药物制剂以及治疗糖尿病的方法 发明领域
本发明涉及新的药物制剂以及治疗糖尿病、特别是II型糖尿病的方法。
发明背景
糖尿病是一种非常普通的疾病，其中糖尿病患者的机体不产生或者不能产生足够量的胰岛素或者不能适当地使用胰岛素。糖尿病有两种主要类型：I型糖尿病或称胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，患者的机体不产生胰岛素，经常出现在儿童和年轻的成年人中，并认为是自身免疫疾病；II型糖尿病也称作非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，它是最常见的疾病形式，是由于机体不能产生足够的胰岛素或者不能适当地使用胰岛素导致的代谢性疾病。II型糖尿病占所有糖尿病患者中的约90％。这也是很常见的疾病，在西方世界有2-10％的人口患有此病。II型糖尿病的起因不是十分清楚的，既有遗传因素也有环境因素，例如肥胖和缺少运动显然是起作用的。还有一种类型地糖尿病是妇女在妊娠期间发展的，即妊娠糖尿病，以及在成人期开始的自身免疫糖尿病，称作LADA(成人潜伏性自身免疫糖尿病)或缓慢进行性自身免疫糖尿病。
I型糖尿病通常使用胰岛素进行治疗。特别是I型糖尿病的其他可能治疗方法描述于WO 92/19633(涉及硫酸化糖脂的应用)、WO97/42974(涉及糖脂配合物的应用)和WO 99/33475(涉及半乳糖神经酰胺、葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺的应用)中。
还对胰腺或生产胰岛素的胰腺细胞的移植进行了试验。
II型糖尿病通常首先用专门的饮食进行治疗，如果这样的治疗不够，则然后通常用三种不同类型的药物中的一种治疗；或者是刺激胰腺释放胰岛素的药物，或者是增加患者对胰岛素敏感性的药物，或者是直接影响葡萄糖血液水平的药物(例如减少肝脏产生葡萄糖的药物或增加肌肉对葡萄糖吸收的药物)。这些药物还可以与不同的饮食结合使用。在许多情况下还使用胰岛素。
目前还没有对所有糖尿病患者都适用的具有最佳结果的治疗策略，因此非常需要治疗糖尿病、特别是II型糖尿病的有效方法。
发明概述
因此，本发明的目的是提供糖尿病、特别是II型糖尿病的新的治疗方法。
在导致本发明的工作中发现，硫苷脂是预防和治疗糖尿病、特别是II型糖尿病的重要物质。
因此，本发明涉及至少一种对患者给药将以增加硫苷脂量的方式影响硫苷脂代谢的物质在制备治疗糖尿病的药物制剂中的应用，其中所述物质是硫苷脂的同工型，或者更准确地说，本发明涉及硫苷脂的至少一种分子形式或同工型在制备治疗糖尿病的药物制剂中的应用。
本发明还涉及糖尿病的治疗方法，其中对患者施用治疗有效量的物质以增加硫苷脂量的方式影响硫苷脂代谢，其中所述物质是硫苷脂的同工型，或者更准确地说，对患者施用治疗有效量的硫苷脂的至少一种分子形式或同工型。
本发明可以治疗的糖尿病包括前驱糖尿病、糖尿病、葡萄糖不耐性和与糖尿病有关的并发症。本发明可治疗的糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病、LADA和妊娠糖尿病。
此外发现特定的同工型，即在脂肪酸链中具有8-24个碳原子的同工型、特别是具有14-18个碳原子的同工型、最优选具有16个碳原子的同工型导致硫苷脂摄取的增加。因此，按照本发明优选的实施方案，用于制备药物组合物或者用于该方法中的物质是在脂肪酸链中具有14-18个碳原子的同工型，最优选的是在脂肪酸链中具有16个碳原子的同工型。
因此，本发明制备的药物组合物和本发明的方法适用于治疗糖尿病例如前驱糖尿病、糖尿病和/或与糖尿病有关的并发症。
由下面的描述和所附权利要求书，本发明的特征将会显而易见。
附图的简要说明
在下面的详细描述和实施例中，将参照所附的附图，其中：
图1是硫苷脂分子的图示说明；
图2说明了硫苷脂的代谢；
图3是揭示来自Lewis大鼠和ob/ob小鼠的硫苷脂之间脂质部分差别的自体放射造影照片；
图4说明在Lewis大鼠和BB大鼠的胰腺胰岛中有两种主要的类似物，一种具有C24：0脂肪酸，另一种具有C16：0脂肪酸，并且在两种II型小鼠模型ob/ob和db/db中C16：0类似物的浓度减少到不可检测的水平(使用抗硫苷脂单克隆抗体进行TLC-ELISA研究)；
图5说明了与C24类似物和天然硫苷脂以及不含硫苷脂的贮藏胰岛素相比，在脂肪酸中具有16个碳原子的硫苷脂同工型对保存胰岛素晶体具有显著的作用；
图6A说明了不同硫苷脂同工型在肝中的摄取；和
图6B说明了不同硫苷脂同工型在胰腺中的摄取。
发明详述
如上所述，本发明人发现硫苷脂是预防糖尿病、特别是II型糖尿病的重要物质。
硫苷脂或者半乳糖神经酰胺-3-O-硫酸盐是酸性鞘糖脂。硫苷脂的图示说明示于图1中。如图所示，硫苷脂分子包括硫酸化半乳糖、鞘氨醇碱和脂肪酸。对硫苷脂的各种分子形式或硫苷脂的同工型早先已有描述，它们在脂肪酸中的碳原子数以及不饱和度和羟基化程度上彼此不同。
在一定程度上，不同的硫苷脂同工型具有不同的生物学活性。再者，某些II型糖尿病可能是由于缺乏特定的硫苷脂分子形式或同工型，并且因此以增加该特定分子形式获得量的方式进行本发明的治疗是重要的。
本发明可以使用所有不同的硫苷脂同工型，既可以是天然的、也可以是合成的。
按照本发明，优选使用在脂肪酸链中具有8-24、优选14-18、最优选16个碳原子的硫苷脂同工型，尤其是在脂肪酸链中具有16个碳原子的硫苷脂同工型，因为该同工型使得硫苷脂的吸收最佳，正如下面的实施例中进一步说明的。
硫苷脂产生于各种哺乳动物、包括人和对这些细胞特定的同工型的产胰岛素细胞中。硫苷脂象胰岛素一样通过相同的细胞内途径加工的事实进一步支持了本发明的发现。硫苷脂与胰岛素的正常加工(从胰岛素原至分泌的单体胰岛素)有关。它涉及胰岛素原的折叠和氧化，因此是胰岛素形成所需的，它涉及胰岛素晶体在分泌颗粒中的保存，因此是胰岛素库贮藏所需的，防止detoriation和原纤维形成，并且它涉及胰岛素在分泌中经由二聚物由六聚物转化为单体的转化，并且该最后的向单体的转化是生物学活性所需的。此外，硫苷脂可能需要与胰岛素结合，以按照适当的方式影响胰岛素受体，并且避免胰岛素耐药性的发展。本发明人发现硫苷脂与胰岛素结合抑制T-细胞对胰岛素的应答支持硫苷脂和胰岛素通常在循环过程中配合，并且不引起在I型糖尿病患者中和对外原给药胰岛素的反应中所见的免疫应答。
因此，改变的硫苷脂合成是与糖尿病、包括I型糖尿病和II型糖尿病有关的致病因素。本发明人举例说明了硫苷脂代谢不足与胰岛素缺乏(这还通过实施例进一步说明)以及II型糖尿病中的胰岛素耐药性相关。
硫苷脂代谢尤其发生在胰腺的胰岛高尔基复合体中。硫苷脂代谢的图示说明示于图2中。如图所示，该代谢途径包括几个步骤。为了得到本发明期望的结果，即获得增加量的至少一种硫苷脂分子形式，可以通过影响终产物硫苷脂来影响该途径。这可以做到。可以通过施用硫苷脂同工型或者其功能等同类似物影响硫苷脂的水平。该同工型可以是其中脂肪酸含有8-24、优选14-18、最优选16个碳原子的同工型中的一种或者组合，或者其功能等同类似物，并且如上以及在下面进一步评述的，在某些情况下，优选施用硫苷脂的一种特定的分子形式或同工型，即具有特定碳原子数的同工型。
本文所用术语″治疗″既涉及预防性治疗，即为了治愈或减轻疾病或病症的治疗，又涉及治疗性治疗，即为了防止疾病或病症的发展的治疗。该治疗既可以是急性治疗、也可以是慢性治疗。
本文所用术语″患者″涉及需要本发明治疗的人或非人哺乳动物。该术语还包括前驱糖尿病和/或葡萄糖不耐性个体，尽管这类个体在其他文章中不被认为是患者。
本文所用术语″功能等同类似物″涉及与本发明含义内的类似物具有基本相同的生物学作用的物质。因此，硫苷脂异构体的功能等同类似物是与硫苷脂异构体对胰岛素具有基本相同作用的物质。
本文所用术语″治疗有效量″涉及产生所需治疗效果的量。
本发明的药物制剂还可以含有用于使制剂本身便于制备或者使制剂易于给药的物质。该物质是本领域专业人员公知的，并且可以是例如可药用辅剂、载体和防腐剂。
本发明的药物制剂和方法还适用于预防和/或治疗与糖尿病有关和/或因糖尿病引起的不同疾病。该有关疾病可以是例如影响眼、肾和神经的疾病以及心脏和血管疾病。
实施例1
该实施例说明了硫苷脂代谢不足与胰岛素缺乏的关系。
从ob/ob小鼠和Lewis大鼠的胰组织分离的胰岛细胞中提取脂质。分离脂质提取物，通过薄层色谱并结合使用硫苷脂特异性单克隆抗体进行的免疫组织化学分析对其进行分析。对已知量的硫苷脂标准品进行平行分析以进行定量。所得到的小鼠胰岛细胞中硫苷脂的定量值示于下面表1中。该结果表明，在II型糖尿病模型的胰岛中硫苷脂的总量明显减少。
表1 种类 硫苷脂 (pmol/mg蛋白) 硫苷脂 (pmol/岛) ob/ob 0.1 0.1 Lewis 3-5 1-2
使从ob/ob小鼠和Lewis大鼠的胰组织分离的胰岛细胞在含35S-硫酸盐的培养基中生长。然后萃取脂质，分离，并在硅胶薄层板上进行色谱后进行放射自显影法分析。图3示出了自体放射造影照片，并且显示了来自II型糖尿病模型Lewis大鼠和ob/ob小鼠的硫苷脂之间的脂质部分差别。
实施例2-对腹膜内注射后硫苷脂
在ob/ob小鼠的胰腺和肝中吸收的研究(3H)
该实施例说明了具有含16个碳原子的脂肪酸链的硫苷脂同工型使硫苷脂的吸收和胰岛素的加工最佳化。
在该实施例中，术语″ Cn：x类似物″是指具有n个碳原子和x个双键的硫苷脂同工型，例如C8：0类似物就是在脂肪酸链中具有8个碳原子和0个双键的硫苷脂同工型。背景
经生化分析表明，ob/ob小鼠具有异常的硫苷脂代谢，无论是从定量上还是从定性上(参见实施例1)。硫苷脂是其中脂质部分的组成可以改变的硫酸化的鞘糖脂。在Lewis大鼠BB大鼠的胰腺胰岛中有两种主要的类似物，一种具有C24：0脂肪酸，另一种具有C16：0脂肪酸。在两种II型小鼠模型ob/ob和db/db中，C16：0类似物的浓度减少到不可检测的水平(使用抗硫苷脂单克隆抗体进行TLC-ELISA研究)。该结果示于图4中。
本发明人进行了体外研究，结果表明C16：0类似物对于胰岛素加工是重要的类似物。胰岛素晶体的保存是胰岛素库贮藏所需的，一旦血液葡萄糖水平升高，即可以释放出胰岛素，与其他硫苷脂同工型相比，硫苷脂C16：0增加胰岛素晶体的保存。与C24：0类似物和得自猪脑的天然硫苷脂混合物以及不含硫苷脂的贮藏胰岛素相比，硫苷脂C16：0类似物对保存具有显著的作用。在图5中说明了该结果。假设
在II型糖尿病模型的胰岛中硫苷脂C16：0类似物的缺乏导致胰岛素加工不能最佳化。这可能不仅影响胰岛素的缺乏，还可能影响胰岛素的耐受性。因此，通过提供C16：0硫苷脂使胰岛中的C16：0硫苷脂恢复存在是治疗II型糖尿病的策略。试验设计
对从猪脑中分离并通过质谱确定其结构特征的天然硫苷脂进行脂肪酸组成的修饰并在鞘氨醇碱中进行氘代。这些类似物经腹膜内对糖尿病ob/ob小鼠给药，并且在切割器官的脂质萃取后对其在肝脏和胰腺中的吸收进行分析。其目的是研究是否外原给药的硫苷脂被胰腺吸收，并因此使得在II型糖尿病模型中见到的硫苷脂的定量和定性改变的替代成为可能。硫苷脂的放射性标记
通过用Pd(OAc)2/NaB3H4催化氢化，在神经酰胺部分对硫苷脂进行氘标记。将标记的硫苷脂与未标记的硫苷脂混合，得到所需的特异活性。硫苷脂中脂肪酸部分的修饰
通过在80℃进行弱碱性甲醇分解，从天然猪脑硫苷脂中除去脂肪酸。经色谱纯化后，在乙酸钠水溶液-四氢呋喃中，用相应的脂肪酰氯将所形成的溶解硫苷脂再酰化。放射标记的硫苷脂类似物对ob/ob小鼠给药
如表2所示，将不同的硫苷脂类似物溶解在磷酸盐缓冲的盐水中(150nmol/300μL)(对该样品进行20秒的超声处理)，然后经腹膜内对ob/ob小鼠给药。这些小鼠为12周龄，最高血葡萄糖的平均值为13.4±1.3nM。用CO2使小鼠麻醉并使颈椎脱位将其处死。该过程综述于表2中。立即切割肝和胰腺。将器官速冻并在分析时融化(4天内)。
表2硫苷脂类似物每只小鼠腹膜内给药的Nmol类似物每只小鼠腹膜内给药的 CPM膜内给药6小时后处死的小鼠；小鼠数膜内给药24小时后处死的小鼠；小鼠数 C8 150 5×106 2 2 C16 150 3.5×106 2 2 C24 150 2×106 2 2硫苷脂的提取和分析
将器官打成匀浆，并用氯仿/甲醇/水萃取脂质。将脂质提取液蒸发，再溶解于氯仿/甲醇/水中，并通过硅胶色谱分离，以除去其他脂质。对含有硫苷脂的馏分进行闪烁计数。
闪烁测量的结果示于图6A和图6B中-图6A描述了肝数据，图6B描述了胰腺数据-以cpm吸收总量、cpm/mg组织净重、cpm/mg组织蛋白和器官残留的cpm％表示。
C8：0类似物优先在肝中吸收并迅速降解。在胰腺中其吸收远低于其他两种类似物。6小时和24小时值是类似的，因此无论是蓄积还是降解均不明显。与C8：0类似物相比，C24：0类似物在肝中的吸收较低。在24小时，C24：0在两种器官中的略微减少表明缓慢降解和没有蓄积。C16：0类似物在肝中的吸收高于C24：0，并且也显示出略微的蓄积。与C8：0类似物相比，给药6小时后肝吸收较低，但是与C8：0硫苷脂的发现相反，其迅速降解，C16：0在24小时显示出蓄积。在胰腺中，C16：0硫苷脂类似物被最有效地吸收，并且象在肝中一样，24小时后有蓄积。结论
具有不同脂肪酸组成的类似物之间的硫苷脂的吸收不同。其中最短的C8：0从循环中迅速排除至肝并降解。此外，在胰腺中有相当的吸收并且没有蓄积。C16和C24类似物在胰腺中均被有效地吸收，而C24在24小时中显示略微降解，C16类似物有蓄积。
因此，胰腺似乎选择性地吸收在II型糖尿病模型中缺乏的硫苷脂类似物，因此本发明人表明，施用硫苷脂、特别是施用在脂肪酸中具有16个碳原子的硫苷脂同工型是恢复该分子异常代谢的一种途径。