生物反应器构建组织工程肌腱.pdf

本发明生物反应器构建组织工程肌腱，涉及生物反应器，尤其涉及构建组织工程化肌腱的生物反应器。本发明提供的生物反应器，由细胞培养室、控制系统、换液控制系统和参数测量系统组成，对细胞－降解材料复合物可以施加脉冲式拉力。该生物反应器所获得的肌腱的应变范围为总长的4％－15％，是生物力学性能良好的肌腱组织。该生物反应器还可用于其它组织、细胞的培养。

1.  一种培养肌腱细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将肌腱细胞按2-6×10⁵细胞/cm²的密度接种于片状的生物可降解的相容载体材料上，形成接种有肌腱细胞的载体复合物；
b.将步骤a的载体复合物在37±2℃，5±2％CO₂浓度下进行培养28-90天，并且在培养过程中，对所述载体复合物施加拉力，所述的拉力使得载体复合物的拉伸程度按下式计算为6-15％：

其中，每天的拉伸次数4-2000次。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中按以下方式施加拉力：其中每次拉伸包括拉紧3-7秒，保持3-7秒，放松3-14秒。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物可降解的相容载体材料的尺寸为长2-5厘米，宽3-10毫米，而位移长度为1-7毫米。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物可降解的相容载体材料选自下组：聚乙二醇。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肌腱细胞是人、狗、羊、牛、猪、猫或鸡的肌腱细胞或成纤维细胞及各种干细胞。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，拉伸程度为4％-12％。

7.  一种用权利要求1所述的方法制得的人工肌腱移植物，其特征在于，所述的移植物的胶原含量为30％-60％，抗张力强度为0.5-3MPa。

8.  一种用于权利要求1所述方法的生物反应器，其特征在于，它包括以下组件：
(i)细胞培养室，所述的细胞培养室包括：用于固定载体复合物的固定装置和用于拉伸载体复合物的拉伸装置，所述的拉伸装置可以对固定的载体复合物施加拉伸程度为2-15％的拉伸，其中拉伸程度按下式计算为：

(ii)控制系统，所述控制系统控制所述拉伸装置的拉伸程度；
(iii)参数测量系统，所述的参数测量系统包括用于测量位移和拉力的探头。

9.  如权利要求8所述的生物反应器，其特征在于，它还包括(iv)用于更换培养液的换液控制系统。

10.  如权利要求8所述的生物反应器，其特征在于，所述探头包括用于测量肌腱的受力大小的应力传感器和测量拉伸的变化量的位移传感器。

生物反应器构建组织工程肌腱
技术领域
本发明涉及生物反应器，尤其涉及构建组织工程化肌腱的生物反应器。
背景技术
肌腱损伤或缺损后，其手术修复和功能重建是外科手术十分重要的研究课题，临床上超过3厘米的肌腱缺损一般不能直接缝合，目前常采用自体肌腱移植或异体肌腱移植、人工合成材料替代等治疗方法进行修复，但是，应用上述方法有供体来源受限和造成新的损伤的缺点，亦不易为病家所接受。组织工程技术为肌腱组织缺损的临床修复提供了新的途径，但是，在肌腱的静态培养中，细胞增殖能力下降，细胞外基质合成降低，PGA(聚羟基乙酸)材料在1-2周内开始降解，胶原呈无续杂乱的排列导致组织工程化肌腱的力学性能较差，无法满足作为可移植肌腱材料所要求的性能。
现有技术中有在裸鼠皮下构建组织工程化肌腱，获得了在大体和组织学结构与正常肌腱类似的组织。但是裸鼠没有完善的免疫功能，不能观察机体对细胞和生物材料的反应，而且组织在形成过程中未受应力作用，生成的组织工程化肌腱并不符合生理特点。
现有技术中也有用自体肌腱细胞构建组织工程化肌腱、原位修复鸡趾屈肌腱缺损成功，但是应用自体肌腱细胞作为组织工程化肌腱的种子细胞仍需切取较大的肌腱组织，造成新的损伤。
所以本领域迫切需要寻求力学性能好、更加符合生理要求的组织工程化肌腱。
发明内容
本发明提供了一种力学性能好、符合生理要求的组织工程化肌腱。
本发明提供了获得这种组织工程化肌腱的生物反应器及通过该生物反应器获得所述的组织工程化肌腱的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种培养肌腱细胞的方法，它包括以下步骤：
a.将肌腱细胞按2-6×10⁵细胞/cm²的密度接种于片状的生物可降解的相容载体材料上，形成接种有肌腱细胞的载体复合物；
b.将步骤a的载体复合物在37±2℃，5±2％CO₂浓度下进行培养28-90天，并且在培养过程中，对所述载体复合物施加拉力，所述的拉力使得载体复合物的拉伸程度按下式计算为6-15％：

其中，每天的拉伸次数4-2000次，优选20-2000次。
其中在步骤(b)中按以下方式施加拉力：其中每次拉伸包括拉紧3-7秒，保持3-7秒，放松3-14秒。
更佳地，步骤(b)中拉伸频率为2-6次/分钟。
上述方法中所述的生物可降解的相容载体材料的尺寸为长2-5厘米，宽3-10毫米，而位移长度为1-7毫米；所述的生物可降解的相容载体材料选自下组：聚乙二醇(polyglycolic acid，PGA)。
上述方法中所述的肌腱细胞是人、狗、羊、牛、猪、猫或鸡的肌腱细胞或成纤维细胞及各种干细胞。
上述方法的拉伸程度为4％-12％。
在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法制得的人工肌腱移植物，它的胶原含量为30％-60％，抗张力强度为0.5-3MPa。
在本发明的第三方面，提供了一种用于上述培养肌腱细胞的方法的生物反应器，它包括以下组件：
(i)细胞培养室，所述的细胞培养室包括：用于固定载体复合物的固定装置和用于拉伸载体复合物的拉伸装置，所述的拉伸装置可以对固定的载体复合物施加拉伸程度为2-15％的拉伸，其中拉伸程度按下式计算为：

(ii)控制系统，所述控制系统控制所述拉伸装置的拉伸程度；
(iii)参数测量系统，所述的参数测量系统包括用于测量位移和拉力的探头。
上述的生物反应器还包括(iv)用于更换培养液的换液控制系统。
在另一优选例中，换液控制系统给细胞培养室自动排、换液。
上述生物反应器的探头包括用于测量肌腱的受力大小的应力传感器和测量拉伸的变化量的位移传感器。
因此本发明的肌腱生物反应器，能够模拟肌腱的体内力学环境，有效改进局部微环境，促进肌腱细胞养分和废物代谢、以及胶原基质分泌，以获得具有良好强度和韧性的组织。通过该生物反应器所获得的肌腱，有良好的强度和韧性，更接近人体自身肌腱组织的力学性能。
附图说明
图1肌腱生物反应器结构图
图2肌腱细胞-PGA支架复合物(大体观察)左图为动态培养组，右图为静态培养组
图3肌腱细胞-PGA支架复合物纵切面H&E染色，100×左图为动态培养组，右图为静态培养组
图4肌腱复合物在反应器后各时间点的胶原含量蓝色为对照组，红色为实验组
图5肌腱细胞-PGA材料复合物的抗张强度
图6肌腱复合物在反应器工型胶原mRNA表达
(1)标记(2)正常(3)实验组4周(4)实验组8周
(5)实验组12周(6)对照组4周(7)对照组8周
(8)对照组12周
图7肌腱复合物PCR产物平均密度扫描
具体实施方式
根据肌腱细胞体内的生物和力学环境，建立细胞和可降解材料复合物的力学模型，通过分析材料复合物的力学行为设计一套能够模拟体内力学环境的生物反应器，使细胞在培养过程中，其近似稳态的蠕变特性成为促进胶原定向排列的重要因素，达到在体外获得力学性能优化的自体肌腱。
在设计肌腱生物反应器时，必须使肌腱的应变在其生理范围内，肌腱的应变范围原认为仅为总长度的2％-3％，超出此长度范围，肌腱组织将屈服破坏，对于组织工程化肌腱和细胞材料复合物而言，其应变范围更小。但本发明的生物反应器，通过使其中所固定的肌腱细胞载体复合物得到不同频率和大小的受力，其中的肌腱应变范围可达总长度的6％-15％，更佳为8％-12％。
本发明的肌腱生物反应器，能够模拟肌腱的体内力学环境，整个系统通过控制系统作为动力源对肌腱细胞复合物进行一维张应力的施加。在组织生长过程中控制系统通过调节和设定控制系统各参数，施加不同频率、幅度和时程的拉力，其中作用时间和停止时间可以人为地进行设定：拉伸频率为2-30次/分钟，更佳为4-15次/分钟；每次拉伸包括拉紧3-7秒，保持3-7秒，放松3-14秒；每天的拉伸次数4-2000次；位移(拉伸量)长度为1-7毫米，更佳为3毫米。每10-14小时作用一次，每天1小时可得到上述效果。
肌腱应变范围为2-3％时的组织工程肌腱在第8周时的抗张力强度为：0.6840±0.0478Mpa；而本发明提供的肌腱应变范围为6％-15％的组织工程肌腱在第8周时的抗张力强度则提高为：1.5997±0.0904Mpa。
组织工程学中，细胞材料复合物的特点是1、材料是可降解的；2、细胞是活性、可以生长的，并能够分泌细胞外基质；3、在材料的不断降解和细胞的不断生长、分泌基质的过程中讨论材料的性质。对肌腱组织的培养过程进行分析可知，细胞和材料的培养过程可分为如下三个阶段：(1)细胞接种到可降解材料上开始持续到材料开始降解为第一阶段(为1周左右)；(2)可降解材料的降解和细胞基质分泌为第二阶段；(3)可降解材料完全降解和细胞基质继续分泌为第三阶段。细胞和可降解材料是一种典型的黏弹性材料，其自身固有的力学特性也可以作为诱导细胞生长、分泌和提高组织工程肌腱力学强度的一个重要因素。
为了便于理解，我们将肌腱细胞和可降解材料复合物近似为线性黏弹性材料，以Maxwell模型为材料的数学模型，但本发明并不受限于该数学模型。将肌腱细胞和可降解材料复合物看成是由弹性元件和黏弹性元件串联而成，设在应力σ(t)作用下，弹性和阻尼器的应变分别为ε₁ε₂，假定模型的总应变为：
ε＝ε₁+ε₂                                                  (1)
或写为： ϵ · = σ · E + σ η - - - ( 2 ) ]]>
其中：ε--总应变；E--拉压弹性模量；η--黏性系数；σ--正应力
表示肌腱细胞材料复合物应力应变时间关系，模型的总位移为弹性元件位移和黏弹性元件位移之和。在肌腱细胞复合物的培养过程中，加入近似阶跃交变恒定应力作用，细胞材料复合物将产生黏弹性形变，随着时间的延续细胞可降解材料将发生蠕变现象，即复合物发生了良好的弹性变形，对复合物施加一定时间段的作用后，复合物的长度增加了。蠕变现象的发生印证了上述力学模型的正确性。因为从力学的角度分析：上述方程求解可知：设在阶跃应力σ₀(t)作用下，方程的总应变为弹性应变和阻尼器应变之和：
ϵ ( t ) = σ 0 E + σ 0 t η - - - ( 3 ) ]]>
式中：E为拉压弹性模量，η为黏性系数，σ0为正应力将t＞0时的 σ · = 0 ]]>代入上述(2)式后积分得ε(t))＝σ₀t/η+C，式中C为积分常数，由t＝0⁺，瞬时弹性的初始条件为ε(0⁺)＝σ₀/E。所以，在突加恒应力σ₀作用下，显示复合物有瞬时弹性变形，应变随时间呈线性增加。若在t＝t₁时刻卸载外力，则原有σ₀作用下的稳态流动终止，弹性变形部分立即消失，即瞬时弹性回复为σ₀/E，遗留在材料中的永久变形为σ₀(t₁-t₀)/η。这就是复合物的弹性变形和长度增加的原因。
在细胞复合物的培养过程中，细胞复合物的固相和液相在σ₀作用下稳态流动。对基质中和粘附在降解材料中的细胞产生力的刺激作用，同时对基质中的杂乱无章胶原纤维产生力的作用。
本发明的生物反应器模拟肌腱在生物体内的生物力学环境，在肌腱的生长过程中施加不同频率和不同大小的张应力作用，通过脉冲力的刺激促进局部微环境肌腱细胞养份和废物的代谢，促进肌腱细胞胶原基质的分泌，获得了具有充分胶原基质及一定强度和韧性的肌腱组织。
本发明所获得的肌腱在7-9周效果最好。
本文所称的“肌腱”和“肌腱复合物”是指肌腱与PGA的复合物。
本发明的主要优点在于：
(1)生物反应器可方便组装；
(2)生物反应器可消毒；
(3)生物反应器可用于肌腱细胞以外其它组织的细胞培养；
(4)该生物反应器所获得的肌腱组织具有良好的生物力学特性。
以下结合具体实施例对本发明进行详述，但并不能作为对本发明的限制。
实施例1
生物反应器的制备
如图1所示，本实施例的生物反应器，包括细胞培养室、控制系统、换液控制系统和参数测量系统，其中，细胞培养室与控制系统、换液控制系统和参数测量系统分别连接。
该生物反应器，选用完全透明的有机材料，外围结构尺寸为长450毫米、高130毫米、宽350毫米。反应器中的细胞培养室外形尺寸为长140毫米、高60毫米、宽90毫米。反应器的个数可根据具体要求合理组合，构成多个不同且相对独立的单个培养室置于培养箱中。拉力的显示可精确到0.00千克，测量范围为0-4千克，位移的测量可精确到0.01毫米，测量范围为0-20毫米。
实施例2
生物反应器培养肌腱细胞的方法
(1)在无菌条件下，切取Leghorn鸡趾所有的深屈肌腱3-4cm，切成1×2×2mm³大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青霉素，链霉素各100U/ml)冲洗2遍，组织块贴壁培养；
(2)肌腱细胞传至第2代，经0.25％胰蛋白酶消化收集细胞；
(3)将20mg PGA平行排列成束状，长3.5cm，直径0.3cm；
(4)用上述细胞与培养液制成浓度为5.0×10⁷/ml的细胞悬液，然后与PGA混合形成复合物，固定于反应器的培养室中，在37℃、二氧化碳浓度5％的培养箱内放置4小时；
(5)然后加入含20％胎牛血清的DMEM培养液后继续置于培养箱内体外培养，每二天更换培养液一次，以保证细胞营养；
(6)人工调节和设定系统参数，频率：4次/分，每12小时作用一次，每次1小时，位移(拉伸量)设定：长度3毫米。
实施例3-6
生物反应器培养肌腱细胞
重复实施例2的方法，不同点在于采用下表所示的条件：