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1、10申请公布号CN104178490A43申请公布日20141203CN104178490A21申请号201410406303322申请日20140818C12N15/12200601C12N15/63200601C12N15/11320100171申请人中国科学院成都生物研究所地址610041四川省成都市人民南四段九号72发明人余懋群郑明辉李林徐德林龙海潘志芬邓光兵74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列及其载体和应用57摘要本发明公开了一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列及其载体与应用。
2、，本发明通过RNASEQ测序技术并结合生物信息学分析，第一次获得了较为完整的禾谷孢囊线虫侵染抗性植物时候的基因表达谱，并在相关数据库中找到了三条具有致死效应的RNAI特异位点序列，其序列为RCCNY1SEQIDNO1或RCCNY2SEQIDNO2或RCCNY3SEQIDNO3。51INTCL权利要求书1页说明书13页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页附图3页10申请公布号CN104178490ACN104178490A1/1页21一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列，其特征在于，其序列为RCCNY1SEQIDNO1或RCCNY。
3、2SEQIDNO2或RCCNY3SEQIDNO3。2根据权利要求1所述的一种用于线虫研究及生物防控的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列，其特征在于，所述干扰序列的构建方法为选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草1号作为转录组测序材料，之后通过RNASEQ测序技术得到了第一个禾谷孢囊线虫侵染植物的转录组，进行转录组测序，并通过序列比对，基于线虫数据库找到了36个禾谷孢囊线虫的RNAI干扰位点序列，通过进一步的筛选，排除了和植物、昆虫和人类同源的序列，最后得到了三个具有致死效应的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列。3一种RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体含有权利要求1所述的RCCNY1或RCC。
4、NY2或RCCNY3的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列。4权利要求1所述的一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列在禾谷孢囊线虫研究及生物防控方面的应用。权利要求书CN104178490A1/13页3用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列及其载体和应用技术领域0001本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列及其载体和应用。背景技术0002禾谷孢囊线虫又称燕麦孢囊线虫、禾谷孢囊线虫，对小麦、大麦、黑麦、燕麦及多种禾本科牧草具有严重危害性，是世界上广泛存在的病原线虫，尤其对小麦的生产构成严重的威胁。我国自1987年在湖北天门县发现该病害以来，迄。
5、今已在华北、西北、华中以及华东等13个省区市发现有分布，且有逐渐蔓延之势。目前的主要防治方法包括农业防治、化学农药防治和生物防治。长期以来我国农民主要采取轮作、灌溉、增施有机厩肥、深翻和日晒土壤、种植诱捕植物和调节播期等农业技术措施防治线虫,但是日常种植的作物基本上都是禾谷孢囊线虫的寄主,因而防治效果并不显著。化学农药防控线虫是有效的方法之一，但是它对环境和农产品造成的污染使得该方法缺陷凸显。而生物防治目前报道最多的是食线虫真菌和线虫天敌细菌,但因其效果不明显,商品化困难,至今尚没有一种生防制剂被广泛推广。因此,寻找安全而又行之有效的线虫防治途径非常必要。0003RNAI干扰RNAINTERF。
6、ERENCE,RNAI是指由双链RNADOUBLESTRANDRNA,DSRNA在细胞内特异性地诱导与之同源互补的MRNA降解,使相应基因的表达关闭,从而引发的转录或转录后水平的基因沉默现象POSTTRANSCRIPTIONALGENESILENCING,PTGS。这种现象是生物为保护自身基因组免受外源如病毒和内源性如转座元件序列的侵袭,特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御“免疫”应答现象。0004关于线虫研究中,已发现线虫体内存在着能把RNAI信号放大和传递的机制，微量的DSRNA就能引导机体产生强烈的RNAI效应,而且能够传递到子代。DSRNA可以通过微注射进入CELEGANS成虫,也。
7、可以把CELEGANS成虫浸泡在含有DSRNA的溶液中或者喂饲含有DSRNA的大肠杆菌。注射进入的DSRNA很容易在干细胞中扩散引起RNAI,而且能将这种效应传递到子代。这种方法产生的表型外显率高,非常适合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要体外合成DSRNA和手工注射操作,费时、花费高而且技术难度大,很难用于大规模的功能分析。浸泡法是将线虫浸泡于高浓度的DSRNA溶液。相比注射法,浸泡法能够同时对大量的线虫材料进行处理。但是,浸泡法同样需要体外合成大量的DSRNA一般为15MG/ML,成本很高。与注射法和浸泡法比较，喂饲法有其独特的优势。喂饲法通过构建特殊载体,细菌体内诱导表达DSRNA,再喂。
8、饲线虫,可以有效抑制靶标基因的表达，省钱省事,并且可大规模进行实验。因而,如果建立一个RNAI细菌喂饲文库,该方法就可高效地研究大批基因的功能，从而找出可用于农业生产中线虫的防治方法。0005禾谷孢囊线虫与根结线虫同属于固着性内寄生线虫，与寄主建立寄生关系后雌虫固着在取食部位不再移动。由于不能在人工培养基上培养,所以直接在寄生线虫中应用RNAI技术比较困难。根结线虫体形小,微注射感染手段变得不再实用。另外，它们在感染说明书CN104178490A2/13页4寄主植物前不正常吸收液体也使得研究无法开展。因而，近几年的一项重大突破即是找到在植物寄生线虫上进行RNAI技术的方法。首次向植物寄生线虫成。
9、功注入DSRNA的是URWIN等应用章鱼胺刺激大豆胞囊线虫HETERODEAGLYCINES和马铃薯白线虫GLOBODERAPALLIDA的口腔,使其吸半胱氨酸蛋白酶、HGCTL、精子主蛋白MSP三个基因的DSRNA。处理过的线虫侵染植物14天后分离,发现三个靶标基因的表达明显受到抑制,相应的表观遗传性状也发生了改变。经优化后,此方法也被用于根结线虫的研究。BAKHETIA等把MINCOGNITA幼虫浸泡在编码过氧化物酶DUALOXIDASE的DSRNA中，结果在线虫侵入大豆35天后检测,总产卵量减少了70。SHINGLES等应用RNAI技术敲除MICPL1基因,降低了其转录本丰度，MINCO。
10、GNITA的J2S幼虫的半胱氨酸蛋白酶活性也降低了。几丁质合成酶是甘蓝根结线虫MELOIDOGYNEARTIELLIA生成卵壳几丁质的一种重要的酶。FANELLI等证明把卵块浸泡在几丁质合成酶DSRNA溶液中,可以使几丁质合成酶基因的表达减少，卵孵化延迟。另外，ROSSO等研究发现,间苯二酚可刺激MINCOGNITA对DSRNA的吸收,并且观察到了明显的RANI现象。除了离体干扰线虫以外,有些学者通过构建表达DSRNA的转基因植物达到减少根结线虫寄生的目的。YADAV等把RNAI用于转基因烟草成功地干扰了MINCOGNITA的生长发育，表明在寄主植物中表达DSRNA是一种控制寄生线虫病的可行策。
11、略。HUANG等在拟南芥内过表达根结线虫寄生基因16D10，结果根结减少了6390,而且体积很小,卵块的产量也减少了6993，成功地减少了4种根结线虫的寄生。FAIRBAIRN等构建转基因烟草NICOTIANATABACUM表达DSRNA发夹结构，沉默爪哇根结线虫MELODODOGYNEJAVANICA转录因子MJTIS11。结果虽然没有明显减少线虫的繁殖量和卵的孵化率,但是证明植物可以作为一种传输体系诱导根结线虫RNAI介导的基因沉默。由上可以看出,利用RNAI转基因植物来防治寄生线虫是一个新的防治策略，将为植病防治工作带来新的前景。0006但前述研究均是集中在模式动物秀丽线虫和植物寄生根线。
12、虫的相关研究，由于禾谷孢囊线虫的基因组背景尚未阐明，所以没有相关研究报道。随着近年来转录组测序技术的发展，利用基因组和转录组技术相结合来研究植物寄生性线虫的方法流行起来。利用转录组技术可以高通量的获得相关线虫的候选基因从而进一步鉴定相关功能基因。我们利用对禾谷孢囊线虫HAVENAE和根结线虫MELOIDOGYNENAASI具有双抗作用的材料易变山羊草的根部进行了深度的转录组测序。通过对测序结果进行分析，在去除了植物，微生物，细菌和载体序列后，首次得到了禾谷孢囊线虫在侵染抗性植物时表达的相关基因846条。进一步和已有的线虫数据库进行比对分析后，去除和植物PLANT，昆虫INSECT和人类HUMA。
13、N同源的基因，最后得到三条和秀丽线虫CELEGANS同源又具有致死效应的基因。在此基础上构建了DSRNA干扰载体，进行DSRNA浸泡干扰实验，最后发现三个基因位点均具有致死效应，其中两个基因具有显著致死效用。发明内容0007为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列及其载体和应用。0008为达到上述目的，本发明的技术方案为0009一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列，其序列为说明书CN104178490A3/13页5RCCNY1SEQIDNO1或RCCNY2SEQIDNO2或RCCNY3SEQIDNO3。0010进一步的。
14、，所述干扰序列的构建方法为选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草1号作为转录组测序材料，之后通过RNASEQ测序技术得到了第一个禾谷孢囊线虫侵染植物的转录组，进行转录组测序，并通过序列比对，基于线虫数据库找到了36个禾谷孢囊线虫的RNAI干扰位点序列，通过进一步的筛选，排除了和植物PLANT、昆虫INSECT和人类HUMAN同源的序列，最后得到了三个具有致死效应的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列。0011一种RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体含有上述的RCCNY1或RCCNY2或RCCNY3的禾谷孢囊线虫RNAI位点序列。0012一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAI位点。
15、序列在禾谷孢囊线虫研究及生物防控方面的应用。0013相对于现有技术，本发明的有益效果为本发明通过体外转录分别合成禾谷孢囊线虫CCN的靶标基因片段RCCNY1UNIGENE38116、RCCNY2UNIGENE102492和RCCNY3UNIGENE38007的DSRNA,然后通过浸泡法对禾谷孢囊线虫CCN的J2幼虫进行RNAI实验。本实验发现线虫长时间聚集容易死亡,采用摇床培养悬浮线虫溶液,大大改善了这一状况。结果发现DSRNA明显降低了幼虫的活性,说明靶标致死效应基因在线虫的生长发育中具有重要作用。0014由此证明本发明采用转录组技术找到相关功能基因研究基因功能的方法切实可行,为大规模鉴定物。
16、种全基因组功能提供了新的思路，同时也首次较为系统的鉴定并筛选了禾谷孢囊线虫与抗性植物拮抗过程中表达的相关基因。附图说明0015图1利用基因特异的干扰RNA喂饲线虫24H后线虫的存活率，DSRNA的浓度为25NG/L，和对照相比较有显著差异的P50为筛选得分临界值；00352对公共数据库NCBIDBEST中可以下载的全部线虫表达0036序列标签NEMATODEEST基于生活周期分为三类自由线虫FLN、动物寄生线虫APN和植物寄生线虫PPN。将蛋白数据库比对后序列在线虫表达数据库中进行本地比对TBLASTX来进一步确定线虫相关基因，同时也通过核苷酸序列比对BLASTN和蛋白质序列比对BLASTX在。
17、MINCOGNITA和MHAPLA的基因组数据库中进行比对GENOMEPROJECTWEBSITESHTTP/WWWINRAFR/MELOIDOGYNE_INCOGNITA,HTTP/WWWHAPLAORG，以上比对结果均选择最佳比对值TOPHITS。说明书CN104178490A5/13页70037转录组测序UNIGENE序列比对路线如图4所示。0038RNAI位点的发现00391把预测得到的线虫基因序列采用本地比对，基于秀丽线虫基数0040据库WORMBASEHTTP/WWWWORMBASEORG,RELEASEWS227，将最为相似的基因序列作为禾谷孢囊线虫候选基因保留下来；00412将。
18、前述比对得到的基因和秀丽线虫的RNAI位点数据库相比较0042WORMMARTSECTIONOFWORMBASERELEASEWS220，选出可以对应到致死效应的位点的基因比对得分临界值40，BITSCORE40；00433将前述得到的RNAI位点序列以比对得分临界值40BITSCORE40为标准，进一步和植物的非冗余蛋白数据库相比较PLANTNONREDUNDANTPROTEINDATABASE，EMBRYOPHYTA，NCBITXID3193，将比对不到NOHITS植物非冗余蛋白数据库的基因进一步和昆虫INSECT的非冗余蛋白数据库NONREDUNDANTINSECTPROTEINDATA。
19、BASENCBITXID6960及人类HUMAN的非冗余蛋白数据库NONREDUNDANTHUMANPROTEINDATABASENCBITXID9606进行比对得分临界值40，BITSCORE40，最后只将致死型RNAILETHALRNAI序列，同时又比对不到NOHITS植物、昆虫和人类非冗余蛋白数据库的基因序列作为候选的RNAI位点。00443三个禾谷孢囊线虫基因部分片段的PCR扩增0045A引物设计0046如表1所示，候选禾谷孢囊线虫转录组中具有致死效用基因序列及秀丽线虫中同源基因00470048基于转录组中的候选UNIGENE基因片段表1，从WORMBASE下载对应基因的全长，基于基因。
20、的保守区，利用PREMIER50设计引物0049UNIGENE_38116_AS,0050CAACCTGCACCGAATACTTCACTACAAA说明书CN104178490A6/13页80051UNIGENE38116_S,0052ACCCTAAATAATGGAGACCTCACTAACG；0053UNIGENE102492_AS,0054ACAAGATGACGGAAATGGAAGAAGAGTT0055UNIGENE102492_SIRNA_S,0056CGTTAGTGAGGTCTCCATTATTTAGGGT；0057UNIGENE38007_SIRNA_AS,0058AAGAGCCAACAA。
21、TCTCCGAGTTCTCCCT0059UNIGENE38007_SIRNA_S,0060CACCAAGACCAACTACCGAACCACAAGA；0061BPCR扩增0062PCR扩增体系006300640065PCR扩增程序如下0066说明书CN104178490A7/13页90067PCR电泳结果如图7所示。00684扩增片段的回收、克隆、测序0069A扩增片段的回收0070使用天根的回收试剂盒00711用干净的刀片将目的DNA条带从琼脂糖胶上切下来,置于15ML的离心管中,称取重量；00722每100MG胶加300L溶胶液,50水浴10MIN,不断温和上下翻转离心管,直到胶完全溶解；0。
22、0733将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB中吸附柱放入收集管中,12000R/MIN离心30SEC,倒掉收集管中的废液；00744加700L漂洗液PW,12000R/MIN离心30SEC,弃掉废液；00755加500L漂洗液PW,12000R/MIN离心30SEC,弃掉废液；00766将离心吸附柱放回收集管中,12000R/MIN离心2MIN,尽量除去漂洗液；00777将吸附柱放入一个干净的离心管中,在吸附膜中间位置加入适量6570预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2MIN。104R/MIN离心LMIN。回收的DNA保存在20备用。0078B连接0079连接体系00800081C转化00821取感。
23、受态细胞100L,置于冰上溶化；00832用预冷的无菌吸头将连接产物10L加入到感受态细胞中,轻轻旋转混匀内容物,置于冰上30MIN，每隔10MIN混匀一次；00843将离心管在42水浴6090SEC,不要摇动,然后立即置于冰上23MIN；00854加500L的37预热的SOC培养基,置于37摇床180R/MIN培养LH使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标一记基因；00865取100L300L己转化的感受态细胞转移到LB平板上含50MG/LAMP,16LIPTG50MG/L,40LXGAL20MG/ML,用一无菌的弯头玻棒轻轻地将细胞均匀涂开；00876将平板置于室温直至液体被吸收,37。
24、倒置培养1216H；说明书CN104178490A8/13页1000887筛选蓝白斑,挑取白斑进行菌液PCR、酶切鉴定。0089D质粒提取0090L将5ML含相应抗生素的LB加入到通气良好的15ML的试管中,接入单菌落,于37摇床220R/MIN培养过夜；00912取15ML培养物加入到15ML离心管中,12000R/MIN离心30SEC,倒掉上清,收集菌体。收集2次,最后一次吸去培养液,细菌沉淀尽可能干燥；00923加入100L预冷的溶液I,振荡,使菌体悬浮在溶液I中,室温放置10MIN；00934加入200L新鲜配制的溶液,颠倒混匀,冰浴5MIN；00945加入150L预冷的溶液,颠倒混匀。
25、,冰浴5MIN；0095612000R/MIN,4离心10MIN；00967转移上清,加入等体积的氯仿,混匀,室温放置5MIN,412000R/MIN离心5MIN；00978转移上清,加入07倍体积的异丙醇,室温放置5MIN,412000R/MIN离心15MIN；00989弃上清,用70乙醇洗涤沉淀,室温风干沉淀；0099E测序0100委托英俊公司进行0101结果如图46所示。01025载体构建0103将含有测序正确的基因片段载体与表达DSRNA的载体LITMUS281用SACI和NCOL酶进行双酶切,获得具有相同酶切位点的片段和LJTMUS281载体,便于把片段构建到LITMUS281载体上。
26、。01040105用T4DNALIGASE16连接1216H,将连接产物转化TOP10,通过蓝白斑筛选,挑选白斑进行双酶切鉴定出阳性克隆,至此成功地在目的基因的两段引入了T7序列。01066高纯度质粒提取0107为获得高纯度质粒,采用PROMEGA公司的回收试剂盒,具体步骤如下01081将摇床培养过夜的3ML菌液分次倒入15ML离心管中,104R/MIN离心2MIN；01092倒掉上清,加入300LCELLRESUSPENSIONSOLUTION,使菌体混匀；说明书CN104178490A109/13页1101103加入300LCELLLYSISSOLUTION,颠倒4次,混匀；01114加入。
27、300LNEUTRALIZATIONSOLUTION,颠倒4次,混匀；01125104R/MIN离心5MIN；01136将35ML注射器的活塞取下,再将空注射器插到微型柱上,向注射器内加入1MLRESUSPENDRESIN；01147将第5步所得的上清轻轻转移到加入RESIN的注射器中；01158装上活塞,轻轻推溶液到微型离心柱中；01169取下注射器,抽出活塞,再将注射器装到小柱上；011710加入2MLCOLUMNWASHSOLUTION,插上活塞,慢推；011811取下注射器,将小柱转移到L5ML离心管中,104R/MIN离心2MIN；011912将小柱转移到新的离心管中,加入50LNU。
28、ELEASEFREEWATER65水浴,放置LMIN；012013104R/MIN离心20SEC；012114所得溶液保存在20。0122以前述所获得的质粒作为模板,用T7引物序列为5TAATACGACTCACTATAGG3进行PCR扩增。0123PCR扩增体系012401250126PCR扩增程序如下0127说明书CN104178490A1110/13页120128将PCR产物进行纯化,纯化产物作为体外转录的模板01291将PCR产物加入等体积的苯酚氯仿,轻打混匀。4，12000R/MIN离心15MIN；01302转移上清于另一个离心管中,加入上清的2倍体积的无水乙醇,412000R/MIN。
29、离心10MIN；01313轻轻倒掉乙醇,再加200L75乙醇洗涤。47500R/MIN离心5MIN,倒掉上清,干燥沉淀；01324加入DEPC处理水溶解沉淀DNA。01337体外转录合成DSRNA0134以前述所获得的DNA作为模板,用T7RNA聚合酶进行转录0135013637反应2H。反应完毕,于70水浴15MIN后,冷却至室温。最后,将转录产物DSRNA进行纯化0137L在反应产物中加入1LDNASE和1LRNASEH,37温育30MIN；01382加入01倍体积醋酸钠3M,PH52和25倍体积的95乙醇,冰浴10MIN,412000R/MIN离心10MIN；01393轻轻倒掉上清,再加。
30、500L75乙醇洗涤。47500R/MIN离心10MINS,再倒掉上清,干燥沉淀；说明书CN104178490A1211/13页1301404加入DEPC处理水溶解DSRNA,将合成好的DSRNA于80保存备用。01415紫外分光光度计测定260NM处的吸光度,计算反应产物浓度,在1琼脂糖凝胶上电泳检测DSRNA的完整性。01428DSRNA处理线虫侵染实验0143如图2、3所示，将构建好的DSRNA在25NG/L浓度下喂饲禾谷孢囊线虫J2S24H,通过解剖显微镜镜检统计活线虫和死亡线虫的数目来计算线虫存活率，每个实验设置两个样本，样本之间的统计比较采用统计学软件SPSS20中的MANNWHI。
31、TNEYUTEST方法，显著差异值为P005。发现三条序列相比对照均有40以上的致死率，其中两条序列更是达到了显著致死80。图10144以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。0145说明书CN104178490A1312/13页140146说明书CN104178490A1413/13页15说明书CN104178490A151/3页16图1图2说明书附图CN104178490A162/3页17图3图4说明书附图CN104178490A173/3页18图5图6图7说明书附图CN104178490A18。