发明内容
本发明的目的就是提供一种针对前列腺疾病的更有效的、针对性更强的药物和治疗方案。
在本发明的第一方面，提供了一种式I所示的靶向性治疗分子，
T-A (I)
式中，
T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；
A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物；
并且T和A通过化学键或共价键结合。
在另一类优选例中，所述的T为抗前列腺特异性抗原(PSA)的抗体或其具有靶向性的抗体片段。
在另一类优选例中，所述的抗PSA的抗体为单克隆抗体。
在另一类优选例中，所述的A为治疗前列腺癌、前列腺增生或前列腺炎的化合物。
在另一类优选例中，所述的A为治疗前列腺癌的化合物。
在另一类优选例中，所述的靶向性治疗分子的治疗活性保留率≥50％，其中治疗活性保留率按下式计算：
在另一类优选例中，所述的靶向性治疗分子的治疗活性保留率≥60％、≥70％、≥80％或≥90％。
其中，所述的治疗活性是在不考虑靶向因素情况下的同一种治疗活性。例如，如果化合物A的治疗活性是抑制前列腺增生的活性，则靶向性治疗分子的治疗活性也是抑制前列腺增生的活性。如果化合物A的治疗活性是治疗前列腺癌的活性，则靶向性治疗分子的治疗活性也是治疗前列腺癌的活性。
在另一类优选例中，所述的A为选自下组的治疗前列腺癌的化合物：爱普列特、非那甾胺或它们的衍生物(如药学上可接受的盐和活性衍生物)。
在另一类优选例中，所述的T和A通过共价键结合。
在另一类优选例中，所述的T和A是通过DCC法形成偶联的。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体和本发明第一方面中所述的靶向性治疗分子。
在另一类优选例中，所述的药物组合物剂型是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂、或注射剂、口腔喷雾剂、滴丸、混悬剂。
在另一类优选例中，所述的药物组合物还含有致凋亡化疗药物。
在另一类优选例中，所述的致凋亡化疗药物是肿瘤坏死因子。
在另一类优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的治疗剂：TRAIL、TGF-β、IFN-α、血管他丁(Angiostatin)、内皮他丁(Endostatin)、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑或替尼泊甙。
在本发明的第三方面，提供了本发明第一方面中所述的靶向性治疗分子的用途，它被用于制备治疗前列腺疾病的药物。
较佳地，它用于制备治疗前列腺癌、前列腺增生、或前列腺炎的药物。
在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面中所述的靶向性治疗分子的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在偶联剂存在下，将靶向性部分T与化合物A进行偶联反应，从而形成式I所示的靶向性治疗分子
T-A (I)
其中，
T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；
A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物，
并且T和A通过化学键或共价键结合。
在另一类优选例中，所述的偶联剂是羧基活化剂，并且在步骤(a)中包括：(i)将化合物A用活化试剂进行活化，形成活化的化合物A；和(ii)将活化的化合物A与靶向性部分T进行偶联，从而形成式I所示的靶向性治疗分子。
在另一类优选例中，在步骤(ii)中，还包括：添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共同参与活化的化合物A与靶向性部分T的偶联反应。
在另一类优选例中，所述的偶联剂选自下组：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、溴化氰、和高碘酸钠。
在另一类优选例中，靶向性部分T与化合物A的摩尔比为1∶5-1∶500；较佳地为1∶10-1∶200；更佳地为1∶10-1∶100。
在另一类优选例中，偶联反应在0-40℃，更佳地4-35℃下进行。
在另一类优选例中，偶联反应在pH 3.0-7.0，更佳地pH4.0-6.0下进行。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就靶向性部分T与化合物A的摩尔比而言，范围1∶5-1∶500的上限1∶500可以与另一优选范围1∶10-1∶200的下限1∶10进行组合，从而构成范围1∶10-1∶500。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，将治疗前列腺疾病的小分子化合物与抗PSA的抗体通过化学偶联所形成的偶联物，不仅结合牢固并保留了PSA抗体的靶向性，而且基本上保留了小分子化合物全部活性。因此，与原先单独的小分子化合物(如爱普列特和非那甾胺)相比，药物使用剂量大大降低(在抑制前列腺增生时剂量下降约1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的毒副作用。更出乎意料的是，在原本无治疗前列腺癌效果的爱普列特和非那甾胺的临床剂量范围内，本发明的相应偶联物表现出显著的抑制前列腺癌细胞生长的效力。在此基础上完成了本发明。
活性成分
如本文所用，术语“本发明的小分子化合物”或“治疗前列腺疾病的小分子化合物”可互换使用，都指对于前列腺疾病有治疗活性的化学合成的化合物(compound)。代表性的小分子化合物包括但并不限于：爱普列特和非那甾胺。
1)爱普列特。
其他名称：17b-(N-叔丁基氨基甲酰基)雄甾-3，5-二烯-3-羧酸；依立雄胺；爱普列特UV；(17B)-17-[[(1，1-二甲基乙基)氨基]羧基]雄甾-3，5-二烯-3-羧酸；依普甾胺。
爱普列特通过抑制人体内5α-还原酶的活性，抑制睾丸酮还原为双氢睾丸酮，从而降低双氢睾丸酮的浓度，起到治疗前列腺良性增生症的作用。
其分子式：C25H37NO3
其化学结构式：
2)非那甾胺
其他名称：N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺，非那雄胺
其分子式：C23H36N2O2
其化学结构式：
本发明的小分子化合物是可从商业途径购买到，也可常规的有机合成方法制备获得。
如本文所用，本发明的小分子化合物还包括所述小分子的由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸和马来酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
PSA抗体
前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)是一个被证明的标志物，大量存在于前列腺中，血清中也有少量，PSA有不同的分子形式，FREE-PSA以游离的形式循环于血液中。测定血清中不同分子形式的PSA对于区别前列腺癌和前列腺增生有重要意义。前列腺癌患者血清中Free PSA/TotalPSA比值明显较前列腺增生患者低，当PSA值为4～15ng/ml时，应用游离PSA/总PSA比值来区别癌和增生。
PSA抗体能够专一地识别PSA，尤其是抗PSA的单克隆抗体，具有灵敏度高，专一性强的特点，可以被用作靶向性药物的载体，专门运载针对前列腺增生和前列腺癌的药物。
除了抗前列腺特异性抗原PSA的完整抗体之外，抗体的具有靶向性的抗体片段也可用于本发明。
可用于本发明的PSA抗体可从商业途径购买到，也可常规的单克隆技术制备获得。
小分子化合物-PSA抗体的偶联物及其制法
本发明提供了小分子化合物-PSA抗体的偶联物及其制法。
本发明的偶联物可用式I表示
T-A (I)
式中，
T为针对前列腺细胞的靶向性部分(moiety)；
A是对于前列腺疾病有治疗活性的化合物；
并且T和A通过化学键或共价键结合。
如本文所用，术语“本发明的偶联物”和“小分子化合物-PSA抗体的偶联物”可互换使用，都指将本发明的小分子化合物与靶向性部分(优选PSA单克隆抗体)通过DCC法等进行偶联，所形成的小分子化合物-PSA抗体的偶联物。
应理解，在本发明的偶联物中，一个PSA抗体上可以共价结合有一个或多个小分子化合物。
本发明的方法包括：将现有的治疗前列腺疾病小分子化合物与PSA抗体经化学共价偶联(优选通过DCC法)，从而产生稳定的共价偶联物。
以爱普列特和非那甾胺两种药物为例，分别与PSA单克隆抗体偶联后，得到两类偶联物：
爱普列特-PSA抗体(简称：E-PSA)
非那甾胺-PSA抗体(简称：F-PSA)
对本发明的偶联物进行动物试验表明，其具有极其优异的药物效果。与原先单独的爱普列特和非那甾胺相比，药物使用剂量大大降低(在抑制前列腺增生时，用药剂量可下降约1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。
另外，采用本发明提供的新偶联物，可以用作治疗前列腺癌的临床应用。原先单独使用爱普列特和非那甾胺在临床可接受的剂量范围无法观测到抗癌效果，而加大使用剂量造成严重的副作用而无法实施。而本发明偶联物在爱普列特和非那甾胺的临床可接受的剂量范围内可以观察到对前列腺癌的治疗效果。
药物组合物
本发明还包括含有小分子化合物-PSA抗体的偶联物的药物组合物。本发明的小分子化合物-PSA抗体的偶联物及其药物组合物可用于治疗前列腺简便(尤其是前列腺增生和前列腺癌)，即给哺乳动物施用安全有效量的本发明偶联物。
本发明的偶联物可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如TNF-α、TRAIL、TGF-β、IFN-α、血管他丁(Angiostatin)、内皮他丁(Endostatin)、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。此外，还可与抗肿瘤的中药(或其制剂)合用。
一种优选的药物组合物还含有致凋亡化疗药物，尤其是肿瘤坏死因子如人肿瘤坏死因子α等。
当本发明的偶联物用于治疗前列腺癌时，它可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。
液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，而固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)。
通常，本发明的药物组合物包括以下剂型：如下口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0.05-5％悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等渗介质中含有约0.05-5％助溶剂)进行非肠胃给药。这些药物制剂通常可含有与载体混合的约0.5-99.5wt％，较佳地2.5-90wt％，更佳地5％-60wt％(重量)的本发明偶联物，按组合物的总重量计。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服或局部给药。优选静脉给药方式。
适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明化合物每天以约0.005-500mg/kg动物体重(较佳地0.01-100mg/kg体重，更佳地0.05-5mg/kg体重给药)的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-4次的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.1-1000mg或更高，较佳地0.5-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明偶联物不仅结合牢固并保留了PSA抗体的靶向性，而且基本上保留了小分子化合物全部活性。
(b)与原先单独的小分子化合物(如爱普列特和非那甾胺)相比，药物使用剂量大大降低(在抑制前列腺增生时剂量下降约1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。
(c)在原本无治疗前列腺癌效果的爱普列特和非那甾胺的临床剂量范围内，本发明的相应偶联物表现出显著的抑制前列腺癌细胞生长的效力。
(d)本发明偶联物的毒副作用小。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法一)
采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。爱普列特与EDC之比为1M∶1.2-1.8M。活化反应的pH范围为4.0-6.0。活化反应结束后，加入PSA抗体(该抗体为小鼠单抗)，PSA抗体加入的量与爱普列特之比为1M∶10-100M。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例2
DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法二)
采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。爱普列特与EDC之比为1M∶1.2-1.8M。活化反应的pH范围为4.0-6.0。活化反应结束后，加入PSA抗体，PSA抗体加入的量与爱普列特之比为1M∶10-100M，同时加入少量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例3
DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法三)
爱普列特加入溴化氰活化(与溴化氰的重量比例为1∶0.5)，再加入己二酰肼处理，衍化率为1-3％。活化反应结束后，加入PSA抗体和碳二亚胺(19.17mg/ml)，PSA抗体加入的量与爱普列特之比为1M∶10-100M，同时加入少量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例4
DCC法制备爱普列特-PSA抗体(方法四)
爱普列特加入高碘酸钠氧化(爱普列特与高碘酸钠之比为1M∶1.2-1.8M)。活化反应结束后，加入PSA抗体和硼氰氢化钠(爱普列特与硼氰氢化钠之比为1M∶1.2-1.8M)，PSA抗体加入的量与爱普列特之比为1M∶10-100M反应得到E-PSA结合物。采用100KD的超滤器纯化，以去除残留的硼氰氢化钠，得到初步纯化的偶联物。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将E-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例5
DCC法制备非那甾胺-PSA抗体(方法一)
采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。非那甾胺与EDC之比为1M∶1.2-1.8M。活化反应的pH范围为4.0-6.0。活化反应结束后，加入PSA抗体，PSA抗体加入的量与非那甾胺之比为1M∶10-100M。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例6
DCC法制备非那甾胺-PSA抗体(方法二)
采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是一种可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。非那甾胺与EDC之比为1M∶1.2-1.8M。活化反应的pH范围为4.0-6.0。活化反应结束后，加入PSA抗体，PSA抗体加入的量与非那甾胺之比为1M∶10-100M，同时加入少量(终浓度约为0.02M)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例7
DCC法制备非那甾胺-PSA抗体(方法三)
非那甾胺加入溴化氰活化(与溴化氰的重量比例为(1∶0.5)，再加入己二酰肼处理，衍化率为1-3％。活化反应结束后，加入PSA抗体和碳二亚胺(19.17mg/ml)，PSA抗体加入的量与非那甾胺之比为1M∶10-100M，同时加入少量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，共同完成偶联反应。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例8
DCC法制备非那甾胺-PSA抗体(方法四)
非那甾胺加入高碘酸钠氧化(非那甾胺与高碘酸钠之比为1M∶1.2-1.8M)。活化反应结束后，加入PSA抗体和硼氰氢化钠(非那甾胺与硼氰氢化钠之比为1M∶1.2-1.8M)，PSA抗体加入的量与非那甾胺之比为1M∶10-100M反应得到F-PSA结合物。采用100KD的超滤器纯化，以去除残留的硼氰氢化钠，得到初步纯化的偶联物。采用DEAE离子交换柱进行色谱分离，即将F-PSA偶联物悬浮于缓冲液中，缓冲液使用100mM Tris，pH8.6，去除小分子化合物，得到纯化的偶联物产品。
实施例9
不同偶联方法的结果比较
对于实施例1-8中所制备的偶联物，通过常规方法测定其与等量游离药物的活性等同性(按照标准爱普列特，非那甾胺活性测定方法测定)，结果列于下表。
偶联物
偶联方法
与等量游离药物的活性等同性
爱普列特-PSA抗体
实施例1
65％
爱普列特-PSA抗体
实施例2
95％
爱普列特-PSA抗体
实施例3
95％
爱普列特-PSA抗体
实施例4
82％
非那甾胺-PSA抗体
实施例5
15％
非那甾胺-PSA抗体
实施例6
42％
非那甾胺-PSA抗体
实施例7
79％
非那甾胺-PSA抗体
实施例8
96％
通过对比实验，考证不同的方法，表明不同的偶联方法对不同的药物产生明显不同的结果。
对于爱普列特-PSA抗体而言，实施例3和实施例2的方法都被证明可行有效，但是实施例3中采用溴化氰活化的方法在将来生产过程中非常危险和难以操作，涉及高度危险的生产防护。而采用实施例2的方法，简单容易。
对于非那甾胺-PSA抗体而言，实施例8的方法被证明可行有效，这可能由于采用溴化氰活化的方法对非那甾胺结构产生破坏，而采用高碘酸钠氧化方法能够提高效率。
两种药物相比，在结构上爱普列特末端羧酸提供了很好的活化位点，且不影响活性，与抗体蛋白分子上的活化氨基形成较为牢固的共价偶联。
非那甾胺也能提供了很好的化学活化位点，并可与抗体蛋白分子上的活化氨基形成较为牢固的共价偶联。
实施例10
爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体的抗丙酸睾酮引起的大白鼠前列腺增生试验
在本实施例中，SD雄性大白鼠经去势恢复后，以丙酸睾丸酮诱发前列腺增生，继而连续一个月静脉注射1.6和8.0ug/kg的爱普列特和非那甾胺的PSA偶联抗体，结果显示与丙睾组相比，24小时排尿量增加；前列腺体积、前列腺湿重及前列腺指数均缩小，腹部叶腺上皮细胞高度降低，腺腔面积缩小。因此，爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体都具有改善前列腺增生症状效果，同时，对于丙睾诱导的大鼠前列腺增生具有抑制作用。
一、激素与药物
1、苯甲酸雌二醇，上海第九制药厂，批号：20090401，橄榄油稀释；
2、丙酸睾酮，上海华联制药有限公司，批号：010504，橄榄油溶解；
3、非那甾胺，广丰县创新医药原料有限公司提供，英文名：Finasteride，化学名：N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺，分子式：C23H36N2O2，分子量：373，外观：白色或类白色结晶性粉末；
4、爱普列特，江苏联环药业股份有限公司提供，英文名：Epristeride，化学名：17B-(N-叔丁基-氨基-甲酰基)雄甾-3，5-Z烯-3-羧酸，分子式：C25H37NO3，分子量：399.57，外观：白色结晶性粉末；
5、爱普列特-PSA偶联抗体，简称E-PSA，实施例2制备，纯度98.1％；
6、非那甾胺-PSA偶联抗体，简称F-PSA，实施例8制备，纯度98.3％。
二、动物
1、来源、种属、合格证：SD大鼠，♂，100-120g，上海西普尔-必凯公司提供，合格证号：沪动合证字SCXK沪2003-0002号，饲养条件：按普通级动物要求饲养，自由取水，室温25±2℃，相对湿度40-70％，光照明暗各12小时。经一周适应性。饲料购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司；
2、体重：给药时体重为170±20g左右；
3、性别：雄性；
4、动物数：54只，每组6只。
三、剂量设置
根据文献资料，以5为剂距，设两个供试品各1.6和8.0ug/kg高和低两个剂量组。
四、给药方法
1、E-PSA或F-PSA：SD大鼠尾静脉注射，1.6和8.0ug/kg体重；(该用量是按偶联物的重量计算，大致合0.16-0.8ug爱普列特或非那甾胺/kg体重和0.8-4ug爱普列特或非那甾胺a/kg体重)
2、苯甲酸雌二醇：皮下注射，0.05mg/kg；
3、丙酸睾酮：皮下注射，0.5mg/只；
4、非那甾胺：SD大鼠灌胃，1.0ml/100g体重。
五、给药时间
连续给药31天。
六、实验方法
1、分组：将去势SD大鼠随机分组，同时设置正常对照组共10组，见表1所示。
表1、实验动物分组及剂量设计
2、给药及处理：将SD大白鼠去势后，观察SD大鼠身体状况，每周根据动物体重变化。待大白鼠恢复后，根据其体重调整用药量，按照表1中所示药量及方案，每日上午8:30-10:30给药，丙酸睾酮及苯甲酸雌二醇每日皮下注射。连续给药一个月，于末次给药前最后一天用代谢笼收集大鼠24小时尿液，测其尿量。末次给药24小时后，将SD大鼠称重后处死，取血及前列腺组织，进行检验分析，提取血清后保存于-80℃备用。前列腺测量体积大小后，将前列腺组织分腹侧叶和背侧叶，称取各叶湿重，再将各叶分成两部分，一部分称取湿重后，将组织块放置80℃烘箱中烘24小时后称干重。另一部分前列腺组织经中性福尔马林固定，组织切片，在显微镜下，利用显微图像分析软件测量腺腔面积和腺上皮高度，判断结果。
七、实验观察指标
1、尿量；
2、前列腺体积；
3、前列腺湿重；
4、前列腺腺腔面积和腺上皮高度。
八、数据处理方法
数据用±SD表示，以单因素方差分析法进行数据分析。
九、结果
1、E-PSA和F-PSA对SD大鼠体重、尿量、前列腺重量及前列腺系数的影响给予E-PSA和F-PSA后，SD大鼠体重与丙睾组相比，体重未见明显异常(P＞0.05)；24小时排尿量较丙睾组增加；与丙睾组相比，高剂量和低剂量组前列腺体积、前列腺湿重及前列腺指数均缩小(表2)。
表2、药物对SD大鼠体重、尿量、前列腺体积、前列腺湿重及前列腺系数的影响(n＝6)
注：*P＜0.05，**P＜0.01 VS丙睾组
2、E-PSA和F-PSA对SD大鼠前列腺各叶上皮高度影响
与丙睾组相比，E-PSA和F-PSA组腹侧叶上皮高度均缩小(P＜0.01)(表3)。
3、E-PSA和F-PSA对SD大鼠前列腺各叶腺腔面积影响
与丙睾组相比，主要是腹侧叶腺腔面积缩小(表3)。
表3、药物对SD大鼠前列腺各叶上皮高度和腺腔面积影响
注：*P＜0.05，**P＜0.01 VS丙睾组 上皮高度n＝40，腺腔面积n＝20.
十、结论
爱普列特和非那甾胺的PSA偶联抗体在丙酸睾酮引起的大白鼠中，对前列腺增生有抑制作用。
另外，与原先单独的爱普列特和非那甾胺相比，药物使用剂量大大降低(1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。本试验中使用非那甾胺为阳性对照药物。
十一、参考文献
中华人民共和国卫生部药政局.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)[M]北京：人民卫生出版社，1993.101-103.
实施例11
爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体的抗裸鼠移植性前列腺癌药效学试验
在本实施例中，分别观察爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体对裸鼠移植性前列腺癌的治疗效果。
方法如下：(1)取BABL/C裸鼠20只，雄性，17～23g。适应性饲养一周后，套管针皮下接种把大小相近的组织块接种入这20个裸鼠右侧背部靠腋下部。每天观察肿瘤大小，用游标卡尺测量肿瘤长径短径，计算肿瘤体积，直至大部分裸鼠肿瘤体积范围为100～300mm3，剔除此范围之外的裸鼠，结果18只裸鼠在此范围之内。随机分成6组，分别灌胃给药，给药体积为0.2ml/20g，每天1次，连续25天。观察供试品对裸鼠移植性前列腺癌的治疗效果。
结果：阳性对照(比卡鲁胺)组可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率为83.45％；E-PSA高低两剂量组亦可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率分别为61.38％和31.03％，认为对前列腺癌有抑制作用。F-PSA高低两剂量组亦可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率分别为68.97％和59.31％，认为对前列腺癌有抑制作用。
一、动物
1、动物来源、种属、品系：BABL/C裸鼠由中科院上海实验动物中心提供。通过实验动物检测所检疫选用符合国家实验动物；合格证：SCXK沪2003-0002(上海市医学实验动物管委会颁发)；
2、周龄：6～8周龄；
3、体重：17～23g；
4、性别：雄；
5、动物数：18只。
二、饲养条件
1、饲料：饲料由中英合资上海西普尔-必凯试验动物有限公司提供；
2、饲养条件：在SPF级动物房层流架中饲养。每天上、下午各喂食一次，用高压灭菌的标准饲料和水供动物自由食用。动物房通风良好，室温25±2℃，相对湿度40-70％，光照12小时，黑暗12小时；
3、饲养环境：BABL/C裸鼠饲养于318×202×135mm3塑料笼内，每笼饲养同性小鼠3只，用高压灭菌的标准饲料和水供动物自由食用。
三、阳性对照药
1、名称：比卡鲁胺；
2、性状：白色，粉末状；
3、提供单位：上海希地医药科技有限公司；
4、批号：20051201；
5、含量：99.4％；
6、溶媒：0.5％的CMC-Na。
四、受试物
1、爱普列特-PSA偶联抗体，简称E-PSA，实施例2制备，纯度98.1％；
2、非那甾胺-PSA偶联抗体，简称F-PSA，实施例8制备，纯度98.3％。
五、试验方法
1、裸鼠皮下移植瘤模型的建立[1]：取裸鼠32只，雄性，17～23g。取肿瘤生长旺盛且无破溃，健康情况良好的荷瘤鼠3只，右侧均长了由22Rv1前列腺癌细胞所致的皮下肿瘤，脱臼处死，固定于手术板上，用酒精消毒动物皮肤，无菌条件下剥肿瘤，所用器械均经高压消毒。剔除坏死部分，选取表皮边缘长势良好形如鱼肉状的肿瘤，放入盛有加入了抗生素的生理盐水的培养皿中，仔细冲洗，用眼科剪小心分离肿瘤组织至大小均一，大概1mm×1mm×1mm的小块，剪去坏死和血管，把边缘修剪光滑，再反复用生理盐水冲洗。用20号套管针小心吸入肿瘤块，接入这18个裸鼠右侧靠腋窝处。保证接入裸鼠的同一位置，避免触及血管，套管针在皮下的滑行距离尽可能长，酒精消毒接种部位的皮肤。
2、观察和测量肿瘤生长情况：每天观察裸鼠肿瘤生长情况，每隔3天称裸鼠体重，并用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的最长径和最短径，按照公式V＝0.5ab2计算肿瘤体积，式中V为肿瘤体积，a为通过肿瘤中心量取的最长径，b为通过肿瘤中心量取的最短径。直至大部分裸鼠肿瘤体积范围为100～300mm3，剔除此范围之外的裸鼠2只，结果30只裸鼠在此范围之内。用SAS程序生成随机数据表，随机分成10组。
3、观察供试品对裸鼠移植性前列腺癌的防治作用：根据预实验的结果，每个供试品各设计高剂量低剂量2个剂量，分别为10mg/Kg和0.5mg/Kg。阳性药比卡鲁胺的浓度根据文献[2]配置成25mg/Kg，详细情况见表4。按照表4的分组给予相应药物，根据每20mg裸鼠给予0.2ml的药物给药。每天早晨9点灌胃。灌胃后密切观察裸鼠一般状态。每三天称裸鼠体重[3]，用游标卡尺测量裸鼠长短径，计算肿瘤体积。直至大部分裸鼠肿瘤出现坏死时结束实验。停药24小时后处死所有裸鼠，称量裸鼠体重，把它们排列整齐拍照。取出皮下肿瘤，小心分离皮肤，直至肿瘤完整剥离，测量肿瘤长短径，称肿瘤体重，放在滤纸上排列整齐，拍照。
4、疗效评价[1]：停药24小时后处死所有裸鼠，称量裸鼠体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。如果对照组裸鼠肿瘤平均重量小于1克，或20％裸鼠肿瘤重量小于400mg，则表示肿瘤生长不良，试验作废。本试验结果所有裸鼠肿瘤均大于1克，试验有效。
疗效评价公式：肿瘤抑制率＝(C-T)/C*100％
式中T为给药组平均瘤重；C为对照组平均瘤重。
老版本的指导原则认为，抑制率＞30％，经统计学处理有显著性差异(P＜0.05)且经2次重复实验证明后，则评定该药对肿瘤有一定疗效。
然而，最近学术界有趋向认为抑制率要＞60％才算有效，目前还没有定论，本试验采用的标准为抑制率＞50％且经统计学处理有显著性差异算有效。
表4、抗裸鼠前列腺癌药效学模型中受试物剂量组设置
六、结果
各给药组间裸鼠体重、生存天数、瘤重和抑制率结果(SD)
表5、裸鼠体重、生存天数、瘤重和抑制率结果
注：与阴性对照组相比*P＜0.05 **P＜0.01
根据表5中数据显示：阳性对照(比卡鲁胺)组可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率为83.45％；E-PSA高低两剂量组亦可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率分别为61.38％和31.03％，认为对前列腺癌有抑制作用。F-PSA高低两剂量组亦可减轻瘤重，抑制肿瘤进展，与阴性对照组对比差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率分别为68.97％和59.31％，认为对前列腺癌有抑制作用。
七、结论
爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体高剂量组对前列腺癌抑制作用明显，抑瘤率＞50％，而低剂量组抑瘤率＜50％，两者与阴性药对比差异均有显著的统计学意义(P＜0.01)。
八、参考文献
1、中华人民共和国卫生部药政局.新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学).北京：人民卫生出版社，1993.88～90.
2、B.J.A.Furr，Ph.D.，and H.Tucker，Ph.D.The preclinical development of bicalutamide pharmacodynamics and mechanism of action.UROLOGY 47(Supplement IA)，January 1996：13-26
3、张均田主编，现代药理实验方法[下册].北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991.2281
实施例12
爱普列特和非那甾胺的PSA偶联抗体急性毒性试验
一、实验目的
观察受试物一次静脉注射后对小鼠产生的急性毒性反应和死亡情况。
二、受试药物
1、爱普列特-PSA偶联抗体，简称E-PSA，实施例2制备，纯度98.1％；
2、非那甾胺-PSA偶联抗体，简称F-PSA，实施例8制备，纯度98.3％。
三、动物
1、来源、种属、合格证：昆明种小鼠40只，雌雄各半，由上海医科大学动物中心提供，合格证号：医动字第02-22-1号。经一周适应性。饲料购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。自由饮水，饲养温度：22±1℃；相对湿度：60±5％；
2、体重：给药时体重为18-20g；
3、性别：雌雄各半；
4、动物数：按体重随机分2组，20只/组。
四、剂量
1、参照预试结果，最高剂量定为2.0g/kg；
2、每只动物接受容量：注射体积约为0.25ml/10g。
五、给药方式
小鼠单次尾静脉注射，缓慢推注约15秒。
六、实验方法
动物按体重随机分为2组，每组20只，雌雄各半。单次尾静脉注射给予供试品注射液，缓慢推注约15秒，给药后即观察动物各方面反应情况，死亡动物即进行解剖，检查内脏。记录每天动物的死亡数。
七、观察指标
1、观察期：连续观察14天；
2、毒性反应：观察检查小鼠外观、行为、进食、粪便等情况，死亡动物进行尸检。第15天实验结束时，存活小鼠解剖，检查心、肺、肝、脾、肾等脏器病变。
八、结果
1、毒性反应及死亡情况：小鼠在静脉注射供试品注射液后，小鼠给药后无明显反应，第15天全部解剖，肉眼检查未见明显病变；
2、最大耐受量：小鼠在静脉注射供试品注射液后，最大耐受量MTD＝2.0g/kg。
九、结论
昆明种小鼠静脉注射供爱普列特的PSA偶联抗体和非那甾胺的PSA偶联抗体的最大耐受量(MTD)分别都为2.0g/kg。
讨论
近年来，靶向性药物的开发成为了研究的热点。靶向性药物因其靶向性可以使得药物在病灶或其附近富集，从而在总用药量减少的情况下，也能显著提高病灶处药物的有效浓度，从而取得更为有效的治疗效果。目前，已经开发出了针对肝脏组织的靶向性药物。然而，对于靶向性药物的制备中，在将小分子化合物与靶向性部分(通常为针对某一特定组织的抗体或配体)时，并没有非常通用而有效的方法。必须针对不同的化合物而选用不同的连接方案。此外，基于连接方法、靶向性分子的空间结构等诸多因素，制备的靶向性分子常常会产生以下问题：(1)小分子化合物与靶向性部分的结合不够牢固；(2)因空间位阻等多种因素，靶向性分子仅保留了小分子化合物的少量活性。
本发明的试验结果表明，将对于前列腺疾病有治疗活性的小分子化合物(如爱普列特和非那甾胺)和对前列腺细胞的有靶向性的PSA抗体通过DCC化学偶联法，可以形成结合牢固的偶联物。该偶联物不仅保留了原PSA抗体的靶向性，而且基本上保留了小分子化合物全部活性。与原先单独的爱普列特和非那甾胺相比，药物使用剂量大大降低(1000倍左右)，从而降低了药物使用过程中产生的副作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。