本发明涉及用于检测特异性DNA（脱氧核糖核酸）碱基顺序的一种方法和一种装置。这样的检测一种特异性DNA碱基顺序的操作被应用于临床试验、基因诊断、病理研究、药物质量控制及其他领域中。 特异性DNA碱基顺序主要是利用Southern blotting法和液相杂交法（Liqpid phase hybridization）来检测。然而，不利的是这样一种方法由于需要进行B-F分离和将DNA片段拼结成膜因而处理起来太复杂。作为一种无需进行B-F分离而检测一种特异碱基顺序的方法，业已推荐了一种使用一种荧光标记单链DNA探针和一种固定剂的方法，所述固定剂是通过将碱基顺序与所述DNA探针互补的单链DNA耦合到具有高分子量的载体上的方式制备的。当样品中的DNA和所述DNA探针以竞争的方式同所述固定剂反应之后，根据荧光偏光度检测所述特异碱基顺序[参见日本专利申请公开本5-123196（1993）]。
另一方面，将表面敏化的（Surface Sensitized）喇曼光谱法用作一种检测分子振动光谱的方法。这个方法利用了这样一种现象，即当一种物质被吸收在电极的表面或贵金属（例如金或银）的胶体上时引起了强的喇曼散射（例如，参见“Bunseki”1993，第577-585页）。蛋白质、胆红素及其他类似物是通过这种表面敏化的喇漫光谱法研究的。众所周知，当出现表面敏化地喇曼散射时，振动光谱就被强到107至108倍，这使得能够进行高灵敏度的测量。
然而，不利的是使用所述荧光标记的DNA探针和所述固定互补DNA处理起来复杂并且由于要用各种化学物质标记DNA而使其方便性差。
本发明的第一个任务是提供一种可以简化对特异碱基顺序的测量而无需用化学物质标记DNA的操作。
本发明的第二个任务是提供一种用于完成前面所述的特异碱基顺序检测的装置。
本发明的检测DNA碱基顺序的方法使用了一种DNA探针，这种探针是通过用贵金属胶体颗粒标记具有待检测的靶DNA的特征碱基顺序的特异性单链DNA来制备的，该方法包括如下步骤：一个通过升温将样品DNA分裂为单链DNA的步骤;一个在所述分裂步骤之前或之后将所述DNA探针同所述DNA样品加以混合的步骤;一个降低所述被分裂的DNA样品和所述DNA探针的混合溶液的温度以便随即使所述DNA探针和所述碱基顺序互补的被分裂的样品DNA键合的杂交步骤;以及随后测量通过用激发光照射所述混合溶液所产生的喇曼散射光的步骤。所述DNA探针是通过使所述的特异性单链DNA同金、银或铜的贵金属胶体颗粒键合的方式制备的。所述胶体颗粒的适宜的尺寸是0.8至200nm。
检测相应于所述DNA探针的碱基顺序的一种较为可取的模式包括用光谱测定法分析在杂交步骤前后由所述DNA探针所得到的喇曼散射光成分以及根据所述喇曼散射光成分的光谱的特征之间所存在的差别来检测所述碱基顺序的方法。
尽管并不排除将本发明应用于一种进行B-F分离的不同的检测方法，但是最好还是在杂交步骤后可以不进行B-F分离来检测喇曼散射光。
本发明的用于检测DNA碱基顺序的装置包括一个可以储存所述DNA样品和所述DNA探针的混合溶液的、带有一个温度传感器和加热/冷却装置的器皿、一个用于激发光照射储存在该器皿中的混合溶液的光源部分、一个用来通过光谱测定法测量由储存在所述器皿中的混合溶液发出的喇曼散射光成分的光谱测定部分以及一个用来根据预定的程序通过所述器皿中的温度传感器和加热/冷却装置改变所述器皿的温度的温度控制器。
图1A说明了一个通过将带正电荷的金胶体72混合入含具有待检测的靶DNA的特征碱基顺序的特异性单链DNA70的溶液中的方式形成DNA探针74的过程。
图1B说明了一个检测相应于形成DNA探针74的所述单链DNA的一种碱基顺序的方法。将用于测量的、含有DNA样品76的溶液引入一个受到温度控制的器皿78中并且用tris-盐酸缓冲液或磷酸缓冲液将该溶液的pH值调节到4至8.5，而后将DNA探针74与该溶液相混合。将受到温度控制的器皿78加热到温度为90-95℃，以便分裂DNA样品76并将它转化为单链DNA76a。而后，逐渐降低温度，以便在37℃至70℃下保温几分钟至一个小时。如果DNA样品76包括了相应于形成DNA探针74的单链DNA的碱基顺序，那么DNA样品76的相应的单链DNA76a与DNA探针74杂交，在DNA探针76中形成双链DNA。数字80表示带有所述双链DNA的DNA探针。
或者，在将DNA样品76分裂为单链DNA76a之后，可以将DNA探针74与DNA样品76相混合。
为了检测在所述DNA样品中是否存在相应于所述DNA探针的单链DNA的特异碱基顺序的DNA，用激发光照射杂交步骤前后的含有所述DNA探针的溶液，以便用光谱测定法分析由相应的溶液发出的喇曼散射光成分。由所述双链DNA物质得到的喇曼散射光成分由于其上耦合有所述DNA物质的贵金属胶体颗粒的存在而被加强。当由杂交形成双链DNA时，在杂交前后得到不同的喇曼光谱。
喇曼散射光成分提供了有关分子振动光谱的信息，这种光谱十分敏感地依赖于分子的空间结构和电子状态。其特点在于由分子振动中的能量改变决定的喇曼频率对应于形成该物质的两个电子振动能级之间的差别。由喇曼散射光获得的振动光谱（它对于分子个体敏感）提供了借助于诸如分子的参比振动分析的理论和分析处理高精度地识别分子的有效手段。因此，还可以根据分子光谱推测分子结构并测量浓度。
在与贵金属胶体结合的DNA探针之间分子结构是不同的，这些探针有的是处于单链DNA状态，有的是处于双链DNA状态（通过与具有互补碱基顺序的单链样品DNA杂交转化得来），因此，它们的喇曼光谱也彼此不同。
当在DNA探针中通过杂交而形成双链DNA时，检测的灵敏度也可能是不同的。
当在DNA探针中如此形成双链DNA时，由喇曼光谱的峰位置的变化，或进一步由检测灵敏度的变化，可以检测出所述DNA样品含有具有所述特异碱基顺序的DNA。
根据本发明，所述DNA探针是通过用贵金属胶体粒子标记具有待检测的特异碱基顺序的单链DNA而制备出来的，将该DNA探针同通过加热使样品DNA分裂而制备的单链DNA相混合，并降低温度以获得引起杂交的条件。在杂交步骤前后用激发光照射所述DNA探针，以便测量喇曼散射光成分，借此检测所述DNA样品是否会有碱基顺序与形成所述DNA探针的那种DNA互补的DNA。于是，就可以在短时间内简单地检测出所述特异碱基顺序。
根据本发明的方法，可以不需要进行B-F分离就测量出喇曼散射光成分，于是处理被简化了。
本发明的前面所述的以及其他的任务、特性、观点和优点通过以下结合附图对本发明所作的详细说明将变得更为清楚。
图1A说明了形成DNA探针的步骤;
图1B说明了杂交步骤;
图2是一幅用图示方式显示用于实施本发明的方法的一个光学系统的方块图;
图3是一幅详细地显示根据本发明的一个实施例的一个光学系统的方块图;
图4是一幅显示优选器皿的例子的垂直剖视图;
图5是一幅显示用于图4所示的器皿的温度控制系统的方块图;
图6是一幅显示优选器皿的另一个例子的局部垂直剖视图。
可以将带负电荷的单链DNA同带正电荷的胶体粒子用静电方式和疏水方式键合起来。例如，一种带正电荷的金胶体可以从市场上购到，商品名称为“GENOGOLD”（由BioCell，U.S.A出品）。当将单链DNA与这样一种带正电荷的金胶体相混合时，可以很容易地得到在其中金胶体与所述单链DNA相键合的DNA探针。没有与所述胶体粒子键合的未反应的单链DNA利用超速离心分离法、胶体过滤法或高效液相色谱法除去。为了抑制存在于样品中的靶DNA以外的DNA对所述金胶体不发生特异吸收，所述DNA探针最好是用BSA或酪蛋白的蛋白质溶液或等电点低于含有所述DNA探针的反应溶液的pH值的蛋白质溶液阻断。
另外，单链DNA也可以与胶体粒子键合，这是通过这样的方式实现的：使其中引入了SH基的单链DNA同键合有顺丁烯二酰亚胺基的胶体粒子利用美国Nano探针进行顺丁烯二酰亚胺反应，以便形成共价键。
还可以使单链DNA与胶体粒子键合，这是通过这样的方式实现的：使其中引入了生物素的单链DNA与键合有链球菌抗生物素蛋白的胶体粒子（利用Zaimet（美国）或E.Y实验室（美国）的Nano探针）进行抗生物素蛋白-生物素键合。
图2示出了根据本发明的一个实施例的一个DNA检测器。
由一个加热器和一个珀尔帖（Peltier）元件构成受温度控制的器皿80储存含有DNA样品和具有待检测的特异DNA碱基顺序的DNA探针的样品15。数字67表示一个用于检测器皿80的温度的温度传感器。一个取自所述温度传感器67的检测信号被输入温度控制器84，该温度控制器依次将器皿80的温度升高至使所述DNA样品分裂所必须的水平，而后将该温度降至杂交所必要的水平。
数字1表示一个激发光源，它是由一个激光单元构成，用于测量喇曼散射光。所述激光单元可以选自一些具有从近紫外区至近红外区这样宽波长范围的激光器，例如等幅振荡Ar离子激光器、Kr离子激光器、He-Ne激光器和He-Cd激光器以及脉冲激光器例如Nd：YAG激光器。当该激光器的自发发射光被屏蔽，使得只有振荡光束被用作所述激发光时，该激光单元可以与一个干涉滤光器或一个分光计组合起来。另外，还可以同时利用自发发射光，以便进行光谱的波长校正。
由光源1产生的激发光用一个光学系统10分隔成一个测量光束和一个参比光束，于是所述测量光束由光学系统10加以调节并被加到储存在器皿80中的样品15上。样品15产生的喇曼散射光在与所述测量光束的入射方向成90°角的方向上被取出并且穿过一个用于调节光束的光学系统20由一个包括一个分光镜的光谱检测器检测。
另一方面，所述参比光束穿过一个用于调节光束的光源系统40用一个检测器26检测，以便修正激发光强度的影响。信号处理运算单元50利用指示光源强度的检测器26的输出信号修正由光谱检测器30检测的所述喇曼散射光，以便得到一个喇曼光谱，于是检测出特异碱基顺序。信号处理运算单元50根据预定的温度程度控制温度控制器84以改变器皿80的温度。数字35表示一个输出单元，例如打印机或CRT（示波管）。
图3详细地示出了一些所述DNA检测器的光学系统。一个光束分离器2（用于将从激光光源1接收的激发光光束分隔成所述测量光束和所述参比光束）、一个凸透镜3（用于汇聚由光束分离器2分隔出的所述测量光束）、凸透镜6和7（用于调整所述光束）以及一个光束分离器8（用于反射以便将所述测量光束导向储存在器皿80中的样品15）沿所述测量光束的光路分布，构成光学系统10，用于用作为所述测量光束的发光光束照射样品15。在所述测量光束的光路中，还在凸透镜3和6之间设置一个滤光器4，用于由从激光光源1接收到的一系列振荡光束中选择一个波长的激光光束。
另一方面，一个凸透镜9（用于汇聚所述喇曼散射光和穿过所述光束分离器8的测量光束）、凸透镜12和13（用于调整所述发光束）沿由储存在器皿80中的样品15发出的喇曼散射光束的光路分布，构成光学系统20，用于提取处在与所述测量光束的入射方向成180°角的方向上的喇曼散射光。一个用于除去一种激发光成分的滤光器11被设置在凸透镜9和12之间。
在参比光束一侧，沿所述光路还分布有反光镜21和22（用于使所述光路转向）和凸透镜24和25（用于调整所述发光束），以便将所述参比光束导向检测器26。在反光镜22和凸透镜24之间设置了一个与设置在所述测量光束侧的滤光器4的波长特性相同的滤光器23。
图4示出了一个典型的有温度控制的器皿80。
参见图4，数字63表示一个铝制器皿，包括一个铝制金属块，在其上端朝向其内部有一个孔，用于储存样品。这个孔的内表面作过镜面抛光处理并镀金以提高红外反射率。在该孔的底部设置有一个窗口65，用于从外部使激发光射向样品64并且提取由样品64向外发射的喇曼散射光，同时，将一块石英玻璃窗板68安装在这个窗口65中。在形成器皿63的金属块中在所述孔的侧面和底部分别设有包括加热器和珀尔帖（Peltier）元件的加热/冷却装置62，62，同时铝制漫射板61，61与加热/冷却装置62，62的另一侧接触。一个温度传感器67被嵌入形成器皿63的金属块中。在图4所示的器皿63中，激发光的入射方向与提取喇曼散射光的方向成180度角。
为了升高和降低器皿63的温度，如图5所示那样，设置一个温度控制器84，以便输入温度传感器67的检测信号并控制准备供给加热/冷却装置62，62的电流量。
图6示出了另一个典型的器皿。与图4所示的、由中空的金属块整体形成的器皿63不同，在图6中使用了一个石英玻璃器皿66。一个铝制金属块被分为两部分63a和63b，同时在两部分63a和63b的相对的部分上形成储存器皿66的空腔，结果所述金属块的两部分63a和63b彼此组合起来用所述空腔将器皿66包围起来。器皿66与由彼此组合起来的二部分63a和63b形成的金属块接触。窗口65形成在金属块63a部分与器皿66的底部对应的位置上，以便供给激发光并且提取喇曼散射光。用于控制温度的加热/冷却装置62，62要安装得使其每一侧都与金属块的部分63b接触，同时，在加热/冷却装置62，62的另一侧设置漫射板61，61并且在金属块部分63a中嵌入温度传感器67。
虽然业已对本发明作了详细的描述和举例说明，但是这种描述和举例说明仅仅是一种说明和例子，而并不是要对本发明加以限定，只有所附的权利要求书才能限定本发明的精神和范围。