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1、10申请公布号CN104178532A43申请公布日20141203CN104178532A21申请号201410274106022申请日2009031108152584220080311EP200980116933420090311C12P13/00200601C12P17/10200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601C12N15/54200601C12N15/6020060171申请人基因组股份公司地址美国加利福尼亚州72发明人比托纳拉凯萨琳娜拉伊马克斯弗兰肯马丁斯库尔曼埃克斯勒克里斯多佛特里弗泽斯蒂法恩马莉亚安德勒德威尔德曼74专利。
2、代理机构北京东方亿思知识产权代理有限责任公司11258代理人肖善强54发明名称从5甲酰缬草酸制备6氨基己酸57摘要本发明涉及从5甲酰缬草酸制备6氨基己酸下文也称作“6ACA”的方法。本发明还涉及通过环化这类6ACA制备E己内酰胺下文称作“己内酰胺”的方法。本发明还涉及可用于制备6ACA或己内酰胺的宿主细胞、微生物或多核苷酸。30优先权数据62分案原申请数据51INTCL权利要求书3页说明书31页序列表145页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书31页序列表145页10申请公布号CN104178532ACN104178532A1/3页21用于制备6氨基己酸的方法，。
3、其中所述6氨基己酸是使用至少一种生物催化剂从酮庚二酸制备的。2用于制备6氨基己酸的方法，其中所述6氨基己酸是使用至少一种生物催化剂从5甲酰基戊酸酯制备的。3根据权利要求1或2的方法，其中所述生物催化剂包含能够催化转氨基反应和/或还原性氨基化的酶。4根据权利要求3的方法，其中所述能够催化转氨基反应和/或还原性氨基化的酶选自氨基转移酶EC261和氨基酸脱氢酶EC141的组。5根据权利要求4的方法，其中所述氨基转移酶或氨基酸脱氢酶选自氨基异丁酸酯酮戊二酸酯氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4氨基丁酸酯氨基转移酶EC26119、L赖氨酸6氨基转移酶EC26136、2氨基己二酸酯氨基转移。
4、酶EC26139、5氨基戊酸酯氨基转移酶EC26148、2氨基己酸酯氨基转移酶EC26167、赖氨酸丙酮酸酯6氨基转移酶EC26171和赖氨酸6脱氢酶EC14118的组。6根据权利要求3、4或5的方法，其中所述酶选自能够催化转氨基反应和/或还原性氨基化的下述酶的组，所述酶来自选自VIBRIO；PSEUDOMONAS；BACILLUS；MERCURIALIS；ASPLENIUM；CERATONIA；哺乳动物；NEUROSPORA；ESCHERICHIA；THERMUS；SACCHAROMYCES；BREVIBACTERIUM；CORYNEBACTERIUM；PROTEUS；AGROBACTERI。
5、UM；GEOBACILLUS；ACINETOBACTER；RALSTONIA；SALMONELLA；RHODOBACTER和STAPHYLOCOCCUS组的生物，尤其来自选自BACILLUSSUBTILIS、BACILLUSWEIHENSTEPHANENSIS、RHODOBACTERSPHAEROIDES、STAPHYLOCOCCUSAUREUS、LEGIONELLAPNEUMOPHILA、NITROSOMONASEUROPAEA、NEISSERIAGONORRHOEAE、PSEUDOMONASSYRINGAE、RHODOPSEUDOMONASPALUSTRIS、VIBRIOFLUVIALIS。
6、和PSEUDOMONASAERUGINOSA组的生物。7根据权利要求46中任一的方法，其中使用下述氨基转移酶，所述氨基转移酶包含根据SEQUENCEID2、SEQUENCEID5、SEQUENCEID8、SEQUENCEID12、SEQUENCEID15、SEQUENCEID17、SEQUENCEID19、SEQUENCEID21、SEQUENCEID23、SEQUENCEID25、SEQUENCEID27、SEQUENCEID29、SEQUENCEID65、SEQUENCEID67、SEQUENCEID69的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。8根据前述权利要求中任一的方法，其中所述生物催化剂。
7、包含能够催化酮酸或氨基酸脱羧的酶。9根据根据权利要求8的方法，其中能够催化脱羧的所述酶是脱羧酶EC411。10根据权利要求9的方法，其中所述脱羧酶选自谷氨酸酯脱羧酶EC41115、二氨基庚二酸酯脱羧酶EC41120、天冬氨酸1脱羧酶EC41111、支链酮酸脱羧酶、酮异戊酸酯脱羧酶、酮酮戊二酸脱羧酶、丙酮酸酯脱羧酶EC4111和草酰乙酸酯脱羧酶EC4113的组。11根据权利要求8、9或10的方法，其中能够催化脱羧的所述酶是来自下述生物或其部分的酶，所述生物选自CUCURBITACEAE；SACCHAROMYCES；CANDIDA；HANSENULA；KLUYVEROMYCES；RHIZOPUS；。
8、NEUROSPORA；ZYMOMONAS；ESCHERICHIA；MYCOBACTERIUM；CLOSTRIDIUM；LACTOBACILLUS；STREPTOCOCCUS；PSEUDOMONAS和LACTOCOCCUS的组。权利要求书CN104178532A2/3页312根据权利要求811中任一的方法，其中能够催化脱羧的所述酶包含根据SEQUENCEID31、SEQUENCEID34、SEQUENCEID37、SEQUENCEID40、SEQUENCEID43或SEQUENCEID46的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。13根据前述权利要求任一的方法，其中在存在能够催化酮酸脱羧的生物催化剂时。
9、，酮庚二酸被生物催化性转化成5甲酰基戊酸酯，在存在至少一种氨基供体和至少一种能够催化5甲酰基戊酸酯的转氨基反应和/或还原性氨基化的生物催化剂时，5甲酰基戊酸酯被生物催化性转化成6氨基己酸。14根据前述权利要求任一的方法，其中在存在至少一种氨基供体和至少一种能够催化酮庚二酸的转氨基反应和/或还原性氨基化的生物催化剂时，酮庚二酸被生物催化性转化成氨基庚二酸，从而形成氨基庚二酸，并且在存在能够催化氨基酸脱羧的生物催化剂时氨基庚二酸被生物催化性转化成6氨基己酸。15根据前述权利要求任一的方法，其中所述酮庚二酸得自天然来源。16用于制备己内酰胺的方法，所述方法包括环化通过根据前述权利要求任一的方法制备的。
10、6氨基己酸，从而形成己内酰胺。17重组宿主细胞，所述细胞包含编码具有酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，和/或编码具有5甲酰基戊酸酯氨基转移酶活性的酶的核酸序列。18根据权利要求17的重组宿主细胞，所述细胞包含编码具有5甲酰基戊酸酯氨基转移酶的酶的核酸序列，所述酶包含根据SEQUENCEID2、SEQUENCEID5、SEQUENCEID8、SEQUENCEID65、SEQUENCEID67、SEQUENCEID69的氨基酸序列或其同源物。19根据权利要求17或18的重组宿主细胞，所述细胞包含编码具有酮庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，所述酶包含根据SEQUENCEID31、SEQUENCEID3。
11、4、SEQUENCEID37、SEQUENCEID40、SEQUENCEID43或SEQUENCEID46的氨基酸序列或任何这些序列的同源物。20重组宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有酮庚二酸氨基转移酶活性或酮庚二酸脱氢酶活性的酶的核酸序列，和/或编码具有氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列。21根据权利要求20的重组宿主细胞，其中所述生物催化剂包含编码下述氨基转移酶的核酸序列，所述氨基转移酶包含根据SEQUENCEID2、SEQUENCEID8、SEQUENCEID12、SEQUENCEID15、SEQUENCEID17、SEQUENCEID19、SEQUENCEID21、SEQUENCEID。
12、23、SEQUENCEID25、SEQUENCEID27、SEQUENCEID29的氨基酸序列或其同源物。22根据权利要求1721任一的重组宿主细胞，所述细胞包含编码一种或多种下述生物催化剂的一种或多种核酸序列，所述生物催化剂能够催化从酮戊二酸制备酮庚二酸中的至少一个反应步骤。23根据权利要求1722中任一的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自ASPERGILLUS、PENICILLIUM、SACCHAROMYCES、KLUYVEROMYCES、PICHIA、CANDIDA、HANSENULA、BACILLUS、CORYNEBACTERIUM和ESCHERICHIA的组。24根据权利要求1723。
13、中任一的微生物，所述微生物包含选自下述序列组的核酸序列，所述序列由选自SEQUENCEID1、SEQUENCEID3、SEQUENCEID4、SEQUENCEID6、SEQUENCEID7、SEQUENCEID11、SEQUENCEID13、SEQUENCEID14、SEQUENCEID16、权利要求书CN104178532A3/3页4SEQUENCEID18、SEQUENCEID20、SEQUENCEID22、SEQUENCEID24、SEQUENCEID26、SEQUENCEID28、SEQUENCEID30、SEQUENCEID32、SEQUENCEID33、SEQUENCEID35、S。
14、EQUENCEID36、SEQUENCEID38、SEQUENCEID39、SEQUENCEID41、SEQUENCEID42、SEQUENCEID44、SEQUENCEID45、SEQUENCEID47、SEQUENCEID64、SEQUENCEID66、SEQUENCEID68及其功能性类似物的组的任何序列表示。25多核苷酸，其包含选自示于SEQUENCEID3、SEQUENCEID6、SEQUENCEID13、SEQUENCEID32、SEQUENCEID35、SEQUENCEID38、SEQUENCEID41、SEQUENCEID44、SEQUENCEID47中的序列及其功能性类似物的。
15、组的核酸序列。权利要求书CN104178532A1/31页5从5甲酰缬草酸制备6氨基己酸0001本申请是国际申请日为2009年03月11日，国家申请号为2009801169334，发明名称为“从5甲酰缬草酸制备6氨基己酸”的发明专利申请的分案申请。0002本发明涉及制备6氨基己酸下文也称作“6ACA”的方法。本发明还涉及从6ACA制备己内酰胺下文称作“己内酰胺”的方法。本发明还涉及可用于制备6ACA或己内酰胺的宿主细胞。0003己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙6或尼龙6，12己内酰胺和十二内酰胺的共聚物。由大量化学品制备己内酰胺的多种方式是本领域已知的，并且包括由环己酮、。
16、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通常得自矿物油。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己二酸或己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺。另外，想要提供一种方法，所述方法比利用来自石油化学来源的大量化学品的传统化学工艺需要更少能源。0004已知由6ACA制备己内酰胺，例如如USA6,194,572中所述。如WO2005/068643中所公开的，可以在存在具有，烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转化6氨基己2稀酸6AHEA来生物化学地制备6ACA。可以例如生物化学地或通过。
17、纯化学合成，由赖氨酸制备6AHEA。尽管可以通过WO2005/068643中公开的方法，通过6AHEA的还原制备6ACA，但是本发明人发现在还原反应条件下，6AHEA可自发并且基本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是高脯氨酸。所述环化可以是6ACA生产中的瓶颈，并可导致产率的可观损失。0005本发明的一个目的是提供用于制备6ACA或己内酰胺尤其可以被用于制备聚酰胺或用于制备6ACA或己内酰胺的中间产物化合物的新颖方法，所述方法可以作为已知方法的替代方式。0006本发明的又一个目的是提供克服一种或多种上述缺点的新颖方法。0007根据本发明可解决的一个或多个其他目的可根据下文的说明书得到。000。
18、8目前发现可能从特定的起始化合物制备6ACA，即已经发现可能制备6氨基己酸6ACA，其中6氨基己酸从2氧代庚烷二酸也已知为酮庚二酸，AKP制备。具体地，所述制备可以在两个或更多个反应步骤中进行。例如，提供了一种方法，其中AKP首先被转化成5甲酰戊酸5甲酰缬草酸，5FVA，所述5FVA被转化成6ACA。还提供了一种方法，其中AKP首先被转化成氨基庚二酸AAP。之后，APP被转化成6ACA。0009本发明人认识到原则上可能以完全化学即不使用生物催化剂的方式从AKP制备6ACA。进行个体反应步骤的合适化学途径的例子在下文中给出。然而，本发明人还认识到可从AKP生物化学地制备6ACA。0010因此，本。
19、发明尤其涉及制备6ACA的方法，其中所述6ACA是使用至少一种生物催化剂从AKP制备的。0011本发明还涉及一种方法，其中使用生物催化剂从5甲酰基戊酸5甲酰基缬草酸，5FVA制备6ACA。如上文所述，5FVA可得自AKP。说明书CN104178532A2/31页60012在一个实施方案中，在本发明方法中制备的6ACA被用于制备己内酰胺。这类方法包括任选地在存在生物催化剂时环化6氨基己酸。0013在本文中提到羧酸或羧酸酯例如6ACA、2氨基庚烷二酸氨基庚二酸，下文缩写为“APP”、另一氨基酸、5FVA或AKP时，这些术语旨在包括质子化的羧酸基例如中性基团、它们相应的羧酸酯其共轭碱及其盐。在本文中。
20、提到氨基酸例如6ACA时，所述术语旨在包括两性离子形式其中氨基被质子化且羧酸酯基是去质子化的形式的氨基酸，其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。0014根据本发明，未注意到关于中间产物的不想要的环化的问题，其中形成6ACA并任选地形成己内酰胺，导致产率的损失。0015预期本发明的方法允许得到与WO2005/68643中所述方法相当或甚至更好的产率。预期在利用活生物时，尤其是在要考虑生物的生长和维持的方法中，本发明的方法尤其是有利的。0016还预期在本发明的一个实施方案中，可提高本发明方法中6ACA的生产力形成的G/LH。0。
21、017除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”被定义为“和/或”。0018在本文中使用的术语“一个”“A”或“AN”被定义为“至少一个”。0019涉及单数名词例如化合物、添加剂等时，复数旨在被包括在内。0020涉及存在立体异构体的化合物时，所述化合物可以是任何这类立体异构体或其组合。因此，涉及例如存在对映异构体的氨基酸时，氨基酸可以是L对映异构体、D对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是立体异构体。0021关于括号中的酶种类EC提到酶时，所述酶种类是以NOMENCLATURECOMMITTEEOFTHEINTERNATIONALUNIONOFBIOCHEMISTRYANDMO。
22、LECULARBIOLOGYNCIUBMB提供的ENZYMENOMENCLATURE为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见HTTP/WWWCHEMQMULACUK/IUBMB/ENZYME/。尚未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其他合适的酶旨在包括在内。0022术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30、优选地至少40、更优选地至少60、更优选地至少65、更优选地至少70、更优选地至少75、更优选地至少80、尤其是至少85、更尤其是至少90、至少91、92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、至少98或至少99的序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也旨在包括。
23、由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列多核苷酸序列。0023序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多多肽序列或两条或更多核酸序列之间的相互关系，通过比较所述序列来测定。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTNALTSCHUL。
24、，SFETAL，JMOLBIOL1990，215，403410，公众可说明书CN104178532A3/31页7以从NCBI和其他来源BLASTMANUAL，ALTSCHUL，S，ETAL，NCBINLMNIHBETHESDA，MD20894获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放100，缺口延伸05，BLOSUM62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放100，缺口延伸05，DNA全矩阵DNA同一性矩阵。0024根据本发明，使用生物催化剂，即所述方法中至少一个反应步骤由生物材料或来自生物来源的部分例如来自生物来源的生物或生物分子催化。生物催化剂可尤其包含。
25、一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一个实施方案中，使用从天然环境中分离从生产它们的生物中分离的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞悬浮液、作为裂解物、或固定在支持物上。在一个实施方案中，一种或多种酶形成了活细胞的部分如活的全细胞。在一个实施方案中，一种或多种酶形成活生物的一部分如活的完整细胞。0025酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。0026活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠细胞例如孢子或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透的细胞的部分。0027本发明方法中使用的生物催化剂原则上可以是任何生物。
26、，获得得自或来自任何生物。生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可选自动物包括人、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。0028在一个实施方案中，生物催化剂源自动物，尤其源自其部分，例如肝、胰、脑、肾、心或其他器官。动物可尤其选自哺乳动物的组，更尤其选自LEPORIDAE、MURIDAE、SUIDAE和BOVIDAE的组。0029合适的植物尤其包括选自下组的植物ASPLENIUM；CUCURBITACEAE，尤其是CURCURBITA，例如CURCURBITAMOSCHATA南瓜或CUCUMIS；MERCURIALIS，例如MERCURIALISPERENNIS；HYDNOCARPUS；和C。
27、ERATONIA。0030合适的细菌可尤其选自下组VIBRIO、PSEUDOMONAS、BACILLUS、CORYNEBACTERIUM、BREVIBACTERIUM、ENTEROCOCCUS、STREPTOCOCCUS、KLEBSIELLA、LACTOCOCCUS、LACTOBACILLUS、CLOSTRIDIUM、ESCHERICHIA、THERMUS、MYCOBACTERIUM、ZYMOMONAS、PROTEUS、AGROBACTERIUM、GEOBACILLUS、ACINETOBACTER、RALSTONIA、RHODOBACTER、PARACOCCUS、NOVOSPHINGOBIUM。
28、、NITROSOMONAS、LEGIONELLA、NEISSERIA、RHODOPSEUDOMONAS、STAPHYLOCOCCUS、DEINOCOCCUS和SALMONELLA。0031合适的古细菌可尤其选自下组ARCHAEOGLOBUS、AEROPYRUM、HALOBACTERIUM、METHANOSARCINA、METHANOCOCCUS、THERMOPLASMA、PYROBACULUM、METHANOCALDOCOCCUS、METHANOBACTERIUM、METHANOSPHAERA、METHANOPYRUS和METHANOBREVIBACTER。0032合适的真菌可尤其选自RHIZ。
29、OPUS、NEUROSPORA、PENICILLIUM和ASPERGILLUS的组。0033合适的酵母可尤其选自CANDIDA、HANSENULA、KLUYVEROMYCES和SACCHAROMYCES的组。0034本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然存在的生物催化剂野生型或天然存在的生物催化剂的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计RATIONALDESIGN改进天然存在的生物说明书CN104178532A4/31页8催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术随机诱变、定点诱变、定向进化、基因重组等修饰下述生物的。
30、编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分如酶。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的宿主细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO2008/000632中所述方法。0035突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、PH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子。
31、利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。0036提到来自具体来源的生物催化剂尤其是酶、来自第一生物但是实际上在经遗传修饰的第二生物中生产的重组生物催化剂尤其是酶时，特定地旨在包括来自所述第一生物的生物催化剂尤其是酶。0037在本发明的一个优选的方法中，所述制备包含在存在下述生物催化剂时的生物催化通常为酶促反应，所述生物催化剂能够催化酮酸或氨基酸例如包含至少一个羧基和至少一个氨基的化合物的脱羧。具有催化活性的酶因此可以分别被称作酮酸脱羧酶或者氨基酸脱羧酶。0038所述酸优选地为二酸，其中所述生物催化剂对与酮。
32、基或氨基相邻的酸基具有选择性。0039通常，合适的脱羧酶具有能够催化AKP转化成为5FVA的酮庚二酸酯脱羧酶活性，或能够催化AAP转化成为6ACA的氨基庚二酸酯脱羧酶活性。0040能够使酮酸或氨基酸脱羧的酶可尤其选自下组草酰乙酸酯脱羧酶EC4113、二氨基庚二酸酯脱羧酶EC41120、支链酮酸脱羧酶EC41172、酮异戊酸酯脱羧酶、酮戊二酸酯脱羧酶EC41171和丙酮酸酯脱羧酶EC4111。0041一种或多种其他合适的脱羧酶可选自下组草酸酯脱羧酶EC4112、乙酰乙酸酯脱羧酶EC4114、缬氨酸脱羧酶/亮氨酸脱羧酶EC41114、谷氨酸酯脱羧酶EC41115、天冬氨酸1脱羧酶EC41111、3。
33、羟基谷氨酸酯脱羧酶EC41116、鸟氨酸脱羧酶EC41117、赖氨酸脱羧酶EC41118、精氨酸脱羧酶EC41119、2氧代；戊二酸酯脱羧酶EC41171和二氨基丁酸酯EC41186。0042脱羧酶可尤其是选自以下组生物的脱羧酶南瓜；黄瓜；酵母；真菌，例如SACCHAROMYCESCEREVISIAE、CANDIDAFLARERI、HANSENULASP、KLUYVEROMYCESMARXIANUS、RHIZOPUSJAVANICUS和NEUROSPORACRASSA；哺乳动物，尤其是来自哺乳动物脑；和细菌，如ESCHERICHIACOLI、LACTOCOCCUSLACTIS、MYCOBACT。
34、ERIUMTUBERCULOSIS、PSEUDOMONASSP和ZYMOMONASMOBILIS。0043丙酮酸酯脱羧酶可源自SACCHAROMYCESCEREVISIAE或ZYMOMONASMOBILIS。具体地，可以使用来自ZYMOMONASMOBILIS的丙酮酸酯脱羧酶突变体I472A。0044可以使用来自ESCHERICHIACOLIECOLI的谷氨酸酯脱羧酶、二氨基庚二酸酯脱说明书CN104178532A5/31页9羧酶或天冬氨酸脱羧酶。0045可以使用来自NEUROSPORACRASSA、MYCOBACTERIUMLEPRAE、CLOSTRIDIUMPERFRINGENS、LACT。
35、OBACILLUSBREVIS、MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS、STREPTOCOCCUS或LACTOCOCCUS的谷氨酸酯脱羧酶。谷氨酸酯脱羧酶可来源的LACTOCOCCUS物种的例子尤其包括LACTOCOCCUSLACTIS，如LACTOCOCCUSLACTIS菌株B1157、LACTOCOCCUSLACTISIFPL730，更尤其是LACTOCOCCUSLACTISVARMALTIGENES先前称作STREPTOCOCCUSLACTISVARMALTIGENES。0046尤其可使用来自PSEUDOMONAS的草酰乙酸酯脱羧酶。0047可以使用来自LACTOCOCCUS。
36、LACTIS的支链酮酸脱羧酶。更尤其可以使用来自LACTOCOCCUSLACTIS的酮异戊酸酯脱羧酶。0048尤其可以使用来自MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS的酮戊二酸酯脱羧酶。0049在本发明的一个优选的方法中，6ACA的制备包含在存在能够在存在氨基供体时催化转氨基反应的酶时的酶促反应，所述酶选自氨基转移酶EC261的组。0050通常，合适的氨基转移酶具有能够催化5FVA转化成6ACA的6氨基己酸6氨基转移酶活性，或能够催化AKP转化成AAP的氨基庚二酸酯2氨基转移酶活性。0051氨基转移酶可尤其选自以下组氨基异丁酸酯酮戊二酸酯氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移。
37、酶、4氨基丁酸酯氨基转移酶EC26119、L赖氨酸6氨基转移酶EC26136、2氨基己二酸酯氨基转移酶EC26139、5氨基戊酸酯氨基转移酶EC26148、2氨基己酸酯氨基转移酶EC26167和赖氨酸丙酮酸酯6氨基转移酶EC26171。0052在一个实施方案中，氨基转移酶可选自下组丙氨酸氨基转移酶EC2612、亮氨酸氨基转移酶EC2616、丙氨酸氧代酸氨基转移酶EC26112、丙氨酸丙酮酸酯氨基转移酶EC26118、S3氨基2甲酰基丙酸酯氨基转移酶EC26122、L，L二氨基庚二酸酯氨基转移酶EC26183。0053氨基转移酶可尤其选自来自以下的的氨基转移酶哺乳动物；MERCURIALIS，尤。
38、其是MERCURIALISPERENNIS，更尤其是MERCURIALISPERENNIS的嫩芽SHOOTS；ASPLENIUM，更尤其是ASPLENIUMUNILATERALE或ASPLENIUMSEPTENTRIONALE；CERATONIA，更尤其是CERATONIASILIQUA；RHODOBACTER，尤其是RHODOBACTERSPHAEROIDES，STAPHYLOCOCCUS，尤其是STAPHYLOCOCCUSAUREUS；VIBRIO，尤其是VIBRIOFLUVIALIS；PSEUDOMONAS，尤其是PSEUDOMONASAERUGINOSA；RHODOPSEUSOMONA。
39、S；BACILLUS，尤其是BACILLUSWEIHENSTEPHANENSIS和BACILLUSSUBTILIS；LEGIONELLA；NITROSOMAS；NEISSERIA；或酵母，尤其是SACCHAROMYCESCEREVISIAE。0054当酶是哺乳动物的酶时，其尤其可源自哺乳动物肾，来自哺乳动物肝，来自哺乳动物心或来自哺乳动物脑。例如，合适的酶可选自下组来自哺乳动物肾的氨基异丁酸酯酮戊二酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肾的氨基异丁酸酯酮戊二酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物肝的丙氨酸氨基转移酶，尤其是来自兔肝的丙氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物心的天冬氨酸氨基转移酶；尤其是来自猪心的天冬氨酸氨基。
40、转移酶；来自哺乳动物肝的4氨基丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肝的4氨基丁酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物脑的4氨基丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自人、猪或大鼠脑说明书CN104178532A6/31页10的4氨基丁酸酯氨基转移酶；来自NEUROSPORA的酮己二酸酯谷氨酸酯氨基转移酶，尤其是来自NEUROSPORACRASS的酮己二酸酯谷氨酸酯氨基转移酶；来自ECOLI的4氨基丁酸酯氨基转移酶，或来自THERMUS的氨基己二酸酯氨基转移酶，尤其是来自THERMUSTHERMOPHILUS的氨基己二酸酯氨基转移酶，和来自CLOSTRIDIUM、尤其是来自CLOSTRIDIUMAMINOVALERICUM。
41、的5氨基戊酸酯氨基转移酶。一种合适的2氨基己二酸酯氨基转移酶可例如由PYROBACULUMISLANDICUM提供。0055氨基供体尤其可选自氨、铵离子、胺和氨基酸的组。合适的胺是伯胺和仲胺。氨基酸可具有D构型或L构型。氨基供体的例子是丙氨酸、谷氨酸、异丙胺、2氨基丁烷、2氨基庚烷、苯甲胺、1苯基1氨基乙烷、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、氨基异丁酸酯、丙氨酸、4氨基丁酸酯和氨基己二酸酯。0056在又一个优选的实施方案中，制备6ACA的方法包含在存在下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应，所述酶选自作用于供体CHNH2基团上的氧化还原酶EC14的组，尤其是选。
42、自氨基酸脱氢酶EC141的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化5FVA转化成为6ACA的6氨基己酸6脱氢酶活性，或者具有催化AKP转化成为AAP的氨基庚二酸酯2脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶尤其选自二氨基庚二酸酯脱氢酶EC14116、赖氨酸6脱氢酶EC14118、谷氨酸脱氢酶EC1413；EC1414和亮氨酸脱氢酶EC1419的组。0057在一个实施方案中，氨基酸脱氢酶可选自被归类为以下的氨基酸脱氢酶以NAD或NADP作为受体的谷氨酸脱氢酶EC1413、以NADP作为受体EC1414的谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶EC1419、二氨基庚二酸酯脱氢酶EC14116和赖氨酸6脱氢酶EC14118。00。
43、58氨基酸脱氢酶可尤其源自选自下组的生物CORYNEBACTERIUM，尤其是CORYNEBACTERIUMGLUTAMICUM；PROTEUS，尤其是PROTEUSVULGARIS；AGROBACTERIUM，尤其是AGROBACTERIUMTUMEFACIENS；GEOBACILLUS，尤其是GEOBACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS；ACINETOBACTER，尤其是ACINETOBACTERSPADP1；RALSTONIA，尤其是RALSTONIASOLANACEARUM；SALMONELLA，尤其是SALMONELLATYPHIMURIUM；SACCHAROMYCES。
44、，尤其是SACCHAROMYCESCEREVISIAE；BREVIBACTERIUM，尤其是BREVIBACTERIUMFLAVUM；和BACILLUS，尤其是BACILLUSSPHAERICUS、BACILLUSCEREUS或BACILLUSSUBTILIS。例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自来自BACILLUS，尤其是BACILLUSSPHAERICUS的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自BREVIBACTERIUMSP的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自CORYNEBACTERIUM的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自CORYNEBACTERIUMGLUTAMICUM的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自PROTEUS。
45、的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自PROTEUSVULGARIS的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自AGROBACTERIUM、尤其是AGROBACTERIUMTUMEFACIENS的赖氨酸6脱氢酶，来自GEOBACILLUS、尤其是来自GEOBACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS的赖氨酸6脱氢酶；来自ACINETOBACTER的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶EC1413，尤其是来自ACINETOBACTERSPADP1的谷氨酸酯脱氢酶；来自RALSTONIA的谷氨酸酯脱氢酶EC1413，尤其是来自RALSTONIASOLANACEARUM的谷氨酸酯脱氢酶；来自。
46、SALMONELLA的以NADPH作为辅因子发挥作用的，尤其是来自SALMONELLATYPHIMURIUM的谷氨酸酯脱氢酶；来自SACCHAROMYCES的谷氨酸酯脱氢酶EC1414，尤其是来自说明书CN104178532A107/31页11SACCHAROMYCESCEREVISIAE的谷氨酸酯脱氢酶；来自BREVIBACTERIUM的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自BREVIBACTERIUMFLAVUM的谷氨酸酯脱氢酶；和来自BACILLUS的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自BACILLUSCEREUS或BACILLUSSUBTILIS的谷氨酸酯脱氢酶。0059在一个特定的实施方案中，AKP在存在。
47、脱羧酶或催化这类转化的其他生物催化剂时，AKP被生物催化性转化成5甲酰基戊酸酯5FVA。根据本发明使用的脱羧酶可尤其选自来自LACTOCOCCUSLACTIS、LACTOCOCCUSLACTISVARMALTIGENES或LACTOCOCCUSLACTISSUBSPCREMORIS的酮酸脱羧酶；来自LACTOCOCCUSLACTIS菌株B1157或LACTOCOCCUSLACTISIFPL730的支链酮酸脱羧酶；来自SACCHAROMYCESCEREVISIAE、CANDIDAFLARERI、ZYMOMONASMOBILIS、HANSENULASP、RHIZOPUSJAVANICUS、NEUR。
48、OSPORACRASSA或KLUYVEROMYCESMARXIANUS的丙酮酸脱羧酶；来自MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS的酮戊二酸酯脱羧酶；来自ECOLI、LACTOBACILLUSBREVIS、MYCOBACTERIUMLEPRAE、NEUROSPORACRASSA或CLOSTRIDIUMPERFRINGENS的谷氨酸酯脱羧酶；和来自ECOLI的天冬氨酸脱羧酶。0060具体地，发现来自ESCHERICHIACOLI、ZYMOMONASMOBILIS、SACCHAROMYCESCEREVISIAE、MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS、PSEUDOMONASS。
49、PECIES或LACTOCOCCUSLACTIS的脱羧酶适合催化AKP成为5FVA的转化。更具体地，可以使用包含下述脱羧酶的生物催化剂，所述脱羧酶具有SEQUENCEID31、SEQUENCEID34、SEQUENCEID37、SEQUENCEID40、SEQUENCEID43、SEQUENCEID46所鉴定的氨基酸序列或其同源物。还预期这类脱羧酶可被用于从AAP制备6ACA。0061之后5FVA被转化成6ACA。这可以化学完成可以在氢化催化剂例如SIO2/AL2O3支持物上的NI上通过用氨还原性氨化5FVA，以高产率制备6ACA，如EPA628535或DE4322065中针对9氨基壬酸9氨基正壬酸和12氨基正十二烷酸12氨基月桂酸所述。0062或者可以通过在PTO2上氢化6OXIMOCAPROICACID获得6ACA，所述6OXIMOCAPROICACID通过5FVA和羟胺的反应制备同源的12氨基正十二烷酸的合成见例如FOAYORINDE，EYNANA，PDNICELY，ASWOODS，EOPRICE，CPNWAONICHAJAMOILCHEMSOC1997，74，531538。0063在一个实施方案中，5FVA到6ACA。