一种用于定性检测半胱氨酸、高半胱氨酸的磷光铂配合物及其制备方法.pdf

本发明涉及磷光化学传感器技术领域，具体涉及一种用于定性检测半胱氨酸、高半胱氨酸的磷光铂配合物及其制备方法。该磷光铂配合物其特征在于是一种含醛基的金属铂配合物，该铂配合物的醛基能与高半胱氨酸和半胱氨酸的氨基和巯基发生环化反应转变为杂环，原铂配合物中存在醛基与苯环共轭，而与半胱氨酸或者高半胱氨酸反应以后醛基与苯环的共轭消失，从而影响了所生成产物的光谱性质，利用此光谱性质的改变来检测半胱氨酸和高半胱氨酸。本发明中的铂配合物溶液在365nm紫外光激发时发出绿色磷光，而在与巯基氨基酸作用后发出黄色磷光，其它的氨基酸对之没有干扰。

1.  一种用于定性检测半胱氨酸、高半胱氨酸的磷光铂配合物，具体来说是一种含醛基的铂配合物，其特征在于结构式如下：


2.  一种如权利要求1所述的磷光铂配合物的制备方法，其特征在于制备步骤如下：
(1)首先制备1，10-菲咯啉铂二氯的配合物，Pt(phen)Cl₂，其中phen为1，10-菲咯啉：
称取K₂PtCl₄和1，10-菲咯啉加入到双颈瓶中，二者的质量比为8～0.2∶1，最佳质量比为2∶1；再加入0.05～0.5M的HCl溶液，HCl溶液最佳溶液浓度为0.1M；HCl溶液与1，10-菲咯啉的质量比例为10000～600∶1，最佳质量比例为3000∶1；然后将反应混合物加热至80℃～100℃，最佳反应温度为100℃；搅拌反应1～48小时，最佳反应条件为20小时；反应结束后，冷却到室温，有沉淀生成，所得沉淀分别用热水洗涤，并真空干燥，得到亮黄色固体1，10-菲咯啉铂二氯的配合物，Pt(phen)Cl₂；
(2)将步骤(1)中制得的1，10-菲咯啉铂二氯的配合物和碘化亚铜固体加入三颈瓶内，其中1，10-菲咯啉铂二氯的配合物与碘化亚铜的摩尔比为20∶1～4∶1，最佳摩尔比为10∶1；然后加入二异丙胺与二氯甲烷的混合溶剂，体积比1∶5～1∶80，最佳体积比1∶20；1，10菲咯啉铂二氯的配合物与二异丙胺的质量比例为1～1∶25，最佳质量比列为1∶5；在室温下搅拌均匀之后缓慢滴加对乙炔基苯甲醛，其中1，10-菲咯啉铂二氯的配合物与对乙炔基苯甲醛的摩尔比为1∶1～1∶15，最佳摩尔比为1∶4；滴加完后将反应混合物在常温下搅拌1～40小时，最佳反应条件为18小时；反应结束后，用二氯甲烷为洗脱剂柱层析分离，即制得所述磷光铂配合物的纯品。

3.  一种如权利要求1所述的磷光铂配合物在检测半胱氨酸和高半胱氨酸中的应用，其特征在于检测半胱氨酸和高半胱氨酸是在乙腈和水的混合溶液中进行。

一种用于定性检测半胱氨酸、高半胱氨酸的磷光铂配合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及磷光化学传感器技术领域，具体涉及一种用于定性检测半胱氨酸、高半胱氨酸的磷光铂配合物及其制备方法。
背景技术
磷光重金属配合物由于其优越的光物理性质，在光化学领域的受到越来越多的关注。它们具有如下几个特点：发射波长随所处环境的变化而发生变化；相比有机磷光材料具有较大的(斯托克斯)Stokes位移和较长的发射寿命，而长的发射寿命有利于使用时间分辨技术使磷光信号与背景的磷光信号相区分，可以有效地避免背景荧光的干扰。
作为仅有的两种含巯基的天然氨基酸，高半胱氨酸和半胱氨酸在生理及临床上都有重要的功能。其中，高半胱氨酸在临床上的应用主要作为心血管疾病，尤其是冠状动脉粥硬化和心肌梗塞的危险指标，它的浓度升高程度与疾病的危险性成正比，而半胱氨酸参与细胞的还原过程和肝脏内的磷脂代谢，它有保护肝细胞不受损害、促使肝脏功能旺盛的作用。由于这些重要的功能，这两种氨基酸的检测已经受到很大的关注。目前的检测方法主要有色谱分离和免疫分析，然而上述两种方法都需要昂贵复杂的仪器，且操作也很繁琐。
目前已有一些磷光重金属配合物，如铱、铼和钌配合物，被用作检测阴离子、氧浓度和金属离子的磷光化学传感器。然而作为性能优越的磷光材料，金属铂配合物用于化学传感器的价值尚未得到充分开发。到目前为止，只有少数铂配合物被用作检测碱金属离子，尚未有关于检测氨基酸的铂配合物报道。
发明内容
本发明的目的在于提出一种铂配合物，该铂配合物可作为磷光化学传感器定性检测水和乙腈混合溶液中的巯基氨基酸，以解决巯基氨基酸的快速实时检测的技术问题，所述巯基氨基酸为高半胱氨酸(Hcy)和半胱氨酸(Cys)。
本发明提出的用于定性检测水和乙腈混合溶液中巯基氨基酸的磷光铂配合物，其结构式中含有能与高半胱氨酸和半胱氨酸的氨基及巯基发生环化反应的醛基，具体结构式为：

本发明所提出的含有醛基的磷光铂配合物其制备方法为：
(1)  首先制备1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物，Pt(phen)Cl₂，其中phen为1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)。称取K₂PtCl₄和1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)加入到双颈瓶中，二者的质量比为8～0.2∶1，最佳质量比为2∶1；再加入0.05～0.5M的HCl溶液，最佳溶液浓度为0.1M；HCl溶液与1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)的质量比例为10000～600∶1，最佳质量比例为3000∶1；然后将反应混合物加热至80℃～100℃，最佳反应温度为100℃。搅拌反应1～48小时，最佳反应条件为20小时，反应结束后，冷却到室温(25℃)，有沉淀生成。所得沉淀分别用热水洗涤，并用真空干燥，得到亮黄色固体1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物，Pt(phen)Cl₂。
(2)将步骤(1)中制得的1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物和碘化亚铜固体加入三颈瓶内，其中1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物与碘化亚铜的摩尔比为20∶1～4∶1，最佳摩尔比为10∶1；然后加入二异丙胺与二氯甲烷的混合溶剂，体积比1∶5～1∶80，最佳体积比1∶20；1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物与二异丙胺的质量比例为1～1∶25，最佳质量比列为1∶5；在室温下(25℃)搅拌均匀之后缓慢滴加对乙炔基苯甲醛，其中1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物与对乙炔基苯甲醛的摩尔比为1∶1～1∶15，最佳摩尔比为1∶4；滴加完后将反应混合物在常温下(25℃)搅拌1～40小时，最佳反应条件为18小时。反应结束后，用柱层析(二氯甲烷)分离，即制得所述磷光铂配合物的纯品。

如上述反应方程式所示，本发明中的铂配合物的醛基能与高半胱氨酸和半胱氨酸的氨基和巯基发生环化反应转变为杂环，原铂配合物中存在醛基与苯环共轭，而与半胱氨酸或者高半胱氨酸反应以后醛基与苯环的共轭消失，从而影响了所生成产物的光谱性质，利用此性质的改变来检测半胱氨酸和高半胱氨酸。本发明中的铂配合物溶液在365nm紫外光激发时发出绿色磷光，而在与巯基氨基酸作用后发出黄色磷光，其它的氨基酸对之没有干扰。
铂配合物对巯基氨基酸响应的紫外光谱测试：紫外光谱的测定是在乙腈和水的混合溶液中进行的，铂配合物溶于乙腈和水的混合溶液中，再加入不同浓度的用纯水配制的高半胱氨酸和半胱氨酸溶液。达到平衡后测试。
铂配合物对巯基氨基酸响应的磷光光谱测试：磷光光谱的测定是在乙腈和水的混合溶液中进行的，将铂配合物溶于乙腈和水的混合溶液中，再加入不同浓度的用纯水配制的高半胱氨酸和半胱氨酸溶液。达到平衡后测试。
本发明的优点：利用金属铂配合物的长发光寿命，通过时间分辨荧光技术可以有效地消除背景荧光的干扰，获得高的检测灵敏度。本发明中金属铂配合物能检测半胱氨酸和高半胱氨酸，其它的氨基酸对这个过程没有干扰。
附图说明
图1是铂配合物对高半胱氨酸及半胱氨酸响应的紫外光谱变化图。最大吸收峰(330nm)下降。横坐标代表吸收波长，纵坐标代表吸光度。图1a为高半胱氨酸，1b为半胱氨酸。
图2是铂配合物对高半胱氨酸及半胱氨酸响应的磷光光谱变化图。最大发射波长红移近50nm，荧光强度有所下降。横坐标代表发射波长，纵坐标代表发射强度。图2a为高半胱氨酸，2b为半胱氨酸。
图3为铂配合物对21种氨基酸及一种小肽响应的磷光光谱选择性测试，只有含巯基氨基酸使得体系的比度磷光发生明显的变化。纵坐标代表在不同波长处发射强度之比，其中高半胱氨酸为波长555nm与510nm处发射强度之比(L₅₅₅/L₅₁₀)，半胱氨酸为波长560nm与510nm处发射强度之比(L₅₆₀/L₅₁₀)；横坐标代表不同氨基酸，分别是，L-高半胱氨酸，L-半胱氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-羟脯氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸及谷胱甘肽。图2a中白色柱代表在体系中加入不同的氨基酸后比度磷光的变化，黑色主代表在体系中同时加入高半胱氨酸及其他不同氨基酸后比度磷光的变化。图2b代表在体系中同时加入半胱氨酸及其他不同氨基酸后比度磷光的变化。
具体实施方式
实施例1
铂配合物的制备：称取K₂PtCl₄(0.1g)和1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)(0.2g)加入到双颈瓶中，二者的质量比为2∶1，再加入HCl溶液(0.1M)300mL。然后将反应混合物加热至100℃，搅拌反应20小时，反应结束后，冷却到室温(25℃)，有沉淀生成。所得沉淀分别用热水洗涤，并用真空干燥，得到亮黄色固体1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物，Pt(phen)Cl₂。然后称取1，10菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物(0.44mmol)和碘化亚铜固体(0.04mmol)于三颈瓶内，加入二异丙胺与二氯甲烷的混合溶剂(21mL)，体积比1∶20；在室温下(25℃)搅拌10分钟。之后缓慢滴加对乙炔基苯甲醛(1.76mmol)；滴加完后将反应混合物在常温下(25℃)搅拌18小时。反应结束后，用柱层析(二氯甲烷)分离得到说述磷光化学传感器铂配合物的纯品。
实施例2
铂配合物的制备：称取K₂PtCl₄(0.1g)和1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)(0.1g)加入到双颈瓶中，二者的质量比为1∶1，再加入HCl溶液(0.1M)500mL。然后将反应混合物加热至100℃，搅拌反应24小时，反应结束后，冷却到室温(25℃)，有沉淀生成。所得沉淀分别用热水洗涤，并用真空干燥，得到亮黄色固体1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物，Pt(phen)Cl₂。然后称取1，10-菲咯啉(邻菲罗啉)铂二氯的配合物(0.44mmol)和碘化亚铜固体(0.1mmol)于三颈瓶内，加入二异丙胺与二氯甲烷的混合溶剂(20mL)，体积比1∶40；在室温下(25℃)搅拌10分钟。之后缓慢滴加对乙炔基苯甲醛(1.76mmol)；滴加完后将反应混合物在常温下(25℃)搅拌24小时。反应结束后，用柱层析(二氯甲烷)分离得到说述磷光化学传感器铂配合物的纯品。
1H NMR(500MHz，d₆-DMSO，TMS)：δ＝9.98(2H，s)，9.69(2H，d，J＝5.5Hz)，9.02(2H，d，J＝8Hz)，8.27(2H，s)，8.22(dd，2H，J＝5.0Hz，J＝5.5Hz)，7.85(4H，d，J＝8Hz)，7.62(4H，d，J＝8.5Hz).FT-IR：v/cm-12107(v_C＝C).MS(MALDI-TOF)：m/z 634[M+H]⁺.
实施例3
配合物对巯基氨基酸响应的紫外光谱测试：将铂配合物溶于乙腈和水的混合溶液中，二者体积比为4∶1，配合物的浓度为40μmol/L，而后加入等体积0-100eq的纯水配置的高半胱氨酸和半胱氨酸溶液。待平衡以后，测定紫外光谱，见图1。
实施例4
配合物对巯基氨基酸响应的紫外光谱测试：将铂配合物溶于乙腈和水的混合溶液中，二者体积比为4∶1，配合物的浓度为40μmol/L，而后加入等体积0-100eq的纯水配置的高半胱氨酸和半胱氨酸溶液。待平衡以后，测定紫外光谱，见图2。
实施例5
铂配合物溶于乙腈和水的混合溶液中浓度为40μmol/l，加入100倍当量的不同氨基酸，氨基酸分别是L-高半胱氨酸，L-半胱氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-羟脯氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸及谷胱甘肽。达平衡后测试，测试结果见图3a。
实施例6
干扰性测试。铂配合物溶于乙腈和水的混合溶液中浓度为40μmol/L，加入100倍当量的不同氨基酸，氨基酸分别是L-高半胱氨酸，L-半胱氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-组氨酸，L-羟脯氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸及谷胱甘肽。达平衡后测试，测试结果见图3a和3b。