用于治疗黄斑变性的方法 发明领域 本发明涉及治疗、 预防或改善患者的黄斑变性的方法。
发明背景
黄斑变性是其中称为黄斑的视网膜的一部分退化的疾病的通用术语。年龄相关 性黄斑变性 (AMD) 是最见的黄斑变性类型。有报道指出在美国 AMD 是大于 55 岁人群失明 的主要原因。在美国有超过一千万的人患有该疾病， 其中包括 23％超过 90 岁的人。(www. webmd.com/eye-health/macular-degeneration/macular-degeneration-overview)。
影响患者的黄斑变性有多种类型。黄斑变性的一种类型是 “干性” 黄斑变性， 亦称 地图样萎缩 (geographical atropy)。干性黄斑变性是该疾病的早期阶段， 其中脉络膜小 疣 (drusen) 沉积在视网膜下水平的黄斑上。这种脉络膜小疣的沉积可由黄斑组织老化或 变薄引起。 作为脉络膜小疣的这种沉积的结果， 可逐渐引起中心视力丧失。 AMD 常常始于干 性黄斑变性。
AMD 的另一种类型是 “湿性” 黄斑变性。湿性黄斑变性是新血管类型的变性， 其中 不完整的血管在视网膜下异常生长， 并且开始渗漏。渗漏的结果是视网膜的感光细胞发生 永久性损伤， 最终引起这些细胞死亡， 从而出现盲点。 与视力丧失可以是轻微的干性黄斑变 性不同， 湿性黄斑变性中发生的视力丧失可能十分严重。 实际上有报告指出， 虽然仅 10％的 AMD 患者患有湿性黄斑变性， 但是患有严重视力丧失的 66％的 AMD 患者可直接归因于由湿 性黄斑变性引起的视力丧失。
不幸的是， 仅有有限的成功确定该病病因的案例。 而且， 黄斑变性的治疗也只有有 限的成功案例。迄今为止， 干性黄斑变性的治疗尚未通过 FDA 的批准， 而营养干预被用来预 防湿性黄斑变性的进程。此外， 湿性黄斑变性的治疗只限于玻璃体内注射抗血管生成性质 的化合物。
因此， 需要用于预防、 治疗或改善黄斑变性的方法。
本文引用的任何参考文献不应解释为承认这类参考文献可作为本申请的 “现有技 术” 而获得。
发明概述
本文提供之前未知晓的用于预防、 治疗或改善各种形式的黄斑变性的方法以及之 前未知晓的用于治疗脉络膜新血管形成的方法， 该方法进而用于治疗黄斑变性。
从广义上讲， 本发明提供用于治疗、 预防或改善患者的脉络膜新血管形成的方法， 所述方法包括给予患者有效量的调节患者免疫系统的化合物， 其中免疫系统具有 I 型免疫 应答和 II 型免疫应答， 使得与给予化合物前患者的 I 型免疫应答相比， 给予患者化合物将 提高患者的 I 型免疫应答。
本发明还提供用于治疗、 改善或预防患者的黄斑变性的方法， 所述方法包括给予 患者有效量的调节患者免疫系统的化合物， 其中免疫系统具有 I 型免疫应答和 II 型免疫应 答， 使得与给予化合物前患者的 I 型免疫应答相比， 给予患者化合物将提高患者的 I 型免疫 应答。
另外， 本发明提供用于治疗、 预防或改善患者的黄斑变性的方法， 所述方法包括给 予患者有效量的调节患者免疫系统的化合物， 其中免疫系统具有 I 型免疫应答和 II 型免疫 应答， 使得与给予化合物前患者的 I 型免疫应答相比， 给予患者化合物将提高患者的 I 型免 疫应答。
本发明还提供治疗或改善免疫系统为具有 I 型免疫应答和 II 型免疫应答的患者 的黄斑变性的方法， 所述方法包括给予患者有效量的调节患者的免疫细胞活性的化合物， 其中所述免疫细胞包括天然杀伤细胞 (NK 细胞 )、 天然杀伤 T 细胞 (NKT 细胞 )、 肥大细胞、 树突细胞、 选自嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞的粒细胞或其任何组合， 与给 予化合物前患者的 I 型免疫应答相比， 所述方法提高患者的 I 型免疫应答， 并且 I 型应答的 提高治疗、 改善或预防患者的脉络膜新血管形成。
在另一个实施方案中， 本发明提供治疗或改善免疫系统为具有 I 型免疫应答和 II 型免疫应答的患者的湿性黄斑变性的方法， 所述方法包括给予患者有效量的调节患者的免 疫细胞活性的化合物， 其中免疫细胞包括天然杀伤细胞 (NK 细胞 )、 天然杀伤 T 细胞 (NKT 细 胞 )、 肥大细胞、 树突细胞、 选自嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞的粒细胞或其 任何组合， 使得与给予化合物之前的患者的 I 型免疫应答相比， 患者的 I 型免疫应答提高， 并且 I 型应答的提高治疗、 改善或预防患者的脉络膜新血管形成， 其中所述化合物选自 ：
(a) 磷酸一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 ]-2， 嗪 -4- 基甲基 } 酯乙酸盐2- 二甲基 -3- 氧代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4]
(b)2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇
(c)2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺(d)2-(3-{6-[2-(2， 4- 二 氯 - 苯 基 )- 乙 氨 基 ]-2- 甲 氧 基 - 嘧 啶 -4- 基 }- 苯 基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐
(e)2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 -)-1， 2， 4-二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺
(f)4- 甲基 -2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 (5- 氟 -3- 甲基 - 吲哚 -1- 基 )- 酰胺
2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 -)-1， 2， 4-二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺公开于 2009 年 10 月 8 日申请的美国临时申请 61/249,963， 通过引用 全部结合到本文中。另外， 其它 2-(3- 氟 - 苯基 )-4 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺 公开于已公布的 PCT 申请 WO2009/114373， 通过引用全部结合到本文中。
本发明另还提供预防或改善免疫系统为具有 I 型免疫应答和 II 型免疫应答的患者的黄斑变性的方法， 所述方法包括给予患者有效量的调节患者的免疫细胞活性的化合 物， 其中免疫细胞包括天然杀伤细胞 (NK 细胞 )、 天然杀伤 T 细胞 (NKT 细胞 )、 肥大细胞、 树 突细胞、 选自嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞的粒细胞或其任何组合， 使得与 给予化合物之前的患者的 I 型免疫应答相比， 患者的 I 型免疫应答提高， 并且 I 型应答的提 高改善或预防患者的脉络膜新血管形成， 其中所述化合物选自 ：
(a) 磷酸一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 ]-2， 2- 二甲基 -3- 氧代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4]
嗪 -4- 基甲基 } 酯乙酸盐 ；(b)2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇 ；
(c)2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺 ；
(d)2-(3-{6-[2-(2， 4- 二 氯 - 苯 基 )- 乙 氨 基 ]-2- 甲 氧 基 - 嘧 啶 -4- 基 }- 苯 基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐 ；
(e)2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 -)-1， 2， 4-二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺 ； 和
(f)4- 甲基 -2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 (5- 氟 -3- 甲基 - 吲哚 -1- 基 )- 酰 胺。 无疑， 本发明的方法容易应用于治疗任何类型的黄斑变性， 包括但绝不限于干性 黄斑变性、 湿性黄斑变性和年龄相关性黄斑变性。
此外， 多种类型的化合物已用于本发明的方法。容易用于本发明方法的这些类型 的实例为例如 (a)syk 多激酶抑制剂、 hPGDS 抑制剂和 DP 拮抗剂。
PCT 公布的专利申请 WO 2003035065 中明确阐述了用于本发明方法的 syk 多激 酶抑制剂， 所述专利申请通过全部引用结合到本文中。用于本发明方法的 syk 多激酶抑制 剂的具体实例为例如磷酸一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨
基 ]-2， 2- 二甲基 -3- 氧代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4]嗪 -4- 基甲基 } 酯乙酸盐和 2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇。用于本发明方法 的 syk 多激酶抑制剂的其它实例阐述于美国专利 7,449,458， 所述专利通过引用全部结合 到本文中。
hPGDS 抑制剂也容易应用于本发明的方法。用于本文的具体 hPGDS 抑制剂为例如 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺、 2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲 酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 -)-1， 2， 4二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺和 4- 甲基 -2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 (5- 氟 -3- 甲基 - 吲哚 -1- 基 )- 酰胺。此外， 容易用于本发明的 另外的 hPGDS 抑制剂公开于美国专利申请 12/062,641 和 12/570,355， 所述申请通过引用全 部结合到本文中。
此外， DP 拮抗剂例如 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧 啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐， 也容易应用于本发明的方法。
此外， 在本发明的方法中， 将本文所述的化合物给予患有黄斑变性的患者调节患 者的免疫细胞的活性。在本发明的方法中可以调节多种类型的免疫细胞的活性。这类免疫 细胞的实例包括天然杀伤细胞 (NK 细胞 )、 天然杀伤 T 细胞 (NKT 细胞 )、 肥大细胞、 树突细 胞和选自嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞的粒细胞。 无疑， 在本发明的方法中 可调节这些细胞的组合的活性。此外， 本发明的方法还可用于治疗或改善脉络膜新血管形成， 这进而也治疗或改 善患者的湿性黄斑变性。
参照下面的附图和发明详述可更好地理解本发明方法的各个方面。
附图简述
图 1 图示与溶媒治疗的相比时， 用化合物治疗时脉络膜新血管斑块厚度减小且面 积缩小。 “化合物 I” 为 2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇。 “化合物 II” 为 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺。
图 2 图示与溶媒治疗的相比时， 用化合物治疗时脉络膜新血管斑块厚度减小且面 积缩小。 “化合物 I” 为 2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇。 “化合物 III” 为磷酸一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 ]-2， 2- 二甲基 -3- 氧代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4] 嗪 -4- 基甲基 } 酯乙酸盐。 “化合物 IV” 为 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲 基 - 丙酸磷酸盐。
图 3 图示与溶媒治疗的相比时， 用化合物治疗时脉络膜新血管斑块的面积和体 积减小。对于本图， “化合物 I” 为 2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯 基 ]- 丙 -2- 醇 ； “化合物 III” 为磷酸一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧 啶 -4- 基氨基 ]-2， 2- 二甲基 -3- 氧代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4] 嗪 -4- 基甲 基 } 酯乙酸盐 ； “化合物 IV” 为 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧 啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐。 图 4 图示在大鼠激光诱发性黄斑变性模型中 DP 拮抗剂 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二 氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐 ( 对于本图 为 “化合物 V” ) 对脉络膜新血管形成的斑块体积的作用的分析结果。吲哚美辛用作阳性对 照。
图 5 图 示 在 大 鼠 激 光 诱 发 性 黄 斑 变 性 模 型 中 hPGDS 抑 制 剂 4- 甲 基 -2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧啶 - 甲酸 (5- 氟 -3- 甲基 - 吲哚 -1- 基 )- 酰胺 ( 对于本图为 “化合物 VI” ) 对脉络膜新血管形成的斑块体积的作用的分析结果。吲哚美辛用作阳性对照。
图 6A 图示 hPGDS 抑制剂 2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙
基 )-1， 2， 4-二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺 ( 对于本图为 “化合物 VII” ) 对大鼠激光诱发性脉 二唑 -3- 基 ]- 苄基络膜新血管形成的作用的结果 ： 第一剂量反应研究。在第 1-7 天， 每天两次口服给予 2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 )-1， 2， 4酰胺。多西环素用作阳性对昭
图 6B 图示 hPGDS 抑制剂 2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙 基 )-1， 2， 4二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺 ( 对于本图为 “化合物 VII” ) 对大鼠激光诱发性脉 二唑 -3- 基 ]- 苄基 络膜新血管形成的作用的结果 ： 第二剂量反应研究。在第 1-7 天， 每天两次口服给予 2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 )-1， 2， 4酰胺。CELEBREX 用作阳性对照。
图 6C 图 示 hPGDS 抑 制 剂 2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧 啶 -5- 甲 酸 3-[5-(1- 羟 基 -1- 甲 基 - 乙基 )-1， 2， 4二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺 ( 对于本图为 “化合物 VII” ) 对大鼠脉络膜13新血管形成的作用的结果 ： 一天一次给药。 在本实验中， Brown Norway 大鼠在第 0 天接受激102316868 A CN 102316873说明书6/20 页光凝固， 在第 1-7 天， 每天一次 (q.d.) 或每天两次 (b.i.d.) 口服给予 2- 吡啶 -2- 基 - 嘧 啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 )-1， 2， 4二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺。 CELEBREX 用作阳性对照
发明详述
本发明是基于新的和有用的发现， 即为了增强 I 型免疫应答， 在包括淋巴细胞、 巨 噬细胞、 单核细胞、 NK 细胞、 NKT 细胞、 肥大细胞和树突细胞在内的这些细胞类型的活性从 先天免疫应答转变成适应性免疫应答期间， 改变或调节参与支配免疫应答是偏向 I 型免疫 应答还是偏向 II 型免疫应答的免疫细胞， 将会调节脉络膜新血管形成 (CNV) 这种湿性形式 的年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的标志的发生和发展。因此给予调节免疫细胞活性的化合物 从而提高 I 型免疫应答的活性可容易地用于治疗黄斑变性的方法。
因此广义上看， 本发明提供用于预防、 治疗或改善患者的脉络膜新血管形成的方 法， 所述方法包括给予患者有效量的调节患者免疫系统的化合物， 其中免疫系统具有 I 型 免疫应答和 II 型免疫应答， 使得与给予化合物前患者的 I 型免疫应答相比， 给予患者化合 物将提高患者的 I 型免疫应答。
此外， 本发明提供用于治疗、 改善或预防患者的黄斑变性的方法， 所述方法包括给 予患者有效量的调节患者免疫系统的化合物， 其中免疫系统具有 I 型免疫应答和 II 型免疫 应答， 使得与给予化合物前患者的 I 型免疫应答相比， 给予患者化合物将提高患者的 I 型免 疫应答。
本说明书和随附的权利要求书全文中使用的各种术语和短语的定义如下。
本文使用的术语 “免疫系统” 是指例如在脊椎动物中参与引起生理后果 ( 例如炎 症 ) 的免疫细胞的直接或间接作用的系统。
本文使用的术语 “I 型免疫应答” 是指这样免疫应答， 即优先激活 T 淋巴细胞的 Th1 和 Tc1 应答及特征是释放促炎介质的巨噬细胞的典型活化 ( 称为 M1 活化 )， 以及与体液免 疫应答相反， 使免疫应答偏向更多细胞介导的免疫应答。
本文使用的术语 “II 型免疫应答” 是指这样的免疫应答， 即优先激活 T 淋巴细胞 的 Th2 和 Tc2 应答及作为促血管生成、 伤口愈合或其它修复导向性结果的巨噬细胞的替代 性活化 ( 称为 M2 活化 ) 以及产生抗体。
本文使用的短语 “与给予化合物之前患者的 I 型应答相比提高 I 型应答” 是指提 高免疫应答， 提高 IFNγ、 IL-12、 IL-23、 TNFα、 IL-1β、 CCL9、 CCL10、 CCL11 等促炎介质的 释放和减少诸如 IL-10、 CCL19、 CCL21 等介质的释放。 本文使用的术语 “免疫细胞” 是指作为免疫系统的组成部分且来源于造血细胞谱 系的细胞。这些细胞对 I 型免疫应答产生影响。
本文使用的术语 “syk 多激酶抑制剂” 是指通过同时抑制 syk 激酶以及若干其它激 酶而具有治疗效果的化合物 ； 所述化合物不是特异性抑制作为分子靶标的唯一一种激酶， 而是主要抑制 syk 激酶连同其它激酶。
本文使用的术语 “hPGDS 抑制剂” 是指抑制造血型前列腺素 D2 合酶的功能的化合 物。该合酶催化 PGH2 转化为 PGD2， PGD2 进而从被认为是变态反应和炎症反应的介质的肥大 细胞中释放出来。
本文使用的术语 “DP 拮抗剂” 是指抑制前列腺素 D2、 DP1 或 DP 的受体的功能的化
合物。 本文使用的术语 “脉络膜新血管形成” 是指不完全的新血管系统形成， 自突出到脉 胳膜基底层 (Bruch’ s membrane) 与视网膜色素上皮 (RPE) 细胞之间的视网膜下空间的脉 络膜区室开始。
本文使用的术语 “有效量” 是指足够减轻宿主黄斑变性症状或体症的临床明显缺 陷至少约 15％、 优选至少 50％、 更优选至少 90％、 最优选防止宿主黄斑变性症状或体症的 临床明显缺陷的量。或者， 有效量足以引起患者的临床显著病况 ( 即黄斑变性 ) 的改善。
本文使用的不定冠词是指一或更多。
本文使用的 “患者” 是指按照本发明的方法进行治疗的受治疗者。无疑， 患者可以 是人、 灵长类动物、 犬、 猫、 牛、 马、 鼠等。
如上所述， 本发明涉及治疗、 预防或改善黄斑变性的方法， 其中将化合物给予患有 黄斑变性的患者。在一个具体的实施方案中， 化合物是给予患者的药物组合物的组分。这 类药物组合物可用于注射给药， 或者用于口服、 经肺、 经鼻或其它给药形式。 一般而言， 本发 明所包括的是包含有效量的应用于本发明方法中的化合物与药学上可接受的稀释剂、 防腐 剂、 增溶剂、 乳化剂、 辅助剂和 / 或载体的药物组合物。 这类组合物包括各种缓冲成分 ( 例如 Tris-HCl、 乙酸盐、 磷酸盐 )、 pH 和离子强度的稀释剂 ； 添加剂， 例如去污剂和增溶剂 ( 例如 吐温 80、 聚山梨酯 80)、 抗氧化剂 ( 例如抗坏血酸、 焦亚硫酸钠 )、 防腐剂 ( 例如 Thimersol、 苯甲醇 ) 和填充物质 ( 例如乳糖、 甘露醇 ) ； 将原料掺入聚合物 ( 例如聚乳酸、 聚乙醇酸 等 ) 的颗粒制剂或掺入脂质体中。还可使用透明质酸。这类组合物可影响应用于本发明方 法的化合物的物理状态、 稳定性、 体内释放速率和体内清除速率。参见例如 Remington′ s Pharmaceutical Sciences， 第 18 版 (1990， Mack Publishing Co.， Easton， PA 18042)， 第
1435-1712 页， 该文献通过引用结合到本文中。 组合物可制成液体形式， 或者可呈干粉， 例如 冻干形式。
口服递送
用 于 本 文 的 包 括 口 服 固 体 剂 型， 一 般 可 参 见 Remington ′ s Pharmaceutical Sciences， 第 18 版， 1990(Mack Publishing Co.Easton PA 18042)， 第 89 章， 该文献通过引 用结合到本文中。固体剂型包括片剂、 胶囊剂、 丸剂、 锭剂或糖锭剂、 扁囊剂或小丸剂。同 样， 可采用脂质体囊化或类蛋白质囊化配制应用于本发明方法中的化合物 ( 例如美国专利 第 4,925,673 号报告的类蛋白质微球 )。可采用脂质体囊化， 脂质体可用不同的聚合物衍 生化 ( 例如美国专利第 5,013,556 号 )。有关用于治疗药的可能的固体剂型的描述可参 见 Marshall， K. 载于 ： Modern Pharmaceutics， G.S.Banker 和 C.T.Rhodes 主编， 第 10 章， 1979。一般而言， 制剂可包括应用于本发明方法的化合物和保护免受胃部环境影响并在肠 中释放化合物的惰性成分。
还特别包括应用于本发明方法中的化合物的口服剂型。此外， 最好该剂型的总体 稳定性提高， 从而延长化合物在机体内的循环时间。
释放部位可以是胃、 小肠 ( 十二指肠、 空肠或回肠 ) 或大肠。本领域技术人员可获 得在胃中不溶解， 但是仍将在十二指肠或肠的其它部位释放应用于本发明方法中的化合物 的制剂。优选这种释放将通过保护蛋白质或化合物在胃部环境以外 ( 例如在肠中 ) 释放， 来避免胃部环境的有害作用。为了确保充分耐受胃部环境， 需要在至少 pH 5.0 的环境下不被渗透的包衣材 料。最常见的用作肠溶包衣的惰性成分的实例为醋酸纤维素偏苯三酸酯 (CAT)、 羟丙基甲 基纤维素邻苯二甲酸酯 (HPMCP)、 HPMCP 50、 HPMCP 55、 聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯 (PVAP)、 Eudragit L30D、 AQUATERIC、 醋酸邻苯二甲酸纤维素 (CAP)、 EUDRAGIT L、 EUDRAGIT S 和虫 胶。这些包衣材料可用作混合薄膜。
包衣材料或包衣材料的混合物还可用于并非为了免受胃部作用的片剂中。 这可包 括糖衣或使片剂更易于吞咽的包衣材料。胶囊剂可由用于递送无水药物 ( 即粉剂 ) 的硬质 外壳 ( 例如明胶 ) 组成 ； 对于液体形式， 可使用软质明胶外壳。扁囊剂的外壳材料可为黏稠 淀粉或其它可食性纸。对于丸剂、 糖锭剂、 模制片或模印片 (tablet triturate)， 可采用湿 法成块技术 (moist massing technique)。
应用于本发明方法中的化合物还可包括在粒径约为 1mm 的颗粒剂或小丸剂形式 的微细多颗粒的制剂中。 用于胶囊给药的化合物的制剂还可为粉剂、 轻轻压缩的栓塞， 甚至 为片剂。治疗药可通过压缩制备。此外， 化合物可呈晶体或非晶体形式。
着色剂和矫味剂也都包括在内。例如， 可配制化合物 ( 例如通过脂质体囊化或微 球囊化 )， 然后进一步包含在食用产品 ( 例如含有着色剂和调味剂的冷冻饮料 ) 中。 可以用惰性材料稀释或增加化合物的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物， 尤其 是甘露醇、 α- 乳糖、 无水乳糖、 纤维素、 蔗糖、 改性葡聚糖和淀粉。 某些无机盐也可用作填充 剂， 包括三磷酸钙、 碳酸镁和氯化钠。一些市售可获得的稀释剂为 Fast-Flo、 Emdex、 STA-Rx 1500、 Emcompress 和 Avicell。
可将崩解剂包括在应用于本发明方法中的化合物的制剂中成为固体剂型。 用作崩 解剂的材料包括但不限于淀粉， 包括市售基于淀粉的崩解剂 Explotab。还可使用羟基乙酸 淀粉钠、 Amberlite、 羧甲基纤维素钠、 超微支链淀粉 (ultramylopectin)、 藻酸钠、 明胶、 橙 皮、 酸性羧甲基纤维素、 天然海绵和皂土。崩解剂的另一种形式是不溶性阳离子交换树脂。 粉状树胶可用作崩解剂和粘合剂， 且这些可包括诸如琼脂、 刺梧桐树胶或西黄蓍胶等粉状 树胶。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
可以使用粘合剂将含有应用于本发明方法中的化合物的药物组合物保持在一起 形成硬质片剂， 并包括来自天然产物的材料， 例如阿拉伯树胶、 西黄蓍胶、 淀粉和明胶。 其它 粘合剂包括甲基纤维素 (MC)、 乙基纤维素 (EC) 和羧甲基纤维素 (CMC)。聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 和羟丙基甲基纤维素 (HPMC) 均可用于醇溶液中以制成颗粒药物。
抗磨剂也可包括在应用于本发明方法中的化合物的制剂中以防止在配制期间粘 结。润滑剂可用作化合物与模壁之间的层， 这些可包括但不限于硬脂酸 ( 包括其镁盐和钙 盐 )、 聚四氟乙烯 (PTFE)、 液状石蜡、 植物油和蜡。还可使用可溶性润滑剂， 例如十二烷基硫 酸钠、 十二烷基硫酸镁、 各种分子量的聚乙二醇、 Carbowax 4000 和 6000。
可以加入在配制期间改进化合物的流动特性并且在压制期间有助于重新配置的 助流剂。这类助流剂可包括例如淀粉、 滑石粉、 热解硅石和水合硅铝酸盐。
为了有助于将应用于本发明方法中的化合物溶于水性环境， 可加入作为润湿剂的 表面活性剂。 表面活性剂可包括阴离子去污剂， 例如十二烷基硫酸钠、 多库酯钠和二辛基磺 酸钠。可以使用阳离子去污剂， 阳离子去污剂可包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可作为表面活 性剂包括在制剂中的可能的非离子去污剂为聚桂醇 400、 硬脂酸聚烃氧 (40) 酯、 聚氧乙烯
氢化蓖麻油 10、 50 和 60、 甘油单硬脂酸酯、 聚山梨酯 40、 60、 65 和 80、 蔗糖脂肪酸酯、 甲基纤 维素和羧甲基纤维素。 这些表面活性剂可单独或作为这类化合物的混合物存在于应用于本 发明方法中的化合物的制剂中。
可能促进应用于本发明方法中的化合物吸收的添加剂为例如油酸、 亚油酸和亚麻 酸等脂肪酸。
可取的是控释口服制剂。 可将应用于本发明方法中的化合物掺入允许通过扩散或 沥滤机制释放的惰性基质 ( 例如树胶 ) 中。还可将缓慢变性基质掺入制剂中。一些肠溶包 衣也具有延时释放的效果。
应用于本发明方法中的化合物的另一种控释形式是通过以 Oros 治疗系统 (Alza Corp.) 为基础的方法， 即将化合物封入半透性膜中， 该膜由于渗透作用允许水经单个小孔 进入并将化合物排除。
其它包衣材料可以用于制剂。这些包括可用于包衣锅的各种糖。应用于本发明方 法中的化合物也可以薄膜衣片剂提供， 用于这种情况的材料被分成 2 组。第一组是非肠溶 材料， 包括甲基纤维素、 乙基纤维素、 羟乙基纤维素、 甲基羟乙基纤维素、 羟丙基纤维素、 羟 丙基甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠、 聚维酮和聚乙二醇。第二组由肠溶材料组成， 其通常为 苯二甲酸的酯。
可以使用混合材料以提供最适的薄膜包衣。薄膜包衣可在包衣锅或流化床中进 行， 或者通过压制包衣材料进行。
经肺递送。本文还包括经肺递送应用于本发明方法中的化合物。将化合物递送 至哺乳动物肺部， 同时吸入并透过肺上皮层直到血流。有关的其它报告包括 Adjei 等， 1990， Pharmaceutical Research， 7： 565-569 ； Adjei 等， 1990， International Journal of Pharmaceutics， 63 ： 135-144( 醋 酸 亮 丙 立 德 ) ； Braquet 等， 1989， Journal of Cardiovascular Pharmacology， 13( 增 刊 5) ： 143-146( 内 皮 素 -1) ； Hubbard 等， 1989， Annals of Internal Medicine， 第 III 卷， 第 206-212 页 (a1- 抗胰蛋白酶 ) ； Smith 等， 1989， J.Clin.Invest.84 ： 1145-1146(a-1- 蛋白酶 ) ； Oswein 等， 1990，″ Aerosolization of Proteins ″， Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II， Keystone， Colorado， March， ( 重 组 人 生 长 激 素 )； Debs 等， 1988， J.Immunol.140 ： 3482-3488( 干扰素 -g 和肿瘤坏死因子 α) 和 Platz 等， 美国专利第 5,284,656 号 ( 粒细胞 集落刺激因子 )。用于经肺递送药物实现全身作用的方法和组合物参见 1995 年 9 月 19 日 授予 Wong 等人专利权的美国专利第 5,451,569 号。
用于实施本发明的方法所包括的为多种机械装置， 被设计来用于经肺递送应用于 本发明方法中的化合物， 包括但不限于雾化器、 计量吸入器和粉末吸入器， 所有这些都为本 领域技术人员所掌握。
适 于 实 施 本 发 明 的 市 售 可 获 得 的 装 置 的 某 些 具 体 实 例 为 由 Mallinckrodt， Inc.， St.Louis， Missouri 制 造 的 ULTRAVENT 雾 化 器 ； 由 Marquest Medical Products， Englewood， Colorado 制造的 ACORN II 雾化器 ； 由 Glaxo Inc.， Research Triangle Park， North Carolina 制造的 VENTOLIN 计量吸入器 ； 由 Fisons Corp.， Bedford， Massachusetts 制造的 SPINHALER 粉末吸入器 ； 以及由 sanofi-aventis 制备的 ULTRAHALER 等等。
所有这类装置都需要使用适于分配应用于本发明方法中的化合物的制剂。通常，各种制剂对所采用的装置类型都是特定的， 除了治疗有益的常规稀释剂、 辅助剂和 / 或载 体以外， 还可包括合适推进材料的使用。 同样， 还包括使用脂质体、 微囊剂或微球剂、 包涵体 复合物或其它类型的载体。
适用于喷射式雾化器或超声波雾化器的制剂通常可包含溶于水的应用于本发明 方法中的化合物， 浓度为约 0.1-25mg 化合物 /mL 溶液。该制剂还可包括缓冲剂和单糖 ( 例 如用于稳定和调节渗透压 )。雾化器制剂还可含有表面活性剂以减少或防止由在形成气溶 胶时溶液雾化而引起的表面诱导的化合物聚集。
用于计量吸入器装置的制剂一般可包含微细粉剂， 该粉剂中含有应用于本发明方 法中的化合物， 其悬浮于表面活性剂辅助的抛射剂中。抛射剂可以是用于该目的的任何常 用的材料， 例如氯氟烃、 氢氯氟烷、 氢氟烷或烃， 包括三氯一氟甲烷、 二氯二氟甲烷、 二氯四 氟乙醇和 1， 1， 1， 2- 四氟乙烷或其组合。本文应用的其它抛射剂为具有通式 CxHyFz 的氢氟 烷烃， 其中 x 为 1-3 的整数， y+z ＝ 2x+2， y 和 z 两者至少为 1。应用于本文的具体的氢氟烷 烃为 CF3CFH2、 CH3CHF2 和 CF3CHFCF3。抛射混合物的蒸气压一般应在对于气雾剂抛射剂适合 和允许的范围内。可按适当比例将一种或多种氢氟烷烃和 / 或其它一些合适的蒸气压改性 剂混合以改变蒸气压。
合适的表面活性剂包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。 此外， 化合物可呈晶体或非晶体形式。
用于从粉末吸入器装置中分配的制剂可包含应用于本发明方法中的化合物的微 细干粉剂， 还可包括填充剂， 例如乳糖、 山梨醇、 蔗糖或甘露醇， 其量有利于使粉剂从装置中 分配出来， 例如占制剂重量的 50-90％。 应最有利地将化合物制备成平均粒径小于 10mm( 或 微米 )、 最优选 0.5-5mm 的颗粒形式， 以便最有效地递送至肺部远端。
经鼻递送。还包括经鼻递送应用于本发明方法中的化合物。经鼻递送允许在将治 疗药品给予鼻后， 药品无需在肺部沉积， 化合物便可直接通过进入血流。 经鼻递送的制剂包 括具有葡聚糖或环糊精 (cyclodextran) 的制剂。
经皮递送。本领域已知经皮给予药物的各种方法， 例如通过透皮贴剂。透皮贴剂 参见例如 1995 年 4 月 18 日授予 Rolando 等人专利权的美国专利第 5,407,713 号 ； 1004 年 10 月 4 日授予 Fallon 等人专利权的美国专利第 5,352,456 号 ； 1994 年 8 月 9 日授予 D′ Angelo 等人专利权的美国专利第 5,332,213 号 ； 1994 年 8 月 9 日授予 Sibalis 专利权 的美国专利第 5,336,168 号 ； 1994 年 3 月 1 日授予 Farhadieh 等人专利权的美国专利第 5,290,561 号 ； 1993 年 10 月 19 日授予 Tucker 等人专利权的美国专利第 5,254,346 号 ； 1992 年 11 月 17 授予 Berger 等人专利权的美国专利第 5,164,189 号 ； 1992 年 11 月 17 日授予 Sibalis 专利权的美国专利第 5,163,899 号 ； 1992 年 2 月 18 日授予 Sibalis 专利权的美国 专利第 5,088,977 和 5,087,240 号 ； 1991 年 4 月 16 日授予 Benecke 等人专利权的的美国 专利第 5,008,110 号 ； 以及 1990 年 5 月 1 日授予 Sibalis 专利权的美国专利第 4,921,475 号。
不难理解， 使用皮肤渗透促进剂有利于经皮给药途径， 例如美国专利第 5,164,189 号 ( 同上 )、 美国专利第 5,008,110 号 ( 同上 ) 和 1989 年 11 月 7 日授予 Aruga 等人专利 权的美国专利第 4,879,119 号中披露的促进剂， 各专利的内容均通过引用全部结合到本文 中。局部眼部递送
适于局部给药的组合物是本领域已知的(参见例如美国专利申请 2005/0059639)。在各种实施方案中， 应用于本发明方法中的化合物的组合物可包含在溶 液、 混悬液或两者中含有化合物的液体。本文使用的液体组合物包括凝胶。优选液体组合 物是含水的。或者， 组合物可呈软膏剂的形式。在一个优选的实施方案中， 组合物是原位可 胶凝含水组合物， 更优选原位可胶凝水溶液。 这类组合物可包含胶凝剂， 其浓度在与眼或眼 外泪液接触时有效地促进胶凝。本发明的含水组合物具有与眼相容的 pH 和重量摩尔渗透 压浓度。
应用于本发明方法中的化合物的局部应用 ( 滴入眼内 ) 可避免大部分的全身副作 用， 但对于疗效， 必需将一种或多种化合物以足够的水平通过角膜主动转运达到适当的接 受部位。
通常， 给予应用于本发明方法中的化合物包括用常规的药用载体 ( 例如卡波普 ) 制备软膏剂 ( 例如矿脂 ) 或凝胶剂， 并局部给予凝胶剂组合物。对于滴眼剂组合物， 组合物 中化合物的量应为约 0.25％重量 - 约 5％重量， 优选约 0.5％重量 - 约 2.0％重量。重点不 在于剂量， 而是量有效用于治疗、 预防或改善黄斑变性而又不至于太强以引起眼部刺激或 副作用。一般而言， 本文规定范围内的量是令人满意的。此外， 本领域普通技术人员可采用 常规实验室技术容易地确定适当的范围。
滴眼剂组合物的载体可以为缓冲至 pH 约 4- 约 8 的等渗眼用治疗载体， 通常可含 有少量的常用润湿剂和抗细菌剂。 优选的 pH 范围为约 6.8- 约 7.8， 并且含有足够的氯化钠 或等渗的等同物。所包括的抗细菌剂的范围占组合物的约 0.004％ (W/V)- 约 0.02％ (W/ V)。
可将应用于本发明方法中的化合物掺入各种眼用凝胶剂中以递送至眼部。 为了形 成无菌眼用软膏剂， 可将化合物与合适溶媒 ( 例如矿物油、 液体羊毛脂或白矿脂 ) 中的防腐 剂混合。可按照已公布的类似眼用制品的制剂， 将应用于本发明方法中的化合物悬浮于由 carbopol-940( 一种可获自 B.F.Goodrich Company 的羧基乙烯基聚合 ) 的混合制品制备的 亲水基料中， 制备无菌眼用凝胶剂。还可掺入防腐剂和张度剂。
筋膜下递送
还可采用筋膜下递送应用于本发明方法中的化合物来治疗、 预防或改善黄斑变 性。 这类递送的一个具体实例参见美国专利 6,413,245， 该专利公开了将药剂递送至人眼的 方法和装置。该方法包括将所述装置在眼缘后某一点上插入眼球筋膜下和巩膜上的步骤， 并在巩膜外表面上注射药剂形成贮药库。 该装置包括套管， 套管具有远侧部、 近侧部及将远 侧部与近侧部分隔开的曲部。远侧部的曲率半径大致等于眼球的曲率半径。远侧部在曲部 上相对于近侧部的正切的角度往往不大于约 56 度。本领域已知的其它筋膜下递送方法和 装置也容易应用用本文中。
玻璃体内递送
组合物可包含用于结膜下给药的眼用贮库制剂， 其含有应用于本发明方法中的化 合物。可将包含化合物的微粒包埋在生物相容性的药学上可接受的聚合物或脂质包胶剂 中。贮库制剂可适于在一段长的时间内释放全部或几乎全部化合物。聚合物或脂质基质如 果存在的话， 可适于充分降解， 以便在全部或几乎全部化合物释放后从给药部位转运。 贮库制剂可以为液体制剂， 包含药学上可接受的聚合物和已溶解或已分散的活性剂。 注射时， 聚 合物通过例如胶凝或沉淀在注射部位形成药库。组合物可包含可插入眼内合适位置 ( 例如 眼与眼睑之间或在结膜囊中 ) 的固体制品， 该制品在该位置上释放出化合物。适于以这类 方式植入眼内的固体部件一般包含聚合物， 并且可是生物蚀解的或非生物蚀解的。
治疗方法、 药物制备方法
如上所述， 本发明提供用于治疗、 预防或改善黄斑变性的方法。
剂量。在本发明的方法中， 正如所进行的进一步研究一样， 信息将揭示有关预防、 治疗、 预防或改善各种患者的黄斑变性的剂量水平， 并且考虑治疗背景、 患者的年龄和一般 健康状况， 普通技术人员仅仅采用常规实验室技术便能够确定适当的剂量。
与其它化合物一起给予。 无疑， 应用于本发明方法的治疗、 预防或改善黄斑变性的 化合物可与一种或多种用于治疗可能与黄斑变性有关的其它临床症状 ( 例如脉络膜血管 生成 ) 的药物组合物共同给予。用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性的抗血管生成药 ( 例如 LUCENTIS 和 AVASTIN) 可与应用于本发明方法中的化合物联用， 使得可以延长 LUCENTIS 或 AVASTIN 的玻璃体内的注射间隔。
参照以本发明的实例提供的下列非限制性实施例， 可更好地理解本发明。提供下 列实施例， 以便更全面地说明本发明的优选实施方案。 然而， 不得以任何方式将实施例解释 为限制本发明的大的范围。
实施例 1
50 只雄性 Brown Norway( 品系 BN/RijHsd) 大鼠 ( 褐家鼠 (Rattus norvegicus))， 4-7 周龄 ( 各为 50-124g)， 购自 Harlan(Indianapolis， IN)， 接收时状态良好。对动物进行 检疫， 并适应新环境三 (3) 天。在检疫期间， 至少一天一次观察动物临床体症的异常。任意 将 50 只动物分派到研究组， 并指定永久标识号。
当分派到研究组时， 给每只动物称重， 并用不褪色墨水， 以唯一永久标识号在尾部 打上标记。在整个生命期内都摆放显示动物永久标识号和研究号的笼子标记卡。
动物管理
设置控制装置以保持动物室的温度和相对湿度分别为 64-79 ℉和 30-70％。每天 监测并记录这些环境参数。在动物室内提供 12 小时光期和 12 小时暗期。采用荧光灯源， 每天 0700 时左右开灯， 1900 时左右关灯。在整个适应期和生命期内任意喂食 LABDIET 5001 啮齿动物日粮 (Purina Mills， Inc.， St.Louis， MO)。 由测试设备 (Testing Facility) 保持批号记录和分析证明。 没有已知的合理预计存在于日粮中的已知能够干扰研究目的或 研究实施的污染物。通过托架给水系统向动物任意提供来自城市给水的淡水。定期监测给 水中的氯含量和细菌污染。单独或相容成对地将动物关养在啮齿动物专用室内的塑料 “鞋 柜” 笼中。动物关养与管理的一般程序按照 Testing Facility SOP 进行， 并符合有关研究 动物利用的所有规程， 包括补充动物福利法 (Animal Welfare Act)(21 USC 2131 以及下列 等 ) 的美国农业部法规 (9CFR 第 1 章 ) 和实验动物管理和使用全国研究理事会指引的建 议 (National Research Council’ s Guide for Care and Use of Laboratory Animals) (National Academy Press， 1996)。
激光手术
按照公共机构动物管理与使用委员会 (Institutional Animal Care and UseCommittee) 批准的研究计划进行研究。
采用具有附属 Kowa PortSlit， SC14 ； Keeler Fison 间接眼检镜 ( 透镜 30 屈光度 ) 的视网膜激光装置对视网膜 ( 每只大鼠的双眼 ) 发射激光。使大鼠短暂麻醉， 把眼睛张开， 需要时用盖玻片把角膜压平。各视网膜用 186mW 发射激光， 光点尺寸为 75μm， 持续时间为 0.1 秒钟， 在 ( 约 )9、 12 和 3 时的位置上实施， 外科医生根据可行性确定每只眼的视神经圆 盘直径为 2-3。通过在光凝固的部位直接发生的气泡形成鉴定脉胳膜基底层的破裂。使大 鼠短暂麻醉， 给予荧光素 (fluoroscein) 以观察手术后和尸检前的视网膜血管系统。使用 用于啮齿动物的 Kowa 视网膜照相机拍摄视网膜的代表性照片。在紧接激光手术后且临尸 检前拍摄照片以确保存在血管损伤。
给药剂量
研 究 期 间 一 周 两 次 在 溶 媒 中 配 制 2-[4-(7- 乙 基 -5H- 吡 咯 并 [2， 3-b] 吡 嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇 A 和 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基 酰胺。 溶媒由 0.5％甲基纤维素、 0.2％吐温 20 的无菌水溶液组成用于注射， 一周配制一次。 将 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺试验品以 0.6、 2 和 6mg/mL 在 溶媒中复溶 ； 将 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺对照品以 2mg/ mL 复溶。在每次给药间隔期间将全部溶液冷冻保存于 2-8℃， 在每次给予剂量前混匀。
以 5mL/kg 经一天两次口管饲法给予动物， 临照射激光前开始， 并继续 14 天。每周 根据最新体重重新计算剂量体积。注意在前后两天内给动物照射激光， 但是在一天内一起 处死以利于尸体解剖处理。因此， 第一组群 (1-3 组 ) 的动物在第 14 天上午接受额外 ( 第 29 次 ) 剂量， 以便在给予最终剂量 2-4 小时内进行最终的放血和处死。
临床观察
每天记录各动物在整个生命期 ( 检疫 / 适应和治疗 ) 的临床观察结果， 包括发病 率、 死亡率和毒性作用或药理作用的明显体症。记录临床异常的任何及全部体症。
体重
在给药前、 在一周时以及尸体解剖时记录体重。
眼底照相术
在第 0 天、 在照射激光时或照射后不久、 在第 13 或 14 天、 在处死前对眼底拍照。 在 每个时间点上， 在拍照前几分钟， 给每只动物静脉内 (IV) 注射 0.1mL 10％的荧光素染料溶 液， 使视网膜血管系统显现。每只眼用散瞳药扩瞳后， 用 Kowa 小动物眼底照相机拍照。眼 底照相术的目的是证实在照射激光后以及在尸检前存在损伤。 从研究中剔除任何不存在损 伤的动物并更换。
尸体解剖
在眼底照相术后以及最终放血后， 动物用 SOP 处死。将每只动物右眼收集到 10％ NBF 中， 左眼收集到冷冻 OCT 盒 (frozen OCT block) 中。
组织病理学
在处理用于组织病理学分析的 NBF 固定的右眼后， 如下进行切片 ： 将每只固定眼 按矢状定向， 然后通过包括视网膜 - 视神经区在内的眼中心部分， 切取 10-15 片逐层切片。 由于可将 4-6 片切片放在一片载玻片上， 因此每眼通常有 4-5 片载玻片。查找至少一个损 伤， 优选两个或更多个损伤。直观、 定量和半定量地对载玻片进行评价。统计视网膜上生长的新血管的核。评 价通常包括 4-6 片代表性视网膜切片的大约 6 高倍视野的计数。将数据录入电子数据表， 应用 Excel (Office 2000 ； Microsoft， Redmond， WA) 计算平均值和标准差。
将剩余眼 ( 左眼 ) 冷冻保存以备免疫组织化学评价免疫细胞浸润。
统计分析
应用 Excel 的单因素方差分析 (ANOVA) 函数 (OFFICE 2000 ； Microsoft， Redmond， WA) 分析体重。P 值≤ 0.05 被视为有统计显著性。
实施例 2
测试系统
35 只雄性和 35 只雌性 Brown Norway 大鼠 ( 褐家鼠 ； 品系 BN/MCW)， 6-7 周龄， 购自 Charles River Laboratories(Portage， MI)。使动物适应七 (7) 天。在适应期间， 至少一 天一次观察动物临床体症的异常， 动物临床表现正常， 便放出用于研究。给全部 70 只动物 称重， 将 30 只雄性和 30 只雌性随机分派到研究组， 并指定永久标识号。在分派研究组时， 给每只动物称重， 并用不褪色墨水， 以唯一永久标识号在尾部打上标记。 在整个生命期内都 摆放显示动物永久标识号和研究号的笼子标记卡。 动物管理
设置控制装置以保持动物室的温度和相对湿度分别为 64-79 ℉和 30-70％。每天 监测并记录这些环境参数。 在动物室内提供 12 小时光期和 12 小时暗期。 采用荧光灯源， 每 天 0700 时左右开灯， 1900 时左右关灯。在整个适应期和生命期任意喂食 LABDIET 5001 啮 齿动物日粮 (Purina Mills， Inc.， St.Louis， MO)。由测试设备保持批号记录和分析证明。 没有已知的合理预计存在于日粮中已知能够干扰研究目的或研究实施的污染物。 通过托架 给水系统向动物任意提供来自城市给水的淡水。定期监测给水的氯含量和细菌污染。单独 或相容成对地将动物关养在啮齿动物专用室内的塑料 “鞋柜” 笼中。动物关养与管理的一 般程序按照 Testing Facility SOP 进行， 并符合有关研究动物利用的所有规程， 包括补充 动物福利法 (21 USC 2131 以及下列等 ) 的美国农业部法规 (9CFR 第 1 章 ) 和实验动物管 理和使用全国研究理事会指引的建议 (National Academy Press， 1996)。
激光手术和眼科分析
按照公共机构动物管理与使用委员会批准的研究计划进行研究。
采用改进的裂隙灯激光传输系统， 对双眼视网膜进行了激光手术。采用 IRIDEX Diovet 二极管激光器， 发射 810nm 波长的光。170mW 激光传送至 75um 光点达 0.075 秒钟。 将 3 个激光损伤靶定在约 9、 12 和 3 时的位置上， 每只眼视的神经圆盘直径为 2-3。使激光 条件最优化以在脉胳膜基底层上产生表示膜破裂的强烈气泡。 外科医生按需要使用盖玻片 压平角膜以助于对准 / 瞄准激光。
临手术前 ( 第 1 天 ) 和尸检前 ( 第 13 天 )， 通过肌内注射 0.15mL/ 大鼠的氯胺酮 / 赛拉嗪混合物使大鼠短暂麻醉。这个剂量水平相当于约 60mg/kg 氯胺酮和约 8mg/kg 赛 拉嗪的剂量， 给予约 30 分钟的麻醉， 进行发射激光及手术后拍照 ( 第 1 天 ) 以及最终拍照 ( 在尸体解剖时 )。在这两天内， 临拍照前静脉内给予荧光素 (0.1mL 的 10％溶液 )， 以供观 察视网膜血管系统。采用 Kowa 小动物眼底照相机拍摄视网膜的代表性照片。拍摄照片以 确保在紧接激光手术后和临尸检前存在血管损伤， 以供评价激光手术后 14 天的病灶大小。
如果任何动物第 1 天未出现激光后损伤， 则从研究中剔除并更换。在该研究中， 无出于此原 因的更换。
化合物制备
将 2-[4-(7- 乙 基 -5H- 吡 咯 并 [2， 3-b] 吡 嗪 -6- 基 )- 苯 基 ]- 丙 -2- 醇、 磷酸 一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨基 ]-2， 2- 二甲基 -3- 氧 代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4] 嗪 -4- 基甲基 } 酯乙酸盐和 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二 氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐分别重新悬 浮于由 0.5％甲基纤维素、 0.2％吐温 20 的无菌水溶液组成的溶媒中。由下列组分配制溶 媒： 甲基纤维素 ： SpectrumChemical Mfg.Corp. 目录 ME136( 批次 NI0534 ； 有效期至 2008 年 12 月 ) ； 吐温 20 ： Sigma-Aldrich(St.Louis， MO) 目录 X251-07( 批次 X22H09 ； 有效期至 2010 年 12 月 ) ； 以及注射用无菌水 USP 级。将各组分保存在受控室温下 ； 将下列制剂 ( 一 次， 在研究开始时 )、 溶媒冷冻保存于 2-8℃。
给药剂量
在第 0 天制备一批溶媒 (0.5％甲基纤维素、 0.2％吐温 20 的无菌水溶液 )， 用于所 有随后的试验品制剂。在整个研究中， 将溶媒冷冻保存于 2-8℃下。每个研究日中， 每天两 上午一次， 下午一次， 给药间隔约 6 小时。 次给予动物，
临床观察
至少一天一次记录每个动物在整个生命期 ( 检疫 / 适应和治疗 ) 内的临床观察结 果， 包括发病率、 死亡率和毒性作用或药理作用的明显体症。 记录临床异常的任何和全部体 症。
体重
在给药前、 在一周时以及在尸体解剖时记录体重。
尸体解剖
对在研究期内死亡的动物进行肉眼尸检以确定可能的死因。 在眼底照相术和最终 采血后第 13 天处死其余 ( 存活的 ) 动物。将每只动物的右眼收集到改良的 Davidson 溶液 中 ( 用于组织病理学评价 )， 将左眼冷冻在 OCT 包埋化合物中 [ 用于可能的免疫组织化学检 查 (IHC)]。
组织病理学
在对用于组织病理学检查的改良的 Davidson 固定的右眼进行处理后， 如下进行 切片 ： 将每只固定的眼按矢状定向， 然后通过包括视网膜 - 视神经区在内的眼中心部分， 切 取片 10-15 片逐层切片。由于可将 4-6 片切片放在一片载玻片上， 因此每眼通常有能够使 病理学者观察每只动物至少两个损伤的 4-5 片载玻片。
用十字线目镜在 400x 放大倍数下以水平和横向定位测量损伤。选择三片切片用 于测量。选择估计最接近激光损伤部位的损伤和紧接这个部位前后的切片用于测量。将数 据录入 Excel 电子数据表。计算每组的平均宽度和长度与组平均值和标准差。以每只动物 每个部位的三角形计算每个损伤的面积。因为在主要损伤之上和之下进行了测量， 所以还 计算了体积估计值。
统计分析
应用 EXCEL 的单因素方差分析 (ANOVA) 函数 (OFFICE 2000 ； Microsoft， Redmond，WA) 分析了体重。P 值≤ 0.05 被视为有统计显著性。
实施例 3
在本实施例中， 大鼠激光诱发性黄斑变性模型中 DP 拮抗剂 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二 氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲基 - 丙酸磷酸盐 ( 化合物 ) 对脉络膜新血管形成的斑块体积的作用。与上述实施例一样， 在本实施例中采用褐色挪 威大鼠 ( 褐家鼠 )。大鼠在第 0 天接受激光凝固。大鼠 4-7 周龄 ( 每只 50-124g)， 购自 Harlan(Indianapolis， IN)， 收到时状态良好。对动物进行检疫并适应三 (3) 天。在第 1-14 天每天两次口服给予化合物。同样一天给予两次吲哚美辛 ( 阳性对照 )。在第 14 天处死大 鼠， 并在第 14 天测量脉络膜新血管 (CNV) 体积。
图 4 图示将化合物给予模拟黄斑变性的模型非常有效地限制脉络膜新血管形成 的体积。
实施例 4
在本实施例中， 用大鼠激光诱发性黄斑变性模型进行了相同的实验以确定 hPDGS 抑制剂 4- 甲基 -2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 (5- 氟 -3- 甲基 - 吲哚 -1- 基 )- 酰胺是否 可限制脉络膜新血管形成的斑块体积。
具体地讲， 在第 1 天至第 14 天每天两次口服给予大鼠 hPDGS 抑制剂 4- 甲基 -2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 (5- 氟 -3- 甲基 - 吲哚 -1- 基 )- 酰胺 ( 化合物 )。在第 0 天， 使 用激光在褐色挪威大鼠眼内诱发脉络膜新血管形成。同样将吲哚美辛给予对照组， 即从第 1 天到第 14 天每天两次给予。
14 天后处死大鼠， 测量眼中脉络膜新血管形成的斑块体积。 图 5 中所示结果表明， 与对照相比， 化合物的确在受试大鼠中有效限制脉络膜新血管形成的斑块体积。
图 5 图示将化合物给予模拟黄斑变性的模型非常有效地限制脉络膜新血管形成 的斑块体积。
实施例 5
在本实施例中， 采用大鼠激光诱发性黄斑变性模型， 评价了 hPGDS 拮抗剂 2- 吡 啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 )-1， 2， 4啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟基 -1- 甲基 - 乙基 )-1， 2， 4二唑 -3- 基 ]- 苄 基酰胺的作用。具体地讲， 在第 1 天至第 7 天每天两次口服给予大鼠 2- 吡啶 -2- 基 - 嘧 二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺。每天一 次口服给予阳性对照多西环素。在第 7 天测量脉络膜新血管 (CNV) 体积。
试验品
将化合物保存在受控室温下。 将化合物悬浮于溶媒 (0.5％甲基纤维素、 0.2％吐温 80) 中。
溶媒和阳性对照品
阴性对照品为试验品的溶媒， 由 0.5 ％甲基纤维素、 0.2 ％吐温 80 的蒸馏水溶 液组成。由以下组分配制溶媒 ： 甲基纤维素， Sigma Chemical.(St Louis， MO)， 目录号 M-0262( 批次 017k0087) ； 吐温 80， Acros Organics(Geel， Belgium)， 目录号 278632500( 批 次 A0265286) ； 以及去离子水 ( 内部 )， 将组分保存在受控室温下 ； 之前制剂、 溶媒于 2-8℃ 冷冻。使用 Retsch 混合磨 MM301 型 (Retsch Industries(Newtown， PA))， 用 2.0mm yttria stab zir oxide beads(Fox industries(Fairfield NJ)， 批次 #12974) 的以 15 次振动 /秒振荡 10 分钟， 将试验材料悬浮于溶媒中来制备试验品。将试验品保存在玻璃瓶中。对照 品为 Sigma-Aldrich 多西环素 (St Louis， MO， 目录号 D9891， 批次 18K0709)。将多西环素 (3mg/ml) 溶于与试验品相同的溶媒中 (0.5％甲基纤维素、 0.2％吐温 80)。在配制后， 将所 有试验材料保存在玻璃瓶中， 避光保护， 当不给药时便冷冻保存在 2-8℃下。将多西环素保 存在褐色玻璃瓶中。
试验系统
六 十 (60) 只 雄 性 BN 大 鼠 ( 褐 家 鼠 ； 品 系 Brown Norway) 约 8 周 龄， 购自 Harlan(Livermore， CA)。
动物的使用
本研究遵行 sanofi-aventis 集团对研究动物使用的政策。
接收与适应
接收六十只动物， 动物状态良好。使动物适应最少 5 天。在适应期， 观察动物临床 体征的任何异常。所有动物都处于良好状态。
剂量组群
向作为两个独立组群的动物给药并进行激光凝固。
鉴定
随机选择动物， 使用不褪色墨水， 以唯一的永久标识号在每只动物尾部打上标记。 在整个生命期内都摆放显示动物永久标识号和研究号的笼子标记卡。
动物关养条件
在符合 USDA 实验动物福利法的 NIH 实验动物福利与使用指南概述的条件下， 在充 分认可的 AAALAC 设施中关养动物。每笼关养 3 只动物。在动物室内提供 12 小时光期和 12 小时暗期。任意给动物饲喂 Harlan Global Teklad Diet 2016 和过滤水。
动物的最终选择
在第一天头一半动物 (n ＝ 30)( 组群 A) 接受激光凝固， 另一半 (n ＝ 30)( 组群 B) 在第二天接受激光凝固。在因照射激光期间意外死亡或激光传送差 ( 即意外的视网膜血管 击中和出血 ) 引起的需要更换动物的情况下， 以每组 12 只动物开始研究。 未发生意外死亡。 如果照射激光期间特定组未出错， 则随机抓取大鼠。
激光凝固
在第 0 天上午， 即第一次给药后的当天， 把动物转移到激光传输处理室。采用改进 的裂隙灯激光传输系统， 仅在每只动物左眼视网膜上进行激光手术。
手术过程如下。
以 40/0.25mg/kg( 依照 Testing Facility SOP) 通过腹膜内 (IP) 注射氯胺酮 / 美托咪定使大鼠麻醉。通过局部 ( 经眼 ) 给予 1％托吡卡胺 (MYDRACIL， Alcon Labs)， 对每 只眼扩瞳。
将动物放置在改进的裂隙灯激光传送系统前。使用置于系统中的 VOLK 接触镜观 测眼底。在 3 个部位上， 在大约 12、 3 和 9 点钟的位置上处理左眼眼底， 尽外科医生的全 力， 每只眼视神经的 2 圆盘直径。这可利用配有改进的裂隙灯传送系统 (Carl Zeiss Slit Lamp) 的绿色氩激光器 (Coherent Novus 2000 ； 514-nm 波长 ) 进行。使每个处理部位 ( 以 0.5 秒脉冲持续时间传送 200mW， 光点尺寸为 100μm) 最优化， 以在视网膜下方产生表示脉胳膜基底层破裂的强烈气泡。
手术后， 以 0.25mg/kg 给动物肌内 (IM) 注射 ANTISEDAN 用以使麻醉逆转。将一滴 GENTEAL(Novartis) 眼膏点入照射激光的眼部以减轻目涩。监测动物直到从麻醉中完全复 原， 并放回其动物室。
剂量给予
在研究前制备两批溶媒 (0.5％甲基纤维素、 0.2％吐温 80)， 用于所有随后的试验 品制剂。在整个研究中， 将溶媒在 2-8℃下冷冻。制备两批试验品。在第 -1 天制备一批， 用 于从第 -1 天到第 3 天给予动物， 在第 4 天制备的第 2 批用于所有随后的给药。每天两次即 清早和下午经口管饲法喂给动物， 研究每天给药的间隔约为 8-9 小时。在研究的第 -1、 4和 7 天给动物称重， 这些重量用来确定给药体积。
药代动力学分析
在第 7 天， 在上午具体时间点即 0.5、 1 和 4 小时 ( 每组 3 只动物 )， 大鼠接受最终给 药， 将动物放入 CO2 室直到停止呼吸后， 进行最终的心穿刺术。 紧接采血后， 收获眼睛。 将照 射激光的左眼放入 10％福尔马林溶液中用于平铺封片， 将右眼放入预称量的玻璃小瓶中， 并在干冰上冷冻。将血液收集到 BD 肝素化 Microtainer 管中以获得血浆。将样品离心， 将 所得血浆在干冰上冷冻。然后对样品进行分析。
尸体剖检
在相应的第 7 天处死组群 A 和 B 的动物。从每只动物中收集照射激光的左眼、 右 眼到 10％福尔马林溶液用于解剖和平铺封片。收集右眼并冷冻用于 PK 分析。
平铺封片、 荧光显微法和 3D 图像建模
在相应的第 7 天， 从福尔马林溶液中取出激光照射的左眼， 处理后平铺封片。使用 解剖显微镜对眼进行显微解剖。摘除前部和晶状体得到前眼杯。轻轻将组织彼此拉开， 仔 细地将神经视网膜从 RPE/ 脉络膜区中分离出来。 通过 3-6 个均匀相间的径向切割， 使 RPE/ 脉络膜区和神经视网膜呈 “花状” 。将组织平铺， 分别用封固剂 (Vectashield HardSet) 和 盖玻片封在载玻片上。将载玻片于 4℃避光保存直到荧光分析。
采用配有 APOTOME 和 AXIOVISION 软件的 Zeiss AXIOIMAGEr， 根据荧光 (FITC) 和 3D 建模测量损伤体积。 分析了所有 RPE/ 脉络膜载玻片的荧光。 全部分析由操作者以盲法进 行。对于大部分载玻片， 鉴定出 2-3 个损伤。对于少部分载玻片， 只鉴定出 1 个损伤或根本 无损伤。如果组织显示极低的荧光 ( 灌注差 )， 则将样品从分析中剔除。在 RPE/ 脉络膜平 铺片中鉴定出激光损伤。 以 20x 放大倍数暴露 150msec 来进行激光损伤的成像。 采用 3D 图 像分析所必需的提供去模糊光学切片的 APOTOME， 获得图像作为 Z-stack。 采用 AXIOVISION 3D 测量工具测定体积， 将数据输入 Excel。
图 6A、 图 6B 和图 6C 中所示结果表明， 2- 吡啶 -2- 基 - 嘧啶 -5- 甲酸 3-[5-(1- 羟 基 -1- 甲基 - 乙基 )-1， 2， 4
二唑 -3- 基 ]- 苄基酰胺在限制 CNV 体积方面确实有效。结论
上述实施例的结果清楚表明， 上述化合物的类型影响大鼠激光诱发性黄斑变性功 能的改善。这些结果结合上文引述的参考资料表明， 通过改变肥大细胞、 NK 细胞、 NKT 细胞、 巨噬细胞和树突细胞的功能， PGD2 和 DP 以及通过 Syk 多激酶抑制剂阻断肥大细胞脱粒改 变免疫细胞对于 II 型免疫应答的活性。因此在免疫系统中， 上述化合物的类型可引起 I 型免疫应答提高。 因此， 本文论述和公开的化合物显然可在治疗、 预防或改善黄斑变性中提供 益处。只通过在化合物暴露的足够时间内， 受治疗者的上文提及的可容性介质中的血液浓 度， 便可评价上述化合物类型的作用。
在第一组研究中， 以 3、 10 和 30mpk 的剂量测定 2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b) 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇， 以 10mpk 测定 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸 吲哚 -1- 基酰胺 (hPGDS 抑制剂 )。大鼠用 3、 10 和 30mpk 的 2-[4-(7- 乙基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇经口治疗分别导致 CNV 斑点厚度减少 11.3％、 36.6％ 和 32.2％。另外， 用 10mpk 的 2-(3- 氟 - 苯基 )-4- 甲基 - 嘧啶 -5- 甲酸吲哚 -1- 基酰胺经 口治疗导致 CNV 斑点厚度减少 40.7％， 见图 1。这比阳性对照、 玻璃体内注射曲安奈德 ( 现 行治疗标准之一 ) 更好， 这导致 CNV 斑点厚度减少 25.9％。
在 第 二 组 研 究 中， 以 1.25、 6 和 30mpk 剂 量， 经 口 一 天 两 次 测 定 2-[4-(7- 乙 基 -5H- 吡咯并 [2， 3-b] 吡嗪 -6- 基 )- 苯基 ]- 丙 -2- 醇。另外， 用相同方案， 以 30mpk 和 12.5mpk 分别测定磷酸一 -{6-[5- 氟 -2-(3， 4， 5- 三甲氧基 - 苯氨基 )- 嘧啶 -4- 基氨 基 ]-2， 2- 二甲基 -3- 氧代 -2， 3- 二氢 - 吡啶并 [3， 2-b][1， 4] 嗪 -4- 基甲基 } 酯乙酸 盐和 2-(3-{6-[2-(2， 4- 二氯 - 苯基 )- 乙氨基 ]-2- 甲氧基 - 嘧啶 -4- 基 }- 苯基 )-2- 甲 基 - 丙酸磷酸盐。虽然我们仍需要从组织载玻片中计算了 CNV 斑点厚度， 但是荧光血管造 影照片的初步数据表明所有所测试的化合物都有显著功效。照片和图例见图 2 和图 3。
所采集的数据清楚表明， 在大鼠 LIMD 模型中评价的这些化合物表明， 通过组织学 分析以及视网膜荧光血管造影术， 以脉络膜新血管斑块形成的厚度测定的 CNV 形成显著减 少。
数据证实， 化合物的这些类型容易应用于治疗湿性 AMD。此外， 这些化合物显然可 用于本发明的新的方法， 以治疗湿性 AMD 并抑制 AMD 从干性形式 ( 地图样萎缩 ) 向湿性形式 发展。数据还表明， 诸如类胰蛋白酶 β 抑制剂或其它关键的肥大细胞抑制剂等化合物可有 益于 AMD 的治疗。应用于本发明方法中的这类类胰蛋白酶 β 抑制剂的实例为 4-(5- 氨基 甲基 -2- 氟 - 苯基 )- 哌啶 -1- 基 ]-[7- 氟 -1-(2- 甲氧基 - 乙基 )-4- 三氟甲氧基 -1H- 吲 哚 -3- 基 ]- 甲酮 ( 见下 )，
类胰蛋白酶 β 抑制剂的其它实例披露于美国专利 6,977,283 和 PCT 公开申请 WO 2005/097780 中， 所述文献通过引用全部结合到本文中。另外， DP 拮抗剂的数据表明， 改变 NK、 NKT 细胞以及树突细胞的活化可为治疗 AMD 的有效方法。
本发明并不通过本文描述的具体实施方案来限制范围。 从上面的说明书和附图来
看， 除本文描述的实施方案以外， 本发明的各种修改对于本领域技术人员而言的确是显而 易见的。这类修改也都落入随附权利要求书的范围。