-160.
114.Kelley等人，(1995)神经科学杂志(J Neurosci)15：3013-3026.
115.Kelley等人，(1993)发育(Development)119：1041-1053.
116.Klein等人，(1991a)细胞(Cell)65：189-197.
117.Klein等人，(1991b)细胞(Cell)66：395-403.
118.Klein等人，(1990)发育(Development)109：845-850.
119.Klein等人，(1992)神经元(Neuron)8,947-956.
120.Klein等人，(1989)，欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)，8,3701-3709.
121.Knusel等人，(1992)神经科学杂志(J Neurosci)12：4391-4402.
122.Koliatsos等人，(1993)神经元(Neuron)10：359-367.
123.Konings等人，(1994)脑研究(Brain Res)640：195-204.
124.Kopf-Maier等人，(1992)化学生物学相互作用(Chem.Biol Interact)
82：295-316.
125.Korsching，等人，(1993).神经科学(J.Neurosci.)13：2739-2748.
126.Lamballe等人，(1991)细胞(Cell)66：967-979.
127.Lambert等人，(1994)喉镜(Laryngoscope)104：701-718.
128.Larkfors等人，(1993)神经科学(Neurosci.)19：A278.14.
129.Leake等人，(1992)耳朵研究(Hear Res)64：99-117.
130.Lefebvre al，(1994)神经报道(Neuro Report)5：865-868.
131.Lefebvre等人，(1993).科学(Science)260：692-695.
132.Lefebvre等人，(1991).耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol)(Stockh)
111：304-311.
133.Lefebvre等人，(1995)科学(Science)267：709-711.
134.Leibrock等人，(1989)自然(Nature)341：149-152.
135.Levi-Montalcini等人，(1987)欧洲分子生物学协会杂志(EMBO J.)
6：1145-1154.
136.Lim等人，(1986)美国耳鼻喉科学杂志(Am J Otolaryngol)7：73-99。
137.Lippe等人，(1995)耳鼻喉科学研究协会(Assoc Res Otolaryngol)摘要
p84。
138.Maisonpierre等人，(1990)科学(Science)247：1446-1451。
139.Martin-Zanca等人，(1989)，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，9，24-44.
140.Mc Alpine等人，(1990)耳朵研究(Hear Res)47：191-204.
141.Mc Cabe等人，(1965)耳学年报(Ann Otol)74：312-324.
142.Mollman等人，(1990)新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)322：216-127.
143.Myers等人，(1965)耳鼻喉科头颈外科文献(Arch Otolaryngol Head Neck
Surg)82：483-493.
144.Nakai等人，(1982).耳鼻喉科学报(Acta Otolaryngol)93：227-232.
145.Pirvola等人，(1992).美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
89：9915-9919.
146.Pryor等人，(1994)Chang LW.编辑，Marcel Dekker，Inc.pp345-371.
147.Rastel等人，(1993)神经科学方法杂志(J Neurosci Methods)47：123-131.
148.Richardson等人，(1991)耳朵研究(Hear Res)53：293-311.
149.Roelofs等人，(1984).神经学(Neurology)34：934-938.
150.Rosenthal等人，(1990)神经元(Neuron)4：767-773.
151.Rybak等人，(1986)听力神经生物学(Neurobiology ofHearing).Altschuler
RA.Bobbin RP.Hoffman DW.Eds.Raven Press(New York)PP441-454.
152.Schacht等人，(1986)耳朵研究(Hear Res)22：297-304.
153.Schecterson等人，(1994).耳朵研究(Hear Res).73：92-100.
154.Scopes等人，R.，蛋白质纯化(Protein Purification)，Springer-Verlag，NY
(1982).
155.Sera等人，(1987).扫描显微镜(Scanning Microsc.)1：1191-1197.
156.Shelton等人，(1995)神经科学(J.Neurosci.)15：477-491.
157.Siegal等人，(1990)癌症(Cancer)66：1117-1123.
158.Snider等人，(1994)细胞(Cell)77：627-638.
159.Sobkowicz等人，(1975)神经细胞学杂志(J Neurocytol)4：543-572.
160.Soppet等人，(1991)细胞(Cell)65：895-903.
161.Squinto等人，(1991)细胞(Cell)65：885-893.
162.Stadnicki等人，(1975).癌症化疗(Cancer Chemother.Rep.)59：467-480.
163.Thompson等人，(1984).癌症(Cancer)54：1269-1275.
164.Tsoulfas等人，(1993)神经元(Neuron)10：975-990.
165.Tsue等人，(1994a)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
91：1584-1588.
166.Tsue等人，(1994b)头颈外科(Head Neck Surg)111：281-301.
167.Valenzuela等人，(1993)神经元(Neuron)10：963-974.
168.Vazquez等人，(1994)解剖胚胎学(Anat.Embryol.)189：157-167.
169.Verdi，等人，(1994).神经元(Neuron)12：733-745.
170.Von Bartheld等人，(1991).发育(Development)113：455-470.
171.Warchol等人，(1993).科学(Science)259：1619-1622.
172.Weskamp等人，(1991).神经元(Neuron)6：649-663.
173.Wheeler等人，(1994).耳朵研究(Hear Res)73：46-56.
174.Windebank等人，(1994)神经学(Neurology)44：488-494.
175.Wittmaack等人，(1903).Pflueger Ges生理学文献(Pflueger Arch Ges
Physiol)95：237.
176.Woodford等人，(1978)耳鼻喉科年报(Ann Otol Rhinol Laryngol)87：117-
127.
177.Yamashita等人，(1995)美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)
92：3152-3155.
178.Yan等人，(1992)自然(Nature)360：753-755.
179.Yan等人，(1994).实验神经学(Exper.Neurology)127：23-36.
180.Ylikoski等人，(1993).耳朵研究(Hear Res).65：69-78.