对线虫卵高致病率的淡紫拟青霉菌剂的制备方法 本发明涉及一种杀线虫的生物农药及其制备方法。
线虫为除昆虫之外的第二大类作物害虫，其分布广泛，可寄生并危害多种农作物，使作物产量减少，质量下降。据估计，全国农林种植业每年因此而造成的损失约为233亿元。
农业上防治线虫，除选育抗病品种，轮作及物理防治之外，最有效的手段是化学防治，氯化苦、呋喃丹、灭克灵及克线磷等为常用药物。然而这些药物也同时给农田土壤并进而给农产品造成严重污染。
鉴于此，人们开始从生态角度另觅新法。1979年秘鲁国际马铃薯研究中心的P.Jatava首次从南方根结线虫的病卵中分离到一种经鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)的线虫病原真菌，随后许多国家科学工作者对此作了大量研究，并确定它也是根结线虫(Meloidogyme SPP)、孢囊线虫(Heterodera SPP)、半穿刺线虫(Tylenchulus SPP)等多种线虫的病原真菌。而且淡紫拟青霉为土壤中的习见菌，对农作物及人畜无害，因此用它来作为杀灭有害线虫的生物防治微生物具有很大潜力。
上世纪80年代，由菲律宾生产地世界上第一个杀线虫的生物农药“Biocon”推向市场，用它来防治马铃薯南方根结线虫和金线虫的效果与呋喃丹或灭克灵相仿，马铃薯产量也因此而增加20.3～36.5％。我国于1997年也有两项专利(公开号1149393、1149394)公开了利用啤酒厂或糖厂废液生产杀线虫生物农药——淡紫拟青霉菌剂的方法。
然而，上述从线虫卵中分离得到的淡紫拟青霉菌株，应用通常配方成份进行大量繁殖而得到的菌剂，其杀线虫效果是不稳定的，其对线虫卵的感染寄生率会随繁殖的代数增加而降低，杀线虫效果也就随之而降低。这是因为淡紫拟青霉寄生于线虫卵首先需要菌丝穿过线虫卵壳，而线虫卵壳中厚厚的几丁质层需要几丁质酶降解形成孔隙菌丝方能伸展进入卵内。淡紫拟青霉在有诱导底物几丁质的培养条件下可以产生几丁质酶并分泌到细胞外，如果在其生存环境中缺乏诱导底物或诱导底物不足，则很少分泌这种酶。几丁质酶对很多真菌都是诱导酶。
本发明的目的旨在提供一种能够稳定保持对线虫卵高感染率的淡紫拟青霉菌剂的制备方法，本发明的基础是为生产此种真菌杀线虫生物农药，必须既利用从病卵中分离的此种真菌，所获菌株的培养中，全部一、二、三代(即种子斜面、摇瓶及发酵)培养基中都必须配入诱导物质几丁质。淡紫拟青霉在这种条件下由于始终处于诱导环境中，就可以保持几丁质酶的合成和分泌，所生产得到的菌剂也就始终保持其对线虫卵高的感染率，生物农药的使用效果，可获得保证。
本发明的技术方案如下：
步骤一：由根结线虫病卵中分离淡紫拟青霉菌株。取栽培蕃茄已感染线虫的根结，从中收集无病线虫卵块，用10％次氯酸钠消毒2分钟，然后用无菌水漂洗。在无菌操作下，将已表面灭菌的无病卵块移入已培养好的淡紫拟青霉培养物上，在25±2℃下培养10天。取出已感染了真菌的卵，并用次氯酸钠表面消毒，再用无菌水漂洗数次后，移入燕麦洋菜培养基(OMA)上培养，分离出有寄生力的菌株。
步骤二：一级培养：将含2～5％几丁质细粉以3％为佳的OMA培养基分装常规高压灭菌并摆成斜面，接入上步分离出的淡紫拟青霉菌种，在26±1℃下培养7天左右。
步骤三：二级培养：培养基含马铃薯提取液1.0升，葡萄糖20.0克，几丁质细粉10～40克(以20克为佳)，调PH到5.5～6.5，经常规高压灭菌后接种一级培养物，在26±1℃振荡5～8天。
步骤四：三级培养：培养基为燕麦粉或碎米渣5％；谷糠85％左右(其量随几丁质粉料量而调整)；含几丁质粉状料约10％，其配入量视几丁质含量而定，使几丁质在全部培养基中的重量比例＞1％，最佳≥3％。几丁质粉状料可以是虾蟹壳粉、蝇蛆壳粉、蚕蛹粉、真菌的菌丝体如黑曲霉(柠檬酸发酵渣)、食用菌采取子实体后的废料、米根霉(乳酸发酵渣)、犁头霉(Absidia)等真菌的菌体均可加以利用。
以上粉料加适量水拌匀，成捏不滴水，触之能散为度。经湿热灭菌后，接种二级培养物，在28±1℃培养10天左右。培养物真空抽干，粉碎即成。
用此法生产的淡紫拟青霉菌剂，每克含孢子≥2×108个。将此菌剂再接种到燕麦洋菜培养基(OMA)上，待菌生长较好时，移入经表面消毒的无病菌感染的线虫卵块，共同培养8天后，检查发现线虫卵块已100％被淡紫拟青霉感染，卵内都已发现菌丝生长。未经几丁质及线虫卵反复定向诱导的淡紫拟青霉(试验的对照菌株)在此条件下对线虫卵的感染率＜30％。
淡紫拟青霉经反复定向诱导后，对线虫卵有稳定的高感染率。因此可以作为一种新型的生物杀线虫剂，用于粮(小麦、玉米)、棉、油(花生、大豆)、糖料作物(甜菜、甘蔗)、茶、薯(甘薯、马铃薯)、果(香蕉、柑桔、菠萝、桃、猕猴桃、杨梅、罗汉果、柿、无花果、葡萄、草莓)、烟草、瓜(黄瓜、甜瓜、西瓜、苦瓜)、菜(蕃茄、辣椒、茄子、胡萝卜、菜豆)等作物线虫病害的防治，可以完全替代污染环境及农产品的化学杀线虫药，而且可以提高作物产量。
实施例1：
将自线虫卵中分离出并纯化的淡紫拟青霉菌种接种到经高压灭菌的含虾壳粉10％的调PH6.0的马铃薯——葡萄糖培养基中，在26±1℃下振荡6至7天；最后接入经高压灭菌的固态培养基(固态培养基含虾壳粉约100克、谷糠850克、碎米渣50克，加水搅匀至捏之成团，触之即散)，在28±1℃下培养10天。培养物经真空干燥后粉碎即成菌剂。镜检计数每克含孢子≥2×108个。蝇蛆粉、蚕蛹粉均可替代虾蟹壳粉。
实施例2：
所有程序均同实施例1，但用柠檬酸发酵渣代替虾壳粉，并相应减少谷糠用量。柠檬酸发酵渣水洗至PH5.5以上，干燥之。
在一级培养的斜面培养基OMA中加15％柠檬酸发酵渣；
在二级培养的摇瓶培养基PDA中加10％柠檬酸发酵渣；
在三级培养的每公斤固态培养基中含柠檬酸发酵渣150克，谷糠800克，碎米渣50克；
如无柠檬酸发酵渣，也可用(米根霉)乳酸发酵渣代替。
实施例3：
用固态培养的并经灭菌干燥的犁头霉培养物代替三级培养的固态培养基中的虾壳粉。固态培养基组分为：干燥的犁头霉培养物95％，燕麦粉或碎米渣5％。其余均同实施例1或实施例2。食用菌采去子实体后的培养废料也可代替犁头霉培养物。