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1、(10)申请公布号 CN 103740634 A (43)申请公布日 2014.04.23 CN 103740634 A (21)申请号 201410003169.2 (22)申请日 2014.01.03 C12N 3/00(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农业环境与可持续 发展研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号中国农科院环发所 206 室 申请人 中国农业科学院植物保护研究所 (72)发明人 曾希柏 蒋细良 苏世鸣 王秀荣 李莲芳 白玲玉 王亚男 段然 吴翠霞 (74)专。
2、利代理机构 北京君智知识产权代理事务 所 11305 代理人 刘秀娟 (54) 发明名称 一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法 与它的用途 (57) 摘要 本发明涉及一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及 其制备方法与它的用途。棘孢木霉菌厚垣孢子粉 剂制备方法包括耐砷活性保持培养、 纯化培养、 摇 瓶种子培养、 发酵种子培养、 控制发酵与后处理等 步骤。本发明棘孢木霉菌厚垣孢子具有高的抗逆 境能力， 其粉剂受环境温度、 酸碱度等影响小， 环 境中不同砷浓度水平对厚垣孢子萌发无明显影 响。因此， 棘孢木霉菌厚垣孢子具有很强的生命 力， 在土壤中存活时间很长， 明显促进土壤中砷的 挥发， 减少土壤中砷的总。
3、量， 从而可以有效地修复 受砷污染的土壤。本发明的方法能够缩短大量生 产棘孢木霉菌厚垣孢子所需的时间， 显著地降低 了棘孢木霉菌厚垣孢子生产成本， 有利于该技术 推广应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103740634 A CN 103740634 A 1/2 页 2 1. 一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法， 其特征在于该方法的步骤如下 ： A、 耐砷活性保持培养 按照棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比 1 ： 4。
4、5 55， 将含菌量为 1.0 9.9104cfu/ml的棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的砷浓度为4350mg/l的菌种培养 基里， 在温度 26 30与摇床转速 120 140rpm 的条件下连续培养 4 6 天， 待其瓶中 棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积的 1/2 2/3 时， 再从该瓶中取出棘孢木霉菌 菌悬液在上述含砷的 PGP 培养基中在上述条件下进行培养， 按照这种方式重复培养 3 4 次， 得到含菌量为 1.0 9.9104cfu/ml 的、 具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液 ； 然后， 按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比 1 ： 45 55， 将该。
5、棘孢 木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的无砷菌种培养基里， 在温度 26 30与摇床转速 120 140rpm 的条件下连续培养 3 5 天， 待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积 的 1/2 2/3 时结束纯化培养， 得到含菌量为 1.0 9.9104cfu/ml 的不含砷的， 且具有 较高耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液 ； B、 摇瓶种子培养 按照纯化棘孢木霉菌的菌悬液与摇瓶种子培养基的体积比 1 ： 400 500， 将步骤 B 得 到的含菌量为 1.0 9.9104cfu/ml 的纯化棘孢木霉菌的菌悬液接种于装有摇瓶种子培 养基的摇瓶中， 在温度2630与摇床转速160180rpm的。
6、条件下连续培养28-32小时， 待摇瓶中微生物进入其生长速度最快的指数生长期时结束培养， 得到摇瓶种子 ； C、 发酵种子培养 将步骤C得到的摇瓶种子按照摇瓶种子与发酵种子培养基的体积比1 ： 200250接入 发酵种子培养基中， 在温度 26 30与摇床转速 160 180rpm 的条件下连续培养 25 30 小时， 得到发酵种子 ； D、 控制发酵 在发酵罐中， 按照以发酵培养基体积计 6 10% 接种量将步骤 C 得到的发酵种子接种 到发酵培养基中在下述条件下进行控制发酵 ： 控制发酵温度 ： 在控制发酵第020小时为26； 在控制发酵第2050小时为28， 然后将发酵温度控制在 26直。
7、到控制发酵结束 ； 通气量 ： 以发酵培养基与空气体积比计， 在控制发酵第 0 15 小时为 1:0.6， 在控制发 酵第 15 50 小时为 1:1， 在控制发酵第 50 小时以后为 1:0.6 ； 搅拌速度 ： 160 180rpm ； E、 后处理 向步骤D中得到的控制发酵液中添加以控制发酵液总重量计3-6%硅藻土， 再对该发酵 液进行过滤， 得到的厚垣孢子经自然风干， 得到的固态厚垣孢子再使用研磨器进行研磨， 得 到棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于在步骤A中， 所述的菌种培养基是按照 下述方法制备得到的 ： 取20g削皮马铃薯在水中煮沸20分钟，。
8、 榨汁， 将得到的汁与1.0g葡萄糖、 0.3g蛋白胨、 2.0g 琼脂与 100ml 水混合， 将得到的混合物的 pH 值调节至 6.8 7.2， 灭菌后得到所述的 菌种培养基， 得到所述的菌种培养基。 权 利 要 求 书 CN 103740634 A 2 2/2 页 3 3. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于所述的砷是砷酸钠、 砷酸钾或砷酸钙。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于在步骤B中， 所述的摇瓶种子培养是按 照下述方法制备得到的 ： 将淀粉、 葡萄糖、 酵母粉与 CaCO3按照重量比 2.5 ： 1.2 ： 1.2 ： 0.2 溶于 100 重量份水中， 。
9、然后进行湿热灭菌， 得到所述的摇瓶种子培养。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于在步骤C中， 所述的发酵种子培养基是 按照下述方法制备得到的 ： 将淀粉、 葡萄糖、 酵母粉与 CaCO3按照重量比 4 ： 5 ： 2 ： 1 溶于 500 重量份水中， 将得到溶 液的 pH 值调节至 6.5 6.8， 然后蒸汽灭菌， 得到所述的发酵种子培养基。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于在步骤D中， 所述的发酵培养基是按照 下述方法制备得到的 ： 将淀粉、 酵母粉、 玉米浆、 玉米浆、 蛋白胨、 CaCO3按照重量比 16.5、 11.0、 22.0、 16.5、 2.05 溶。
10、于 650 重量份水中， 将得到溶液的 pH 值调节至 6.5 7.2， 然后蒸汽灭菌， 得到所述 的发酵培养基。 7.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于在步骤E中， 所述的过滤方法为板框压 滤法。 8. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于在步骤 E 中， 所述的自然风干温度是 20 30。 9. 根据权利要求 1-8 中任一项权利要求所述制备方法所得到的棘孢木霉菌厚垣孢子 粉剂， 其特征在于所述的粉剂只含有厚垣孢子， 所述厚垣孢子的含量是 8.3108cfu/g 以 上。 10. 根据权利要求 9 所述的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂在修复被砷污染的土壤中的用 途。 权 利 要 。
11、求 书 CN 103740634 A 3 1/14 页 4 一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途 【技术领域】 0001 本发明属于微生物技术领域。更具体地， 本发明涉及一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉 剂， 还涉及所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法， 还涉及所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉 剂的用途。 【背景技术】 0002 木霉菌 (Trichoderma spp.) 是一类土壤中普遍存在的腐生真菌， 其生长快、 生物 量大。木霉菌在其生长周期内可以产生三种繁殖体， 包括菌丝体、 厚垣孢子和分生孢子， 目 前生产实际中常用的木霉菌剂多为它的活分生孢子制剂， 如以色列开发的哈茨木霉 T39 可。
12、 湿性粉剂 Trichodex， 美国的 Topshield( 哈茨木霉 T22) 等。一些木霉菌常常可形成圆形 或椭圆形的厚垣孢子， 在基内菌丝上间生， 或者在营养菌丝侧枝的尖端端生， 其大小在 7 1210-13m， 表面光滑， 细胞壁有加厚现象， 无性生殖产生， 通常有耐不良环境条件的能 力。厚垣孢子是木霉菌重要的繁殖体形式。木霉属厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生 孢子， 至少能存活 20 月。 0003 在木霉菌的众多种类中， 棘孢木霉 （Trichoderma asperellum） 具有富集与转化 砷功能、 能忍耐高砷环境且生长良好。如 Zeng 等 (Capability of。
13、 Pentavalent Arsenic Bioaccumulation and Biovolatilization of Three Fungal Strains under Laboratory Conditions， Clean-Soil Air Water， 2010， 38(3),238-241) 报道的结果表明， 棘孢木霉菌 对环境中砷具有很高的耐受性， 并且可将环境中砷累积于细胞内， 同时将砷转化为易挥发 的形态从而释放到大气中， 进而减少环境中砷的含量。 因此， 棘孢木霉菌可被用于砷污染环 境的修复中。此外， 木霉菌的生防能力也被大家广泛认同。 0004 目前， 许多研究者就对。
14、木霉的产孢条件进行了大量的摸索， 以期高效地将该类木 霉菌应用于生产实践中。从木霉菌分生孢子的产生条件来看， 其在多种固体或液体培养基 中都能够产生分生孢子， 而且城市垃圾、 腐败的咖啡果皮、 禽类的粪便以及混以牛粪的咖啡 果皮、 香蕉叶、 甘蔗渣和麦麸等廉价物质均可作为木霉菌的固体培养基来生产分生孢子， 且 孢子产量都可达 109CFU/ 克左右。由此来看， 木霉菌产生分生孢子的生产条件相对要求较 低。 0005 近年来， 国内外研究发现 T.harzianum,T.viride 等木霉菌株在糖蜜玉米浆等 液体培养基中进行深层发酵 15 天左右可产生 107数量级的厚垣孢子 ； 在麦麸等、 。
15、灭菌土壤、 土壤浸出液及植物碎片等固体培养基中培养20天左右也可产生厚垣孢子达106数量级。 总 体来看， 目前报道的各木霉菌厚垣孢子的发酵时间均较长 （15 天） ， 且成本较高， 发酵的产 率较低， 并且发酵后生成的部分厚垣孢子的活性或作用能力可能会降低或丧失。 目前， 国内 外尚未见到具有富集与转化砷功能棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂制备的相关报道。 所生产出的 厚垣孢子如果以液态形式施用， 不仅运输不方便、 而且也易使菌剂受到污染 ； 而厚垣孢子经 制备成固态粉剂后， 不仅运输方便、 菌剂受污染的几率大大减少， 而且还利于储存、 方便应 用等， 同时对提高菌株的活性和应用效果等具有良好作用。 。
16、说 明 书 CN 103740634 A 4 2/14 页 5 【发明内容】 0006 要解决的技术问题 0007 本发明的目的是提供一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。 0008 本发明的另一个目的是提供所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法。 0009 本发明的另一个目的是提供所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的用途。 0010 技术方案 0011 本发明是通过下述技术方案实现的。 0012 本发明涉及一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的制备方法。 0013 本发明使用的棘孢木霉菌 （Trichoderma asperellum） 已在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保存， 保存编号为 CGMCC No。
17、.3186， 保存日期为 2009 年 7 月 09 日， 具体参见申请日 2012 年 09 月 26 日、 申请号 201210361866.6、 发明名称 “一种棘孢木霉 菌的筛选方法及其应用” 的发明专利申请。 0014 该制备方法的步骤如下 ： 0015 A、 耐砷活性保持培养 0016 按照棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比 1 ： 45 55， 将含菌量为 1.0 9.9104cfu/ml的棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的砷浓度为4350mg/l的菌种培养 基里， 在温度 26 30与摇床转速 120 140rpm 的条件下连续培养 4 6 天， 待其瓶中 棘孢木霉菌丝体体积为。
18、所述菌种培养基体积的 1/2 2/3 时， 再从该瓶中取出棘孢木霉菌 菌悬液在上述含砷的 PGP 培养基中在上述条件下进行培养， 按照这种方式重复培养 3 4 次， 得到含菌量为 1.0 9.9104cfu/ml 的、 具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液。然后， 按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比 1 ： 45 55， 将该棘孢 木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的无砷菌种培养基里， 在温度 26 30与摇床转速 120 140rpm 的条件下连续培养 3 5 天， 待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积为所述菌种培养基体积 的 1/2 2/3 时结束纯化培养， 得到含菌量为 1.0 9.9。
19、104cfu/ml 的不含砷的， 具有高 耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液。 0017 所述的菌种培养基 （PGP） 是按照下述方法制备得到的 ： 0018 取 20g 削皮马铃薯在水中煮沸 20 分钟， 榨汁， 将得到的汁与 1.0g 葡萄糖、 0.3g 蛋 白胨、 2.0g 琼脂与 100ml 水混合， 将得到的混合物的 pH 值调节至 6.8 7.2， 灭菌后得到所 述的菌种培养基， 得到所述的菌种培养基。 0019 在本发明中， 采用的灭菌方法是本技术领域里常规灭菌方法。 0020 根据本发明， 含砷菌种培养基是按照本发明对砷浓度的要求， 将含有 V 价砷的水 溶性化合物溶于所述的菌种培养。
20、基 （PGP） 中所得到的菌种培养基。 0021 在本发明中， 所述的含有 V 价砷的水溶性化合物例如是砷酸钠、 砷酸钾或砷酸钙， 优选地是砷酸钠。 0022 在本发明中， 所述含砷菌种培养基的砷浓度优选地是 45 48mg/l。 0023 优选地， 棘孢木霉菌菌悬液与菌种培养基的体积比是 1 ： 48 52， 更优选地是 1:50。 0024 在本发明中， 使用的微生物培养摇床是本技术领域里通常使用的培养微生物的设 说 明 书 CN 103740634 A 5 3/14 页 6 备， 是目前市场上销售的产品。 0025 在本发明中， 棘孢木霉菌丝体体积是采用微生物学实验常规方法 微生物学实验。
21、 技术 （合肥工业大学出版社， 2009） 、微生物学实验 （科学出版社， 2010） 测定的。 0026 棘孢木霉菌的菌悬液的含菌量采用稀释平板计数法， 该方法是微生物学实验操作 中的常规方法 （微生物学实验， 科学出版社， 2010） 。 0027 根据本发明， 棘孢木霉菌在含砷的 PGP 培养基中重复培养的目的在于充分活化棘 孢木霉菌对砷的耐受能力。然后于不含砷的 PGP 培养基中培养的目的在于去除棘孢木霉菌 中可能含有的砷， 同时保持其较高的耐砷活性。 0028 B、 摇瓶种子培养 0029 按照纯化棘孢木霉菌的菌悬液与摇瓶种子培养基的体积比 1 ： 400 500， 将步骤 B得到的。
22、含菌量为1.09.9104cfu/ml的纯化棘孢木霉菌的菌悬液接种于装有摇瓶种子 培养基的摇瓶中， 在温度 26 30与摇床转速 160 180rpm 的条件下连续培养 28-32 小 时， 待摇瓶中微生物进入其生长速度最快的指数生长期时结束培养， 得到摇瓶种子。 0030 所述的摇瓶种子培养是按照下述方法制备得到的 ： 0031 将淀粉、 葡萄糖、 酵母粉与CaCO3按照重量比2.5 ： 1.2 ： 1.2 ： 0.2溶于100重量份水 中， 然后进行湿热灭菌， 得到所述的摇瓶种子培养。 0032 湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、 沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌法以 高温高压水蒸气为介质。
23、， 由于蒸汽潜热大， 穿透力强， 容易使蛋白质变性或凝固， 最终导致 微生物死亡， 所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高， 是药物制剂生产过程中最常用的灭菌 方法。湿热灭菌法包括煮沸灭菌法、 巴氏消毒法、 高压蒸汽灭菌法、 流通蒸汽灭菌法和间歇 蒸汽灭菌法。 0033 在本发明中， 进行湿热灭菌所采用的方法是高压蒸汽灭菌法， 其具体条件是在温 度 121的条件下灭菌 15 分钟， 湿热灭菌所使用的设备是本技术领域里通常使用的灭菌设 备， 例如是北京科林恒达科技有限公司的型号为致微 GI80TR 的高温灭菌锅。 0034 C、 发酵种子培养 0035 将步骤 B 得到的摇瓶种子按照摇瓶种子与发酵种子。
24、培养基的体积比 1 ： 200 250 接入发酵种子培养基中， 在温度 26 30与摇床转速 160 180rpm 的条件下连续培养 25 30 小时， 得到发酵种子。 0036 这个步骤的主要目的在于培养用于大量生产棘孢木霉菌厚垣孢子的发酵种子。 0037 所述的发酵种子培养基是按照下述方法制备得到的 ： 0038 将淀粉、 葡萄糖、 酵母粉与 CaCO3按照重量比 4 ： 5 ： 2 ： 1 溶于 500 重量份水中， 将得 到溶液的 pH 值调节至 6.5 6.8， 然后蒸汽灭菌， 得到所述的发酵种子培养基。 0039 发酵种子培养基的 pH 值可以使用无机酸或无机碱水溶液进行调节。无机。
25、酸例如 是硫酸、 盐酸或磷酸 ； 无机碱例如是氢氧化钠、 氢氧化钾或碳酸钠。无机酸或无机碱水溶液 的浓度一般是 0.5-2.0N。 0040 在本发明中， 所述蒸汽灭菌的具体条件是在温度 121的条件下灭菌 15 分钟。 0041 本发明发酵种子培养所使用的设备是本技术领域里通常使用的种子培养设备， 例 如是金坛市城西富威实验仪器厂生产的型号为 HZQ-A 的大型气浴恒温摇床。 0042 D、 控制发酵 说 明 书 CN 103740634 A 6 4/14 页 7 0043 在发酵罐中， 按照以发酵培养基体积计 6 10% 接种量将步骤 C 得到的发酵种子 接种到发酵培养基中在下述条件下进行。
26、控制发酵 ： 0044 控制发酵温度 ： 在控制发酵第 0 20 小时为 26； 在控制发酵第 20 50 小时为 28， 然后将发酵温度控制在 26直到控制发酵结束 ； 0045 通气量 ： 以发酵培养基与空气体积比计， 在控制发酵第 0 15 小时为 1:0.6， 在控 制发酵第 15 50 小时为 1:1， 在控制发酵第 50 小时以后为 1:0.6 ； 0046 搅拌速度 ： 160 180rpm。 0047 所述的发酵培养基是按照下述方法制备得到的 ： 0048 将淀粉、 酵母粉、 玉米浆、 蛋白胨、 CaCO3按照重量比16.5、 11.0、 22.0、 16.5、 2.05溶 于。
27、 650 重量份水中， 将得到溶液的 pH 值调节至 6.5 7.2， 然后蒸汽灭菌， 得到所述的发酵 培养基。 0049 本发明控制发酵所使用的发酵罐是本技术领域里通常使用的发酵设备， 例如是江 苏丰泽生物工程设备制造有限公司生产的型号为 FZ-D300L 的发酵设备。 0050 这个步骤的主要作用在于通过优化发酵过程， 以便高效、 大量地生产棘孢木霉菌 厚垣孢子。 0051 E、 后处理 0052 向步骤D中得到的控制发酵液中添加以控制发酵液总重量计3-6%硅藻土， 再对该 发酵液进行过滤， 得到的厚垣孢子再自然风干， 得到的固态厚垣孢子再使用研磨器进行研 磨， 得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。
28、。 0053 使用硅藻土主要是用于提高发酵液中厚垣孢子的浓度， 避免过滤过程中可能产生 的厚垣孢子流失， 此外， 还可以提高过滤的速度， 提高工作效率。 0054 本发明对发酵液进行过滤的装置是本技术领域里通常使用的发酵设备， 例如是上 海钧鼎机械制造有限公司生产的 450 型铸铁板框式压滤机， 0055 过滤后的棘孢木霉菌厚垣孢子平铺在滤纸上， 让其在温度 20 30下自然风干。 0056 得到的固态厚垣孢子再使用本技术领域里通常使用的研磨器进行研磨， 得到棘孢 木霉菌厚垣孢子粉剂。 0057 本发明还涉及采用所述制备方法所得到的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。 所述的粉剂 只含有厚垣孢子， 所述厚。
29、垣孢子的含量是 8.3108cfu/g 以上。 0058 利用无菌水将本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂稀释， 然后使用光学显微镜 进行计数分析， 同时采用稀释平板计数分析， 分析结果表明所述棘孢木霉菌厚垣孢子粉的 厚垣孢子含量达到8.3108cfu/g。 通过显微镜分析还发现， 本发明制备的棘孢木霉菌厚垣 孢子粉全部为厚垣孢子， 无其它类型的孢子成分。以上方法均是微生物学实验操作中的通 过方法， 具体地可以参见 微生物学实验技术 （合肥工业大学出版社， 2009） 、微生物学实 验 （科学出版社， 2010） 。 0059 另外， 将本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂研磨至 100 目， 然。
30、后使用能谱仪 （EDS） 对其粉末样品进行了元素含量分析， 具体分析条件如下 ： 0060 美国热电Thermo-VG Scientific公司的ESCALAB250型能谱仪 ； 测定条件 ： 样品平 铺于专用样品架上， 待达到真空后， 利用仪器进行元素相对含量分析， 数据采用仪器配置的 专用软件进行分析。 说 明 书 CN 103740634 A 7 5/14 页 8 0061 元素含量分析结果列于下表1中。 由表1可见， 本发明制备的棘孢木霉菌厚垣孢子 粉剂的碳、 氧、 氮、 钾、 钠、 钙、 磷、 硫等元素含量， 具有典型的生物体元素含量特征 （参见 微 生物学 ， 高等教育出版社， 2。
31、009 年出版） 。 0062 表 1 ： 棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂元素含量分析结果 0063 0064 本发明还涉及所述的棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂在修复被砷污染的土壤中的用途。 0065 本发明人对棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂中的厚垣孢子萌发情况进行了研究。 0066 将棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂制成厚垣孢子悬液， 然后用无菌水稀释至约每毫升菌 液中含孢子数约 50cfu 时， 将其涂布于固态 PGP 培养基中， 于温度 28下恒温培养约 3-5 天， 待平板上的菌落萌发完毕时进行计数。 0067 本发明人发现， 在本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂中， 棘孢木霉菌厚垣孢子在 温度 4时不萌发， 在温度为 10。
32、以下时萌发亦不很明显。棘孢木霉厚垣孢子在温度 10 -40的条件下萌发结果列于图 5。从图 5 可以看出， 随着温度的增加， 厚垣孢子开始 萌发所需要的时间逐渐变少 ； 当温度达到 30时， 仅需 3 小时即开始萌发， 当培养时间达到 9 小时， 在该温度下厚垣孢子的萌发率已高达 90%。而在培养 9 小时时， 温度为 10的处理 中厚垣孢子的萌发率仅为 4%。综合以上结果， 尽管本发明中的厚垣孢子能在较为宽广的温 度范围内萌发， 但其萌发的最适温度范围为 25-30。 0068 本发明人还发现， 在本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂中， 棘孢木霉菌厚垣孢子对 pH 值适应范围较广， 其结果列于表 。
33、2 中。在 pH 值 3-10 范围内， 本发明棘孢木霉菌孢子均能 萌发 ； 最佳的 pH 值为 5-7。当培养时间为 3h 时， 该菌株厚垣孢子萌发率均高于 18%， 而当培 养时间达到 9h 时， 厚垣孢子萌发率均高于 90%。 0069 表 3 ： 本发明棘孢木霉菌厚垣孢子在不同 pH 值条件下萌发结果 0070 说 明 书 CN 103740634 A 8 6/14 页 9 0071 0072 将棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂制成厚垣孢子悬液， 然后用无菌水稀释至约每毫升菌 液中含孢子数约50cfu时， 将其涂布于含砷浓度分别为0、 1、 5、 10、 20、 40、 60、 100ppm的固。
34、态 PGP 培养基中， 于温度 28下恒温培养约 3-5 天， 待平板上的菌落萌发完毕时进行计数， 其 结果列于表 3。 0073 表 3 ： 本发明厚垣孢子粉剂中棘孢木霉菌厚垣孢子在不同浓度砷胁迫条件下的萌 发情况 0074 0075 由表3的结果可以看出， 与不加砷的固态PGP培养基对照相比， 在不同浓度砷胁迫 下对本发明棘孢木霉菌厚垣孢子的萌发均没有明显影响， 本发明厚垣孢子粉剂中的棘孢木 霉菌厚垣孢子表现出高耐砷能力。因此， 由于本发明厚垣孢子粉剂中的棘孢木霉菌厚垣孢 子依然保留了对环境中砷较高的耐受性能， 所以可以将本发明厚垣孢子粉剂用于砷污染环 境的修复中。 0076 另外， 本发。
35、明人还研究了在接种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂后， 捕获土壤中挥发态 砷的情况。 0077 将本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂接入 200g 砷污染土壤， 然后在温度 28下恒 温培养， 并采用挥发态砷的富集装置 （CN 201310023824， 发明名称 ： 一种对挥发态砷的富 集装置及其安装方法） 捕获挥发态的砷。 在培养42天在不同情况下挥发砷的结果列于图1。 由图 1 可以看到， 不添加所述粉剂的对照处理的砷挥发量为 0.01g， 而所述粉剂添加量为 说 明 书 CN 103740634 A 9 7/14 页 10 土壤重量的 1.0% 和 5% 时的砷挥发量分别为 0.06g 和 0.39g。
36、。因此， 与对照处理相比， 所述粉剂使砷挥发量分别提高约 6 倍和 39 倍， 表现出很好的对土壤中砷的挥发效果。因此 可以认为， 向土壤中添加本发明棘孢木霉菌孢子粉剂后能够促进土壤中砷的挥发。 0078 通过添加本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂， 可以明显促进土壤中砷的挥发， 减少 土壤中砷的总量， 从而对砷污染土壤进行修复。 此外， 利用捕获装置可以将挥发态的砷进行 捕获， 进而从根本上消除可能带来的二次污染。 0079 本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂的土壤试验方法如下 ： 将本发明棘孢木霉菌厚垣 孢子粉剂接入 200g 砷污染土壤， 然后在温度 28下恒温培养， 在不同的培养时间采集土壤 样品。
37、， 使用 0.5MNaHCO3溶液对土壤中有效态砷进行提取 （涂从等，“土壤砷有效性研究” ，西 南农业大学学报 ， 1992 年） ， 然后， 分析样品中总砷含量。 0080 在不同的情况下， 在培养 42 天在土壤中有效态砷的分析结果列于图 2。由图 2 可 以看到， 接种本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂后， 土壤中有效态砷含量均有明显下降。 当本 发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂添加量分别为 0.5%、 1.0% 和 5.0% 时， 在培养 42 天后， 与未加 该粉剂的对照 （CK） 相比， 试验土壤中有效态砷含量分别下降了约 3.6%、 5.4% 和 23.7%。本 发明棘孢木霉菌厚垣孢子本身。
38、具有高的抗逆境能力， 能在土壤中存活很长时间， 可以长期 地且稳定地对土壤中砷进行修复。 此外， 该菌株是从土壤中分离的， 且在厚垣孢子粉剂制备 过程中没有花费昂贵的营养成分或专用设备， 因此表现出很好的经济性及环境友好性。 0081 本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂施入土壤中后， 能明显促进空心菜的生长， 降低 砷对空心菜生长的胁迫。试验方法如下 ： 将本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂 （按 1% 和 5% 水 平） 接入1.5kg砷污染土壤中， 该土壤中砷的含量水平达到200mg/kg。 待厚垣孢子在土壤中 活化 1 周后， 每盆中播种空心菜种子 3 粒。待培养 60 天后， 采集空心菜地上及地下。
39、部生物 样品。在温度 90下杀青 2 小时后， 于烘箱内烘干样品， 称量地上及地下部生物样品重量。 0082 接种厚垣孢子粉剂后空心菜生长状况如图 3 所示。接种厚垣孢子粉剂后能明显促 进空心菜的生长， 降低土壤中砷对空心菜的影响。而在不接种厚垣孢子粉剂的 CK 处理中， 空心菜的生长明显受到土壤中砷的抑制。从图 4 可以看到接种厚垣孢子粉剂后空心菜的地 上部生物量情况。随着厚垣孢子粉剂添加量的增加， 空心菜地部上部干重显著性高于不接 厚垣孢子粉剂的 CK 处理， 这表明接种厚垣孢子粉剂可以显著促进空心菜的生长， 降低土壤 中砷的胁迫。 0083 目前还未见到有关棘孢木霉菌液体发酵生产厚垣孢子。
40、粉的文献报道。 本发明是具 体针对棘孢木霉菌厚垣孢子发酵生产及粉剂制备的方法， 具有高效、 产厚垣孢子量大， 更好 地保持棘孢木霉原有功能等方面的优势。 0084 有益效果 0085 本发明的有益效果是 ： 0086 本发明棘孢木霉菌厚垣孢子具有高的抗逆境能力， 本发明的棘孢木霉菌厚垣孢子 粉剂受环境中温度、 酸碱度等的影响较小， 环境中砷的不同浓度水平对厚垣孢子的萌发无 明显影响， 因此棘孢木霉菌厚垣孢子具有很强的生命力， 能在土壤中存活很长时间， 可以长 期地且稳定地对土壤中砷进行修复。 0087 往土壤中添加本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂， 可以明显促进土壤中砷的挥发， 减少土壤中砷的总量。
41、， 从而可以修复受砷污染的土壤。 此外， 利用捕获装置可以将挥发态的 说 明 书 CN 103740634 A 10 8/14 页 11 砷进行捕获， 进而从根本上消除可能带来的二次污染。 0088 往土壤中添加本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂， 可以显著减少土壤中砷的有效 性， 降低土壤中砷向作物体内转移的风险， 在一定程度上有利于保证农产品安全。此外， 土 壤中添加本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂， 可以显著促进作物的生长， 提高产量， 减少砷对 作物生长的胁迫。 0089 本发明制备的粉剂大幅度地缩短了棘孢木霉菌厚垣孢子大量生产所需的时间， 本 发明大量产厚垣孢子时间为 90 110 小时， 而。
42、现有技术为 15-20 天， 显著地降低了棘孢木 霉菌厚垣孢子生产成本， 有利于该技术推广应用。 【附图说明】 0090 图 1 表示在接种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂后土壤中挥发态砷的捕获情况图 ； 0091 图 2 表示在接种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂后土壤中有效态砷含量的情况图 ； 0092 图 3 表示接种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂后空心菜生长状况 0093 图 4 表示接种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂后空心菜地上部干重 0094 图 5 表示在本发明棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂中棘孢木霉菌厚垣孢子在不同温度 下的萌发情况图。 【具体实施方式】 0095 通过下述实施例将能够更好地理解本发明。 0096 实施例。
43、 1 ： 制备棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂 0097 一、 培养基的制备 0098 、 菌种培养基 (PGP) 的制备 ： 取 20g 削皮马铃薯在水中煮沸 20 分钟， 榨汁， 将得 到的汁与 1.0g 葡萄糖、 0.3g 蛋白胨、 2.0g 琼脂与 100ml 水混合， 将得到的混合物的 pH 值调 节至 6.8 7.2， 灭菌后得到所述的菌种培养基， 得到所述的菌种培养基。 0099 、 含砷 PGP 培养基的制备 ： 将砷酸钠溶于 100ml 上述 PGP 培养基中， 得到所述的 含砷 PGP 培养基。 0100 、 摇瓶种子培养基的制备 ： 将 2.5g 淀粉、 1.2g 葡萄糖、 1.2。
44、g 酵母粉与 0.2gCaCO3 溶于 100 重量份水中， 自然 pH 值， 然后进行湿热灭菌， 得到所述的摇瓶种子培养。 0101 、 发酵种子培养基的制备 ： 4kg 将淀粉、 5kg 葡萄糖、 2kg 酵母粉、 1kgCaCO3溶于 500ml 水中， 将其 pH 值调节至 6.6， 蒸汽灭菌， 得到所述的发酵种子培养基。 0102 发酵培养基的制备 ： 将 165kg 淀粉、 110kg 酵母粉、 220kg 玉米浆、 165kg 蛋白胨 与 20.5kgCaCO3溶于 6.5m3水中， 将其 pH 值调节至 6.8， 蒸汽灭菌， 得到所述的发酵培养基。 0103 二、 固态厚垣孢子。
45、粉剂的制备 0104 制备步骤如下 ： 0105 A、 耐砷活性保持培养 0106 按照棘孢木霉菌 （CGMCC No.3186） 菌悬液与菌种培养基的体积比 1 ： 48， 将含菌量 为 5.6104cfu/ml 的棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的砷浓度为 43mg/l 的菌种培养基 里， 在温度 26与摇床转速 140rpm 的条件下连续培养 4 天， 待其瓶中棘孢木霉菌丝体体积 为所述菌种培养基体积的 1/2 时， 再从该瓶中取出棘孢木霉菌菌悬液在上述含砷的 PGP 培 说 明 书 CN 103740634 A 11 9/14 页 12 养基中在上述条件下进行培养， 按照这种方式重复培养。
46、3次， 得到含菌量为5.6104cfu/ml 的、 具有耐砷活性的棘孢木霉菌的菌悬液 ； 然后， 按照含有具有耐砷活性的棘孢木霉菌菌悬 液与菌种培养基的体积比 1 ： 48， 将得到的棘孢木霉菌菌悬液接入在培养瓶中的无砷菌种 培养基里， 在温度 26与摇床转速 140rpm 的条件下连续培养 3 天， 待其瓶中棘孢木霉菌丝 体体积为所述菌种培养基体积的 1/2 时结束纯化培养， 得到含菌量为 5.6104cfu/ml 的纯 化棘孢木霉菌的菌悬液 ； 0107 B、 摇瓶种子培养 0108 按照纯化棘孢木霉菌的菌悬液与摇瓶种子培养基的体积比 1 ： 420， 将步骤 A 得到 的含菌量为 5.6。
47、104cfu/ml 的纯化棘孢木霉菌的菌悬液接种于装有摇瓶种子培养基的摇 瓶中， 在温度26与摇床转速170rpm的条件下连续培养29小时， 使菌株进行指数生长期时 结束培养， 得到摇瓶种子 ； 0109 C、 发酵种子培养 0110 将步骤B得到的摇瓶种子按照摇瓶种子与发酵种子培养基的体积比1 ： 200接入发 酵种子培养基中， 在温度 26与摇床转速 170rpm 的条件下连续培养 25 小时， 得到发酵种 子 ； 0111 D、 控制发酵 0112 在发酵罐中， 按照以发酵培养基体积计6%接种量将步骤C得到的发酵种子接种到 发酵培养基中在下述条件下进行控制发酵 ： 0113 控制发酵温度。
48、 ： 在控制发酵第 0 20 小时为 26； 在控制发酵第 20 50 小时为 28， 然后将发酵温度控制在 26直到控制发酵结束 ； 0114 通气量 ： 以发酵培养基与空气体积比计， 在控制发酵第 0 15 小时为 1:0.6， 在控 制发酵第 15 50 小时为 1:1， 在控制发酵第 50 小时以后为 1:0.6 ； 0115 搅拌速度 ： 160rpm ； 0116 E、 后处理 0117 向步骤D中得到的控制发酵液中添加以控制发酵液总重量计3%硅藻土， 再利用板 框压滤装置对步骤 D 得到的控制发酵液进行过滤， 得到的厚垣孢子再放置于滤纸上自然风 干， 得到的固态厚垣孢子再使用研磨器进行研磨， 得到棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂。 采用本说 明书描述的方法检测所述的粉剂只含有厚垣孢子， 所述厚垣孢子的含量是 8.3108cfu/g。 0118 实施例 2 ： 制备棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂 0119 一、 培养基的制备 0120 该实施例按。