含有抗菌蛋白酶抑制剂的 一次性的预润湿的擦拭物 【发明领域】
本发明涉及一次性预润湿的擦拭物，更具体地，本发明涉及包括有效抑制有害的粪便微生物和蛋白酶的抗菌蛋白酶抑制剂的一次性预润湿的擦拭物。
【发明背景】
预润湿的擦拭物是本领域公知的。这类擦拭物也称为“湿擦拭物”、“婴儿擦拭物”和“小毛巾”(“towelettes”)。预润湿的擦拭物包括在使用前被液体润湿的无纺纤维底物。底物可包括纤维素纤维、合成聚合物纤维如聚酯、聚丙烯、聚乙烯等的各种组合。底物还可包括将纤维固定在一起的粘结剂。底物通常用液体如水润湿。液体可包括各种其它成分如润湿剂或湿润剂、润肤剂、表面活性剂、乳化剂、pH调节剂、香料、粉末等。
通常使用这类预润湿的擦拭物除去会阴区的粪便物和尿。粪便物和尿导致会阴皮炎。会阴皮炎，包括尿布性皮炎，被定义为会阴区内的接触皮炎，所述会阴区包括会阴(perineum)、臀部和会阴部、尾骨部和上/内大腿部(Brown D.S.,Serars M.,Perineal Dermatitis:A Conceptual Framework,Ostomy/Wound Management 1993,39(7),20-25)。尿布皮炎被认为是由于皮肤与身体废物的长时间接触引起地。尿布皮炎的体征可包括红斑、肿胀、渗出(oozing)、visiculation、结硬皮和鳞屑中的一种或其组合，以及随着时间推移可能出现的表皮脱落、增厚和色素沉着过多(Brown)。
至今还未鉴定出决定尿布皮炎的尿和粪便的确切成分。被怀疑引起尿布皮炎的因素包括氨、湿气、尿pH、粪便微生物和蛋白酶(如粪便物中所含的那些)。
需要提供一种预润湿的一次性擦拭物，该擦拭物可清洁皮肤并在皮肤上留下抑制尿布皮炎形成的残留物。
还需要提供一种预润湿的一次性擦拭物，该擦拭物包括通过控制有害的粪便微生物和蛋白酶而能够抑制尿布皮炎形成的单一的活性剂。
本发明的一个好处是通过使用包含抗菌蛋白酶抑制剂的预润湿的擦拭物抑制尿布皮炎形成的能力。抗菌蛋白酶抑制剂能够控制有害的粪便微生物和蛋白酶，所述粪便微生物和蛋白酶被认为是形成尿布皮炎的主要原因。
本发明的进一步的好处是预润湿的擦拭物清洁皮肤并在皮肤上留下抗菌蛋白酶抑制剂残留物的能力。因此，即使当预润湿的擦拭物不再与皮肤接触时，对有害的粪便微生物和蛋白酶的抑制作用仍会持续。
可以预示的是，本发明的另一好处是能够通过联合使用本发明的一次性擦拭物和一次性吸湿用品如尿布而提供一种保持或改善皮肤健康的方案。
发明概述
本发明涉及一种能够抑制有害的粪便微生物和蛋白酶的预润湿的擦拭物。在一个实施方案中，预润湿的擦拭物包含无纺纤维底物，该底物包括基于底物中的干纤维重量的约0.004％至约10％的抗菌蛋白酶抑制剂和基于底物中每克干纤维约0.5克至8克的液体。
抗菌蛋白酶抑制剂在纯化的胰蛋白酶上的IC50小于约1000μM并且对大肠杆菌的最小抑制浓度小于约1000μM。
抗菌蛋白酶抑制剂是芳族二脒，其选自：其中X是H或OH，和其中n=3-12,X是Cl、I、Br、F或H。
芳族二脒可选自五脒和六脒。优选的六脒是六脒二羟乙磺酸盐。芳族二脒也可直接加入底物中或加入液体中。
当加入液体中时，抗菌蛋白酶抑制剂占液体重量的约0.0005％-10％。溶剂占液体重量的约50％。所述溶剂选自油、醇(alcohol)、水及其混合物。
液体也可任选包括：一种或多种润湿剂，其占液体重量的约0.5％-10％；一种或多种润肤剂，其占液体重量的约0.1％-10％；一种或多种表面活性剂，其占液体重量的约0.01％-10％；和一种或多种防腐剂，其占液体重量的约0.01％-1％。
本发明还包括一种改善或保持一次性吸湿用品穿用者的穿用者接触区域内皮肤健康的皮肤护理方案，该皮肤护理方案包括下列步骤：
a)提供包含无纺纤维底物的预润湿的擦拭物，所述底物包括基于每克干纤维约0.5克至8克的液体，所述液体进一步包含：
i)溶剂，其中所述溶剂占所述液体重量的至少约50％，所述溶剂选
自：油、醇、水及其混合物；和
ⅱ)至少一种抗菌蛋白酶抑制剂，其占所述液体重量的约0.0005％至
约10％；
b)用所述预润湿的擦拭物擦拭皮肤的所述穿用者接触区域，使得所述抗菌蛋白酶抑制剂转移到所述皮肤上；
c)用一次性吸湿用品接触皮肤；和
d)重复步骤a)-c)。
发明详述
本发明的预润湿的擦拭物包括底物、抗菌蛋白酶抑制剂和液体。抗菌蛋白酶抑制剂能够杀死有害的粪便微生物并抑制蛋白酶。本文所用的术语“预润湿”指在使用前将液体加入底物中。术语“液体(liquid)”包括具有液体相的任何物质，包括但不限定于具有液体相的乳液。底物可以在生产期间被液体润湿或在生产后被液体润湿(如，在使用位置处由使用者润湿)。
抗菌蛋白酶抑制剂可以被直接加入底物中或优选与液体混合。另外，如果需要，可以将抗菌蛋白酶抑制剂单独以及作为液体的一个组分加入底物中。优选实施方案中的液体包括能够杀死有害的粪便微生物并抑制蛋白酶的抗菌蛋白酶抑制剂。
底物
更详细地涉及本发明的各组分时，本发明的预润湿的擦拭物包括底物，该底物包含纺织或无纺天然纤维、合成纤维或其混合物。合适的合成纤维包括通常用于织物中的纤维，如但不限定于聚酯、聚乙烯和聚丙烯纤维。
能够使用各种方法来形成适用于本发明中的底物。形成底物的合适方法包括但不限定于纺粘、熔喷、梳理、湿成形法(wet laying)和干成形法(airlaying)。将底物的纤维结合在一起的合适方法包括但不限定于水力缠结(hydroentangling)、针刺法、热粘结法、超声粘结法，优选是化学结合法。
化学结合方法往往比其它纤维结合技术在经济上更有利。与具有通过其它技术结合在一起的纤维的类似的底物相比，其中纤维通过化学手段结合在一起的底物往往密度还更低，因此具有更大的空隙率。因此，与具有通过其它技术结合在一起的纤维的类似的底物相比，其中纤维通过化学手段结合在一起的底物预示将会提供更大的清洁能力。常规的化学结合剂包括但不限定于基于溶剂和基于树脂的粘结剂(如，乳胶等)。
可以用于生产适用于本发明的其它技术的实例包括但不限定于表面处理和层压。
在一个实施方案中，底物能够是干法无纺纤维底物，其包含天然纤维、切断纤维长度(staple length)的合成纤维和乳胶粘结剂的组合。干纤维底物可以是约20％至80％重量的木浆纤维、约10％至60％重量的切断纤维长度的聚酯纤维和约10％至25％重量的粘结剂。
干纤维底物能够具有的定量为每平方米约40至100克。干底物的密度优选小于约0.2克/立方厘米。干底物的密度是通过将干底物的定量除以干底物的厚度而计算得到的，单位一致。干底物的厚度是使用面积为2平方英寸、提供约95克/平方英寸的限定压力的环形底脚(circular foot)而测量的。在一个实施方案中，干底物的定量为约64克/平方米、厚度为0.06厘米和密度为约0.11克/立方厘米。
在一个实施方案中，干纤维底物能够包含至少约50％重量的木浆纤维，更优选至少约70％重量的木浆纤维。适用于本发明的一个特定的干法无纺纤维底物包含75％重量的平均纤维长度为约2.6毫米的南方针叶木牛皮纸木浆纤维；约12％重量的旦为约1.35克/9000米纤维长度且切断纤维长度为约0.85英寸的聚酯纤维；和约13％重量的包含苯乙烯丁二烯共聚物的粘结剂组合物。优选的苯乙烯丁二烯共聚物所具有的苯乙烯与丁二烯的比例为约45份苯乙烯比55份丁二烯。适用于制备粘结剂组合物的乳胶粘结剂是ROVENE 5550(包含约50重量％苯乙烯丁二烯共聚物固体)，其购自Mallard Creek Polymers(Charlotte,North Carolina)。
在一个实施方案中，本发明的底物是通过下列方法形成的：干铺天然纤维和合成纤维的共混物以形成纤维幅，将水喷洒在纤维幅上，然后对纤维幅进行压花。然后，将乳胶粘结剂施用到纤维幅上，随后在烘箱中将乳胶粘结剂干燥并固化。接着，将无纺幅用液体预润湿。这类预润湿幅的一个实例是由本申请的受认人销售的PAMPERS BABY FRESH牌婴儿擦拭物。
其它幅和制备适用于本发明的纤维幅的方法包括但不限定于下列专利中所描述的那些，将这些专利引入本发明作为参考：US 3,862,472,1975年1月28日授予Norton等人；US 3,905,863,1975年9月16日授予Ayers；US3,974,025,1976年8月10日授予Ayers；US 3,918,126,1975年11月11日授予Wood；US 3,982,302,1976年9月28日授予Valburg；US4,004,323,1977年1月25日授予Gotchel等人；US 4,014,635,1977年3月29日授予Kroyer；US 4,057,669,1977年11月8日授予McConnell；US 4,064,600,1977年12月27日授予Gotchel等人；US 4,074,393,1978年2月21日授Hicklin等人；US 4,097,965,1978年7月4日授予Gotchel等人；US 4,130,915,1978年12月26日授予Gotchel等人；US4,144,619,1979年3月20日授予White等人；US 4,176,426,1979年12月4日授权；US 4,176,427,1979年12月4日授予Neuenschwander；US4,191,609,1980年3月4日授予Trokhan；US 4,207,367,1980年6月10日授予Baker,Jr；US 4,296,161,1981年10月20日授予Kaiser等人；US4,309,469,1982年1月5日授予Varona；美国专利申请流水号08/915,349,1997年8月22日提交；和美国专利申请流水号09/132,833,1998年8月12日提交。
抗菌蛋白酶抑制剂
可以将有效控制有害的粪便微生物和蛋白酶的抗菌蛋白酶抑制剂直接加入底物中或优选加入液体中。当直接加入底物中时，抗菌蛋白酶抑制剂以基于底物中干纤维重量计约0.004％至10％、优选约0.04％至5％、更优选约0.08％至2％活性抗菌蛋白酶抑制剂的量加入底物中。
优选，抗菌蛋白酶抑制剂是芳族二脒，其中所述芳族二脒选自：其中X是H或OH，和其中n=3-12,X是Cl、I、Br、F或H。
更优选的是，抗菌蛋白酶抑制剂是芳族二脒，其选自五脒、六脒及其混合物，最优选的是，抗菌蛋白酶抑制剂是六脒二羟乙磺酸盐。
合适的六脒二羟乙磺酸盐是ELESTAB HP100，购自LaboratoriesSerobiologiques S.A.(Pulnoy,France)。
液体
本发明的预润湿的擦拭物的液体由至少一种溶剂，和优选一种抗菌蛋白酶抑制剂构成。可加入液体中的其它任选组分的非限制性的列举是：润湿剂、润肤剂、表面活性剂、香料、香料乳化剂和/或防腐剂。
本文所用的术语“％重量”指液体中所含的表示为液体总重量百分数的活性组分的量。
预润湿的擦拭物是通过用基于底物中每克干纤维约0.5克至8克、优选约1克至6克液体润湿干底物而制备的。
溶剂
用于本发明液体中的溶剂包括油、醇，并且优选水。也可以使用这些溶剂的混合物。溶剂占液体重量的至少约50％、优选至少约75％、更优选至少约90％。
抗菌蛋白酶抑制剂
当加入液体中时，抗菌蛋白酶抑制剂占液体重量的约0.0005％至10％，优选约0.005％至5％，更优选约0.01％至2％。
液体中的任选组分
润湿剂：
本发明的液体可任选包含一种或多种润湿剂。本文所用的术语“润湿剂”指起将水吸入角质层中以使皮肤水合的吸水物质。其中所述的水可以来自皮肤，或者来自空气中。合适的润湿剂包括但不限定于甘油、山梨醇、磷脂，且优选是丙二醇。润湿剂可占液体质量的约0.5％至10％、优选约1％至5％、更优选约1.5％至3.5％。合适的丙二醇购自DowComing(Midland,Michigan)。
润肤剂：
液体可任选包括一种或多种润肤剂。本文所用的术语“润肤剂”指柔软、缓解、软化、涂覆、润滑或滋润皮肤的物质。润肤剂包括但不限定于常规类脂物质(即，脂肪、蜡)，极性类脂(已经经过疏水改性使其水溶性更大的类脂)，聚硅氧烷，烃和其它溶剂物质。
用于本发明中的润肤剂可以是石油基的、脂肪酸酯基的、烷基乙氧基化物基的、脂肪酸酯乙氧基化物基的如聚乙二醇(如羊毛脂等)、脂肪醇基的、聚硅氧烷基的、粘多糖或其混合物。润肤剂可占液体重量的约0.01％至10％、优选约0.1％至5％、更优选约0.3％至2％。优选的润肤剂是LANETO 50(50％固体羊毛脂)，购自Rita Corporation(Woodstock,Illinois)。
表面活性剂：
液体可任选包括一种或多种表面活性剂。本文所用的术语“表面活性剂”指通过降低液体或固体界面处的表面张力而改变液体或固体表面性质的物质。表面活性剂的类别包括但不限定于非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂，优选两性离子表面活性剂，及其混合物。表面活性剂可占液体重量的约0.01％至10％、优选约0.1％至5％、更优选约0.3％至2％。
优选的两性离子表面活性剂是辛基亚氨基二丙酸酯，其购自McINtyreGroup Ltd.(University of Park,Illinois)，为MACKHAM ODP。
香料：
液体可任选包括一种或多种香料。香料的各种成分，如香精(perfumes)，包括但不限定于水不溶性的油，包括精油(essential oils)。香料可占液体重量的约0.005％至0.5％、优选约0.01％至0.1％、更优选约0.02％至0.06％。
香料的乳化剂：
液体可任选包括一种或多种香料的乳化剂。香料的乳化剂，也被称为香料的加溶剂，降低水不溶性的香料组分从液体中沉淀出的趋势。香料乳化剂的实例包括但不限定于：醇如乙醇、异丙醇、苯甲醇和苯氧基乙醇；任何高HLB的乳化剂(即，HLB大于约13)包括但不限定于高度乙氧基化的酸和醇，优选是多乙氧基醚(polysorbate)。香料的乳化剂可占液体重量的约0.01％至5％、优选约0.1％至2％、更优选约0.2％至0.8％。
合适的香料乳化剂是polysorbate 20，以TWEEN 20购自ICI(NewCastle,Delaware)。
防腐剂：
液体可任选包括一种或多种防腐剂。使用防腐剂以便防止液体和/或底物中的微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限定于羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯和2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇。羟苯甲酸甲酯可占液体重量的约0.01％至1％。羟苯甲酸丙酯可占液体重量的约0.005％至0.5％。2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇可占液体重量的约0.005％至0.2％。
合适的羟苯甲酸甲酯是National Formulary级羟苯甲酸甲酯，购自Acme Hardesty Company(Jenkintown,Pennsylvania)。合适的羟苯甲酸丙酯是National Formulary级羟苯甲酸丙酯，也购自Acme Hardesty Company。合适的2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇是BRONOPOL，购自Inolex ChemicalCompany(Philadelphia,Pennsylvania)。
能够用来润湿底物的其它液体在下列专利文件中作了描述，将所述文件引入本发明作为参考：US 4,941,995,1990年7月17日授予Richards等人；US 4,904,524,1990年2月27日授予Yoh；US 4,772,501,1988年9月20日授予Johnson等人；US 4,556,560,1985年12月3日授予Buckingham；和US 5,648,083,1997年7月15日授予Bliezner等人。
用于组合底物、抗菌蛋白酶抑制剂和液体的技术
用于组合擦拭物底物和液体组合物，以及其包装的技术是本领域公知的，且能够应用于本发明。通常，可以干粉末或溶液的形式将抗菌蛋白酶抑制剂加入底物中。它可以与液体分开，单独加入底物中。另一方面，抗菌蛋白酶抑制剂作为液体的一个组分加入底物中或其可以同时单独加入和作为液体的一个组分加入。
可以用来将抗菌蛋白酶抑制剂和/或液体施用到底物中的本领域公知的技术的实例包括但不限定于浸没、压花、浸渍(dipping)、喷洒、挤压、涂覆、印刷、浸渍(impregnation)等。用于组合底物与适用于本发明的组合物的技术在下列专利中作了描述，将下列专利的公开内容引入本发明作为参考：US 4,189,896,1980年2月26日授予Kohlbach等人和US 4,135,024,1979年1月16日授予Callahan等人。
实施例
A．制备不包含抗菌蛋白酶抑制剂的液体组合物(即，“对照物”)的方法
通过下列步骤制备水溶性液体对照组合物：
预混物1：
第一预混物是通过将下列组分共混在一起而制备的：15克丙二醇、2克羟苯甲酸甲酯和0.3克羟苯甲酸丙酯。
预混物2：
第二预混物是通过将下列组分共混在一起而制备的：2克Polysorbate20和0.375克香料。
将预混物1加入970克蒸馏水中。向该混合物中加入0.500克BRONOPOL、5克辛基亚氨基二丙酸酯和5克LANETO 50(即，PEG-75羊毛脂)。然后，将预混物2加入该混合物中。
B．制备包含抗菌蛋白酶抑制剂的液体组合物的方法
通过下列步骤制备包含1％抗菌蛋白酶抑制剂(即，“六脒”)的液体：
预混物1：
第一预混物是通过将下列组分共混在一起而制备的：15克丙二醇、2克羟苯甲酸甲酯和0.3克羟苯甲酸丙酯。
预混物2：
第二预混物是通过将下列组分共混在一起而制备的：2克Polysorbate20和0.375克香料。
将10克六脒二羟乙磺酸盐加入960克蒸馏水中。然后，向该混合物中加入预混物1。向该混合物中加入0.500克BRONOPOL、5克辛基亚氨基二丙酸酯和5克PEG-75羊毛脂。然后，加入预混物2。
C．测试方法
酶抑制检测：
用于测定酶活性和酶活性的抑制的标准体外检测是本领域公知的。用于进行这些测试的试剂通常可从市场上买到。通常，简单体系包含酶特异性底物，所述底物被酶水解时，产生有颜色的产物。在预定的时间段用分光光度法测定为有颜色产物的显色程度(即，颜色变化的速率)的酶的活性。
酶活性的抑制表现为在酶抑制剂的存在下在相同的时间段内颜色变化的速率可可测量的降低。
可以根据下列方程式计算酶抑制剂的抑制活性：
IC50=[Ⅰ]/(v/vi-1]
其中IC50指抑制酶的50％所需的酶抑制剂的最小浓度，[Ⅰ]是所测试的酶抑制剂的浓度，v是在不存在酶抑制剂时底物裂解的速率，vi在存在酶抑制剂时底物裂解的速率。
可以使用下列方法来测定有效抑制公知存在于粪便中的蛋白酶的酶抑制剂的抑制活性。
在所述方法中，以在给定波长/时间(如，分钟)下，吸光度(光密度，OD)的变化来测量v和vi这些方法中使用通过下列方法制备的胰蛋白酶缓冲液：将60.55克TRIS和22.20克氯化钙溶解于0.9毫升蒸馏水中。用盐酸将该溶液的pH调整到8.2。然后，用水将该溶液稀释到1升的最终体积以形成500mM TRIS和200mM氯化钙的溶液。
1．纯化的蛋白酶方法
纯化的蛋白酶方法使用通过下列方法制备的纯化的胰蛋白酶：将0.124毫克人胰腺胰蛋白酶(分子量为22,000)溶解于0.564毫升0.001N盐酸中以形成10μM储液。用蒸馏水将该溶液稀释1∶263.2(即，5微升胰蛋白酶储液和1.311毫升蒸馏水)以给出38nM胰蛋白酶溶液。用于该目的的合适的人胰腺胰蛋白酶以目录号T6424购自Sigma Aldrich Company(St.Louis,Missouri)。
a．评估纯化的胰蛋白酶中蛋白酶抑制剂功效的方法
使用该方法来测试蛋白酶抑制剂对纯化的胰蛋白酶的功效。
将由46.5克N-苄酯基-精氨酸-对硝基苯胺酯(分子量为464.9)构成的底物溶解于1.0毫升二甲基亚砜(下文称为“DMSO”)以形成100μM储液。该储液以1∶25稀释在蒸馏水中(即，20微升储液和0.48毫升蒸馏水)以提供4mM的底物溶液。合适的底物以目录号C4893购自Sigma AldrichCompany(St.Louis,Missouri)。
使用蒸馏水制备蛋白酶抑制剂的连续稀释液。将待评估的蛋白酶抑制剂的每个连续稀释液的50微升的等分试样加入含有0.020毫升胰蛋白酶缓冲液和0.105毫升纯化的胰蛋白酶的微量比色池中。将微量比色池在25℃下培养10分钟。
在培养后，向微量比色池中加入0.025毫升4mM N-苄酯基-精氨酸-对硝基苯胺酯底物溶液。混合微量比色池。然后，在25℃的温度下在10分钟期间在405nm波长下测量混合物的吸光度。
b．评估纯化的胰蛋白酶中含蛋白酶抑制剂的液体组合物的功效的方法
使用该方法来测试含有抗纯化的胰蛋白酶的蛋白酶抑制剂的液体组合物的功效。为了该目的，使用根据方法B制备的含有蛋白酶抑制剂的液体组合物。
用根据上述方法A制备的不含蛋白酶抑制剂的液体组合物连续稀释根据方法B制备的含有蛋白酶抑制剂的液体组合物的0.05毫升等分试样。将待评估的含有蛋白酶抑制剂的液体组合物的每个连续稀释液的50微升的等分试样加入含有0.020毫升胰蛋白酶缓冲液和0.105毫升纯化的胰蛋白酶的微量比色池中。将微量比色池在25℃下培养10分钟。
在培养后，向微量比色池中加入0.025毫升4mM N-苄酯基-精氨酸-对硝基苯胺酯底物溶液。混合微量比色池。然后，在25℃的温度下在10分钟期间在405nm波长下使用分光光度计测量混合物的吸光度。
本发明的预润湿的擦拭物中所含的抗菌蛋白酶抑制剂在纯化的胰蛋白酶上的IC50小于约1000μM，优选小于约500μM，更优选小于约100μM。
2．粪便蛋白酶方法
下文是得到适用于粪便蛋白酶方法中的粪便样品的方法的概述。
为了确定阳性对照物以确保汇集的粪便样品呈现出评估蛋白酶抑制活性所需的酶活性，对每种粪便蛋白酶方法使用下列步骤。以使汇集的婴儿粪便(至少五种不同的样品)不含尿且不被污染的方式收集所述粪便，且使所述粪便与蒸馏水混合以得到重量/重量(w/w)混合物(如，1∶50w/w)。然后，通过均化和超声处理将该混合物彻底混合以得到均相悬浮液。
使用汇集的粪便悬浮液作为下文所述的蛋白酶活性源，在不存在抑制剂下其呈现出的底物转换的速率在约0.005OD405/分钟至0.020OD405/分钟。(并且，为了确保完全的线性，最终的吸光度不应超过1.5OD405单位)。如果汇集的婴儿粪便的活性超出该范围，不可能准确确定推定的蛋白酶抑制剂的IC50值。然而，通过相应地增加或减少每种酶的稀释因子，可以调整酶活性的范围。如果这不可能，应当使用不同组的主体以得到样品汇集物。
a．评估粪便胰蛋白酶中蛋白酶抑制剂的功效的方法
使用该方法来测试蛋白酶抑制剂对粪便中胰蛋白酶活性的功效。
将由14克N-苄酯基-精氨酸-对硝基苯胺酯构成的底物加入0.5毫升甲醇中以形成60mM储液。用蒸馏水以1∶20稀释该储液(即，0.05微升储液和0.95毫升蒸馏水)以形成2mM的底物溶液。
使用蒸馏水制备蛋白酶抑制剂的连续稀释液。将待评估的蛋白酶抑制剂的每个连续稀释液的0.7微升的等分试样加入微量比色池中。向该微量比色池中，加入0.1毫升胰蛋白酶缓冲液和0.1毫升3mM的底物溶液。通过倒置将微量比色池混合并在25℃下培养5分钟。
向微量比色池中加入0.1毫升粪便悬浮液并混合。用分光光度计测量在490nm下混合物的吸光度。因颗粒状粪便物的存在(即，“干扰”)，在490nm下的吸光度代表背景吸光度的校正因子。然后，在25℃在5分钟期间用分光光度计测量在405nm下混合物的吸光度。从490nm下的吸光度中减去这些吸光度读数以校正任何背景干扰。然后，使用校正的吸光度读数来计算每分钟底物裂解的速率。
包含在本发明的预润湿的擦拭物中的抗菌蛋白酶抑制剂在粪便胰蛋白酶上的IC50小于约1000μM，优选小于约500μM，更优选小于约100μM。
3．测定抗菌剂活性的方法
使用该方法来确定抗菌剂的抗菌活性。根据临床实验室标准国家委员会(“NCCLS”)方法测试抗菌剂的抗菌活性。使用用于需氧生长的细菌的NCCLS稀释抗菌敏感性的测试(即，NCCLS文件M7-A2,1990)。
在微量滴定板上在胰胨豆胨培养液中制备抗菌剂的连续两倍稀释液(在六脒二羟乙磺酸盐的情况下，推荐使用1000μM起始浓度)。微生物接种体是通过将琼脂板上的菌落收获入盐水中，并将溶液的光密度调整到相当于0.5McFarland标准而制备的。以1∶10稀释每种微生物悬浮液，并将10微升悬浮液加入每个微量滴定孔中。
密封微量滴定板并在37℃下培养24小时。将阻止生长的抗菌剂的最大稀释度记录为最小抑制浓度(“MIC”)。
本发明的预润湿的擦拭物中所含的抗菌蛋白酶抑制剂对大肠杆菌的最小抑制浓度小于约1000μM，优选小于约500μM，更优选小于约100μM。
实施例
评估抗菌蛋白酶抑制剂六脒二羟乙磺酸盐的蛋白酶抑制活性和抗菌活性。
实施例1
参照表Ⅰ，示出六脒二羟乙磺酸盐的抑制活性剂(记录为IC50)。
参照表Ⅰ，栏1，根据上文的方法2a(即，评估粪便胰蛋白酶中蛋白酶抑制剂的功效的方法)评估六脒二羟乙磺酸盐对粪便胰蛋白酶的抑制活性。
参照表Ⅰ，栏2，根据上文的方法1a(即，评估纯化的胰蛋白酶中蛋白酶抑制剂功效的方法)评估六脒二羟乙磺酸盐对纯化的胰蛋白酶的抑制活性。
参照表Ⅰ，栏3，根据上文的方法1b(即，评估纯化的胰蛋白酶中含有蛋白酶抑制剂的液体组合物的功效的方法)评估含六脒二羟乙磺酸盐的液体组合物对纯化的胰蛋白酶的抑制活性。
表Ⅰ六脒二羟乙磺酸盐的蛋白酶抑制活性 粪便胰蛋白酶 IC50(μM) 纯化的胰蛋白酶 IC50(μM) 纯化的胰蛋白酶(含六脒二羟乙磺酸盐的液体组合物的抑制活性) IC50(μM) 2.3 2.5 2.8
实施例Ⅱ
参表Ⅱ，示出了六脒二羟乙磺酸盐对三种不同微生物的抗菌活性。对该实施例来说，用蒸馏水稀释六脒二羟乙磺酸盐并根据上文的方法3进行评估。
表Ⅱ六脒二羟乙磺酸盐的抗菌活性 有机体ATCC菌株号最小抑制浓度(μM) 大肠杆菌2592253金黄色葡萄球菌259233白色念珠菌1023113
实施例3
参照表Ⅲ，将不含抗菌蛋白酶抑制剂的液体组合物的抗菌抑制活性与含有抗菌蛋白酶抑制剂的液体组合物的抗菌抑制活性进行比较。选择用于该评估的抗菌蛋白酶抑制剂是六脒二羟乙磺酸盐。
六脒二羟乙磺酸盐的抗菌抑制活性记录为抑制特定有机体所需的六脒二羟乙磺酸盐的最小抑制浓度(“MIC”)。表Ⅲ，栏1示出了特定的微生物，相对于这些微生物评估六脒二羟乙磺酸盐的抗菌抑制活性。参照表Ⅲ，栏2，示出了栏1所列出的微生物的ATCC菌株识别号。
参照表Ⅲ，栏3，示出了不含抗菌蛋白酶抑制剂的液体组合物的抗菌抑制活性。根据上文方法A和C3制备液体组合物。
参照表Ⅲ，栏4，示出了含有抗菌蛋白酶抑制剂的液体组合物的抗菌抑制活性。根据上文方法B和C3制备液体组合物。
表Ⅲ液体组合物的最小抑制浓度有机体ATCC菌株号 对照物含有六脒二羟乙磺酸盐的液体组合物金黄色葡萄球菌25923 1∶1281∶262,144粪肠球菌29212 1∶641∶524∶288铜绿假单胞菌27853 1∶1281∶512大肠杆菌25922 1∶1281∶1024表皮葡萄球菌12228 1∶1281∶524,288戊酸变形菌13315 1∶2561∶1024白色念珠菌10231 1∶641∶32768
皮肤护理方案
对于一次性吸湿用品如尿布、训练裤(training pants)、成人失禁短裤、卫生巾等的穿用者来说，本发明的擦拭物可预示与一次性吸湿用品联合使用作为其中使用该组合来保持或改善穿用者接触区域内的皮肤健康的皮肤护理方案的一部分。本文所用的术语“穿用者接触区域”指在使用期间被一次性吸湿用品接触的穿用者的皮肤区域。
所述方案包括下列步骤的重复：
a)用本发明的擦拭物擦拭皮肤的穿用者接触区域使得抗菌蛋白酶抑制
剂转移到皮肤上；和
b)用一次性吸湿用品接触皮肤。
用于该目的的特别优选的吸湿用品在下列文件中作了披露：美国流水号08/926,532,1997年9月10日提交，美国流水号08/926,533,1997年9月10日提交，美国流水号09/041,232,1998年3月12日提交，美国流水号09/041,266,1998年3月12日提交，将所述文件引入本发明作为参考。
适合与本发明的擦拭物一起使用的其它吸湿用品包括但不限定于下列文件中通常描述的那些：US 3,860,003,1975年1月14日授予Buell；US4,342,314,1982年8月3日授予Radel等人；US 4,463,045,1984年7月31日授予Ahr等人；US 4,556,146,1985年12月3日授予Swanson等人；US B14,589,876证书，1983年4月27日授予Van Tilburg；US 4,687,478,1987年8月18日授予Van Tilburg；US 4,950,264,1990年8月21日授予Osbom,Ⅲ；US 5,009,653,1991年4月23日授予Osbom,Ⅲ；US5,151,092,1992年9月9日授予Buell；US 5,171,236,1992年12月15日授予Dreirer等人；US 5,221,274,1993年6月22日授予Buell；US5,267,992,1993年12月7日授予Van Tilburg；US 5,306,266,1994年4月26日授予Freeland；US 5,397,318,1995年3月14日授予Dreirer；US5,514,121,1996年5月7日授予Roe等人；US 5,540,671,1996年7月30日授予Dreirer；US 5,554,142,1996年9月10日授予Dreirer等人；US5,554,145,1996年9月9日授予Roe等人；US 5,569,234,1996年10月29日授予Buell等人；US 5,580,411,1996年12月3日授予Nease等人；US 5,653,703,1997年8月5日授予Roe等人；将所述文件引入本发明作为参考。
尽管已经例举并描述了本发明的具体实施方案，但对本领域普通技术人员来说，在不偏离本发明的精神和范围下，可以作出各种其它变化和改进。因此，打算在所附的权利要求书中覆盖本发明范围内的所有这些变化和改进。