两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法.pdf

本发明公开了属于人阴道上皮细胞培养技术范围的一种培养基联合序贯培养细胞的方法。即用无血清培养基+含血清培养基的序贯培养，从而可以迅速使阴道上皮原代细胞大量增殖，传代成功率在80％左右。

1.  一种两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法，其特征在于：所述对人阴道上皮细胞的培养过程如下：
(1)阴道上皮细胞的原代培养

1.  1取材：
1)阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织；
2)子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除的患者的阴道组织；
3)所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；
4)术后病理均为良性疾病；

1.  2从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有庆大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的4℃D-Hank’s液的无血清培养基无菌小瓶内；

1.  3消毒：用上述1.2的加有抗生素的D-Hank’s液彻底清洗三遍；

1.  4分离：用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以减少成纤维细胞或其它细胞的污染；

1.  5接种：将上皮组织切成0.2～0.3厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内；

1.  6培养：将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入1.5ml两性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)，倒置3小时，在37℃，体积比浓度为5％的CO₂培养箱中培养；

1.  7换液：3天后用上述1.6的无血清培养基进行第一次换液，之后每2-3天换液一次；

1.  8培养2周左右取出组织块，往K-SFM中加入体积比浓度10％胎牛血清(美国GIBCO公司)继续培养约2周左右，原代细胞数量大大增加；
(2)阴道上皮细胞的传代培养

2.  1细胞生长汇合至85％-90％时，准备传代；

2.  2吸除或倒掉瓶内旧培养液；

2.  3向培养瓶内加入3ml D-Hank’s液，清洗细胞后倒掉；

2.  4向培养瓶内加入1.5ml体积比浓度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司产品)和体积比浓度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司产品)等量混合的消化液；

2.  5 37℃消化3-6分钟；

2.  6倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入1.5ml含体积比浓度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美国Hyclone公司产品)培养液终止消化，反复吹打瓶壁细胞，把液体收集入无菌离心管；

2.  7800rpm离心3分钟；

2.  8弃去上清，加入新鲜的含抗生素的无血清培养基，吹打成单细胞悬液，取一滴在血球计数板计数，其中抗生素为青霉素100U/ml和链霉素100U/ml，二者体积比为1∶1；

2.  9按1∶2或1∶3进行传代；

2.  10细胞传代后次日用上述2.8的无血清培养基进行换液，体外可传7-9代，传代成功率高。

2.  根据权利要求1所述两种培养基联合序贯培养阴道上皮细胞的方法，其特征在于：所述两性霉素B 0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比为1∶100。

3.  根据权利要求1所述两种培养基联合序贯培养阴道上皮细胞的方法，其特征在于，所述庆大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液与D-Hank’s液的体积比为1∶100。

4.  根据权利要求1所述两种培养基联合序贯培养阴道上皮细胞的方法，其特征在于：所述无血清培养基为角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)；并且在原代细胞组织块法培养中，可在一定阶段去掉组织块同时短期加入胎牛血清，达到原代细胞数大量增长、传代成功率高而基本不影响细胞的纯度和寿命这一目的。

两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术范围，特别涉及两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法。
背景技术
由于国内尚无学者做过人的阴道上皮细胞的培养，所以我们申请了北京市科委的一项基金，作为关于人阴道上皮细胞模型建立和上皮细胞与白色念珠菌共培养实验的经费来源。实验采用了组织块法进行原代细胞培养，用角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)作为主要细胞培养基。但在实验中发现，K-SFM培养的原代细胞初期的生长速度慢，单纯K-SFM培养的阴道原代上皮细胞数量少，传代困难，所以传代成功率不高(约10％左右)，经常因为传代失败而无法获得大量细胞。查阅许多文献发现，国外进行组织块法的人阴道上皮细胞原代培养是用于永生化细胞系的研究，阴道上皮细胞数量要求不高，国内尚无这方面的研究，而我们的阴道上皮细胞与白色念珠菌共培养试验中需要大量细胞，所以在实验中发现了一种新方法，即两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法，这种方法能使我们获得足够量的阴道上皮细胞。国外也有两种培养基联合运用培养上皮原代细胞的例子，但均为先是有血清培养基(2-7天)培养再到无血清培养基培养，与直接采用无血清培养基培养相似，阴道上皮细胞同样传代困难。而我们的方法是无血清培养基+含血清培养基的人阴道上皮原代细胞序贯培养，目前采用这种方法获取大量人阴道上皮细胞尚无报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种两种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法。
本实施方案是对人阴道上皮细胞的培养过程进行说明，普通培养过程如下：
(1)阴道上皮细胞的原代培养
1.1 取材：
1)阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织；
2)子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除的患者的阴道组织；
3)所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；
4)术后病理均为良性疾病。
1.2 从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有庆大霉素50μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的4℃ D-Hank’s液(D-Hank’s液是按《细胞培养》介绍方法常规配制)的无血清培养基无菌小瓶内，(三种抗生素等量混合液与D-Hank’s液的体积比为1∶100)。
1.3 消毒：用上述1.2的加有抗生素的D-Hank’s液彻底清洗三遍。
1.4 分离：用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以减少成纤维细胞或其它细胞的污染。
1.5 接种：将上皮组织切成0.2～0.3厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内。
1.6 培养：将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入1.5ml两性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)(三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比均1∶100)，倒置3小时，在37℃浓度为5％的CO₂培养箱中培养。
1.7 换液：3天后用上述1.6的无血清培养基进行第一次换液，之后每2-3天换液一次。
2. 阴道上皮细胞的传代培养
2.1 细胞生长汇合至85％-90％时，准备传代。
2.2 吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2.3 向培养瓶内加入3ml D-Hank’s液，清洗细胞后倒掉。
2.4 向培养瓶内加入1.5ml体积比浓度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司产品)和体积比浓度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司产品)等量混合的消化液。
2.5 37℃消化3-6分钟。
2.6 倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入1.5ml含体积比浓度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美国Hyclone公司产品)培养液终止消化，反复吹打瓶壁细胞，把液体收集入无菌离心管。
2.7 800rpm离心3分钟。
2.8 弃去上清，加入新鲜的含抗生素的无血清培养基(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，二者体积比为1∶1)，吹打成单细胞悬液，取一滴在血球计数板计数。
2.9 按1∶2或1∶3进行传代。
2.10 细胞传代后次日用上述2.8的无血清培养基进行换液，体外可传7-9代，但因为细胞数量少传代成功率低。
在组织块培养过程中我们发现，单纯采用无血清培养基培养原代细胞时只有较少组织块有细胞爬出(这可能与手术中电刀操作、反复钳夹或术前阴道冲洗准备等损伤的原因有关)，而且K-SFM培养的原代细胞初期的生长速度慢，所以单纯K-SFM培养的阴道原代上皮细胞数量少，传代困难，所以传代成功率不高(约10％)，经常因为传代失败而无法获得大量细胞。
本发明的有益效果不同于国外的上皮原代细胞培养两种培养基联合运用的例子，即先为有血清培养基(2-7天)再到无血清培养基，这与直接采用无血清培养基一样传代困难，阴道上皮原代细胞传代成功率只有10％左右。本申请的原代细胞无血清培养基(2周左右)、原代细胞有血清培养基(2周左右)然后再传代细胞无血清培养基的阴道上皮鳞状细胞培养方法，简单易行，而且成功率高，传代成功率达到80％左右。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种培养基联合序贯培养人阴道上皮细胞的方法，
人阴道上皮细胞培养的实验过程如下：
1.阴道上皮细胞的原代培养
1.1取材：
1)阴道前后壁膨出行全子宫切除的患者的阴道组织；
2)子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除的患者的阴道组织；
3)所有标本术前宫颈阴道细胞学检查无异常，抗感染筛查均阴性，标本均来源于未绝经患者；
4)术后病理均为良性疾病。
1.2从手术室取下的新鲜的阴道组织放在加有抗生素庆大霉素50μg/ml，青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的4℃D-Hank’s液(D-Hank’s液是按《细胞培养》介绍方法常规配制)的无血清培养基无菌小瓶内。
1.3 消毒：用上述1.2加有抗生素的D-Hank’s液彻底清洗三遍。
1.4 分离：用眼科手术剪刀去除多余的皮下组织，以减少成纤维细胞或其它细胞的污染。
1.5 接种：将上皮组织切成0.2～0.3厘米的小块，并尽快接种在培养瓶内。
1.6 培养：将组织碎块接种于一次性培养瓶中，加入1.5ml的两性霉素B0.25μg/ml、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml三种抗生素等量混合液的角化细胞无血清培养基(Keratinocyte-SFM，美国GIBCO公司产品，编号17005-042)(三种抗生素等量混合液与无血清培养基的体积比均1∶100)，倒置3小时，在37℃浓度为5％的CO₂培养箱中培养。
1.7 换液：3天后用上述1.6的无血清培养基进行第一次换液，之后每2-3天换液一次。
1.8 培养2周左右取出组织块，往K-SFM中加入体积比浓度10％胎牛血清(美国GIBCO公司)继续培养约2周左右，原代细胞数量大大增加。
2. 阴道上皮细胞的传代培养
2.1 细胞生长汇合至85％-90％时，准备传代。
2.2 吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2.3 向培养瓶内加入3ml D-Hank’s液，清洗细胞后倒掉。
2.4 向培养瓶内加入1.5ml体积比浓度0.1％的胰蛋白酶(Sigma公司产品)和体积比浓度0.01％的乙二胺四乙酸(Sigma公司产品)等量混合的消化液。
2.5 37℃消化3-6分钟。
2.6 倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、大部分细胞已从培养瓶底部脱落后，加入1.5ml含体积比浓度10％胎牛血清的DMEM/F-12(美国Hyclone公司产品)培养液终止消化，反复吹打瓶壁细胞，把液体收集入无菌离心管。
2.7 800rpm离心3分钟。
2.8 弃去上清，加入新鲜的含抗生素的无血清培养基(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，二者体积比为1∶1)，吹打成单细胞悬液，取一滴在血球计数板计数。
2.9 按1∶2或1∶3进行传代。
2.10 细胞传代后次日用上述2.8的无血清培养基进行换液，体外可传7-9代，传代成功率高。
在原代细胞数量较少时采用无血清培养基+含血清培养液序贯培养，即原代细胞最初2周左右为K-SFM培养，取出组织块，往K-SFM中加入10％胎牛血清(美国GIBCO公司)继续培养约2周左右，就可以得到较多的细胞进行传代，传代成功率大大提高，细胞传代后再采用单纯K-SFM培养。这样移去组织块再加血清就避免了成纤维细胞污染，而且短期使用血清可以迅速使原代细胞大量增殖，可使传代成功率达到80％左右，同时传代后去掉血清，继续K-SFM培养，对上皮细胞的体外存活时间和经过多次不同患者组织标本培养的结果证明对增殖能力均无明显影响。