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1、(10)申请公布号 CN 103833858 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103833858 A (21)申请号 201410109041.4 (22)申请日 2014.03.24 C07K 19/00(2006.01) C07K 7/08(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C40B 50/06(2006.01) (71)申请人 青岛市畜牧兽医研究所 地址 266000 山东省青岛市李沧区夏庄路 149 号 (72)发明人 赵金山 李和刚 张宝珣 李培培 江科 孙友德 戴正浩 杨培培 刘萌萌 曲明祥 (54) 发明名称 一对多肽及其编码基因和应用。
2、 (57) 摘要 本发明公开了一对多肽及其编码基因和应 用， 所述的一对多肽由多肽甲和多肽乙组成 ； 所 述多肽甲由 16 个 TAL 核酸识别单元组成， 每个 TAL 核酸识别单元中具有一个双连氨基酸 ； 所述 多肽乙由 17 个 TAL 核酸识别单元组成， 每个 TAL 核酸识别单元中具有一个双连氨基酸。本发明可 实现在细胞或个体水平上对猪 A20 基因进行准确 敲除或修饰， 以解析猪 A20 基因的功能、 构建猪 A20 基因突变库或获得相关疾病模型， 为猪育种 及医药研发服务。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产。
3、权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103833858 A CN 103833858 A 1/1 页 2 1. 一对多肽， 由多肽甲和多肽乙组成 ； 所述多肽甲由 16 个 TAL 核酸识别单元组成， 每 个 TAL 核酸识别单元中具有一个双连氨基酸 ； 所述多肽乙由 17 个 TAL 核酸识别单元组成， 每个 TAL 核酸识别单元中具有一个双连氨基酸 ； 所述多肽甲中的 16 个双连氨基酸依次如下 ： 序列表的序列 3 自 N 末端第 12-13 位氨 基酸残基、 第 46-47 位氨基酸残基、 第 80-81 位氨基酸残基、 第 1。
4、14-115 位氨基酸残基、 第 148-149 位氨基酸残基、 第 182-183 位氨基酸残基、 第 216-217 位氨基酸残基、 第 250-251 位氨基酸残基、 第 284-285 位氨基酸残基、 第 318-319 位氨基酸残基、 第 352-353 位氨基酸 残基、 第 386-387 位氨基酸残基、 第 420-421 位氨基酸残基、 第 454-455 位氨基酸残基、 第 488-489 位氨基酸残基和第 522-523 位氨基酸残基 ； 所述多肽乙中的 17 个双连氨基酸依次如下 ： 序列表的序列 4 自 N 末端第 12-13 位氨 基酸残基、 第 46-47 位氨基酸。
5、残基、 第 80-81 位氨基酸残基、 第 114-115 位氨基酸残基、 第 148-149 位氨基酸残基、 第 182-183 位氨基酸残基、 第 216-217 位氨基酸残基、 第 250-251 位氨基酸残基、 第 284-285 位氨基酸残基、 第 318-319 位氨基酸残基、 第 352-353 位氨基酸 残基、 第 386-387 位氨基酸残基、 第 420-421 位氨基酸残基、 第 454-455 位氨基酸残基、 第 488-489 位氨基酸残基、 第 522-523 位氨基酸残基和第 556-557 位氨基酸残基。 2. 如权利要求 1 所述的多肽对， 其特征在于 ： 所。
6、述多肽甲的氨基酸序列如序列表的序 列 2 所示 ； 所述多肽乙的氨基酸序列如序列表的序列 4 所示。 3. 一对 DNA 分子， 由编码权利要求 1 中的所述多肽甲的 DNA 分子甲和编码权利要求 1 中的所述多肽乙的 DNA 分子乙组成。 4. 如权利要求 3 所述的一对 DNA 分子， 其特征在于 ： 所述 DNA 分子甲中， 编码所述多肽甲的 16 个双连氨基酸的核苷酸依次如下 ： 序列表的 序列1自5 末端第34-39位核苷酸、 第136-141位核苷酸、 第238-243位核苷酸、 第340-345 位核苷酸、 第 442-447 位核苷酸、 第 544-549 位核苷酸、 第 64。
7、6-651 位核苷酸、 第 748-753 位 核苷酸、 第 850-855 位核苷酸、 第 952-957 位核苷酸、 第 1054-1059 位核苷酸、 第 1156-1161 位核苷酸、 第 1258-1263 位核苷酸、 第 1360-1365 位核苷酸、 第 1462-1467 位核苷酸和第 1564-1569 位核苷酸 ； 所述 DNA 分子乙中， 编码所述多肽乙的 17 个双连氨基酸的核苷酸依次如下 ： 序列表的 序列3自5 末端第34-39位核苷酸、 第136-141位核苷酸、 第238-243位核苷酸、 第340-345 位核苷酸、 第 442-447 位核苷酸、 第 544。
8、-549 位核苷酸、 第 646-651 位核苷酸、 第 748-753 位 核苷酸、 第 850-855 位核苷酸、 第 952-957 位核苷酸、 第 1054-1059 位核苷酸、 第 1156-1161 位核苷酸、 第 1258-1263 位核苷酸、 第 1360-1365 位核苷酸、 第 1462-1467 位核苷酸、 第 1564-1569 位核苷酸和第 1666-1671 位核苷酸。 5. 如权利要求 4 所述的一对 DNA 分子， 其特征在于 ： 所述 DNA 分子甲的核苷酸序列如 序列表的序列 1 所示， 所述 DNA 分子乙的核苷酸序列如序列表的序列 3 所示。 6. 权利。
9、要求 1 所述的一对多肽在特异识别和靶向修饰猪 A20 基因中的应用。 7. 权利要求 1 所述的一对多肽在构建猪 A20 基因突变库中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103833858 A 2 1/13 页 3 一对多肽及其编码基因和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体而言， 涉及一对多肽及其编码基因与应用， 尤 其涉及一对特异识别猪 A20 基因的多肽及其编码基因和应用。 背景技术 0002 A20 属于抗凋亡基因家族， 除具有抗凋亡的作用外， 它也是 NFB 信号通路一个 重要的抑制因子。而且， 相对于其它 NFB 抑制因子而言， A20 具有其自身独特的优势。
10、， 一 方面可克服 lB 促凋亡的缺点， 另一方面也不存在 p65RHD 发挥功能的入核门槛 ( 即 p65RHD 须进入核内方可发挥抑制作用 )。人 A20 目前已成功应用于异种供体用转基因猪制 作 (Oropeza et a1.， 2009)， 其抗内皮细胞凋亡、 抗炎症的作用在个体水平得到了验证。因 此， A20 基因可作为猪抗病育种及异种移植研究的一个重要候选基因。在细胞或个体水平 上对猪 A20 基因进行敲除或修饰， 可解析猪 A20 基因的功能， 为猪育种及医药研发服务。 0003 转录激活子样效应因子核酸酶 (transcription activator-like effect。
11、or nucleases， TALENs) 技术是一个高效的基因打靶新工具。转录因子激活效应物家族中有一 种蛋白 (TALEs) 能够识别、 结合 DNA。TALE 与 DNA 序列特异性结合主要是由 TAL 结构内 34 个恒定氨基酸序列介导。将 TALEs 与 Fokl 核酸内切酶的切割域相连接， 形成 TALENs， 从而 可以实现对基因组 DNA 序列的精确修饰。TALENs 是一种异源二聚体分子 ( 两单位的 TALE DNA 结合结构域融合到一单位的催化性结构域 )， 能够切割两个相隔较近的序列， 从而使得 特异性增强。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一对特异识别猪 A20。
12、 基因的多肽及其编码基因和应用。本发 明利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子 (TALE) 能够特异性地识别 猪 A20 基因。本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应 因子核酸酶 (TALENs)， 能够对猪 A20 基因进行准确、 高效地靶向修饰。 0005 具体地， 本发明的目的是这样实现的 ： 0006 一对特异识别猪 A20 基因的多肽 ( 命名为特异多肽对 )， 由多肽甲和多肽乙组成 ； 所述多肽甲由 16 个 TAL 核酸识别单元组成， 每个 TAL 核酸识别单元中具有一个双连氨基 酸 ； 所述多肽乙由 17 个 TAL 核酸识别单元组成。
13、， 每个 TAL 核酸识别单元中具有一个双连氨 基酸 ； 0007 所述多肽甲中的 16 个双连氨基酸依次如下 ： 序列表的序列 3 自 N 末端第 12-13 位 氨基酸残基、 第 46-47 位氨基酸残基、 第 80-81 位氨基酸残基、 第 114-115 位氨基酸残基、 第 148-149 位氨基酸残基、 第 182-183 位氨基酸残基、 第 216-217 位氨基酸残基、 第 250-251 位氨基酸残基、 第 284-285 位氨基酸残基、 第 318-319 位氨基酸残基、 第 352-353 位氨基酸 残基、 第 386-387 位氨基酸残基、 第 420-421 位氨基酸残。
14、基、 第 454-455 位氨基酸残基、 第 488-489 位氨基酸残基和第 522-523 位氨基酸残基 ； 说 明 书 CN 103833858 A 3 2/13 页 4 0008 所述多肽乙中的 17 个双连氨基酸依次如下 ： 序列表的序列 4 自 N 末端第 12-13 位 氨基酸残基、 第 46-47 位氨基酸残基、 第 80-81 位氨基酸残基、 第 114-115 位氨基酸残基、 第 148-149 位氨基酸残基、 第 182-183 位氨基酸残基、 第 216-217 位氨基酸残基、 第 250-251 位氨基酸残基、 第 284-285 位氨基酸残基、 第 318-319 。
15、位氨基酸残基、 第 352-353 位氨基酸 残基、 第 386-387 位氨基酸残基、 第 420-421 位氨基酸残基、 第 454-455 位氨基酸残基、 第 488-489 位氨基酸残基、 第 522-523 位氨基酸残基和第 556-557 位氨基酸残基。 0009 所述多肽甲的氨基酸序列具体可如序列表的序列 2 所示。 0010 所述多肽乙的氨基酸序列具体可如序列表的序列 4 所示。 0011 本发明还保护一对 DNA 分子 ( 命名为特异 DNA 分子对 )， 由编码所述多肽甲的 DNA 分子甲和编码所述多肽乙的 DNA 分子乙组成。 0012 所述 DNA 分子甲中， 编码所述。
16、多肽甲的 16 个双连氨基酸的核苷酸依次如下 ： 序列 表的序列 1 自 5 末端第 34-39 位核苷酸、 第 136-141 位核苷酸、 第 238-243 位核苷酸、 第 340-345 位核苷酸、 第 442-447 位核苷酸、 第 544-549 位核苷酸、 第 646-651 位核苷酸、 第 748-753 位核苷酸、 第 850-855 位核苷酸、 第 952-957 位核苷酸、 第 1054-1059 位核苷酸、 第 1156-1161位核苷酸、 第1258-1263位核苷酸、 第1360-1365位核苷酸、 第1462-1467位核苷 酸和第 1564-1569 位核苷酸。 。
17、0013 所述 DNA 分子乙中， 编码所述多肽乙的 17 个双连氨基酸的核苷酸依次如下 ： 序列 表的序列 3 自 5 末端第 34-39 位核苷酸、 第 136-141 位核苷酸、 第 238-243 位核苷酸、 第 340-345 位核苷酸、 第 442-447 位核苷酸、 第 544-549 位核苷酸、 第 646-651 位核苷酸、 第 748-753 位核苷酸、 第 850-855 位核苷酸、 第 952-957 位核苷酸、 第 1054-1059 位核苷酸、 第 1156-1161位核苷酸、 第1258-1263位核苷酸、 第1360-1365位核苷酸、 第1462-1467位核。
18、苷 酸、 第 1564-1569 位核苷酸和第 1666-1671 位核苷酸。 0014 所述 DNA 分子甲的核苷酸序列具体可如序列表中的序列 1 所示。 0015 所述 DNA 分子乙的核苷酸序列具体可如序列表中的序列 3 所示。 0016 本发明还保护所述特异多肽对在特异识别和靶向修饰猪 A20 基因中的应用。所述 猪 A20 基因， 其 NCBI Genne ID 为 392583951。 0017 本发明还保护所述特异多肽对在构建猪 A20 基因突变库中的应用。所述猪 A20 基 因， 其 NCBI Gene ID 为 392583951。 0018 与现有技术相比， 本发明提供了特。
19、异识别猪 A20 基因的多肽对， 并提供了该多肽 对的编码基因。本发明可实现在细胞或个体水平上对猪 A20 基因进行准确敲除或修饰， 以 解析猪A20基因的功能、 构建猪A20基因突变库或获得相关疾病模型， 为猪育种及医药研发 服务。 附图说明 0019 图 1 为 TALENs 靶点设计结果示意图。 0020 图 2 为 TALEN 质粒对 ( 左臂 TALEN 和右臂 TALEN) 转染猪 PEF 细胞 60 小时后提取 DNA 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物克隆后的部分测序结果 ( 突变序列 )。 0021 图 3 为 TALEN 质粒对的工作原理示意图。 说 明 书 CN 10。
20、3833858 A 4 3/13 页 5 具体实施方式 0022 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。以下实施例中， 如无特殊说明， 均采用低糖 DMEM 培养基培养细胞。 0023 FastTALETM TALEN 快 速 构 建 试 剂 盒 ： 上 海 斯 丹 赛 生 物 技 术 有 限 公 司， CatNo.1802-030。该试剂盒包含两个模块板 ： 模块板 1 。
21、包含 96 个模块， 每个模块识别连续 的两个碱基 ； 模块板 2 包含 76 个模块， 其中 48 个模块识别连续的两个碱基， 28 个模块识别 单个碱基。另外， 该试剂盒还包括其他组分 ： 溶液 1、 溶液 2、 溶液 3、 溶液 4、 溶液 5、 感受态 细胞、 SOC 培养基、 ddH2O ； TALEN 骨架载体， 包括左臂骨架和右臂骨架。 0024 实施例 1、 TALENs 质粒对的构建 0025 1、 TALENs 靶点设计 0026 采用在线软件 (https ： tale-nt.cac.cornell.edu) 设计。将猪 A20 基因 CDS 序列 (NCBI Gene 。
22、ID 为 392583951) 输入软件中， 在 7-60bp 区域找到靶序列， 具体示 意图如图 1 所示。TALENs 左臂识别序列是 5 -GAGCAACTCCTTCCCC-3 ， 右臂识别序列是 5 -CTTCACAGCCTTCCGCA-3 。 0027 2、 TALENs 模块组装 0028 依照 FastTALETMTALEN 快速构建试剂盒 ( 以下简称 “试剂盒” ) 说明书进行。具体 步骤如下 ： 0029 1) 将左右臂识别序列分别拆分为 9 个模块， 以一个或两个碱基组合为一个模块， 依次进行标记， 如首个标记为 1， 最后一个标记为 9， 如下所示 ： 0030 左臂 。
23、L4 ： G1AG2CA3AC4T5CC6TT7CC8CC9( 使用骨架载体 L15) 0031 右臂 R4 ： CT1TC2AC3A4GC5CT6TC7CG8CA9( 使用骨架载体 R11) 0032 2)从试剂盒中取出相应编号的9个模块， 每个模块取1.5微升， 并将其加入同一个 PCR 管中。 0033 3) 将溶液 1、 溶液 2 从 -20冰箱取出置于冰盒上， 溶液 3 放置于 37水浴锅中溶 解。 0034 4)按如下体系加样， 先加入相应的TALEN骨架载体(L15或R11)， 然后将溶液3、 溶 液 1、 溶液 2 依次加入步骤 2 的 PCR 管中， 最后加水补至 20 微升。
24、， 短暂离心混匀。 0035 连接体系 ： 说 明 书 CN 103833858 A 5 4/13 页 6 0036 0037 5) 将上述 PCR 管放入 PCR 仪中进行连接反应 ( 关掉 PCR 仪热盖温度 )。 0038 连接程序如下 ： 0039 0040 0041 6) 取出 PCR 管， 将溶液 4(1 微升 )、 溶液 5(0.5 微升 ) 依次加入该管中， 混匀， 在 PCR 仪中 37孵育一小时。 0042 7) 将步骤 6 的最终产物 (20 微升 ) 加入含感受态细胞 ( 试剂盒组分 ) 的 FP 管中， 混匀， 在冰上放置 30 分钟， 然后放入 42水浴锅中热激 4。
25、5 秒， 在迅速放置于冰上 3 分钟。 0043 8) 在超净工作台中向上一步的 EP 管中加入 500 微升 SOC 溶液 ( 试剂盒组分 )， 置 于 37、 250rpm 的摇床中培养 30 分钟。 0044 9) 将上一步的 EP 管取出， 4000rpm 离心 5 分钟。 0045 10)在超净工作台中弃去EP管中的大部分上清， 留下约100微升， 并将沉淀轻轻吹 打均匀， 均匀涂布于卡那霉素抗性的平板中， 置于 37培养箱中培养 12-16 小时。 0046 11) 次日挑取 10 个单克隆， 将单克隆接种于装有 5 毫升 LB 培养液 ( 含卡那霉素 ) 的 15 毫升离心管中，。
26、 在 37、 250rpm 的摇床中培养 16 小时。 0047 12) 将上一步所得单克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序 正向引物为 5-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3 ， 测序反向引物为 5-AGCTGGGCCACGATTGAC-3。 所得一对质粒命名为左臂 TALEN 和右臂 TALEN。左臂 TALEN 质粒测序所得序列为序列表所 示序列 1， 右臂 TALEN 质粒测序所得序列为序列表所示序列 3。 0048 实施例 2、 通过测序验证实施例 1 构建的 TALENs 对的活性 0049 PEF 细胞 ( 猪胎儿成纤维细胞 ) ： 从流产的猪胎儿中分离得。
27、到 PEF 细胞 ( 分离方法 参见文献 ： 李红， 魏红江， 许成盛， 汪霞， 卿玉波， 曾养志 ； 版纳微型猪近交系胎儿成纤维细 说 明 书 CN 103833858 A 6 5/13 页 7 胞系的建立及其生物学特征 ； 湖南农业大学学报 ( 自然科学版 ) ； 第 36 卷第 6 期 ； 2010 年 12 月 ； 678-682)。 0050 1、 将重组质粒左臂 TALEN 和右臂 TALEN 各 4g 通过电转化的方式共转染 1106PEF 细胞， 得到重组细胞。 0051 2、 将步骤 1 得到的重组细胞 30培养 60 小时， 然后收集细胞。 0052 3、 提取步骤 2 收。
28、集的细胞的基因组 DNA 并作为模板， 用 PCRF 与 PCRR 组成的引物 对进行 PCR 扩增， 回收 249bp 的 PCR 扩增产物。 0053 PCRF ： 5 -ATGGCTGAGCAACTCCTTC-3 ； 0054 PCRR ： 5 -GAGCTTCTTCTGGCTTTCC-3 。 0055 4、 将步骤 3 得到的 PCR 扩增产物与 pMD18-T 载体 ( 宝生物， 货号 ： D101A) 连接， 得 到连接产物。 0056 5、 将步骤 4 得到的连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞 ( 宝生物， D9057S)， 然后涂布于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上进。
29、行培养， 随机挑取100个克隆并进行 测序， 计算突变的克隆占总体克隆数的比例， 从而估算出该对 TALEN 质粒的效率。结果发现 4 个克隆在预期切割位点附近出现突变 ( 详见图 2)， 即重组质粒左臂 TALEN 和右臂 TALEN 组成的 TALEN 质粒对在 PEF 细胞基因组中的切割效率达 4。 0057 重组质粒左臂TALEN和右臂TALEN的工作原理见图3， 两种带有Fok I功能域的靶 向 TALE 核酸酶分别在 CMV 启动子控制下高效表达， 并进入细胞核内， 与相应的靶点 DNA 发 生特异性结合， 使得 Fok I 核酸内切酶形成二聚体行使 DNA 切割活性， 切断目标基。
30、因 DNA 双 链。 0058 说 明 书 CN 103833858 A 7 6/13 页 8 0059 说 明 书 CN 103833858 A 8 7/13 页 9 0060 说 明 书 CN 103833858 A 9 8/13 页 10 0061 说 明 书 CN 103833858 A 10 9/13 页 11 0062 说 明 书 CN 103833858 A 11 10/13 页 12 0063 说 明 书 CN 103833858 A 12 11/13 页 13 0064 说 明 书 CN 103833858 A 13 12/13 页 14 0065 说 明 书 CN 103833858 A 14 13/13 页 15 说 明 书 CN 103833858 A 15 1/1 页 16 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103833858 A 16 。