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1、10申请公布号CN104177501A43申请公布日20141203CN104177501A21申请号201410364407222申请日20100209201010107466320100209C07K19/00200601C12N15/70200601C12P21/02200601A61K38/17200601A61P29/00200601A61P25/04200601A61P35/0020060171申请人沈阳药科大学地址110016辽宁省沈阳市沈河区文化路103号72发明人张景海崔勇毛英姿郭桂丽刘岩峰吴春福74专利代理机构沈阳杰克知识产权代理有限公司21207代理人靳玲54发明名称蝎镇。
2、痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法57摘要本发明属于生物技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性片段及其获得方法，具体涉及借助一个简单的短肽接头序列连接的，由作为蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽和作为癌细胞导向肽部分的促黄体生成素释放激素或胰岛素样生长因子内部部分片段或奥曲肽类似物或上述的类似物组成的嵌合蛋白，以上癌细胞导向肽分别融合于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的N端和C端。本发明利用DNA重组技术构建了一系列不同接头序列及癌细胞导向肽的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合蛋白的载体，收获嵌合蛋白后验证其具有体内镇痛活性和体外抗肿瘤细胞生长活性的双重功能，且能够实现对特定肿瘤细胞的靶向杀伤活性。62。
3、分案原申请数据51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页序列表6页10申请公布号CN104177501ACN104177501A1/1页21蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽通过连接肽与癌细胞导向肽形成系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，融合体既具有蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽原有生物活性，同时也具有癌细胞导向肽的生物活性，所述的癌细胞导向肽氨基酸序列如下EPFRSPDLALETYG。2根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，分别通过蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的N端或C端，通过连接肽与。
4、癌细胞导向肽形成系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体。3根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，所述的连接肽包括SSHHHHHHSSGLVPRGSHM,GGGSGGGS,SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS,GSGGGGSGGGGS,GGGGS,G4S2，（G4S）3,（G4S）4,和（G4S）5。4蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，它包含权利要求13任何一项所述的氨基酸序列全序或片段；包括如下结构（1）X1J1BMKAGAP融合体及其衍生物或类似物组的样品MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGY。
5、IADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG；（2）以J2为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的样品MEPFRSPDLALETYGGGGSGGGSBMKAGAP；MBMKAGAPGGGSGGGSEPFRSPDLALETYG；（3）以J3为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的样品MEPFRSPDLALETYGJ3BMKAGAP；MBMKAGAPJ3EPFRSPDLALETYG；（4）以J4为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MEPFRSPDLALETYGJ4BMKAGAP；。
6、MBMKAGAPJ4EPFRSPDLALETYG；（5）以G4SN为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的样品MEPFRSPDLALETYGG4S1BMKAGAP；MBMKAGAPG4S1EPFRSPDLALETYG；MEPFRSPDLALETYGG4S5BMKAGAP；MBMKAGAPG4S5EPFRSPDLALETYG。5根据权利要求4所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性片段，可以利用基因工程技术进行表达获得，其特征在于，表达宿主细胞为原核细胞或真核细胞。6权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性片段在制备镇痛药物中的应用。7根据权。
7、利要求6所述的应用，其特征在于所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。权利要求书CN104177501A1/11页3蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法0001本申请是沈阳药科大学2010年2月9日申请的申请号为2010101074663，发明名称为“蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法”的分案申请。技术领域0002本发明涉及生物医药技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法，具体地说，本发明涉及系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体或该系列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物。
8、、类似物的结构及其制备方法，以及作为镇痛药物和抗肿瘤药物在医药领域中的应用。背景技术0003蝎作为传统中药已有2000多年的药用历史，是我国的传统名贵中药，具有较大的开发价值。近年来人们已经发现了多种具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗癫痫等药理作用的蝎毒单组分多肽。天然蝎毒产量极低，因此，采用基因工程方法，用简单的原核或真核生物表达宿主生产具有药用价值的活性蝎毒多肽的方法显得尤为重要。0004提高抗肿瘤药物之肿瘤细胞特异选择性的一种方法是优先向肿瘤细胞表面递送药物。可借助几种方法将药物导向肿瘤细胞。其中方法之一是依赖存在于肿瘤细胞表面上的特异性受体分子。被称为“导向剂”的分子可以识别这些细胞表面受体并。
9、与之特异性结合。所说的“导向剂”可包括抗体、生长因子或激素等。识别特异性细胞表面受体的“导向剂”可将药物导向具有这些表面受体的细胞。0005功能蛋白融合体是近年来发展起来的具有广泛应用前景的生物治疗新方法，主要是通过导向部分将药物特异且高效地聚集于病灶部位，从而实现靶向杀伤病变细胞的目的。一般情况多在导向部分和蛋白药物之间添加一部分柔性连接物序列，可以有效地保持两端蛋白的各自构型，改善分子的空间柔曲性，以有利融合体蛋白导向部分与相应受体的结合以及蛋白药物发挥固有的治疗作用。0006基于此，有人曾利用小鼠白介素3MIL3作为导向部分与白喉毒素结合，并在两个部分之间插入一个短肽接头序列GLY4SE。
10、R，得到融合蛋白质DAB389GLY4SERMIL3，体外和体内实验结果显示，与不带接头序列的融合蛋白DAB389MIL3相比，前者对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用提高约510倍参见DOMUNIQUEETAL,FEBSLETTERS406157161,1997。AMOTZNECHUSHTAN等首次报道并应用GNRH10肽作为导向肽构建嵌合毒素GNRHPE66，经过体内外相关实验研究并探讨了其针对腺癌细胞的靶向杀伤活性，从而为促黄体生成素释放激素的更广泛应用开阔了思路AMOTZNECHUSHTAN,SHAIYARKONI,IRINAMARIANOVSKYETALADENOCARCINOMACELLS。
11、ARETARGETEDBYTHENEWGNRHPE66CHIMERICTOXINTHROUGHSPECICGONADOTROPINRELEASINGHORMONEBINDINGSITESTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,2721159711063,1997。最近也报导了一种基于接头序列的，有假单胞菌外毒素PE和促性腺激素释放素GNRH组成的嵌合蛋白GNRHLPE66或GNRHLPE40。体外和体内实验结果表明，GNRHLPE对多种肿瘤细胞说明书CN104177501A2/11页4系具有细胞毒活性和肿瘤生长抑制活性，并且活性显著高于不带有接头序列的GNRHPE。因此。
12、，带有柔性连接物的嵌合毒素将会成为一种潜在的肿瘤治疗药物。0007专利名称为蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及获得方法发明专利号ZL011282355的发明提供了一种具有较好镇痛效果和抗肿瘤的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及获得方法，而要得到具有镇痛和抗肿瘤生物活性，同时又对肿瘤细胞实现靶向杀伤功能的系列融合体或该系列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物及其获得方法却有待于进一步研究。0008本发明所选择的与蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合的五种小分子癌细胞导向肽，文献报道其特异性识别受体在肝癌细胞表面高表达而正常细胞几乎不表达或表达量很低SCHALLYAV,SRKALOVICG,ETALANTITUMOREFFE。
13、CTSOFANALOGSOFLHRHANDSOMATOSTATINEXPERIMENTALANDCLINICALSTUDIESJSTEROIDBIOCHEMMOLBIOL,1990,3710611067；RADERERM,HEJNAMH,MULLERC,ETALTREATMENTOFHEPATOCELLULARCANCERWITHTHELONGACTINGSOMATOSTATINANALOGLANREOTIDEINVITROANDINVIVOINTJONCOL,2000,16611971201；周筱梅，陈渊卿。人胰岛素样生长因子受体及其生长因子在原发性肝癌中同时过量表达。肿瘤，1991，112。
14、41，这些研究就为特异性靶向杀伤肝癌细胞提供了理论基础。同时有报道本发明所选择的癌细胞导向肽的特异性高表达受体不仅仅局限于肝癌细胞表面，同样存在于如肺癌、前列腺癌等其他癌组织的细胞膜上。发明内容0009本发明的一个目的是提供由蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽和不同癌细胞导向肽两部分组成的融合体蛋白，并且在两者之间插入了适当的接头序列。0010本发明的另一个目的是构建蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽与不同癌细胞导向肽的融合体蛋白的载体，该系列融合体蛋白的表达纯化方法及体内外生物活性研究。不同癌细胞导向肽分别为导向部分，与不同的柔性连接肽连接后，通过柔性连接肽融合在蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的N端或C端而构成相应的载体。001。
15、1本发明的另一个目的是提供生产如上限定的嵌合蛋白质的方法，该方法包括0012提供携带不同癌细胞导向肽、不同的柔性连接肽、蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的编码DNA的重组表达载体；0013用步骤的重组载体转化适当的宿主细胞原核或真核细胞；0014在适合于表达蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体的条件下培养步骤的被转化的宿主细胞；0015收获并纯化所得到的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白质。0016本发明的再一个目的是提供含有如上限定的融合体蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。0017本发明的再一个目的是提供如上限定的融合蛋白质在生产镇痛和抗肿瘤药物中的应用。0018本发明提供的系列蝎镇痛抗肿瘤缬。
16、精甘肽融合体蛋白或该系列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物均是从基因工程宿主细胞中分离纯化得到的。可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养液说明书CN104177501A3/11页5中分离并纯化所需的蛋白质表达产物。在产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDSPAGE、酶联免疫吸附法ELISA或蛋白免疫印迹法WESTERN检测产物的存在及相应分子大小。0019本发明还提供了系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白或该系列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物在生物制药领域的应用，具体地说包括镇痛和抗肿瘤生物活性。
17、。0020本发明首次利用不同的癌细胞导向肽和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合以及在两者之间引入长度不同及氨基酸组成成分不同的柔性连接肽序列。0021根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是GLY4SERN，N1。0022根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是GLY4SERN，N2。0023根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是GLY4SERN，N3。0024根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是GLY4SERN，N4。0025根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是GLY4SERN，N5。0026本发明首次进行系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白或该系列融合体的部分片。
18、段或该系列融合体衍生物、类似物的小鼠体内镇痛活性和体外抗肿瘤细胞生物学活性实验。0027本发明进一步涉及含有上述融合体蛋白和至少一种医药上可接受的惰性载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物如参见REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCE,15TH,MACKPUBLISHINGCOMPANY,1980。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。0028可使用本发明的融合体蛋白或含有该融合体蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体细胞的各。
19、种疾病。一种优选的用途是用于治疗其表面上过度表达促黄体生成素释放激素受体、胰岛素样生长因子受体或生长抑素受体之细胞相关的疾病。本发明的融合体蛋白质或含有该融合体蛋白质的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。0029在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。0030在本发明中，英文缩写“BMKAGAP”是指蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽。X是指癌细胞导向肽，X1为QHWSYGLRPG，X2为QHWS。
20、YGWRPG，X3为QHWSYGFRPG，X4为EPFRSPDLALETYG,X5为PFCFWKTCT。J是指连接肽，J1为SSHHHHHHSSGLVPRGSHM，J2为GGGSGGGS，J3为SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS，J4为GSGGGGSGGGGS和G4SNN1或2或3或4或5。0031可使用文献中的各种检测方法对本发明的融合体蛋白质的性质及生物学活性进行鉴定。具体包括1小鼠体内镇痛活性实验该方法是根据融合体蛋白质中的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽部分具有明显的镇痛活性，检测其对小鼠醋酸扭体镇痛的抑制率；2MTT细胞存活率实验该方法是根据活细胞将MTT转化成兰紫色甲瓒结晶体的。
21、能力检测对肿瘤细胞的影响；3受体结合实验该方法是根据融合体蛋白质竞争性置换与靶细胞浆膜结合说明书CN104177501A4/11页6125IGNRH的能力检测其特异性受体结合活性；4裸鼠移植瘤生长抑制实验该方法是根据融合体蛋白质对裸鼠移植瘤生长的抑制能力检测其对肿瘤细胞的靶向杀伤活性。0032以五种癌细胞导向肽分别为导向的系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体或该系列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物可以导向性地选择作用于肿瘤原发灶及转移灶，同时毒副作用小，并且本发明的系列融合体蛋白亦能起到较好的镇痛作用，治疗疾病的同时还能减轻患者的病痛，因此其应用前景将是非常广阔的。具体实施方式0033下。
22、面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册。0034实施例10035X1J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得00361X1J1BMKAGAP融合体基因的构建0037本实施例列举描述用于表达本发明X1J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物基因的构建策略和基本方法。0038根据癌细胞导向肽X1QHWSYGLRPG和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽BMKAGAP的氨基酸序列，设计相应寡核苷酸上游引物和下游引物，以构建好的PET28ATAGHISBMKAGAP质粒为模板进行P。
23、CR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收，经过限制性核酸内切酶NCOI和BAMHI双酶切后与同样进行双酶切的质粒PSYPU在T4DNALIGASE的作用下进行连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH5，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA核酸序列测定。结果表明，通过基因工程的方法成功构建并获得重组质粒PSYPUX1J1BMKAGAP，得到癌细胞导向肽QHWSYGLRPG、连接肽SSHHHHHHSSGLVPRGSHM和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的融合基因序列。00392X1J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0040利用基因工。
24、程技术，构建X1J1BMKAGAP融合体蛋白表达质粒，提取质粒进行测序。0041该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。0042经测序确认后按常规方法发酵表达并分离大肠杆菌宿主细胞的表达产物。首先将阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21DE3，然后从该LB固体平板上挑取单菌落后接种至3MLLB含氨苄抗生素，60G/ML，于37，200R/MIN振荡过夜培养。按照1接种量将过夜培养物接种至400ML含相应抗生。
25、素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37，200R/MIN振荡培养至OD值为0608，加入终浓度为0166MMOL/L的诱导物异丙基D硫代半乳糖苷IPTG，培养4H。结束发酵，4离心收集菌体。用40ML裂解缓冲液01MPBS,015MNACL,50MM咪唑重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12,000G、4离心20MIN，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于01MPBSPH80预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的PH缓冲液分别充分洗涤5个柱床说明书CN104177501A5/11页7体积后，使用05M咪唑PH90进行洗脱并收获该洗脱液。所得产物经过。
26、15SDSPAGE验证其纯度。由柱层析色谱图和SDSPAGE图谱说明，重组融合体蛋白质获得高效表达，经过两步常规柱层析后获得单一目的蛋白条带，达到电泳纯度。0043按照上述策略和基本方法，X1J1BMKAGAP融合体衍生物、类似物的结构特征为MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。利用化学法在M处断裂去除M，从而获得X1J1BMKAGAP融合体衍生物、类似物，结构特征为GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIAD。
27、DKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。00443X1J1BMKAGAP融合体蛋白在酵母中的表达及其纯化0045将编码X1J1BMKAGAP或X1J1MBMKAGAP融合体蛋白基因进行扩增，PCR反应所使用的5寡核苷酸引物序列含有ECOR限制性内切酶的酶切位点和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的N末端区域氨基酸序列的编码序列。3端引物序列含有ECOR限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止密码子和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽蝎镇痛抗肿瘤活性肽C末端区域氨基酸序列的编码序列。0046引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体PPIC9K。
28、上的限制性内切酶酶切位点其中ECOR和SNAB的内切酶切口为平末端，该质粒载体编码抗生素抗性AMPR和KANR，一个来自2质粒的复制子，一个AOX1启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导高效表达，一个因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个HIS4选择性标记以及整合序列。0047用SNAB和ECOR消化PPIC9K载体，用ECOR和ECOR消化插入片段，随后将插入片段连入PPIC9K载体，连接产物热转化ECOLIDH5菌株，在含有AMP的LB培养皿上筛选转化子，在含有AMP100G/ML的LB液体培养基中过夜培养含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。0048取质粒线性化后，电转化入。
29、酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用G418筛选出高拷贝的整合转化子。将筛选得到的菌株接种于装有25MLMGY、BMG或BMGY培养基的250ML摇瓶中，于2830/250300转/分培养至OD600261618H；室温下3000转/分离心5MIN，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM、BMM或BMMY重悬菌体约1020ML；将步骤2所得的菌液置于100ML的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于2830/250300转/分的摇床上继续生长；每24H向培养基中添加100甲醇至终浓度为0510；分离样品的上清液,用截留分子量为3000。
30、DA的超滤膜超滤除去色素，用SDSPAGE、WESTERNBLOT及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。0049涉及的表达产物结构特征为00501GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。00512QHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。00523GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVP。
31、RGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。说明书CN104177501A6/11页800534QHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。0054实施例20055X2J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0056本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。0057X2J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为00581QHWSY。
32、GWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00592QHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。00603MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00614MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。0062实施例30063X3J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0064本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。0065X3J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为00661QHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00。
33、672QHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。00683MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00694MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。0070实施例40071X4J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0072本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。0073X4J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为00741MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00752MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSG。
34、LVPRGSHBMKAGAP。00763EPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00774EPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。0078实施例50079X5J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0080本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。0081X5J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为00821MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00832MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。00843PFCFWKTC。
35、TSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP。00854PFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHBMKAGAP。0086实施例60087以J2为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0088本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以J2GGGSGGGS为连接肽形成BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为00891MQHWSYGLRPGGGGSGGGSBMKAGAP,2QHWSYGLRPGGGGSGGGSBMKAGAP,3说明书CN104177501A7/11页9MBMKAGAPGGGSGGGSQHWSYGLRPG,4BMKA。
36、GAPGGGSGGGSQHWSYGLRPG,5MQHWSYGWRPGGGGSGGGSBMKAGAP,6QHWSYGWRPGGGGSGGGSBMKAGAP,7MBMKAGAPGGGSGGGSQHWSYGWRPG,8BMKAGAPGGGSGGGSQHWSYGWRPG,9MQHWSYGFRPGGGGSGGGSBMKAGAP,10QHWSYGFRPGGGGSGGGSBMKAGAP,11MBMKAGAPGGGSGGGSQHWSYGFRPG,12BMKAGAPGGGSGGGSQHWSYGFRPG,13MEPFRSPDLALETYGGGGSGGGSBMKAGAP,14EPFRSPDLALETYGGGGSGG。
37、GSBMKAGAP,15MBMKAGAPGGGSGGGSEPFRSPDLALETYG,16BMKAGAPGGGSGGGSEPFRSPDLALETYG,17MPFCFWKTCTGGGSGGGSBMKAGAP,18PFCFWKTCTGGGSGGGSBMKAGAP,19MBMKAGAPGGGSGGGSPFCFWKTCT,20BMKAGAPGGGSGGGSPFCFWKTCT。0090实施例70091以J3为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0092本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以J3SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS为连接肽形成BMKAG。
38、AP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为00931MQHWSYGLRPGJ3BMKAGAP,2QHWSYGLRPGJ3BMKAGAP,3MBMKAGAPJ3QHWSYGLRPG,4BMKAGAPJ3QHWSYGLRPG,5MQHWSYGWRPGJ3BMKAGAP,6QHWSYGWRPGJ3BMKAGAP,7MBMKAGAPJ3QHWSYGWRPG,8BMKAGAPJ3QHWSYGWRPG,9MQHWSYGFRPGJ3BMKAGAP,10QHWSYGFRPGJ3BMKAGAP,11MBMKAGAPJ3QHWSYGFRPG,12BMKAGAPJ3QHWSYGFRPG,13MEPFRSPDLALE。
39、TYGJ3BMKAGAP,14EPFRSPDLALETYGJ3BMKAGAP,15MBMKAGAPJ3EPFRSPDLALETYG,16BMKAGAPJ3EPFRSPDLALETYG,17MPFCFWKTCTJ3BMKAGAP,18PFCFWKTCTJ3BMKAGAP,19MBMKAGAPJ3PFCFWKTCT,20BMKAGAPJ3PFCFWKTCT。0094实施例80095以J4为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0096本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以J4GSGGGGSGGGGS为连接肽形成BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征。
40、为00971MQHWSYGLRPGJ4BMKAGAP,2QHWSYGLRPGJ4BMKAGAP,3MBMKAGAPJ4QHWSYGLRPG,4BMKAGAPJ4QHWSYGLRPG,5MQHWSYGWRPGJ4BMKAGAP,6QHWSYGWRPGJ4BMKAGAP,7MBMKAGAPJ4QHWSYGWRPG,8BMKAGAPJ4QHWSYGWRPG,9MQHWSYGFRPGJ4BMKAGAP,10QHWSYGFRPGJ4BMKAGAP,11MBMKAGAPJ4QHWSYGFRPG,12BMKAGAPJ4QHWSYGFRPG,13MEPFRSPDLALETYGJ4BMKAGAP,14EPFRS。
41、PDLALETYGJ4BMKAGAP,15MBMKAGAPJ4EPFRSPDLALETYG,16BMKAGAPJ4EPFRSPDLALETYG,17MPFCFWKTCTJ4BMKAGAP,18PFCFWKTCTJ4BMKAGAP,19MBMKAGAPJ4PFCFWKTCT,20BMKAGAPJ4PFCFWKTCT。0098实施例90099以G4S1为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0100本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以G4S1为连说明书CN104177501A8/11页10接肽形成BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为01011。
42、MQHWSYGLRPGG4S1BMKAGAP,2QHWSYGLRPGG4S1BMKAGAP,3MBMKAGAPG4S1QHWSYGLRPG,4BMKAGAPG4S1QHWSYGLRPG,5MQHWSYGWRPGG4S1BMKAGAP,6QHWSYGWRPGG4S1BMKAGAP,7MBMKAGAPG4S1QHWSYGWRPG,8BMKAGAPG4S1QHWSYGWRPG,9MQHWSYGFRPGG4S1BMKAGAP,10QHWSYGFRPGG4S1BMKAGAP,11MBMKAGAPG4S1QHWSYGFRPG,12BMKAGAPG4S1QHWSYGFRPG,13MEPFRSPDLALETY。
43、GG4S1BMKAGAP,14EPFRSPDLALETYGG4S1BMKAGAP,15MBMKAGAPG4S1EPFRSPDLALETYG,16BMKAGAPG4S1EPFRSPDLALETYG,17MPFCFWKTCTG4S1BMKAGAP,18PFCFWKTCTG4S1BMKAGAP,19MBMKAGAPG4S1PFCFWKTCT,20BMKAGAPG4S1PFCFWKTCT。0102实施例100103以G4S5为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得0104本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以G4S5为连接肽形成BMKAGAP融合体及其衍生物、类似。
44、物，其结构特征为01051MQHWSYGLRPGG4S5BMKAGAP,2QHWSYGLRPGG4S5BMKAGAP,3MBMKAGAPG4S5QHWSYGLRPG,4BMKAGAPG4S5QHWSYGLRPG,5MQHWSYGWRPGG4S5BMKAGAP,6QHWSYGWRPGG4S5BMKAGAP,7MBMKAGAPG4S5QHWSYGWRPG,8BMKAGAPG4S5QHWSYGWRPG,9MQHWSYGFRPGG4S5BMKAGAP,10QHWSYGFRPGG4S5BMKAGAP,11MBMKAGAPG4S5QHWSYGFRPG,12BMKAGAPG4S5QHWSYGFRPG,13M。
45、EPFRSPDLALETYGG4S5BMKAGAP,14EPFRSPDLALETYGG4S5BMKAGAP,15MBMKAGAPG4S5EPFRSPDLALETYG,16BMKAGAPG4S5EPFRSPDLALETYG,17MPFCFWKTCTG4S5BMKAGAP,18PFCFWKTCTG4S5BMKAGAP,19MBMKAGAPG4S5PFCFWKTCT,20BMKAGAPG4S5PFCFWKTCT。0106实施例110107系列BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物体内镇痛活性小鼠醋酸扭体法0108本实施例通过小鼠体内镇痛模型旨在验证BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物的镇痛活性。0。
46、109小鼠醋酸扭体法镇痛模型将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起。01101822G昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组8只，腹腔注射BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物样品，20MIN后按02ML/20G腹腔注射06V/V醋酸引起内脏痛，5MIN后记录小鼠10MIN内的扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。0111说明书CN104177501A109/11页110112镇痛生物活性实验结果表明01131生理盐水空白组实验动物扭体次。
47、数MEANSEM为4675365；阳性对照组实验动物扭体次数MEANSEM为2937185，扭体抑制率为3717。01142蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽组的实验动物扭体抑制率为556。01153BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组01161X1J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组0117样品MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG的实验动物扭体抑制率为541。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X1J1BMKAGAP融。
48、合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X1J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。01182X2J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组0119样品MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP的实验动物扭体抑制率为551。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X2J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X2J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。01203X3J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组0121样品MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPR。
49、GSHMBMKAGAP的实验动物扭体抑制率为538。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X3J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X3J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。01224X4J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组0123样品MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP的实验动物扭体抑制率为558。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X4J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X4J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。01245X5J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组0125样品MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHMBMKAGAP的实验动物扭体抑制率为565。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X5J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X5J1BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。01266以J2为连接肽的BMKAGAP融合体及其衍生物、类似物组0127样品MQHWS。