带有白喉类毒素和破伤风类毒素的无细胞百日咳疫苗 本发明涉及新型疫苗制品，它包括低剂量的百日咳博德特氏杆菌的69kda外膜蛋白质(下文称作‘69K’或‘69K抗原’或pertactin，它公开在欧洲专利0162639中；重组69K(P69)已经由NFFairweather等在1990年9月26-28日的“百日咳专题讨论会”(Bethesda)上进行了描述)。本发明特别涉及一种含有一种以上抗原的疫苗、尤其是一种多价疫苗，即：本发明特别涉及用于改善或治疗一种以上疾病情况的疫苗、其中存在低剂量的69K。本发明还涉及这类疫苗的生产和在药物中的应用。
公知69K是一种用于有效预防百日咳的无细胞百日咳疫苗(Pa疫苗)的重要成分。
Keitel,W.等于1996年5月在美国国家健康研究院(NIH)公布了在健康成人中进行的5种无细胞百日咳疫苗的剂量反应研究结果。
含有69K的疫苗包括“三价”疫苗，该疫苗包括抗白喉(D)、破伤风(T)和百日咳(Pa)的抗原，该疫苗已经记载在意大利和瑞典进行的临床试验中并且该疫苗已经进行了销售[例如商标名为INFANRIX-DTPa(SmithKline Beecham Biologicals)]。一般来说，这类疫苗的百日咳成分包括百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)和69K。在INFANRIX-DTPa(商标名)中，D∶T∶PT∶FHA∶69K的量一般为每0.5ml剂量的批疫苗25Lf∶10Lf∶25μg∶25μg∶8μg。
其它包括69K的多价疫苗也是公知的，例如WO93/24148中记载了含有抗肝炎B的抗原和抗白喉、破伤风和百日咳的抗原(Hep B、DTPa)的疫苗。在这类制品中，每0.5ml剂量的批疫苗中给出的D∶T∶PT∶FHA∶69K地量为25Lf∶10Lf∶25μg∶25μg∶8μg。
目前已经发现：一种含有各自为低剂量的白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、PT、FHA和69K的白喉、破伤风和百日咳疫苗(本文将这类低剂量的制品缩写为dtpa疫苗)可维持一种预防百日咳的能力(并且在这方面非常有效)、同时具有表现出罕见的低反应原性的优点。在本文所述的限定范围内，当将这类疫苗给予人体受试体时是安全的，并且这类疫苗可诱发快速保护作用而免受感染。在含有dtpa和其它抗原的疫苗组合物中，已经发现没有干扰，即这类疫苗没有表现出免疫原性的损失、且当将它们给予人体时是有效的。
本发明的疫苗特别适合于在预先给予一种或多种(一般最高约为3)剂量的疫苗后作为加强剂量给予儿童，所述的预先给予的疫苗含有较高剂量的D、T、和Pa抗原，诸如上述的INFANRIX-DTPa疫苗(每0.5ml剂量的批疫苗中D∶T∶PT∶FHA∶69K=25Lf∶10Lf∶25μg∶25μg∶8μg)。对于对成人和青少年进行给药来说，本发明的疫苗也具有很高的价值。
因此，本发明提供了一种包括各自为低剂量的抗原D、T、PT、FHA和69K的疫苗组合物(即dtpa疫苗组合物)。可以理解的是用一种合适的载体或佐剂来配制本发明的疫苗组合物。
所谓dtpa疫苗或dtpa疫苗组合物指的是：在一种剂量中每0.5ml剂量的批疫苗的D浓度不超过5Lf且优选1-4Lf、更优选约2Lf；每0.5ml剂量的批疫苗的T浓度不超过10Lf且优选2.5-7.5Lf、更优选约5Lf；每0.5ml剂量的批疫苗的PT浓度不超过10μg且优选2-10μg、更优选约8μg；每0.5ml剂量的批疫苗的FHA浓度不超过10μg且优选2-10μg、更优选约8μg；且69K的浓度为每0.5ml剂量的批疫苗中不超过4微克且优选范围为每0.5ml剂量的批疫苗0.5μg-3μg。在该疫苗中更优选的69K的浓度为每0.5ml剂量的批疫苗2-3μg、更优选约为2.5μg pertactin。
在一个方面中，本发明的疫苗组合物可以在每0.5ml剂量的批疫苗中(例如)包括(约)PT(2.5μg)、FHA(2.5μg)、69K(0.8μg)。
在一个优选的方面中，本发明的疫苗组合物在每0.5ml剂量的批疫苗中包括(约)PT(8μg)、FHA(8μg)、69K(2.5μg)。
在一个特别优选的方面中，本发明的疫苗组合物在每0.5ml剂量的批疫苗中包括(约)PT(8μg)、FHA(8μg)、69K(2.5μg)、D(2Lf)和T(5Lf)。将这些内容用于下面报导的‘dtpa 005’研究中。
在另一个优选的方面中，本发明的疫苗组合物含有的D成分的量增加至2.5LF。
在一个进一步优选的方面中，dtpa三成分疫苗组合物的组成如下：
PT 8μg
FHA 8μg
69K 2.5 μg
白喉类毒素＞=2IU
破伤风类毒素＞=20IU
Al盐0.3mg
苯氧基乙醇2.5mg
将上述内容用于青少年中称作‘dtpa 003’的研究中，其结果列在下面。
可选择的是PT成分可以是重组的(例如欧洲专利申请EP0306318、EP0322533、EP0396964、EP0322115和EP0275689中所述)或PT成分可以是类毒素样的、例如EP0515415中所述。还参见EP0427462和WO91/12020中所述的百日咳抗原的制备的内容。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种包括dtpa(如上文所定义)以及一种或多种附加抗原、特别是抗肝炎B(Hep B)抗原的疫苗组合物(即一种Hep B-dtpa疫苗)。除将如上文所定义的各自为低剂量的D、T、PT、FHA和69K用于本制品中之外，这类多价疫苗一般如WO93/24148中所述。正如WO93/24148中所述，优选的肝炎B抗原是乙型肝炎表面抗原。
乙型肝炎表面抗原的剂量一般在每0.5ml剂量的批疫苗5-20μg的范围。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的制品已经充分公开。例如参见Harford等在《生物学标准研究进展》(Develop.Biol.Standard)54,125页(1983)、Gregg等在《生物技术》(Biotechnology)5,479页(1987)、EP-A-0226846、EP-A-0299108及其中的参考文献中所述。
本文中所用的表达的‘乙型肝炎表面抗原’或‘HBsAg’包括显示HBV表面抗原的抗原性的任意HBsAg抗原或其片段。可以理解的是：除HBsAg抗原的226个氨基酸序列外(参见Tiollais等，《自然》(Nature),317,489(1985)及其中的参考文献)，如果需要，本文所述的HBsAg还可以含有上述参考文献中和EP-A-0278940中所述的全部或部分前-S序列。本文所述的HBsAg还指的是变体，例如WO91/14703中所述的‘逃避突变体’。在另一个方面中，HBsAg可以含有欧洲专利申请号0414374中所述的L*蛋白质，也就是说，一种氨基酸序列由肝炎B病毒大(L)蛋白质(ad或ay亚型)的部分氨基酸序列组成的蛋白质，其特征在于蛋白质的氨基酸序列的组成如下：
(a)所述L蛋白质的残基12-52、随后是残基133-145、随后是残基175-400；或
(b)所述L蛋白质的残基12、随后是残基14-52、随后是残基133-145、随后是残基175-400。
HBsAg还指的是EP0198474或EP0304578中所述的多肽。
HBsAg一般是颗粒形式。它可以单独含有S蛋白质或可以作为复合颗粒、例如(L*,S)，其中L*如上述所定义且S代表乙型肝炎表面抗原的S蛋白质。
优选如WO93/24148中所述将HBsAg吸附在磷酸铝上。可以将其它抗原吸附在磷酸铝或氢氧化铝上，而在某些情况下，如果仅将其它抗原吸附在磷酸铝上也可以获得令人满意的结果。
正如WO93/24148中所述，在本发明的疫苗中可以包括其它抗原以提供其它多价疫苗而供儿童、青少年或成人使用。例如，合适的所述其它抗原可以包括那些本领域公知的抗原以提供免受流感嗜血杆菌b(Hib)和/或脊髓灰质炎(IPV)和/或甲型肝炎感染的保护作用。
用于这类疫苗中的合适成分已经是市售可得的且具体成分可以从世界卫生组织中获得。例如，IPV成分可以是索尔克灭活的脊髓灰质炎疫苗。可提供抗甲型肝炎的保护作用的成分优选是称作‘Havrix’(SmithKline Beecham Biologicals)的产品，它是一种来源于HAV的HM-175菌株的杀死的减毒疫苗[参见：‘用于甲型肝炎的灭活候选疫苗’，F.E.Andre、A Hepburn和E.D’Hondt，《病毒学药物研究进展》(Prog Med.Virol.)第37卷第72-95页(1990)和由SmithKline Beecham Biologicals公布的产品专论‘Havrix’]。便利的是，肝炎B成分可以包括已经存在于商品疫苗‘Engerix-B’(SmithKline Beecham Biologicals)中的‘S’抗原。
将每种疫苗剂量中抗原的量按照在典型疫苗中诱发非显著性免疫保护反应、不利的副作用的量进行选择。这类量随所用的特异性免疫原而改变。一般来说，预计每种剂量包括15-50μg总免疫原。可以给予加强剂量的注射。在用含有完整细胞百日咳(Pw)的疫苗预处理的受试者中注射加强剂量的本发明疫苗与在用含有无细胞百日咳(Pa)的疫苗预处理的受试者中注射加强剂量的本发明疫苗同样有效。
一般来说，本发明任意方面的疫苗制品可以如下制备。将所需成分吸附在合适的佐剂上、最好是吸附在氢氧化铝或磷酸铝上。在使时间达到相应的成分全部且稳定吸附后，在适宜的条件下可以将不同的成分混合。
在制备本发明混合的含肝炎B的疫苗组合物的优选方面中，提供了一种方法，该方法包括将磷酸铝吸附的HBsAg与一种或多种氢氧化铝或磷酸铝吸附的抗原进行混合。
下面的实施例用于解释本发明：实施例1:dtpa疫苗制品的制备和在成人中的研究
按照WO93/24148中所述的用于配制较高剂量DTPa的工艺、通过标准方法来制备本发明的dtpa疫苗。
附图中列出了在编号为‘dtpa 005’的成人临床研究中使用该疫苗获得的结果，其中dtpa用于表示本发明的疫苗且PRN是pertactin(69K)的缩略语。缩略语dT用于表示从含有较低剂量白喉类毒素和较高剂量破伤风类毒素的Berhringwerke中获得的标准白喉-破伤风疫苗。
在比利时，使用如上所述配制的dtpa对60位年龄为18-45岁的成人受试者进行开放式的、随机取样的单一剂量研究，并与使用dT(Berhring)的60位同年龄的受试者进行比较。
对dtpa组的28位女性(平均年龄33岁)和32位男性(平均年龄33岁)进行研究。对dT组的32位女性(平均年龄34岁)和28位男性(平均年龄35岁)进行研究。
排除在近10年内进行了白喉、破伤风或百日咳接种或在近5年内患有百日咳病的那些受试者。
在15天后要求继续进行和30天后未要求继续进行的免疫接种之前和免疫接种后1个月获得血清。
在附图中列出了反应原性数据、抗体反应、抗PT结果、抗FHA结果和抗PRN(pertactin)结果。
在附图中，还列出了由Keitel等报导的NIH(AAPT)研究中所用的单价pa疫苗的结果。参照SmithKline Beecham的(SB’s)高剂量、中剂量(SB-Med)和低剂量制品，其分别含有：PT(25μg)、FHA(25μg)和69K(8μg)(高)；PT(8μg)、FHA(8μg)和69K(2.5μg)(中)；PT(2.5μg)、FHA(2.5μg)和69K(0.8μg)(低)。
缩略语‘μg’代表微克。
可以看出本发明的dtpa疫苗在成人中是安全且致免疫的。此外，在成人中对本发明的候选疫苗的免疫反应看起来至少比预先给予美国、德国和意大利婴幼儿公知的较高剂量DTPa疫苗所观察到的免疫反应高几倍。实施例2：青少年中的研究(‘dtpa 003’)
在芬兰，使用如上所述配制的dtpa对120位年龄为10-12岁的青少年受试者进行开放式的、随机取样的单一剂量研究，并与使用dT(芬兰)的120位同年龄的受试者进行比较。将同批本发明的dtpa疫苗既用于dtpa 005又用于dtpa 003研究。
市售可得(芬兰)的dT含有：白喉类毒素＞=4IU、破伤风类毒素＞=40IU
对dtpa组的70位女性(平均年龄10.9岁)和49位男性(平均年龄10.8岁)进行研究。对dT组的62位女性(平均年龄10.9岁)和56位男性(平均年龄11.0岁)进行研究。
本试验中包括的受试者在头两年内已经接受了达4个剂量的DTPw。
从本研究中排除的受试者是那些在第二年后已经进行了D、T或P接种或有白喉、破伤风或百日咳病史的受试者。
在15天后要求继续进行和30天后未要求继续进行的免疫接种之前和免疫接种后1个月获得血清。
在附图中列出了反应原性数据、抗体反应、抗PT结果、抗FHA结果和抗PRN(pertactin)结果。
从结果中可以看出本发明的dtpa疫苗在青少年中是安全且致免疫的。
注意：在附图中，成人研究中(dtpa 005)和青少年研究中(dtpa003)涉及抗体反应的结果表明了在免疫接种前和免疫接种后免疫原性总体分析中所包括受试者的各个抗白喉和抗破伤风抗体滴度的分布(＞=0.1IU/ml是为保护作用而测定的间隔滴度)。另外给出的是以IU/ml表示的抗白喉和抗破伤风抗体滴度几何均数。
说明抗PT、抗FHA和抗PRN滴度的dtpa 005和dtpa 003研究的附图表明了免疫原性总体分析中所包括受试者的疫苗反应率(用受试者-n-总数的％表示)和疫苗成分PT、FHA和PRN抗体滴度几何均数(GMT，用IU/ml表示)。实施例3:Hep B-dtpa疫苗的制备
除将如上文所定义的低剂量D、T、PT、FHA和69K用于制成0.5ml剂量的批疫苗外，完全按照WO93/24148的实施例5中所述来制备该制品。
在一种优选的组合物中，dtpa的量约为下列数据：每0.5ml剂量的批疫苗中PT(8μg)、FHA(8μg)、69K(2.5μg)、D(2Lf)和T(5Lf)。
在另一种优选的组合物中，D的量增加至2.5Lf。
疫苗组合物中乙型肝炎表面抗原的量可以在5-20μg之间改变且一般为每0.5ml剂量的批疫苗中有10μg。