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1、10申请公布号CN104220595A43申请公布日20141217CN104220595A21申请号201280072237X22申请日20120404C12N15/09200601A61K39/395200601C07K16/18200601C07K16/46200601C12P21/0820060171申请人株式会社英仙蛋白质科学地址日本东京都72发明人石井敬介见供克之甲田克志野村富美子粥川容子松浦正74专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限公司11322代理人龙淳54发明名称抗CDH3（P钙粘着蛋白）抗体的药剂偶联物57摘要本发明的目的在于提供一种有效地杀伤表达CDH3的癌细胞的抗CDH。
2、3抗体药剂偶联物。根据本发明，提供一种将针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂连结而成的免疫复合物。85PCT国际申请进入国家阶段日2014100886PCT国际申请的申请数据PCT/JP2012/0592362012040487PCT国际申请的公布数据WO2013/150623JA2013101051INTCL权利要求书3页说明书19页序列表23页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书19页序列表23页附图6页10申请公布号CN104220595ACN104220595A1/3页21一种免疫复合物，其特征在于其是将针对CDH3的抗体或具。
3、有CDH3结合能力的其片段与化疗剂连结而成的免疫复合物。2如权利要求1所述的免疫复合物，其特征在于针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段对于表达CDH3的细胞显示细胞毒性。3如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于针对CDH3的抗体是抗体产生细胞产生的抗体，该抗体产生细胞是由投与了CDH3或表达CDH3的细胞作为免疫原的免疫细胞获得的。4如权利要求13中任一项所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体为单克隆抗体。5如权利要求14中任一项所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体被嵌合化。6如权利要求14中任一项所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体被人源化。7如权利要求14中任一项所述的免疫。
4、复合物，其特征在于所述抗体为人抗体。8如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号48、56及65中记载的氨基酸序列，L链包含序列号75、82及86中记载的氨基酸序列。9如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号52、60及70中记载的氨基酸序列，L链包含序列号75、82及91中记载的氨基酸序列。10如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号54、62及72中记载的氨基酸序列，L链包含序列号74、81及93中记载的氨基酸序列。11如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号55、63及73中记载。
5、的氨基酸序列，L链包含序列号80、85及94中记载的氨基酸序列。12如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号49、64及66中记载的氨基酸序列，L链包含序列号76、84及89中记载的氨基酸序列。13如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号49、58及68中记载的氨基酸序列，L链包含序列号79、82及90中记载的氨基酸序列。14如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号53、61及71中记载的氨基酸序列，L链包含序列号75、82及92中记载的氨基酸序列。15如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链。
6、包含序列号51、57及67中记载的氨基酸序列，L链包含序列号78、83权利要求书CN104220595A2/3页3及88中记载的氨基酸序列。16如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体在H链包含序列号50、59及69中记载的氨基酸序列，L链包含序列号77、83及87中记载的氨基酸序列。17如权利要求1或2所述的免疫复合物，其特征在于所述抗体具有由与权利要求816中任一项所述的抗体的H链的氨基酸序列具有至少90的序列同一性的氨基酸序列构成的H链。18如权利要求13中任一项所述的免疫复合物，其特征在于CDH3为哺乳类的CDH3。19如权利要求13中任一项所述的免疫复合物，其特征在于CD。
7、H3选自灵长类的CDH3。20如权利要求13中任一项所述的免疫复合物，其特征在于CDH3选自人的CDH3。21如权利要求13中任一项所述的免疫复合物，其特征在于CDH3是细胞表面表达的CDH3。22如权利要求121中任一项所述的免疫复合物，其特征在于所述具有CDH3结合能力的抗体片段是FAB，FAB2或SCFV。23如权利要求122中任一项所述的免疫复合物，其特征在于所述化疗剂是细胞毒性物质。24如权利要求23所述的免疫复合物，其特征在于所述细胞毒性物质选自美登素类及其衍生物。25如权利要求23所述的免疫复合物，其特征在于所述细胞毒性物质选自奥瑞他汀及其衍生物。26如权利要求24所述的免疫复合。
8、物，其特征在于所述美登素类及其衍生物选自DM1、DM3、DM4。27如权利要求25所述的免疫复合物，其特征在于所述奥瑞他汀及其衍生物选自MMAE或者MMAF。28如权利要求23所述的免疫复合物，其特征在于所述细胞毒性剂为DM1。29如权利要求28所述的免疫复合物，其特征在于针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段的每1分子结合有110个DM1。30如权利要求28所述的免疫复合物，其特征在于针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段的每1分子结合有38个DM1。31如权利要求130中任一项所述的免疫复合物，其特征在于针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂经由连接物。
9、结合。32如权利要求130中任一项所述的免疫复合物，其特征在于针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂经由抗体的FC区域的分子内二硫键结合。33如权利要求130中任一项所述的免疫复合物，其特征在于权利要求书CN104220595A3/3页4针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂的结合是以基因工程的方法改变抗体的FC区域而进行的结合。34如权利要求31所述的免疫复合物，其特征在于使针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂结合的连接物是2价反应性交联试剂。35如权利要求31所述的免疫复合物，其特征在于所述连接物选自N琥珀酰亚胺基4马来酰亚胺基甲基环。
10、己烷羧酸酯SMCC、N琥珀酰亚胺基4N马来酰亚胺基甲基环己烷1羧基6酰胺己酸酯LCSMCC、马来酰亚胺基十一酸N琥珀酰亚胺酯KMUA、马来酰亚胺基丁酸N琥珀酰亚胺酯GMBS、马来酰亚胺基己酸N羟基琥珀酰亚胺酯EMCS、间马来酰亚胺基苯甲酰基N羟基琥珀酰亚胺酯MBS、N马来酰亚胺基乙酰氧基琥珀酰亚胺酯AMAS、琥珀酰亚胺基6马来酰亚胺基丙酰胺基己酸酯SMPH、N琥珀酰亚胺基4对马来酰亚胺基苯基丁酸酯SMPB、及N对马来酰亚胺基苯基异氰酸酯PMPI、6马来酰亚胺基己酰基MC、马来酰亚胺基丙酰基MP、对氨基苄氧基羰基PAB、N琥珀酰亚胺基42吡啶基硫代戊酸酯SPP及N琥珀酰亚胺基4碘乙酰基氨基苯甲酸。
11、酯SIAB、N琥珀酰亚胺基42吡啶基硫代丁酸酯SPDB。36如权利要求31所述的免疫复合物，其特征在于所述连接物被蛋白酶切断。37如权利要求31所述的免疫复合物，其特征在于所述连接物含有VALCIT。38如权利要求31所述的免疫复合物，其特征在于所述连接物含有PABA。39一种医药组合物，其特征在于其包含权利要求1至38中任一项所述的免疫复合物，用于治疗以CDH3的过量表达为特征的癌。40如权利要求39所述的医药组合物，其特征在于其具有抗癌作用。41如权利要求39或40所述的医药组合物，其特征在于所述癌选自结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、浸润性膀胱癌、胰腺癌、脑转移癌、甲。
12、状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤、乳腺癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、胰腺鳞状细胞癌、结肠鳞状细胞癌、或胃鳞状细胞癌、前列腺癌、骨肉瘤或软组织肉瘤。权利要求书CN104220595A1/19页5抗CDH3P钙粘着蛋白抗体的药剂偶联物技术领域0001本发明涉及抗CDH3抗体的药剂偶联物。本发明还涉及一种抗CDH3抗体的药剂偶联物的使用方法。背景技术0002癌症为占死亡原因上位的重要的疾病，但其治疗需求尚未得到满足。近年来，为了解决现有的化疗对于正常细胞也造成损伤这样的问题点，正在积极研究利用以癌细胞特异性表达的特定分子作为靶向而设计药剂进行治疗的分子靶向。
13、药物来治疗癌症。0003作为其靶向之一，鉴定有作为细胞表面抗原的CDH3。CDH3是作为钙依赖性地参与同嗜性的细胞粘附的分子而被发现的膜蛋白质YOSHIDAANDTAKEICHI,CELL28217224,1982。具有由相互同源性高的约110个氨基酸残基构成的钙粘着蛋白重复序列的蛋白质称为钙粘着蛋白超家族，CDH3属于其主要成员。0004报告有在某种癌细胞中CDH3的表达上升例，对于与正常组织相比在癌组织中CDH3表达高的癌细胞使用抗体的癌治疗正在研究中WO2002/097395号公报、WO2007/102525号公报。0005作为分子靶向药物，实际上已经上市许多抗体医药，其大多是以抗体依赖。
14、性细胞毒活性ADCCANTIBODYDEPENDENTCELLULARCYTOTOXICITY为主要的作用机理。然而，其药效未必充分，也同时进行着以更强力的抗肿瘤效果为目标的技术开发。0006作为增强抗体的抗肿瘤能力的有效的方法之一，可以举出抗体与具有强力毒性的药剂毒素的连结。若将毒素单独向患者给药，则对正常组织也造成障碍，而无法成为有效的治疗方法。然而，通过连结与肿瘤细胞特异性的抗原结合的抗体，就可以具有不对正常的组织造成不良影响而仅杀伤肿瘤细胞的能力。这样的药剂称为抗体药物偶联物ADC。即，毒素在与抗体结合的状态下不显示任何毒性。但是，某种抗体若与作为靶向的抗原结合，则被摄入细胞内，被溶酶。
15、体分解。因此，结合有毒素的该种抗体被摄入细胞内并在细胞内分解，由此释放毒素，仅在特定的细胞内部表现毒性，利用其效果杀伤细胞。0007ADC中所使用的药剂成分中包含白喉毒素等细菌性蛋白毒素；篦麻毒素等植物蛋白毒素；奥瑞他汀、美登素类、刺孢霉素等低分子毒素及其衍生物。0008在ADC中，与抗体结合的药剂在血液中循环，在累积到作为靶向的肿瘤中后显示药效。在肿瘤部位以外的药剂释放脱离抗体由于具有产生副作用的危险性，故未必优选。简言之，优选与抗体结合的药剂在导入细胞内后从抗体脱离的设计。近年来，GENENTECH公司从这样的观点考虑，开发了将毒素经由非裂解型连接物SMCC与曲妥单抗结合而成的药剂TDM1。
16、，并进行临床试验，显示非常高的临床效果。另外，也开发了经由裂解性连接物与药剂成分连结而成的抗体药剂偶联物。例如，IMMUNOGEN公司进行了以表达NCAM抗原的癌为对象，经由二硫连接物SPP使HUN901抗体与药剂结合而成的抗体药剂偶联物的开发。0009如上所述，利用ADC治疗癌这样的观点为公知。在该领域中，需需求用于治疗肺说明书CN104220595A2/19页6癌、大肠癌这样的各种癌的进一步的药剂。对该目的特别有用的药剂包括毒性明显低但具有有益的治疗有效性的抗CDH3抗体药剂偶联物。这些及其它的限制乃至过去的问题点可通过本发明来解决。0010现有技术文献0011专利文献0012专利文献1W。
17、O2002/097395号公报0013专利文献2WO2007/102525号公报0014非专利文献0015非专利文献1YOSHIDAANDTAKEICHI,CELL28217224,1982发明内容0016发明所要解决的课题0017本发明的课题在于提供一种有效地杀伤表达CDH3的癌细胞的抗CDH3抗体药剂偶联物。0018用于解决课题的技术方案0019本发明的发明人为了解决上述课题而进行了潜心研究，结果发现，将针对CDH3的抗体与化疗剂连结而成的免疫复合物对于表达CDH3的癌细胞株显示强力的细胞毒活性，从而完成了本发明。0020即，根据本发明，提供一种将针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的。
18、其片段与化疗剂连结而成的免疫复合物。0021优选本发明的免疫复合物中，针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段对于表达CDH3的细胞显示细胞毒性。0022优选针对CDH3的抗体是抗体产生细胞产生的抗体，该抗体产生细胞是由投与了CDH3或表达CDH3的细胞作为免疫原的免疫细胞获得的。0023优选所述抗体为单克隆抗体。0024优选所述抗体被嵌合化。0025优选所述抗体被人源化。0026优选所述抗体为人抗体。0027优选所述抗体在H链包含序列号48、56及65中记载的氨基酸序列，L链包含序列号75、82及86中记载的氨基酸序列。0028优选所述抗体在H链包含序列号52、60及70中记载的氨基。
19、酸序列，L链包含序列号75、82及91中记载的氨基酸序列。0029优选所述抗体在H链包含序列号54、62及72中记载的氨基酸序列，L链包含序列号74、81及93中记载的氨基酸序列。0030优选所述抗体在H链包含序列号55、63及73中记载的氨基酸序列，L链包含序列号80、85及94中记载的氨基酸序列。0031优选所述抗体在H链包含序列号49、64及66中记载的氨基酸序列，L链包含序列号76、84及89中记载的氨基酸序列。0032优选所述抗体在H链包含序列号49、58及68中记载的氨基酸序列，L链包含序列说明书CN104220595A3/19页7号79、82及90中记载的氨基酸序列。0033优选。
20、所述抗体在H链包含序列号53、61及71中记载的氨基酸序列，L链包含序列号75、82及92中记载的氨基酸序列。0034优选所述抗体在H链包含序列号51、57及67中记载的氨基酸序列，L链包含序列号78、83及88中记载的氨基酸序列。0035优选所述抗体在H链包含序列号50、59及69中记载的氨基酸序列，L链包含序列号77、83及87中记载的氨基酸序列。0036优选所述抗体具有由与上述的本发明的抗体的H链的氨基酸序列具有至少90的序列同一性的氨基酸序列构成的H链。0037优选CDH3为哺乳类的CDH3。0038优选CDH3选自灵长类的CDH3。0039优选CDH3选自人的CDH3。0040优选C。
21、DH3为细胞表面表达的CDH3。0041优选所述具有CDH3结合能力的抗体片段为FAB，FAB2或SCFV。0042优选所述化疗剂为细胞毒性物质。0043优选所述细胞毒性物质选自美登素类MAYTANSINOID及其衍生物。0044优选所述细胞毒性物质选自奥瑞他汀AURISTATIN及其衍生物。0045优选所述美登素类及其衍生物选自DM1、DM3、DM4。0046优选所述奥瑞他汀及其衍生物选自MMAE或者MMAF。0047优选所述细胞毒性剂为DM1。0048优选针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段的每1分子结合有110个DM1。0049优选针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其。
22、片段的每1分子结合有38个DM1。0050优选针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂经由连接物结合。0051优选针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂经由抗体的FC区域的分子内二硫键结合。0052优选针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂的结合是以基因工程的方法改变抗体的FC区域而进行的结合。0053优选使针对CDH3的抗体或具有CDH3结合能力的其片段与化疗剂结合的连接物为2价反应性交联试剂。0054优选所述连接物选自N琥珀酰亚胺基4马来酰亚胺基甲基环己烷羧酸酯SMCC、N琥珀酰亚胺基4N马来酰亚胺基甲基环己烷1羧基6酰胺己酸酯LCSMC。
23、C、马来酰亚胺基十一酸N琥珀酰亚胺酯KMUA、马来酰亚胺基丁酸N琥珀酰亚胺酯GMBS、马来酰亚胺基己酸N羟基琥珀酰亚胺酯EMCS、间马来酰亚胺基苯甲酰基N羟基琥珀酰亚胺酯MBS、N马来酰亚胺基乙酰氧基琥珀酰亚胺酯AMAS、琥珀酰亚胺基6马来酰亚胺基丙酰胺基己酸酯SMPH、N琥珀酰亚胺基4对马来酰亚胺基苯基丁酸酯SMPB、及N对马来酰亚胺基苯基异氰酸酯PMPI、6马来酰亚胺基己酰基MC、马来酰亚胺基丙酰说明书CN104220595A4/19页8基MP、对氨基苄氧基羰基PAB、N琥珀酰亚胺基42吡啶基硫代戊酸酯SPP及N琥珀酰亚胺基4碘乙酰基氨基苯甲酸酯SIAB、N琥珀酰亚胺基42吡啶基硫代丁酸酯。
24、SPDB。0055优选所述连接物被蛋白酶切断。0056优选所述连接物含有VALCIT。0057优选所述连接物含有PABA。0058进而，根据本发明，提供一种医药组合物，其包含本发明的免疫复合物，用于治疗以CDH3的过量表达为特征的癌。0059优选本发明的医药组合物具有抗癌作用。0060优选所述癌选自结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、浸润性膀胱癌、胰腺癌、脑转移癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤、乳腺癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、胰腺鳞状细胞癌、结肠鳞状细胞癌、或胃鳞状细胞癌、前列腺癌、骨肉瘤或软组织肉瘤。0061发明的效果0。
25、062本发明提供的将抗CDH3抗体与化疗剂连结而成的免疫复合物与未结合化疗剂的抗体相比，对表达CDH3的癌细胞株显示更强力的细胞毒活性。因此，本发明的免疫复合物通过对具有表达CDH3的癌细胞的患者给药，可期待发挥高的抗癌作用。即，本发明的免疫复合物作为抗癌剂有用。附图说明0063图1表示使人CDH3强制表达细胞株与市售抗人CDH3抗体反应的流式细胞术的结果。ACHO细胞、BCDH3强制表达CHO细胞。A抗CDH3抗体001MG/ML、B抗CDH3抗体01MG/ML、C抗CDH3抗体1MG/ML0064图2表示获得抗体3例与各细胞株的典型的流式细胞术结果。ACDH3强制表达CHO细胞、BCHO细。
26、胞、C源自肺癌的细胞株NCIH358。A抗CDH3抗体001MG/ML、B抗CDH3抗体01MG/ML、C抗CDH3抗体1MG/ML。0065图3表示各种肿瘤组织的CDH3的MRNA的表达结果。A正常组织、B各种癌组织、C胰腺癌分化度0066图4表示各种人肿瘤组织中的CDH3的表达结果。0067图5表示使各CDH3嵌合抗体反应的流式细胞术的结果。ACHO细胞、BCDH3强制表达CHO细胞、C源自肺癌的细胞株NCIH3580068图6表示DM1SME的结构。0069图7表示CDH3抗体药剂偶联物的细胞毒性试验结果。ADCCDH3抗体药剂偶联物、NAKED药剂未结合CDH3抗体。0070图8表示使。
27、用了CDH3抗体药剂偶联物的动物试验结果。ADCCDH3抗体药剂偶联物、NAKED药剂未结合CDH3抗体具体实施方式0071下面，对本发明进一步详细地进行说明。说明书CN104220595A5/19页90072本发明的免疫复合物以有效地杀伤癌细胞的抗CDH3抗体药剂偶联物的形式提供。0073作为用于制作本发明的抗体的抗原，可以使用CDH3或其部分肽。作为一个例子，可以使用可溶型CDH3蛋白质等，但并不限定于此。0074本发明中所使用的抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。本发明的抗体可以通过多种方法中的任一者制造。抗体的制造方法为该领域众所周知的例如参照SAMBROOK,JETAL,MOL。
28、ECULARCLONING,COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS1989。0075A多克隆抗体的制作0076为了制作多克隆抗体，以CDH3或其部分肽作为抗原，将其投与哺乳动物，例如大鼠、小鼠、兔子等。对于每1只动物的抗原的给药量而言，在不使用佐剂时为01100MG，在使用佐剂时为1100G。作为佐剂，可以举出弗氏完全佐剂FCA、弗氏不完全佐剂FIA、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下、腹腔内等进行。另外，免疫的间隔没有特别限定，以数日至数周间隔、优选以25周间隔，进行免疫110次、优选25次。而且，在距最终的免疫日660天后，以酶联免疫测定法ELISAENZ。
29、YMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY或EIAENZYMEIMMUNOASSAY、放射性免疫测定法RIA；RADIOIMMUNOASSAY等测定抗体效价，在显示最大的抗体效价的日子采血，得到抗血清。在需要由抗血清精制抗体的情况下，可以通过适宜选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法等公知的方法或组合这些方法来精制。0077B单克隆抗体的制作0078为了制作单克隆抗体，首先，以CDH3或其部分肽作为抗原，将其投与哺乳动物，例如大鼠、小鼠、兔子等。对于每1只动物的抗原的给药量而言，在不使用佐剂时为01100MG，在使用佐剂时为1100G。作为佐剂，可以举出弗氏完全佐剂。
30、FCA、弗氏不完全佐剂FIA、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下、腹腔内等进行。另外，免疫的间隔没有特别限定，以数日至数周间隔、优选以25周间隔，进行免疫110次、优选25次。而且，在距最终的免疫日160天后，优选114天后，采集抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可以举出脾脏细胞、淋巴结细胞、外周血细胞等，但优选脾脏细胞或局所淋巴结细胞。0079为了得到细胞融合杂交瘤，进行抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的通常可获得的株化细胞。作为使用的细胞株，优选具有药剂选择性且具有无法在未融合的状态存活于HAT选择培养基含有次黄嘌呤、氨喋呤。
31、、胸苷中，仅在与抗体产生细胞融合的状态下能够存活的性质的细胞。作为骨髓瘤细胞，例如可以举出P3X63AG8U1P3U1、NS1等小鼠骨髓瘤细胞株。0080接着，使上述骨髓瘤细胞与抗体产生细胞细胞融合。对细胞融合而言，在不含血清的DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中，混合11061107个/ML的抗体产生细胞和21052106个/ML的骨髓瘤细胞抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞比优选51，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以使用平均分子量10006000道尔顿的聚乙二醇等。另外，也可以使用利用了电刺激例如电穿孔的市售的细胞融合装置使抗体产生细胞与骨髓瘤。
32、细胞融合。说明书CN104220595A6/19页100081从细胞融合处理后的细胞中筛选目的杂交瘤。作为其方法，将细胞悬浮液用例如含胎牛血清的RPMI1640培养基等适当地稀释后，以3105个/孔左右接种于微量滴定板上，在各孔中加入选择培养基，以后适当地更换选择培养基进行培养。其结果，以选择培养基开始培养后，从14天前后能够得到生长的细胞作为杂交瘤。0082接着，在增殖得到的杂交瘤的培养上清中，筛选目的抗体是否存在。杂交瘤的筛选只要按照通常的方法即可，没有特别限定。例如，可以采集作为杂交瘤生长的孔中所含的培养上清的一部分，通过酶联免疫测定法、放射性免疫测定法等，筛选产生与CDH3结合的抗体的。
33、杂交瘤。融合细胞的克隆可以利用有限稀释法等进行，最终建立作为单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。0083作为从建立的杂交瘤中采集单克隆抗体的方法，可以采用通常的细胞培养法或腹水采集法等。在细胞培养法中，将杂交瘤在含10胎牛血清的RPMI1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养培养基中，在通常的培养条件例如37、5CO2浓度下培养714天，从其培养上清中获得抗体。0084在腹水采集法的情况下，在与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物的同种系动物的腹腔内投与杂交瘤约1107个，使杂交瘤大量增殖。然后，在12周后采集腹水。在上述抗体的采集方法中，在需要精制抗体的情况下，可以通过适宜选择硫酸铵盐析法、离子。
34、交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法等公知的方法或组合这些方法来精制。0085本发明的抗体的种类没有特别限制，可以为小鼠抗体、人抗体、大鼠抗体、兔抗体、绵羊抗体、骆驼抗体、鸟抗体等、以及出于降低对人的异种抗原性等为目的而人为改变而的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等的任意种类。基因重组型抗体可以使用已知的方法制造。嵌合抗体为由人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区域和人抗体的重链、轻链的恒定区域构成的抗体，可以通过将编码小鼠抗体的可变区域的DNA与编码人抗体的恒定区域的DNA连结，将其重组入表达载体并导入宿主中使其产生来得到。人源化抗体为将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补性。
35、决定区域CDR移植入人抗体的互补性决定区域而得到的，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，由以末端部具有重叠的部分的方式制作的多个寡核苷酸利用PCR法合成以连结小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区域FRAMEWORKREGION；FR的方式设计的DNA序列。可通过将所得到的DNA与编码人抗体恒定区域的DNA连结，然后重组入表达载体，将其导入宿主中使其产生来得到EP239400号公报、国际公开WO96/02576号公报等。0086用于蛋白质表达的宿主细胞系多是在抗体生产体系中源自哺乳动物的细胞。该生产者可优先确定最适合要表达的基因产物的特定的宿主细胞系。作为通常的宿主细胞系，可以举出源自CHO的。
36、细胞株中国仓鼠卵巢细胞系、CV1猴肾脏系、COS表达SV40T抗原的CV1的衍生物、SP2/0小鼠骨髓瘤、P3X63AG3653小鼠骨髓瘤、及293人肾脏、293T表达SV40T抗原的293的衍生物，但并不限定于这些。宿主细胞系可以由商业设施及美国标准生物品收藏中心ATCC或所发表的文献的发表机关获得。0087作为宿主细胞系，优选为DGFR基因表达缺陷的源自CHO的细胞株或SP2/0的任意细胞系分别参照URLAND,G等，EFFECTOFGAMMARAYSATTHEDIHYDROFOLATEREDUCTASELOCUSDELETIONSANDINVERSIONS,SOMATCELLMOLGEN。
37、ETVOL12,1986P5555566、以及SCHULMAN,M等，ABETTERCELLLINEFORMAKINGHYBRIDOMASSECRETINGSPECIC说明书CN104220595A107/19页11ANTIBODIES,NATUREVOL276,1978,P269270。最优选宿主细胞系为DHFR缺失CHO。0088质粒在宿主细胞中的转染可使用任意的技术实现。作为具体的方法，可以举出利用转染包括磷酸钙法、DEAE法、脂质体转染及电穿孔、利用仙台病毒等的包膜导入DNA的方法、微注射、以及使用逆转录病毒或腺病毒等病毒载体的感染，但并不限定于这些参照CURRENTPROTOCOLS。
38、INMOLECULARBIOLOGY,CHAPTER9INTRODUCTIONOFDNAINTOMAMMALIANCELLS,JOHNWILEYANDSONS,INC。最优选利用电穿孔向宿主中导入质粒。0089另外，人抗体的获得方法也是已知的。例如，在体外用期望的抗原或表达期望的抗原的细胞将人淋巴细胞致敏，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，也可以得到具有与抗原的结合活性的期望的人抗体参照日本特公平159878。另外，可以通过以期望的抗原免疫具有人抗体基因的全部内容的转基因动物而获得期望的人抗体参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/2558。
39、5、WO96/34096、WO96/33735。此外，也已知使用人抗体文库，通过筛选获得人抗体的技术。例如，可以使人抗体的可变区域以单链抗体SCFV的形式利用噬菌体展示法表达在噬菌体的表面，选择与抗原结合的噬菌体。若分析所选择的噬菌体的基因，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区域的DNA序列。若与抗原结合的SCFV的DNA序列明确，则可以由该序列制作适当的表达载体，获得人抗体。这些方法已经是众所周知的，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。0090另外，这些抗体只要识。
40、别CDH3，则可以为一价抗体、二价抗体、多价抗体中的任意种类，也可以为抗体片段片段等低分子化抗体及抗体的修饰物等。另外，也可以为使FC部分与抗体片段及低分子化抗体、例如FAB、FAB、FAB2、FV、SCFVSINGLECHAINFV单链FV抗体、DIABODY双特异抗体等融合而成的物质。为了得到这样的抗体，只要构建编码这些抗体的基因，将其导入表达载体后，使其在适当的宿主细胞中表达即可。0091这些抗体也可以结合例如聚乙二醇PEG等各种分子而使用。这样的抗体修饰物可以通过对所得到的抗体实施化学修饰来得到。需要说明的是，抗体的修饰方法是本领域技术人员所公知的。0092在本发明的免疫复合物中，还可。
41、以在上述的抗体上结合化疗剂，用作细胞毒剂。本发明的免疫复合物例如可以通过使其与表达CDH3的癌细胞接触来杀伤癌细胞。0093作为本发明的免疫复合物的优选形式，可以举出在抗体上结合药剂等细胞毒性物质而成的所谓的ADC。0094作为本发明中所使用的化疗剂的例子，例如可以举出多卡米星DUOCARMYCIN、多卡米星的类似物及衍生物、以CC1065、CBI为主成分的多卡米星类似物、以MCBI为主成分的多卡米星类似物、以CCBI为主成分的多卡米星类似物、多柔比星、多柔比星偶联物、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、多拉司他汀、多拉司他汀10、考布他汀、刺孢霉素CALICHEAMICIN、美登素、美登素类。
42、似物、DM1，DM2，DM3，DM4、DMI、奥瑞他汀E、奥瑞他汀EBAEB、奥瑞他汀EFPAEFP、单甲基奥瑞他汀EMMAE、单甲基奥瑞他汀FMMAF、5苯甲酰基戊酸AE酯AEVB、TUBULYSIN、双萨拉唑DISORAZOLE、埃博霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、SN38、托泊替康、根霉素、棘霉素、秋水仙碱、长春碱、长春地辛、雌氮芥、西马多丁、艾榴塞洛素ELEUTHEROBIN、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、5氟尿嘧啶、6巯基嘌呤、阿糖胞苷、美法仑、长春罗新、异长春碱、放线菌素、柔红霉素、柔红霉素偶联物、丝裂霉素C、丝说明书CN104220595A118/19页12裂霉素A、洋红霉素、氨基。
43、喋呤、他利霉索、鬼臼毒素、鬼臼毒素衍生物、依托泊甙、依托泊甙磷酸盐、长春新碱、泰索、泰索帝视黄酸、丁酸、N8乙酰基亚精胺以及喜树碱等，但并不仅限于此。0095本发明中的ADC可以将上述的化疗剂与抗体结合，利用公知的方法制作。抗体和化疗剂可以经由它们自身具有的连结基团等直接结合，另外，也可以经由连接物或其它的物质间接地结合。0096化疗剂直接结合时的连结基团可以举出例如使用了SH基的二硫键及经由马来酰亚胺基的结合。例如，还原抗体的FC区域的分子内的二硫键和药剂的二硫键，将两者以二硫键结合。另外，还有经由马来酰亚胺基的方法。另外，作为其它的方法，也有以基因工程的方法在抗体内导入半胱氨酸的方法。00。
44、97也可将抗体和化疗剂经由其它的物质连接物间接地结合。优选连接物具有与抗体或化疗剂或者与两者反应的1种或2种以上的官能团。作为官能团的例子，可以举出氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺基、吡啶基等。0098作为连接物的例子，可以举出N琥珀酰亚胺基4马来酰亚胺基甲基环己烷羧酸酯SMCC、N琥珀酰亚胺基4N马来酰亚胺基甲基环己烷1羧基6酰胺己酸酯LCSMCC、马来酰亚胺基十一酸N琥珀酰亚胺酯KMUA、马来酰亚胺基丁酸N琥珀酰亚胺酯GMBS、马来酰亚胺基己酸N羟基琥珀酰亚胺酯EMCS、间马来酰亚胺基苯甲酰基N羟基琥珀酰亚胺酯MBS、N马来酰亚胺基乙酰氧基琥珀酰亚胺酯AMAS、琥珀酰亚胺基6马来酰亚胺基丙酰胺。
45、基己酸酯SMPH、N琥珀酰亚胺基4对马来酰亚胺基苯基丁酸酯SMPB、和N对马来酰亚胺基苯基异氰酸酯PMPI、6马来酰亚胺基己酰基MC、马来酰亚胺基丙酰基MP、对氨基苄氧基羰基PAB、N琥珀酰亚胺基42吡啶基硫代戊酸酯SPP及N琥珀酰亚胺基4碘乙酰基氨基苯甲酸酯SIAB、N琥珀酰亚胺基42吡啶基硫代丁酸酯SPDB等，但并不限定于这些。另外，该连接物例如可以为缬氨酸瓜氨酸VALCIT、丙氨酸苯丙氨酸ALAPHE这样的肽连接物，也可以分别适当地组合使用上述举出的连接物。0099关于化疗剂与抗体的结合方法，例如可以依据CANCERRESEARCH；682292802008、NATUREBIOTECHN。
46、OLOGY；2689252008、BIOCONJUGATECHEMISTRY；19、16732008、CANCERRESEARCH；681563002008、或日本特表2008516896号公报等中记载的方法进行。0100作为本发明的其它的实施方式，可以举出以化学或基因工程的方法在抗体上结合毒素TOXIN而成的所谓的免疫毒素。0101作为本发明中所使用的毒素，例如可以举出白喉毒素A链、假单胞菌内毒素、篦麻毒素链；无糖链篦麻毒素A链、白树毒素GELONIN、皂草素SAPORIN等。0102本发明的免疫复合物由于显示很高的细胞毒活性，因此可以用作细胞毒剂。进而，本发明的抗体可以用作CDH3高表达疾。
47、病的治疗药物。本发明的细胞毒剂及CDH3高表达疾病的治疗药物例如可以通过使其与表达钙粘着蛋白的癌细胞接触来杀伤癌细胞。作为人CDH3高表达疾病，可以举出结肠直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、浸润性膀胱癌、胰腺癌、脑转移癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、肺鳞状细说明书CN104220595A129/19页13胞癌、皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤、乳腺癌、肺腺癌、宫颈部鳞状细胞癌、胰腺鳞状细胞癌、结肠鳞状细胞癌、或胃鳞状细胞癌、前列腺癌、骨肉瘤或软组织肉瘤等。0103本发明的免疫复合物可以根据需要通过适宜组合药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等而作为医药组合物使用。作为本发。
48、明的医药组合物，例如可以制成注射剂。本发明的医药组合物的给药量依赖于患者的症状的程度、年龄及体重、给药方法等，作为有效成分的抗体的重量，通常为约10NG约100MG/KG体重的范围。0104利用以下的实施例对本发明进一步具体地进行说明，但本发明并不受实施例限定。0105实施例0106实施例1CDH3表达CHO细胞株的建立0107为了得到抗CDH3抗体筛选用细胞株，进行表达全长CDH3的CHO细胞的建立。01081CDH3基因表达载体的制作0109为了将序列号1所示的全长人CDH3DNA插入哺乳类表达载体PEF4/MYCHISBINVITROGEN公司中，在37下用2种限制酶KPNITAKARA。
49、BIO公司及XBAITAKARABIO公司处理1小时，然后利用T4DNA连接酶PROMEGA公司按照常规方法插入同样用KPNI及XBAI处理后的PEF4/MYCHISB中，得到表达载体PEF4CDH3MYCHIS。01102CDH3稳定表达株的获得0111依据FUGENE注册商标6转染试剂ROCHEDIAGNOSTICS公司的操作说明书，在转染日前一天向直径10CM的培养皿中接种8105细胞的CHO细胞，培养一晚后，将8G的表达载体PEF4CDH3MYCHIS和16L的FUGENE6试剂混入400L的无血清RPMI1640培养基SIGMAALDRICH公司，室温放置15分钟后，加入细胞培养液进行转染。在转染次日使用选择试剂ZEOCIN注册商标以有限稀释法进行克隆。0112CDH3全长表达CHO的克隆筛选利用使用了抗CMYC单克隆抗体SANTACRUZBIOTECHNOLOGY公司的蛋白质印迹法进行，其结果，得到表达量高、且增殖良好的。