在宿主中植入经包被细胞的方法 发明领域
本发明涉及制备经包被细胞以植入宿主中的方法，此方法包括在体内或体外将细胞暴露于一种或多种与所需植入位点处的条件更密切吻合的限制性条件下，暴露的时间应足以建立对限制性条件反应的所需细胞特性。
当植入宿主即可产生生物活性分子的经包被细胞可用来预防或治疗宿主的许多疾病或障碍，或者可提供、恢复或增强宿主的一种或多种代谢功能。
包被细胞的一种方法被称作“微包被”，其中微球体包裹了含细胞溶液的微滴(Sefton等人，《生物技术与生物工程》29，第1135-1143页(1987)；Sugamori等人，《泛美人工内脏学会》35，第791-799页(1989))。
包被细胞的另一种方法“大量包被法”包括将大量细胞包被在热塑胶囊中。典型地，此方法是通过将细胞装进中空的纤维中，再封闭末端来实现的。多种类型的大胶囊是本技术中已知的。具体地说，Dionne等人(WO 92/19195，此处引入作为参考)提到一种大胶囊，其具有的细胞分散在基质和半渗透的表面套中。另外，Aebischer在美国专利5,158,881，5,283,187和5,284,761也提到通过将聚合物溶液和细胞悬液共同挤压而形成的细胞胶囊。
典型地，当用于包被和植入地细胞直接分离自组织(原代细胞)时，应将它们分散、洗涤，然后进行包被。例见Aebischer等人，《泛美人工脏器学会》32卷，第134-7页(1986)；Altman等人，《糖尿病》35卷，625-633页(1986)；Chang等人，美国专利5,084,350；Darquay和Reach，《糖尿病》28期，776-780页(1985)；Sugamori和Sefton，《泛美人工脏器学会》35卷，791-799页(1989)。
当被包被和植入的是无限增殖化细胞或细胞系时，典型地，它们分离自富含营养的培养物。例见Aebischer等人，《生物材料》12卷，第50-55页(1981)；《实验神经病学》111卷，269-275页(1981)(分泌多巴胺的PC12细胞)，及Ward等人WO 93/22427(分泌IgG的MOPC-31C细胞)。
经包被的细胞通常在体外温育，植入前再进行功能鉴定。通常在此植入前阶段，可在确定成分的培养基中培养经包被的细胞。所述培养基通常是缺乏营养添加剂的平衡盐溶液(例Aebischer.文献同上；Altman.文献同上；Chang et al.、文献同上)。另外，也可在如RPMI1640的营养培养基中温育经包被细胞，所述培养基含有多种氨基酸、维生素、无机盐和葡萄糖(2g/l；11.11mM)《动物细胞培养》，Pollard和Walker编辑，Humana出版公司，克利夫顿，新泽西，696-700页(1990))，典型地，此培养基中添加有5％-15％胎牛或马血清。
与体外条件相比，需经包被并植入宿主的细胞的营养条件必须遭受至少两次剧烈的变化。第一次变化在包被时发生。
与体外条件相比，包被环境中的细胞营养已耗尽。这种耗尽可以两种方式显现。在外部环境和胶囊内部之间有一个营养物梯度，此梯度横跨膜自然形成。应进一步强调此梯度，因为分子不能在外部宿主组织和胶囊内部每一位置处的细胞之间自由扩散。较靠近胶囊表面的细胞具有优先的通路，可让营养成份穿过胶囊套扩散进来。另外，较靠近胶囊表面之细胞的废产物更容易被排出。
如氧和葡萄糖的营养物浓度的第二次剧烈变化在植入宿主之时发生。这是因为体外的氧和至少一些其他营养物水平通常比体内出现的更高，因此体内将这些分子扩散至胶囊内的驱动力有所降低。
营养物环境的这些变化可导致一种或多种细胞特性的变化。例如，可导致细胞死亡或长期细胞存活力的下降。另外，植入时环境条件的改变也会影响保持存活之包被细胞的其他特性，如细胞生长速率或细胞产生生物活性分子的能力。不连续细胞亚群生长速率的改变会导致胶囊被生长较快的细胞亚群接收，从而有可能导致胶囊产品特征的明显改变，或产生其他潜在的不必要的影响。
体内植入条件和体外条件之间的一个重要差别是培养过的细胞所能适应的葡萄糖浓度。组织培养条件和植入位点处的条件之间的另一个差别是细胞可利用的氧的量。培养物培养基中和给定植入位点处的其他营养物浓度也显著不同。
代谢活性高的细胞或组织对营养物和氧丧失(氧过少)的影响格外敏感。类似地，许多在正常情况下靠稠密的毛细层维持，因而可适应在体内高氧和营养物水平下生长的内分泌组织即表现出此行为；朗氏和肾上腺嗜铬细胞的胰岛对氧过少休克特别敏感。
已知氧压力和营养物压力的改变可改变影响多种细胞功能的大量基因的表达。这种改变可影响某些mRNA的稳定性和功能。例如，营养物压力可影响酪氨酸羟化酶mRNA，该mRNA可编码一种酶，此酶可催化多巴胺生产过程中的限速步骤。
此外，低葡萄糖或氨基酸水平也可影响多种热激基因，以及如中间代射(如糖酵解和糖异生途径)所涉及的那些代谢酶的表达。
重要的是，丧失氧的高度分化的细胞类型可失去它们的组织特异性功能直至它们从氧过少休克中恢复[例见Wolffe和Tata，《FEBS通讯》，176，第8-15页(1984)]。丧失或降低的功能包括蛋白质的合成和修饰。这可能会影响到细胞想提供给周围宿主组织的真正的治疗因子的产生和分泌。另外，在一些情况下，氧过少的条件可起动恶性转化(例见H.Goldblatt等人，《生化医药》，7，第241-252页(1973))。
需要研究出一种植入方法，此方法包括在植入前将细胞暴露或适应于一种或多种限制性条件以减少因植入时环境条件改变的影响而导致的细胞特性的变化，从而减少对宿主的任何不良后果。也需要开发出如此制备出的细胞的细胞系。也需要提供体外研究遭受体内环境变化的细胞的方法。
发明概述
本发明涉及将经包被细胞植入宿主的方法，此方法包括在将细胞植入宿主内植入位点之前，在体外或体内使细胞暴露于一种或多种限制性条件达足够一段时间以建立对限制性条件反应的所需细胞特性。优选地，由本发明方法建立的细胞特性植入后实际上也可保持。经包被的细胞可产生生物活性分子，所述分子对于预防或治疗宿主的疾病或障碍，或提供、恢复或增强宿主的代谢功能是有用的。根据本发明所产生的细胞在体外也可用于诊断或其他目的。
图的简述
图1表示经包被的BHK细胞的NGF分泌状况，所述细胞是在体外，于50mmHg，含0.8g/l葡萄糖(低O2/gl)的培养基中培养的。BHK细胞被包裹在冲头封闭的4型双层胶囊内。在第3、7、14、21和23天，测定每个胶囊每24小时所分泌的NGF，结果由线条的高度表示。
图2表示经包被的BHK细胞，所述细胞是在体外，于142mmHg、含5.5g/l葡萄糖(高O2/gl)的培养基中培养的。BHK细胞被包裹在冲头封闭的4型(T4)胶囊中，在第3、7、14、21和28天测量每个胶囊每24小时所分泌的NGF，结果由线条的高度表示。
图3表示经包被的BHK细胞分泌NGF的情况，所述细胞在体外于低O2/gl培养基(同图1)中培养，在冲头封闭的4型(T4)胶囊中维持一段时间，所述胶囊是由(a)10％PAN/PVC、(6)12.5％PAN/PVC，或(c)15％PAN/PVC制成的。在第3、7、14、21和28天测量每个胶囊每24小时分泌NGF的情况，结果由线条的高度表示。
图4表示经包被的肾上腺嗜铬细胞在体外于20、40、60、80或140mmHg O2下培养14天，作为氧压的函数的释放的去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(EPI)。在第2天和第14天测量释放。A组表示基本的NE释放；B组表示K+引起的NE释放；C组表示基本的EPI释放；D组表示K+引起的EPI释放。
图5表示植入前及6周植入期之后的回收后，被2型胶囊包裹的小牛肾上腺嗜铬细胞所释放的儿茶酚胺。A组表示植入期之前和之后基本的NE和EPI释放。B组表示植入期之前和之后由烟碱刺激的NE和EPI的释放。C组表示植入期之前和之后由K+引发的NE和EPI的释放。
图6表示植入前及6周植入期之后的回收后，被4型胶囊包裹的小牛肾上腺嗜铬细胞所释放的儿茶酚胺。A组表示植入期之前和之后基本的NE和EPI释放。B组表示植入期之前和之后由烟碱刺激的NE和EPI的释放。C组表示植入期之前和之后由K+引发的NE和EPI的释放。
图7表示植入前及6个月植入期之后的回收后，经包被的小牛肾上腺嗜铬细胞在大鼠的背柱蛛网膜下隙释放的基本(A)的和经烟碱刺激(B)的儿茶酚胺。
图8表示植入前及3个月植入期之后的回收后，经包被的PC12和PC12A细胞在大鼠纹状体所释放的多巴胺和L-多巴。A组和B组分别表示植入前PC12和PC12A细胞的基本释放。C组和D组分别表示外植后PC12和PC12A细胞的基本释放。
图9比较了体内适应正常的或降低的多巴胺水平的细胞所释放的儿茶酚胺，降低的多巴胺水平是由大鼠黑质内的6-羟基-多巴胺(6-OHDA)损伤引起的。A组表示PC12细胞作为体内适应时间的函数的在黑质的损伤(划斜线的带)或未损伤(空白带)区域所释放L-多巴的基本速率。B组表示作为体内适应时间的函数的在大鼠黑质的损伤(划斜线的带)或未损伤(空白带)区域所释放的基本的L-多巴与多巴胺的比率。
图10表示经包被的PC12细胞作为体内适应时间(以月计)的函数的在灵长类动物的脑内释放的儿茶酚胺量。空心方块表示基本的L-多巴，而空心圆表示基本的多巴胺水平。
图11表示植入前和植入14个月以后BHK-hNGF克隆23细胞释放NGF的速率，所述细胞包裹在含Vitrogen基质或不含基质的HF 120794-6单层纤维中。细胞库(CB)细胞是未适应的BHK-hNGF克隆23细胞。
发明的详细描述
“细胞特性”包括可被测量的任何表型特性，包括细胞存活力、生长速率、细胞生产的生物活性分子。所需细胞特性指的是对限制性条件反应的一种或多种生物活性分子生产水平的变化、或者两种生物活性分子产量比率的变化。另外，所需细胞特性也可指对限制性条件反应的生物活性分子产量的稳定作用。
术语“限制性条件”是指体外正常或最适于培养细胞的一种或多种条件已被改变成与体内所需宿主植入位点处的实际或预期条件更密切吻合的条件。
“生物活性分子”可以(a)在制备它的细胞中起作用(如bcl-2以预防细胞程序死亡)，(b)可在细胞表面表达并影响细胞与其他细胞或生物活性分子(如神经递值受体或细胞粘附分子)、或(c)从制备它的细胞中释放或分泌并将它的影响施加给分离的靶细胞(如神经递质、激素、生长因子、细胞因子、或其他细胞内或细胞间信号传递介质)。生物活性分子可用于治疗或预防宿主的疾病或障碍，或者可以提供、恢复或增强宿主的一种或多种代谢功能。
术语“宿主”或“受体”是指包括哺乳动物，尤其是人类受试者的适当动物受试者。术语“受体”指一种动物，细胞在其中暴露于一种或多种限制性条件以致细胞表现出所需的细胞特性。术语“宿主”指其中植入了表现出所需细胞特性的经包被细胞的动物。
术语“细胞”指任何形式的细胞，包括但不局限于组织、细胞簇中保留的细胞，以及单个分离的细胞。本发明的细胞产生生物活性分子。细胞可以是自然产生生物活性分子的原代细胞或分离细胞，或者是已被基因工程操作从而能产生生物活性分子的细胞。
“生物可容性胶囊”是指胶囊植入宿主哺乳动物时，所产生的宿主反应不足以有害影响胶囊的功能或使它变得不可操作。例如，通过在胶囊周围形成纤维变性结构从而限制营养物扩散到其中的细胞即会出现这种不可操作性。有害的影响还包括胶囊的排斥或者胶囊向周围的宿主组织释放有毒或热性的化合物(例如合成的聚合物副产品)。
“免疫分离的胶囊”是指胶囊植入宿主哺乳动物宿主时，可使宿主免疫系统对其内部核心的细胞的有害影响减至最小，从而使胶囊在体内的作用维持更长一段时间。
术语“水凝胶”是指交联亲水聚合物的三维网状物。网状物是基本上由水组成的凝胶形式，优选但不限于含90％水以上的凝胶。交联水凝胶也可被当作固体，因为没有可感觉到的使用了切应力，它们就不会流动或变形。
在一个实施方案中，细胞在植入宿主内的植入位点之前，在体外被包裹在生物可容性胶囊中并暴露于一种或多种限制性条件下。细胞应在限制性条件下暴露足够长的一段时间以建立对限制性条件反应的所需细胞特性。优选此细胞特性在经包被的细胞植入宿主内的植入位点之后基本上可以保持。
举例说明的限制性条件包括下列一种或多种的变化：温度、pH或大气压，或一种或多种代谢物或辅因子的有效浓度变化，它们包括但不限于糖、醇、羧酸、氨基酸、脂肪酸、核酸、气体、金属离子或任何其他对细胞的生长、功能或存活力有贡献的生物因子，上述改变的结果与所需植入位点的体内条件更密切吻合。另外，限制性条件也可改变一种或多种生物活性分子的有效浓度，这些分子包括但不限于激素、生长因子、神经递质、细胞因子或其他参与细胞内或细胞间信号传递的生物活性分子。
应理解体内一些营养物和生物活性因子的浓度要比正常情况下体外所遇到的浓度低。作为另一种选择，体内一些营养物和生物活性因子的浓度也可比正常情况下体外所遇到的浓度高。
另外，本发明举例说明的限制性条件包括在体内或体外将经包被的细胞暴露于选定植入位点处的靶细胞以在经包被的细胞中产生所需的细胞特性。例见Wainer和Heller，“神经元杂交细胞系：产生，鉴定和利用”，《神经元细胞系》，J.Wood编辑，IRL出版，第20页(1992)。
本发明的方法可使用任何适当的培养物培养基。本领域的普通技术人员可修改确定成分的基本组织培养物培养基以得到符合所需植入位点特性的关键性气体营养物的所需浓度或其他限制性条件。
当细胞暴露于体外的限制性条件时，培养条件可缓慢而连续地改变，或者可以经过一步或多步的变化来得到所需的限制性条件。
在较优选的实施方案中，通过将细胞植入受体内的选定植入位点，而使细胞在体内暴露于一种或多种限制性条件。选定植入位点附近的分子环境会影响植入此位点并适应此位点的细胞的特性。例如，一种或多种生物活性因子(如激素、生长因子、神经递质或细胞因子)的浓度会影响植入细胞生长的能力、通过改变基因表达轮廓以在植入位点存活的适应能力、或产生所需的治疗因子的能力。一旦细胞已在体内暴露于限制性条件达足够一段时间从而表现出所需的细胞特性，即可回收细胞并植入宿主中。
我们优选体内暴露于限制性条件是因为细胞表现出的所需靶细胞特性是通过调整与限制性条件一致的所有细胞表型特性来建立的。相反，体内适应或暴露于限制性条件会导致某些所需细胞特性的建立。然而，当这些细胞被植入宿主时，其他细胞特性会有所变化并影响到所需的已建立的靶细胞特性。
优选地，受体和宿主都是灵长类，最优选宿主为人类。优选宿主内的植入位点与受体中的一致。
根据此实施方案体内制备的细胞也可保持在一种或多种限制性条件下，并在体外用作诊断或其他目的。
在另一个实施方案中，细胞在包被前在体外被暴露于多种限制性条件。优选地，再包被细胞并在植入宿主前暴露于另外的限制性条件下。在包被前暴露于一种或多种限制性条件可使人从最初的种群中选择存活的细胞并仅包被那些细胞。如果所用细胞是有丝分裂后的细胞或其他未分离的细胞，即可根据它们明显的生长状况，和表型从最初的种群中选择细胞，表型最好通过所需生物活性分子的产生来测量。如果所用细胞是活性分离细胞，存活细胞典型地会长出最初种群的范围。
足以建立对限制性条件反应的所需细胞特性的时间根据所用细胞以及限制性条件而有所变化。典型地，当细胞最初暴露于限制性条件时，需经受一个过渡期，在此期间细胞表型持续改变直至建立了对限制性条件反应的细胞特性。通过常规实验可确定过渡所需的时间。
在较优选的实施方案中，经基因工程操作可分泌神经生长因子(NGF)的幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)被悬浮在胶原/Vitrogen基质中并被包裹在两端封闭的中空半透纤维中。如已引入本文作为参考的PCT/US 94/09299中描述了这种BHK-hNGF细胞的制备。在体外使胶囊适应低氧和低葡萄糖条件，将胶囊释放的NGF量测定为体外适应时间的函数。每个胶囊的NGF产率随体外适应时间的增加而增加(图1)。
在另一个较优选的实施方案中，经包被的BHK-hNGF细胞被植入宿主的旁心室并在体内适应。外植胶囊，移出适应的细胞并通过重复传代培养，然后重新包裹以在体内将适应细胞植入受体。在重新植入前和重新植入受体后的不同时间检测含未适应细胞或体内适应细胞之胶囊的NGF释放情况(图11)。
在另一个较优选的实施方案中，将包裹在单层半透膜内的PC12细胞体内暴露于灵长类脑中的限制性条件达6个月。6个月的植入期之后，细胞表现出对限制性条件反应的所需细胞特性，即细胞表现出神经递质的产生有所变化，这是通过L-多巴与多巴胺的基本释放量比值测出的，细胞还表现出与植入前的水平相比，其他儿茶酚胺相对释放量的变化(图7)。
在另一个较优选的实施方案中，PC12细胞被包裹，并在体内适应黑质脑区域，该区域具有正常的多巴胺水平，或具有通过预先施用6-羟基多巴胺(6-OHDA)而单向诱导的降低的多巴胺水平。体内适应28或60天的PC12细胞比适应较短时间的PC12细胞产生的L-多巴水平要高一些。在正常多巴胺水平的存在下体内适应的细胞重新植入受体时比在多巴胺水平降低的6-OHDA损伤的黑质中适应的细胞所产生L-多巴与多巴胺的比率更高(图9)。
在另一个实施方案中，包裹在双层半透膜中的肾上腺嗜铬细胞在人体内蛛网膜下隙的限制性条件中暴露了55和84天。植入期之后，细胞表现出改变的神经递质的产生。
举例说明了大量不同的植入位点。这些植入位点包括中枢神经系统，它包括脑和眼的水样和玻璃状液。优选的脑位点包括纹状体、大脑皮层、丘脑下核和迈内特氏核上颚基片。其他优选的位点是脑脊髓液，最优选蛛网膜下隙和旁室。本发明还举例说明了植入肾囊下位点，和腹膜内、皮下位点、或任何其他对治疗有利的位点。
在某些情况下，体内适应之前或同时修饰植入位点以产生最适环境是有用的。例如，已知的帕金森氏病的模型包括对脑黑质施用6-羟基多巴胺。此毒素是为产多巴胺的神经之选择的。可将细胞植入此损伤区域并使细胞适应此区域。植入此损伤脑部可分泌儿茶酚胺的PC12细胞在体内约1个月后所释放的儿茶酚胺量表现出全面的增长。另外，在体内约14天后，儿茶酚胺种类的比率随着基本的L-多巴与多巴胺比率的降低而变化。
植入位点之间和不同种之间的局部环境是不同的。可能相同种的个体之间任何给定植入位点的局部环境都有所不同。通常，无需经过实验即可从公开的文献中估计出或由本领域普通技术人员确定出给定植入位点的代谢物和气体浓度。
例如，对人而言，已知人体典型的局部氧压在动脉血的约90mmHg到工作的肌肉组织的低于1mmHg之间变化。其他典型的氧压是：静脉血(40mmHg)、腹膜腔(47mmHg)、和脑脊髓液(59mmHg)。
同样，典型的葡萄糖值在供血组织的80-120mg/分升(4.4-6.7mM)和脑脊髓液(CSF)的40-70mg/分升(2.2-3.9mM)之间变化〔《盖吉科技表》第1卷，“测定单位、体液、机体组合物、营养”，第8版，希巴—盖吉，1984〕。在引入本文作为参考的《盖吉科技表》中也可发现这些和其他此例。表I比较了血清和CSF中存在的多种化合物的浓度。
表 1化合物 脑脊髓液 血液(血清)氧 59 mmHg 40 mmHg葡萄糖 100±20 mg/dI 55±15 mg/dL半乳糖 166±99 μm 17± μm甘油 13.5±2.5 μm 120±65 μm乳酸 1.6±0.2 mM 0.76±0.34 mM丙酮酸 115±17 μm 32±19 μm磷脂 5.21±0.9 μm 2.9±1.2 μm脂肪 3.5 μm 500 μmcAMP 21±8 nM 11±2.4 nMcGMP 2.4±0.5 nM 9.5±2.1 nM氧化物 125±3 mM 102.5±4.5 mM磷 0.52±0.07 mM 1.05±0.31 mM钠 145±3.9 mM 140±2.38 mM钙 1.19±0.08 mM 2.44±0.1 mM镁 0.89±0.17 mM 0.78±0.04 mM锌 0.49±0.12 μM 16.7±3.1 μM铁 0.8±0.4 μM 17.2±0.75 μM铜 0.25±0.06 μM 16.25±0.75 μM锰 21±6 nM 10±2.4 nM胆碱 8.3±1.7 μM 15.5±2.3 μM组胺 87± nM 3.4±0.7 nM去甲上腺素 1.4± nM 1.65±1.0 nM肾上腺素 0.24± nM 0.13±0.1 nM血清素 3.9±1.08 nM 50±20 nM
包括葡萄糖、氨基酸、乳酸和核苷的分子跨过血脑屏障被转运到CSF中以供应如室、蛛网膜下隙和脊髓沟的CSF-浸泡区域。典型地，CSF中半乳糖浓度比血浆中高出10倍，CSF中的丙酮酸和乳酸也比血浆中更浓。相反，血液中的大多数氨基酸比CSF中的浓5至30倍(见盖吉科技表，第1卷，出处同前，第169页。)。
如维生素C、叶酸盐(维生素B复合物类)、脱氧核苷和比哆醇(维生素B6)的其他“微量营养物”物质跨过血脑屏障被活性转运到CSF。另外，CSF中的离子浓度，如钠、钾、钙、镁和氯的浓度应被严格调节(Sepctor和Johanson，《科技美国人》，第68-74页(1989年11月))。
典型地，培养物培养基中存在的代谢物应选择为最适于细胞在组织培养中的生长和存活力。这些化合物的浓度与给定植入位点存在的浓度有偏差。通常细胞生长所需的盐和葡萄糖浓度比所需植入位点处的浓度要高一些。例如，RPMI 1640培养基含有11.1mM葡萄糖，而血清中葡萄糖水平约为4.5mM，CSF中仅为2.2-3.9mM。
类似地，RPMI 1640中的钙水平为0.42mM，而CSF中的钙水平为1.2mM，血清中为2.44mM(表1)。CSF中的锌离子浓度为0.5μM，血清中为16.7μm，而RPMI 1640培养基中则不含锌。
另外，大多数细胞在体外于大气氧水平(142mmHg)或带有环境中的潮湿空气和5％-7％CO2的温箱中培养(例Aebicher等人，生物材料文献同上，Ward等人，文献同上)。这比宿主体内选定植入位点处存在的氧浓度显著较高。
而且，所有组织培养用的培养基都缺乏体内存在的短生分子。这些短生分子在体内快速降解并被不断合成或补充。一些培养物培养基添加有热灭活的胎牛或马血清以取代一些物质，但血清中的短生分子通常也很少或没有。当添加血清时，典型地，培养基总量中少于20％的量为血清时，这些分子存在的浓度最多仅为血清中浓度的1/50。另外，添加有血清的培养物培养基会含有不一致宿主中不会出现的分子，所述分子对经包被的细胞具有不良影响。最终，当大多数成分的血清浓度是它们在组织液中浓度的反映时，血清和组织液中的特殊物质的浓度将会显著不同。
本发明所用细胞可以与宿主同种异体(即来自与宿主相同的种)或与宿主异种异体(即来自不同种)。我们优选将细胞植入异种异体宿主。应理解制备植入到异种宿主内的细胞可能涉及到与植入同种宿主所不同的限制性条件，可能产生具有不同细胞将性的表型不同的细胞种群。
可从供体(即原代细胞或组织，包括成年，出生不满一月和胎细胞或组织)制备细胞，或者也可从体外复制的细胞，如无限增殖化细胞或细胞系，包括基因修饰细胞中制备细胞。
原代细胞可来自未分离(有丝分裂后)的正常组织，如肝中的那些自然分离(有丝分裂)的细胞，或来自如脾中和骨髓中的那些多能干细胞。
本发明中所用的原代细胞包括来自哺乳动物CNS的对生长因子敏感的神经祖干细胞〔Peynolds和Weiss，《科学》，255，1707-1710(1992)；Richards等人，《美国国家科学院公报》89，8591-95页(1992)；Ray等人，《美国国家科学院公报》90，第3602-06页(1993)〕，原代成纤维细胞、Schwann细胞、星形细胞、β-TC细胞、Hep-G2细胞、ATT20细胞、少突神经胶质细胞及它们的前体、成肌细胞、肌管、肾上腺髓质组织或肾上腺嗜铬细胞。我们优选神经干细胞和肾上腺嗜铬细胞。
同样优选的Schwann细胞可根据Bunge的方法(PCT公开申请WO 92/03536)制备。可将经包被的Schwann细胞植入脑的适当区域以防止与帕金森氏病相关的黑质纹状体通道的产多巴胺神经元的变质。通常，优选的植入位点是纹状体或其附近的位置。由于细胞不与神经元近侧接触，而且不会出现髓鞘形成，因此包被细胞可增强营养因子的分泌。为了这种目的，包括星形细胞和少突神经胶质细胞在内的其他胶质细胞类型也可被包被和植入。
分离可产生选定产物的细胞或组织的技术是已知的，或者也可由已知技术修改。例如，如Scharp等人的、US专利号4,868,121中所述，联合使用机械膨胀和胶原酶消化即可从大型动物的胰腺(如人或猪)中分离朗氏细胞的子集，使用Scharp等人《糖尿病》第29卷，增刊1，第19-30(1980)的方法即可从如大鼠的小型动物中分离子集。
类似地，如Sun等人在《人工细胞，人工器官生物学》第15卷，第483-496(1987)中所述，先使用胶原酶消化，再使用组织分级沉淀即可从肝脏组织中分离肝细胞。通过已知的方法〔Livett，《生理学评论》第64期，第1103-61页(1984)；Sagen等人的美国专利4,753,635〕可分离肾上腺嗜铬细胞。
无限增殖化细胞可来自原代细胞，或者也可从被病毒、病毒基因产物、癌基因或其他无限增殖化基因或基因产物转化的细胞中选择。适于本发明实际操作的公众可利用的细胞系例子包括：幼仓鼠肾(BHK)、中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠成纤维细胞(L-M)、NIH Suiss小鼠胚(NIH/3T3)、非洲绿猴细胞系(包括COS-a、COS-7、BSC-1、BSC-40、BMT-10和Vero)，大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12)、PC12A、大鼠胶质肿瘤(C6)细胞、RAJI(人淋巴瘤)细胞、MOPC-31C小鼠浆细胞、MN9D、MN9H细胞和rip Tag转基因小鼠衍生的细胞。我们优选BHK和PC12细胞。
细胞无限增殖化技术描述于Land等人，《自然》第304期，596-602页(1983)和Cepko，《神经元》第1期，345-353页(1988)。候选细胞系包括可分泌胰岛素的基因工程β-细胞系，如NIT细胞(Hamaguchi等人，《糖尿病》第40期，第842页(1991))和RIN细胞(Chick等人，《美国国家科学院公报》第74期，628-632页(1977))、ATT细胞(Hughes等人，《美国国家科学院公报》第89期，688-692页(1992))、CHO细胞(Matsumoto等人，《美国国家科学院公报》第87期，9133-37页(1990))、和β-TC-3细胞(Tal等人，《细胞分子生物学》第12期，422-32页(1992))。
本发明的细胞或者可从自然产生生物活性分子，或者可经过基因工程操作而产生生物活性分子。例如，可用选定产物(如神经生长因子、促红细胞生成素、胰岛素、CNTF或因子VIII)的表达载体转染成纤维细胞。
用于治疗疾病或障碍的生物活性分子的例子包括可用于治疗糖尿病的胰岛素，可用于治疗甲状旁腺机能减退的甲状旁腺激素，用于治疗贫血的促红细胞生成素以及治疗癫的γ-氨基丁酸。
类似地，如营养和生长因子的生物活性分子可用于治疗或预防神经变性疾病，如杭廷顿氏舞蹈病和早老性痴呆、与AIDS相关的痴呆和帕金森氏病。如淋巴因子或细胞因子的生物反应因子可增强病人的免疫系统或可用作抗炎症剂，并可用于治疗某些慢性感染性疾病或癌症。另外，经包被的细胞也可提供儿茶酚胺、内啡肽、脑啡肽和其他阿片样肽以治疗疼痛。
可使用经包被细胞提供对修正酶缺陷有用的生物活性分子。这种缺陷的例子之一是暴发的肝损伤，其中肝组织不再能清除毒素或排出代谢废产物。另一个例子是苯丙酮酸尿症，其中氨基酸苯丙氨酸在受侵袭的未成年人血流中增多至危险的水平。
另外，经包被的细胞也可产生能从宿主中除去有毒或不需要的产物的生物活性分子。例如，经包被的细胞可产生能从宿主中“清除”胆固醇的生物活性分子。
本发明的生物活性分子包括激素、细胞因子、生长因子、营养因子、血管生成因子、抗体、血液凝集因子、淋巴因子、酶和其他治疗剂或其拮抗剂、前体、活性类似物或其活性片段。它们包括儿茶酚胺、内啡肽、脑啡肽和其他阿片样肽、强啡肽、胰岛素、因子VIII、促红细胞生成素、P物质、神经生长因子(NGF)、来自胶质细胸系的神经营养因子(GDNF)、来自血小板的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、来自脑的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)系列成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子(CNTF)、CNTF相关分子和胰岛素样生长因子I、II和III。
在一个实施方案中，生物活性分子是神经递质。这种神经递质包括多巴胺、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、乙酰胆碱、去甲肾上腺素、肾上腺素、谷氨酸和其他肽神经递质，优选多巴胺、去甲肾上腺素或肾上腺素。另外，生物活性分子也可以是神经递质的拮抗剂、类似物、衍生物或片段，包括例如多巴胺的前体L-多巴。
在另一个实施方案中，适应细胞可分泌抗伤害感受剂，包括儿茶酚胺、脑啡肽、阿片样肽或其拮抗剂或类似物，它们可被使用，或者可包括它们的混合物。优选分泌儿茶酚胺或脑啡肽，最优选分泌儿茶酚胺和脑啡肽的混合物。
用于本发明的胶囊典型地至少具有一个半透外表面膜或包周含细胞核心的套。此套允许营养物、生物活性分子和其他选定产物透过胶囊扩散。此胶囊是生物可容性的，优选为免疫分离性的。核心内含有分离的细胞，或者悬浮于液体介质中或者固定在水凝胶基质内部。
用来构建胶囊之材料的选择由许多因素确定，并详细描述于Dionne WO 92/19195中。简单地说，多种聚合物和聚合物混合物可用来制备胶囊套。形成胶囊的聚合物膜可包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸酯类共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜类、Polyphosp-hazenes、聚丙烯腈、PAN/PVC及其衍生物、共聚物和混合物。
可通过本领域已知的任何适当方法形成胶囊。其中一种方法包括共挤压聚合物喷射溶液和促凝剂，其包括生物组织片段，细胞器或细胞和/或其他治疗剂的悬浮液。胶囊套可为单层(1，2型)或双层(4型)。当共挤压时通过反淬灭聚合物溶液的一个表层即可产生单层中空纤维。当共挤压时通过淬灭聚合物溶液的两个表层即可产生双层中空纤维。典型地，1型中空纤维与4型中空纤维相比，其表面被大气孔占据的百分比更大。2型中空纤维居中。例见列入本文作为参考的Dionne WO 92/19195和美国专利5,158,881，5,283,187和5,284,761。
许多胶囊构型都是可能的，例如圆筒形、圆盘形或球形。
载体的套所具有的微孔大小可决定选择通透性膜切断的分子量(MWCO)。大于MWCO的分子受到物理阻碍，不能横跨膜。选择膜微孔的大小以允许细胞产生的特殊因子从载体中扩散出来，但可阻止宿主免疫反应因子进入载体。典型地，MWCO在50和200KD之间变化，优选为50至100KD之间。最适合的膜组合物也可以使已知存在于选定植入位点上的宿主免疫效应物分子和载体外膜成分之间的反应性减至最小。
构建免疫分离载体的核心以提供在其中分离的特殊细胞的适当局部环境。此核心可包含足以维持细胞生长的液体培养基。液体核心特别适合维持如PC12细胞的转化细胞系。可选择地，核心也可包含凝胶基质，此凝胶基质由小凝胶(藻酸盐、“Vitrogen”等)或细胞外的基质成分组成。例见Dionne WO 92/19195。
形成小凝胶的组合物可分成三种一般类型。第一类携带净负电荷(如藻酸盐)。第二类携带净正电荷(如胶原和层粘连蛋白)。商业上可得到的细胞外基质成分的例子包括MatrigelTM和VitrogenTM。第三类为净电中性(如高度交联的聚环氧乙烷或聚乙烯醇)。
由水凝胶基质制成的核心特别适于维持趋于形成附聚物或聚集体的细胞或组织，如朗氏细胞的子集细胞或肾上腺嗜铬细胞。
影响胶囊核心内装入的细胞数目或组织量的因子包括(1)胶囊大小和几何形状；(2)胶囊内的细胞有丝分裂活性，和(3)核心的制备和/或装入的粘度需要。这些因子详细描述于Dionne WO 92/19195中。
通过在胶囊上装备一个绳即可容易地回收植入的大胶囊。使用吸出法或任何其他适当的方法可回收微胶囊。尤其是，使用PCT/US 93/07076中描述的袋装置可便于微胶囊的回收。
可使用任何适于封闭胶囊的方法，包括使用聚合物胶粘剂和/或卷曲、连结和热封闭。这些封闭技术是本领域已知的。另外，也可使用任何适当的“干燥”封闭方法。在这种方法中，提供了一个基本上无孔的装置，含有细胞的溶液通过此装置被引入，装满之后封闭胶囊。列入本文作为参考的PCT/US 94/07015中描述了此方法。
植入体内之前，优选使用一种或多种体外测定以确定胶囊的功能。本领域熟知的测定法或诊断试验可用于这些目的。例见《酶学方法》，Abelson编辑，研究出版社，1993。例如可使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、层析或酶测定法或分泌产物的特定生物测定法。如果需要，可通过从受体搜集适当样品(如血清)并检测之来监测植入物的分泌功能达一段时间)。如果受体是灵长类动物，则可使用微量透析。
另外，通过监测如氧摄取、葡萄糖利用或线粒体功能的这些功能还可测定细胞的代谢活性。使用本领域已知的方法(如使用Dia-mond General Oxygen Uptake System(#1271)和带有聚乙烯膜的Clark-style电极(#731)可测量氧摄取率。
通过使用本领域已知技术测定基因插入物的拷贝数即可评价工程化细胞表达异源基因产物的遗传稳定性。例如，通过酶解消化基因组DNA、印迹、探测并使用Phoshor Imager(Molecular Dynamics)将信号与已知标准相比较即可测出质粒拷贝数。
当植入由特殊应用所需生物活性量来确定时，胶囊数目和胶囊大小应足以产生治疗效果。在分泌细胞释放治疗物质的情况下，可使用本领域已知的标准剂量考虑和标准来确定所需分泌物质的量。Dionne，WO 92/19195中讨论了要考虑的因子。
经包被细胞的植入在无菌条件下进行。通常，植入胶囊的宿主位点允许适当传递分泌产物或对宿主的作用，以及将营养物传递剂植入细胞或组织，此位点也允许接近胶囊以回收和/或替换。
下列实施例将进一步阐明本发明，不要认为它以任何方式限制本发明。实施例实施例1：暴露于低氧和葡萄糖环境中的经包被BHK细胞所分泌的
NGFBHK-hNGF细胞系的产生
产生可分泌NGF的BHK细胞系并将它暴露于低氧和葡萄糖环境中。在以DHFR为基础的PNUT表达载体中，紧接小鼠金属硫蛋白-1启动子(-650至+7)和大鼠胰岛素II基因的第一内含子下游亚克隆了约含有第一内含子3′末端37bp的2.51Kb片段，据信为pre-pro-NGF蛋白质翻译起始信号的两个ATG序列以及人基因的完整编码序列和完整的3′非翻译区(Hoyle等人，《神经元》第10期，第1019-34页(1993)(Baetge等人，《美国国家科学院公报》第83期，5454-58页(1986)。
使用磷酸钙法用pNUT-βNGF构建体转染幼仓鼠肾(BHK)细胞。37℃下，于5％CO2，含10％胎牛血清、1×pen/strep/amph B(0.8g/l)和L-谷氨酰胺(GIBCO)的DMEM培养基中培养BHK细胞。在含有200μm氨甲蝶呤(Sigma)的培养基中选择经转染的BHK细胞达3-4周，用或不用200μm氨甲蝶呤将抗性细胞保持为多克隆种群。PAN/PVC纤维的制备：
通过干喷-湿旋技术可制备选择通透性的中空纤维〔Cabasso，《中空纤维膜》第12卷，《科克—奥期玛化学技术百科全书》，Wiley，纽约，第3版，第492-517页，1980；Dionne的国际专利WO 92/19195〕。不对称的中空纤维由二甲基亚砜中的10％(W/W)聚丙烯腈聚氯乙烯(PAN/PVC)共聚物溶液浇铸而成，并在凝结剂浴中直接淬火。在无溶剂水浴中收集所得双层(4型)纤维，用甘油处理并干燥之。基质的制备
在1ml酚红/磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入8ml大鼠尾部胶原(IV型、Collaborative、lot 91-1083)并将溶液调至pH7.0。在2ml酚红/PBS中加入8ml Vitrogen(Celtrix Palo Alto、CA；Lot 92H176)。将等体积的胶原和Vitrogen溶液相混合以形成基质溶液。装入和封闭步骤
用PBS(不含钙和镁)冲洗生长至90％铺满的产NGF的BHK细胞之单细胞悬液，用胰蛋白酶消化约1分钟，在1000rpm下离心3分钟以沉淀细胞。将细胞重新悬浮于培养基中至最终细胞浓度为2×107细胞/ml。然后将此细胞悬浮与胶原/Vitrogen基质溶液按1∶1混合，使最终细胞浓度为1×107细胞/ml。
在基质中轻缓地混合细胞以确保包被前悬浮液可平均分布。使用24-孔径斜截导管滴头和Hamilton注射器将2.5微升(μl细胞/基质悬浮液(10.000细胞/μl)装入纤维中。通过在冲头上封固一个1-1.1cm长的干燥中空纤维即可封闭胶囊，所述冲头在最接近的末端具有一个隔膜固定装置，此末端具有可使细胞注射进装置腔的装载入口。注入2.5μl细胞悬浮液之后，隔膜裂开，使用光硫化丙烯酸酯(LuxtrakTM LCM 24、ICI树脂，美国马里兰州威明顿)封闭入口(“冲头”)封闭。然后通过将一个1.5cm的0.020”硅橡胶管放在丙烯酸类冲头上即可“栓住”胶囊。
在大气氧水平下使胶囊适应3天，检测基线NGF分泌情况。用1毫升(ml)新鲜培养基替换使用了3天的培养基。
然后将胶囊放在含低葡萄糖(0.8mg/l)和低氧(50mmHg)或高葡萄糖(5.5mg/l)和大气(142mmHg)氧水平的24孔培养板中。每隔7天更换一次培养基并进行NGF测定。更换前一天，将新鲜培养基转移到每个适应条件下的适当氧浓度中，用此方法培养经包被的细胞达4周。
在第0、3、7、14、21和28天，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定NGF水平。用4％低聚甲醛固定代表性胶囊以组织学测定细胞存活力的分布情况。
在4％低聚甲醛中固定之后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗回收的胶囊，在超过95％级的乙醇中脱水，在甲基丙烯酸乙二醇酯浸润液(Historesine封固剂，Reichert-Jung)中包埋。在切片机(Supercut2065、Leica)上切下3微米厚的切片，在玻璃载片上封固并用甲酚紫染色。NGF ELISA
按下述对经包被的BHK/NGF的细胞所释放的hNGF进行定量测定。在每孔中用150μl于外被缓冲液(不含CaCl2并不含MgCl2/0.1％叠氮化钠；pH9.6)中的浓度为1ng/ml的抗-小鼠-β(2.5S)NGF覆盖Nunc-Immuno Maxisorp ELISA培养板，在37℃下至少保温2小时或可选择地在4℃下过夜。
弃去外被溶液，用300μl洗涤缓冲液(50mm Tris-HCl/200mmNaCl/1％曲通x-100/0.1％叠氮化钠；pH7.0)将孔洗3次，在室温下用含有10mg/ml BSA的300μl外被溶液封闭30分钟。再用300μl洗涤缓冲液将孔洗3次。在2倍样品缓冲液(样品缓冲液与洗涤缓冲液相同，只是含2％BSA)中将条件培养基样品按1∶1稀释，在孔中装入10μl制备好的样品。37℃下温育培养板至少2小时或4℃下过夜。
倒空每孔，用300μl洗涤缓冲液洗3次，加入100μl 4u/ml的抗-小鼠-β(2.5S)NGF-β-gal缀合物。37℃下将培养板温育至少1小时。倒空每孔，用300μl洗涤缓冲液洗3次，加入200μl氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷底物溶液(40mg CPRG，溶于100mm Hepes/150mm NaCl/2mm MgCl2/0.1％叠氮化钠/1％BSA；pH7.0中)。37℃下将培养板温育30分钟至1小时或直至颜色的生成足以在570nm下进行光度测定。结果
图1和图2显示了在两种环境条件下，每个以冲头封口的10％4型纤维胶囊作为时间函数的NGF释放量。数据表示为每个胶囊每24小时释放的ng NGF。在评价阶段，每个胶囊所产生的NGF呈上升趋势。实施例2：包裹在具有变化的液压渗透性的胶囊之后有所适应的
BHK细胞分泌的NGF
本实施例所用的BHK-hNGF细胞如实施例1中所述。按实施例1所述制备中空纤维，不同之处在于使用12.5％和15％PAN/PVC以及含10％PAN/PVC的喷射溶液来制备大胶囊。PAN/PVC双层纤维(T4)为1cm长并具有下列特性：
％固体 I.D.(μm) 液压渗透性
10 721 60
12.5 733 20
15 746 13
(液压渗透性为ml/min/m2/mmHg)
将BHK-hNGF细胞装进三种类型的大胶囊中，并按实施例1的描述封口。将此胶囊在低葡萄糖和低氧条件下暴露4周，并按实施例1的描述检测NGF的释放。
图3显示了从三种不同的胶囊类型中释放的作用时间函数的NGF量。4周后，由10％的PAN/PVC胶囊所释放的NGF平均值为约50ng/胶囊/24小时，而由12.5％PAN/PVC胶囊所释放的NGF平均值约为30ng/胶囊/24小时。在1、2、3或4周后，由15％PAN/PVC胶囊产生的NGF为不可检测的水平。对胶囊的组织学检测证实了在10％和12.5％的PAN/PVC胶囊中存在生长良好的细胞簇。4周后只有15％的PAN/PVC胶囊中存在死细胞。实施例3：经包被的BHK-hNGF细胞被植入宿主
将实施例1的经包被细胞暴露于实施例1的低氧和葡萄糖浓度下直至BHK细胞的NGF释放水平在这些限制性条件下稳定为止。将经包被的细胞植入人宿主。植入位点包括旁室和脑纹状体。引入本文作为参考的Aebischer等人、WO 93/00127中公开了将胶囊植入脑的方法。实施例4：经包被的肾上腺嗜铬细胞体外暴露于限制性条件
如Livett，《生理学评论》，第64期，第1103-62页(1984)所述，通过用胶原酶消化从牛肾上腺腺体中获取肾上腺嗜铬细胞。
在与CaCl2交联的1.5％藻酸盐基质中固定肾上腺细胞聚集体，并将所述细胞聚集体包裹在双层4型，免疫分离的PAN/PVC中空纤维膜中(ID 750μm、Wall 85μm、MWCO 60KD)，所用方法基本描述于WO 92/19195中。
在20、40、60、80和142mmHg的PO2下将经包被细胞培养2周。在第2和14天，检测细胞的基本和K+-引发的儿茶酚胺释放情况。14天后，在4％低聚甲醛中固定胶囊，并进行组织学分类处理，切片和形态学评价。
通过使用电化学检测的HPLC分析儿茶酚胺。层析系统使用一个库仑多电极检测器(5100A型、ESA、Inc.)一个日立牌L6200泵(Hitachi、Inc.)、和一个配备有MPLC NewGuard Column(AppliedBiosystems、Inc.)的Hypersil 150mm×4.6mm、3微米OPS柱(Key-stone Scientific Inc.)，层析在26℃下进行。
移动相由75mM NaH2PO4、1.4mM辛烷磺酸、0.274mM EDTA和100ml/l CH3CN组成。用浓磷酸将pH调至3.0，流速维持在1.0ml/min。
检测器装备有预注射器保卫元件(5020型)和高分辨率的双重分析元件(5011型，前者在+450mV下操作，后者对电极1和2而言分别在-40mV和+400mV下以氧化屏的方式操作。在检测器2中测量分析物。
使用三份标准以证实52fmol的L-多巴(L-、3、4-二羟基苯丙氨酸)、Dopac(3、4-二羟基苯乙酸)，去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)以及柱上104fmol HVA(同源香草酸)的检测阈值，上述物质的百分标准偏差范围分别为阈值2-5％、9-12％、15-24％和6-17％。单份7点标准曲线线形穿过柱上分析物的范围，此范围对L-多巴、Dopac、NE和DA而言为52至3300fmol，对HVA而言为104至6600fmol，它们的r2值分别为0.999、0.998、0.999和0.999。
使用Waters 845 VAx层析工作站捕获数据并求峰面积的积分。
结果示于图4。数据表示为每30分钟的皮摩尔数(基本释放量)或每15分钟的皮摩尔数(K+-引发的释放量)。在较高的O2浓度下，第14天基本的，更特别地为K+-引发的去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(EPI)的释放量比第2天的要高一些。因此，将经包被的细胞暴露于限制性条件可导致一种或多种细胞特性的改变。实施例5：经包被的肾上腺嗜铬细胞暴露于体内限制性条件
如实施例4中所述制备牛肾上腺嗜铬细胞。在与CaCl2交联的1.5％藻酸盐基质中固定肾上腺细胞聚集体，并将此细胞聚集体包裹在单层2型、免疫分离的PAN/PVC中空纤维膜(ID500μm、Wall 70-90μm、MWCO 60KD)中或双层4型免疫分离的PAN/PVC中空纤维膜(ID 500μm、Wall 70-90μm、MWCO 60KD)中，所用方法基本描述于WO 92/19195中。
通过将经包被细胞植入大鼠受体纹状体可使之暴露于体内限制性条件。在每只大鼠中两侧植入两颗胶囊。沿中线切开后，在颅骨上钻一个洞，此洞的坐标距前囟+0.5mm，位于门齿栏架侧面3.0mm，在内耳线下方-0.3mm。将胶囊放低使它深居硬脑膜7mm。
在植入前和体内适应6周后，检测胶囊产生的儿茶酚胺。如实施例4所述检测儿茶酚胺的量。
图5显示了使用2型膜得到的结果。数据表示为每个胶囊每15分钟的皮摩尔数。植入前和植入6周后，基本的(A组)和K+-引发的(C组)NE和EPI释放水平相似。然而，体内暴露6周后，烟碱-引发的(B组)NE和EPI释放水平高于植入前的水平。
图6显示了使用4型膜得到的结果。植入前和植入6周后，K+-引发的(C组)NE和EPI释放水平类似。然而，体内暴露6周后，烟碱-引发的(B组)NE和EPI释放水平高于植入前的水平。另外，植入前和植入6周后(A组)的儿茶酚胺基本释放水平之间有所不同。实施例6：经包被的肾上腺嗜铬细胞暴露于体内限制性条件
如实施例4所述制备牛肾上腺嗜铬细胞。在与CaCl2交联的1.5％藻酸盐基质中固定肾上腺细胞聚集体，将此细胞聚集体包裹在双层4型、免疫分离的PAN/PVC中空纤维膜(ID 500μm、Wall 70-90μm、MWCO 60KD)中，所用方法基本描述于WO 92/19195中。
通过将经包被的细胞植入大鼠受体的脊柱蛛网膜下隙可使细胞暴露于体内限制性条件。基本按Aebischer et al.、WO 93/00127所述进行外科步骤。
植入前和体内暴露6周后检测胶囊产生的儿茶酚胺。按实施例4所述检测儿茶酚胺。数据表示为每个胶囊每30分钟的皮摩尔数。
图7表示植入前和植入后NE和EPI生产水平的差异。经包被细胞的植入期为6个月。体内植入6个月后，基本的和由烟碱刺激的EPI产量显著降低，而NE产量显著增加。实施例7：经包被的PC12细胞暴露于灵长类动物脑中的体内限制性
条件
在添加有10％热灭活的马血清、5％胎牛血清和100单位青霉素/链霉素的RPMI悬浮培养物中培养PC12细胞，收获细胞，离心并弃去上清液。
70℃下通过剧烈搅拌将Fluka High MW脱乙酰壳多糖(4.4g)溶于150ml无菌的0.85％盐水中，用45ml 100MM HEPES缓冲盐水(pH8.0)将溶液的pH调至6.2。使溶液通过一个0.22μm的微孔滤膜以过滤除菌。
将脱乙酰壳多糖溶液与等体积的RPMI相混合，并用此混合液重新悬浮细胞沉淀物至终浓度为5×106细胞/ml。共挤压细胞/脱乙酰壳多糖溶液(约1,000μl)与PAN/PVC以形成单层、xp11免疫分离的PAN/PVC中空纤维膜(ID 450-500μm，Wall 50-65μm、MWCO 65-100KD，液压渗透性为53ml/min/m2/mmHg、葡萄糖质量转移系数为8×10-4cm/s、微孔大小渗透性为88％BSA排斥系数)。使用美国专利5,158,881、5,283,187和5,284,761所述的一般方法可形成这些纤维。将纤维调整为适当的尺寸(约为1cm)并通过热卷曲末端封闭纤维。
在3只Cynomologous猴中植入经包被细胞，基本上按Aebischeret al.、WO 93/00127所述进行外科步骤。在尾的不同位置植入两个胶囊，在核的不同位置植入三个胶囊。植入核和尾的命名立体定位坐标经推知如下所述：核位点1＝距内耳O前方23.0mm，距矢状缝侧面9.0mm，距脑表面下方16.5mm；核位点2＝距内耳O前方19.0mm，距矢状缝侧面10.0mm，距脑表面下方19.5mm；核位点3＝距内耳O前方15.5mm，距矢状缝侧面11.5mm，距脑表面下方21.0mm；尾位点1＝距内耳O前方18.0mm，距矢状缝侧面4.0mm，距脑表面下方15.0mm；尾位点2＝距内耳O前方22.0mm、距矢状缝侧面4.5mm，距脑表面下方18.0mm。
将经包被的细胞植入约6个月，然后回收。如实施例4所述检测胶囊在植入前和植入后基本的和K+-引发的L-多巴(L-d)、去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(EPI)、dopac(dpc)、多巴胺(DA)、和同源香草酸(HVA)的释放水平。表2所示数据表示为每个胶囊每30分钟的皮摩尔数(基本的)或每个胶囊每15分钟的皮摩尔数(K+-引发的)。表2的结果表明经包被的细胞在限制性条件下暴露6个月后，其特性显著不同。
表 2 植入日期 位点 基本水平 钾—引发的水平 B L-d B NE B EPI B dpc B DA B HVA K L-d K NE K EPI K dpc K DA K HVA 8/9 C1前 1.72 1.22 1.3 3.64 10.85 3.68 0.695 2.95 1.22 3.99 23.33 2.87后 24.2 0.65 0.3 11.9 2.995 14.7 8.796 4.63 nd 8.07 19.44 4.67 C2前 2.25 3.36 3.02 8.14 32.19 10.3 0.595 5.87 2.41 7.26 46.82 5.48后 4.22 nd 0.32 0.42 nd 1.11 2.08 nd nd nd 0.826 nd P1前 1.6 nd 0.78 0.77 nd nd 0.435 0.58 0.6 1.1 3.743 0.61后 12.1 0.85 0.18 6.06 1.664 6.3 1.358 6.35 nd 4.29 26.18 4.34 P2前 1.49 nd 0.92 1.49 0.677 1.46 0.479 0.97 0.73 1.33 7.442 1.22后 31.8 0.54 nd 14.5 3.679 10.2 3.599 8.4 nd 9.47 61.11 4.39 P3前 1.37 0.84 0.85 2.33 8.212 2.71 0.53 1.75 0.61 1.97 13.73 1.54后 10.8 0.72 nd 7.13 2.448 6.01 4.681 10.6 nd 6.73 29.65 3.65 平均前 1.68 1.81 1.37 3.27 12.98 4.53 0.55 2.42 1.11 3.13 19 2.34 SD前 0.34 1.36 0.94 2.92 13.51 3.94 0.1 2.13 0.77 2.58 17.2 1.94 平均后 16.6 0.55 0.26 8 2.707 7.67 4.1 7.5 *** 7.14 27.8 4.26 SD后 11.1 0.13 0.08 5.46 0.849 5.1 2.93 2.58 *** 2.2 21.9 0.43
表 2(续) 植入日期 位点 基本水平 钾—引发的水平B L-d B NE B EPI B dpc B DA B HVA K L-d K NE K EPI K dpc K DA K HVA 8/10 C1前1.17 nd 0.57 0.84 nd 0.7 0.499 0.22 0.86 0.65 1.516 0.6后16.6 11.9 0.91 15.4 10.13 17.2 3.533 89.2 nd 11.1 62.63 7.08 C2前1.45 nd 0.69 0.62 nd 0.79 0.307 0.29 0.67 0.56 1.515 0.42后49.9 1.34 nd 82.6 17.55 57.4 7.49 16.1 nd 28.9 128.7 14.1 P1前1.76 1.14 1.15 3.87 10.56 3.55 0.541 3.33 1.01 3.66 22.31 2.4后50.4 4.04 0.41 46.2 7.45 28.6 12.02 34.8 nd 21.6 100.7 10.8 P2前1.46 0.95 0.94 2.75 9.915 2.72 0.401 1.68 0.66 2.21 11.75 1.6后46.8 4.09 nd 50.8 9.309 39.1 7.639 63.7 nd 24 105.4 13.2 P3前1.49 nd 0.87 1.83 nd 1.95 0.531 1.08 0.79 1.71 5.59 1.33后17.2 2.67 nd 15 6.357 17.1 5.389 24.3 nd 5.6 41.94 3.66 平均前1.46 1.05 0.84 1.98 10.24 1.94 0.46 1.32 0.84 1.76 8.53 1.27 SD前0.21 0.14 0.22 1.35 0.459 1.23 0.1 1.28 0.12 1.27 8.76 0.8 平均后36.2 4.81 0.66 42 10.16 31.9 7.21 45.6 **** 18.2 87.9 9.79 SD后17.7 4.13 0.35 28.2 4.391 16.9 3.17 30.3 **** 9.58 35 4.38
表 2(续) 植入日期 位点 基本水平 钾—引发的水平 BL-d B NE B EPI B dpc B DA B HVA K L-d K NE K EPI K dpc K DA K HVA 8/9 C1前 1.6 0.9 1.4 2.5 7 2.1 0.385 1.48 0.85 1.65 11.29 1.09后 1.5 nd 0.22 0.27 0.827 2.91 0.906 nd nd nd 1.789 nd C2前 1.7 1.91 1.25 4.27 17.92 3.97 0.577 3.41 1 3.86 26.13 2.24后 nd nd 0.02 nd nd nd nd nd nd nd nd 0.87 P1前 1.38 0.14 0.85 2.93 2.284 3.02 0.367 2.68 1.12 2.45 16.9 2.35后 nd nd 0.83 0.21 nd nd 0.16 nd nd nd 0.87 nd P2前 1.66 nd 0.68 1.08 0.489 nd 0.489 0.96 0.5 0.83 4.856 nd后 nd nd 0.05 nd nd 1.72 nd nd nd nd nd nd P3前 5.8 11.1 9.8 25.5 42 19.1 1.193 8.7 5.56 16.8 66.43 7.1后 nd nd nd nd 1 1.9 0.13 nd nd nd nd nd 平均前 2.47 3.51 2.8 7.26 13.94 7.05 0.6 3.45 1.81 5.12 25.1 3.2 前 1.87 6.11 3.93 10.3 17.09 8.07 0.34 3.09 2.11 6.62 24.4 2.66 平均后 1.5 *** 0.28 0.21 0.914 2.18 0.4 *** *** *** 1.33 0.87 后 *** *** 0.38 0.05 0.122 0.64 0.44 *** *** *** 0.65 ***L-d ＝L-多巴 dpc ＝dopac C1，C2 ＝尾位点NE ＝去甲肾上腺素 DA ＝多巴胺 P1，P2，P3 ＝核 EPI ＝肾上腺素 HVA ＝同源香草酸 nd ＝未检测实施例8：在人体内植入经包被的PC12细胞
按实施例7所述包裹PC12细胞并植入受体。6个月后，外植胶囊并检测L-多巴与多巴胺的比率。将细胞铺在多孔平皿中，在体外O2条件范围中培养。定期检测细胞释放的L-多巴和多巴胺的量。选择释放靶L-多巴与多巴胺比率的细胞，并使用基本上如WO 92/00127所述的外科步骤将细胞植入人脑。实施例9：经包被的PC12细胞暴露于大鼠纹状体的体内限制性条件胶囊
基本上按实施例7所述，经用使用PAN/PVC中空纤维的相转化技术由中空纤维制备胶囊(ID 450-500μm、Wall 50-65μm、MW-CO 100KD、液压渗透性53ml/min/m2/mmHg)。细胞培养和包被
于37℃，在水饱和的7％CO2空气氛中，将PC12和PC12A细胞在无血清的确定成分培养基HL-1(Ventrex、Inc.、Portland、Maine)中以80RPM的转速培养了500ml旋转培养物。通过搜集旋转培养物上清并在800g下离心以收获细胞。通过台盼蓝的排斥评价细胞存活力，包裹前细胞存活力显示为90±5％。
将细胞重新悬浮在HL-1、pH7.3中至浓度为4×107细胞/ml、在PC12和PC12A细胞中加入等体积的含2％(W/V)pH6.7低粘度脱乙酰壳多糖(PROTOSAN、脱乙酰壳多糖氯化物、Protan Biopoly-mer、Drammen、Norway)的溶液至终细胞浓度为2.0×107细胞/ml。
单个胶囊长为7±0.5mm。分两批制作装满了PC12和PC12A细胞的胶囊，并将其放入含1ml HL-1培养基的24多孔组织培养板中。
包被后5-7天，用1ml HBSS HEPES缓冲盐水(含10μm抗坏血酸)将自由漂浮的胶囊洗涤两次以除去残留的培养物培养基。取样由250μl HBSS中的30min保温过程(基本释放7组成)。快速加入柠檬酸盐减少酸化缓冲液(CRAB)以防止所有的样品氧化，在10mM柠檬酸，20μm偏亚硫酸氢钠和0.1N高氯酸中产生稳定的样品制品。在-80℃下提供保藏。通过用HBSS稀释贮存液并用CRAB和0.1N高氯酸稳定稀释液即可制备标准液。纹状体的多巴胺耗尽
肌内注射1.0ml/Kg的氯胺酮(33mg/ml)、Xylazine(1.7mg/ml)和acepromazine(10mg/ml)混合物以麻醉大鼠，并将大鼠放在Kopf立体定位器中。以1.0μl/分钟的速度灌注总量为12μg的6-OHDA(溶于含0.2μg/ml抗坏血酸的0.9％盐水中，6μl体积，浓度为2μg/ml)。在灌注套管缓慢液回之前允许扩散5分钟。灌注坐标为距前囟后面4.2mm，距中线侧面1.0mm，距硬脑膜前侧7.4mm。胶囊植入
损伤后4个月(末次注射阿朴吗啡2.75个月之后)植入胶囊，按前述麻醉大鼠，在其头皮上切一矢状切口并钻一洞以放入聚合物胶囊。通过将胶囊放入装备在立体定位框架上的18孔径Teflon导管中可将胶囊植入大鼠。在套管内放入一个不锈钢封闭器，将此装置放入脑内，封闭器维持在原来位置，而外套管被升高至可被动地将胶囊放进宿主纹状体。植入位点的立体定位坐标是：距前囟前方0.5mm、距矢状缝侧面3.8mm，距脑皮层表面下方7.5mm。对未接受移植的大鼠进行假外科手术(麻醉、撕裂头皮、颅骨穿孔、硬脑膜穿刺)。生化分析
行为测定完成之后，在CO2室中麻醉不具胶囊、具PC12、PC12A的大鼠以及半数具空胶囊的大鼠并快速去头。从它们的颅骨内摘除脑，除去胶囊，将两个纹状体都切成碎片，放入Eppendorf管中并在液氮下快速冷冻。从宿主纹状体中回收胶囊之后，将胶囊放入1ml磷酸盐HBSS中的30分钟，除去磷酸盐HBSS并加入1mlHEPES HBSS。如实施例4所述进行儿茶酚胺分析。儿茶酚胺测定完成后，将装置放入4％低聚甲醛中并经受形态学分析。
图8显示了对单个胶囊作图的30分钟后测量的多巴胺和L-多巴的释放情况，每个胶囊都有指定的鉴定人数目。如图8所示，植入后90天L-多巴和多巴胺的产生水平与植入前的水平显著不同。实施例10：经包被的肾上腺嗜铬细胞暴露于人蛛网膜下隙的体内限
制性条件
按实施例4所述制备牛肾上腺嗜铬细胞，在与CaCl2交联的1.5％藻酸盐基质中固定肾上腺细胞聚集体，并将此细胞聚集体包裹在双层4型、免疫分离的PAN/PVC中空纤维膜(ID 770μm、Wall70μm、MWCO 60-100KD)中，所用方法基本如WO 92/19195中所述。
将经包被细胞植入两个病人的蛛网膜下隙，所述病人患有晚期癌症，其疼痛因麻醉剂治疗而得到不完全的缓解，而且没有活性感染的症状，病人或者也可以患有脑膜下隙肿瘤。病人承认了被告知的赞同意见，瑞士洛桑大学医学院道德伦理委员会也接受了此赞同意见。
用1.0％利多卡因局部浸润以确保麻醉皮肤以及骨膜和其下方的其他深层结缔组织结构，包括黄韧带。在中线右或左1-2cm处的旁矢状面切开皮肤3-5cm并延伸至腰背筋膜以下。使用包括髂嵴和腰棘突起的传统骨界标以及荧光镜指导，通过斜正中旁接近在L-3和L-4之间将18孔径的Touhy针引入蛛网膜下隙。引入针以使它能以浅的向上的不超过30-35°的引入角进入下隙，所述进入角在矢状平面或者横截面上与脊髓相关。
一根引线穿到Touhy针冲头腔下方直至它延伸到蛛网膜下隙内4-5cm(经预测量确定)。从线上除去Touhy针。
然后在引线上放一个7 French扩张器，当引线沿着朝向蛛网膜下隙之引线路径，轻轻地但有力地穿过筋膜、旁棘肌和黄韧带推进时，即可用来引导扩张器。
当引线路径被7 French扩张器“过度扩张”之后，可装配一个6French扩张器和套管壳并将它们放在引线上。仔细地将6 French扩张器和套管推进蛛网膜下隙直至套管的开口滴头位于下隙内7cm处。
当确证套管的定位适当时，按顺序从套管腔中轻轻取下引线和6 French扩张器。
无菌双外壳容器提供了经包被的肾上腺嗜铬细胞，所述细胞在转运介质中清洗过，并被完整地装配，它包括管形硅氧烷系绳。装置中的膜部分被仔细地引入套管。推进胶囊直至膜的前端到达距蛛网膜下隙内的套管头部顶端内2-10mm的点处。使用推进器定位胶囊后，完全弃去套管和推进器，胶囊的最终放置为：装置的5cm长的膜部分完全放在马尾下方含CSF的蛛网膜下隙内。
在病人1中植入84天后外植胶囊，在病人2中植入55天后外植胶囊。暴露于体内限制性条件后，将儿茶酚胺释放量一一去甲肾上腺素(“NE”)和肾上腺素(“EPI”)与植入前的水平相比较(表3)。如实施例4所述测量儿茶酚胺。表3的数据表示为每个胶囊每30分钟的皮摩尔数(基本的)或每个胶囊每15分钟的皮摩尔数(烟碱刺激的：N-S)。暴露于限制性条件之后儿茶酚胺的释放量比植入前显著不同。
表 3
胶囊的儿茶酚胺释放量
植入 外植
NE E NE E病人1： 植入84天基本的 0 84 37 N-S 2932 2673 6366 8病人2： 植入55天基本的 48 120 4.1 69.3N-S 5027 5063 10.6 65实施例11：已适应并重新包被的BHK-hNGF细胞暴露于体内限制
性条件
根据实施例1制备经包被的BHK-hNGF细胞，植入大鼠脑的旁室并在体内限制性条件下暴露14个月以适应。14个月后，外植胶囊，合并两个胶囊内的适应细胞并通过在10％FBS DMEM培养基中传代以扩充细胞。此次实验使用的是被称为BHK-hNGF克隆23的克隆系。等分这些细胞，将小伤细胞置液氮中冷冻。未在体内适应的对照BHK-hNGF克隆23细胞在体外于10％FBSDMEM中生长(BHK-hNGF克隆23细胞库)。
检测了下列六组细胞和胶囊：
组1：BHK-hNGF 23细胞(来自体内外植胶囊的适应细胞)；重新包裹在Vitrogen基质中；胶囊被植入大鼠脑旁室中；
组2：BHK-hNGF 23细胞；(适应细胞)重新悬浮在10％FBSDMEM中以包裹(无基质)；胶囊被植入大鼠脑旁室中；
组3BHK-hNGF 23对照细胞(来自细胞库；以前未被植入过)；包裹在Vitrogen基质中；胶囊被植入大鼠脑旁室中；
组4BHK-hNGF 23对照细胞(来自细胞库；以前未被植入过)；重新悬浮在10％FBS DMEM中以包裹(无基质)；胶囊被植入大鼠脑旁室中；
组5：BHK-对照细胞(来自细胞库；以前未被植入过)；包裹在Vitrogen基质中；胶囊被植入大鼠脑旁室中；和
组6：BHK-对照细胞(来自细胞库；以前未被植入过)；重新悬浮在10％FBS DMEM(无基质)中以包裹；胶囊被植入大鼠脑旁室中。胶囊
基本上按实施例1的描述包裹适应的BHK-hNGF克隆23细胞。大多数胶囊由HF120794-6纤维制成，最终长度为7mm。几个对照胶囊由101-97-9纤维制成，此纤维与实施例7-9中所用的xp11纤维是可相容的。
平均而言，HF120794-6单层纤维的壁厚为86.4μ；内径(I.D.)为453.2μ；外径(O.D.)为625.1μ；液压渗透性(HP)为43.0mm/min/m2/mmHg；基于葡聚糖扩散试验的截断分子量(MWCO)为187KD。
平均而言，101-97-9单层纤维的壁厚为59μ；I.D.为541μ；拉伸强度为31g；HP为62mm/min/m2/mmHg；基于葡聚糖扩散试验的MWCO为88KD。
包裹
包裹在基质中的细胞(组1，3和5)被重新悬浮在Vitrogen中，该基质已经用PC-1培养基以1×107细胞/ml的负载密度稀释了一倍。植入前使胶囊在PC-1培养基中维持5-7天。未用基质包裹的组2，4和6的细胞被重新悬浮在10％FBS DMEM中，植入前维持期间将此悬液放进滚筒上的管中。植入胶囊
已在体内适应过的含BHK-hNGF细胞的胶囊和对照胶囊被随机选择并植入大鼠旁室的两侧。未适应过的BHK-hNGF细胞的平行样品用作对照。生化分析
如实施例1所述，检测组1-6的胶囊所释放的NGF。植入前和植入一个月后测量含适应或未适应细胞的胶囊所释放的NGF。组1-4的胶囊所释放的NGF量示于图11。没有显示未产生NGF的对照细胞数据。检测过NGF释放量之后，在4％低聚甲醛中固定胶囊并进行处理以供组织学、切片和形态学分析。实施例12：经包被的PC12细胞暴露于单侧黑质损伤的大鼠体内条
件细胞培养和包裹
基本上按实施例9的描述培养和包裹PC12细胞。黑质多巴胺的耗尽
6-羟基多巴胺(6-OHDA)对黑质中的产多巴胺神经元具有选择性毒性。黑质中具6-OHDA损伤的大鼠会出现与低多巴胺水平相关的帕金森氏病样特征，如实施例9所述麻醉大鼠并将它固定在Kopff立体定位器上。单侧灌注总量为10μg的6-OHDA(4μg的量以2.5μg/μl溶于含0.2μg/μl抗坏血酸的0.9％盐水中)并在灌注套管缓慢缩回之前允许扩散5分钟。灌注坐标为距前囟后面3.2mm，距中线侧面2.7mm，距硬脑膜下方8.0mm，门齿栏套位于其+5.0mm处。胶囊的植入
大鼠被单侧损伤后3至4周，双侧植入胶囊。使用实施例9所述的方法和立体定位坐标麻醉大鼠并植入胶囊。生化分析
植入后3、10、28和60天除去装置，在CO2室中麻醉大鼠并快速去头。从颅骨内取出脑，从脑的损伤和未损伤(对照)侧取出胶囊。通过将纹状体和紧贴的核放在Eppendorf管中并在液氮中快速冷冻Eppendorf管即可使纹状体和紧贴的核被撕成碎片以供儿茶酚胺分析。将胶囊放入1ml磷酸盐HBSS中约30分钟，除去磷酸盐HBSS，加入1ml HEPES HBSS。如实施例4所述进行儿茶酚胺分析。儿茶酚胺测定完成之后，将胶囊放在4％低聚甲醛中以进行形态学分析。
图9(A组)表示植入前(“pre-”)的8个胶囊和植入损伤(低多巴胺)或未损伤(对照)纹状体之后5、14、28或60天外植的胶囊在30分钟内平均释放的L-多巴量。A组表示由经包被的PC12细胞产生的儿茶酚胺相对量随时间而变化。在体内适应两至三周后，从损伤侧和对照侧外植的胶囊显示出较高的L-多巴释放速率。
图9(B组)表示由上述A组胶囊释放的L-多巴与多巴胺的比率。B组表示在体内适应了低多巴胺环境后，经包被的细胞产生的L-多巴与多巴胺的比率比在对照环境中适应的细胞要低一些。体内适应约14天后，L-多巴与多巴胺的比率变得相对稳定。在体内适应之后，从损伤侧和对照侧外植的胶囊释放的L-多巴与多巴胺比率水平比移植前的释放水平要高。实施例13：在灵长类动物脑中适应的经包被的PC12细胞在植入前
和植入后所释放的儿茶酚胺量的比较
如实施例7所述，将PC12细胞包裹在“相当于xp11”的纤维中并在灵长类动物脑中适应。将大量研究此胶囊得出的儿茶酚胺释放量与植入前相同胶囊所释放的儿茶酚胺量相比较。检测植入前经包被的PC12细胞基本的L-多巴和多巴胺释放速率。表4报道的数据表示植入前释放的儿茶酚胺量。然后将胶囊植入灵长类动物脑中以体内适应，植入后1、2.5、3、4、5和6个月外植胶囊并检测基本的L-多巴和多巴胺释放速率(图10)。
图10和表4的简要数据相比较表明植入前的释放量和外植释放量有显著差别。表4第一行的植入前数据相对应于图11中的1个月间隔处的外植数据点。同样，表4中其他行的数据相对应于图11中绘出的其他每月数据点。
表4：植入前的植
灵长类动物PC12胶囊释放的儿茶酚胺量
外植的PC12“相当于xp-11”的纤维 植入前对应的
基本的L-多巴 基本的多巴胺 体内时间
pm/15min/ml pm/15min/ml
平均值(S.D.) 平均值(S.D.) 1(n＝6) 2.02(0.08) 2.95(4.1) 2.5(n＝6) 0.78(0.16) nd 3(n＝6) 0.79(0.25) nd 4(n＝2) 10.6(2.33) 2.39(0.82) 5(n＝6) 2.06(0.01) 4.26(1.62) 6(n＝15) 3.09(1.84) 21.3(21.7)实施例14：产生可分泌hCNTF的BHK细胞系(BHK-CNTF)
将人的CNIF(hCNTF)基因插入以二氢叶酸还原酶(DHFR)为基础的表达载体pNUT中，该载体含有包括多接头的完整pUC18序列。偏码DHFR突变体形式的cDNA的转录由SV40启动子驱动，3′末端与乙型肝炎病毒基因的3′末端(HBV3′)相融合以确保有效的多聚腺苷酸化和成熟的信号。
通过PCR扩增人DNA可得到hCNTF基因。所用引物含有位于天然hCNTF起始密码子位置处的EcoRI位点。hCNTF基因在其5′末端与小鼠免疫球蛋白(Ig)基因的150bp序列相融合。EcoRI位点以hCNTF蛋白的氨基末端部分对应于Ig基因的前18个氨基酸的形式被使用，在hCNTF基因的3′末端克隆了人生长激素基因(hGH)的325 bp AvaI片段，该片段含有多聚腺苷酸化序列和其他对于mRNA3′末端成熟很重要的序列。简单地说，此片段被插入Blue-script多接头的speI位点，从而在5′和3′末端分别产生了BamHI和NotI位点。将BamHI位点与hCNTF3′末端工程化的BglII位点连接。
将此构建体插入小鼠MT-I启动子的位置+6，并在pNUT载体的KpnI-NotI位点插入完整的3050bp的MT/Ig/hCNTF/hGHKpnI-NotI片段。最后，在载体的NotI位点克隆HSV-TK基因，从而通过完整的PUC-18质粒将HSV-TK基因与DHFR基因分离开来。此最终构建体被称为RP3224EZ。
在标准的大肠杆菌菌株(HB101)中扩增RP3224EZ载体的DNA，并使用Qiagen-Plasmid试剂盒(Kontron)纯化。使用标准的钙/磷酸盐转染法转染DNA，并用浓度渐增的氨甲喋呤选择。在PC-1组织培养基中维持时应不断地在氨甲喋呤中选择细胞。PC-1培养基是含有人重组源蛋白质的确定成分的培养基。
药物选择后(25至200μm氨甲喋呤)，未经药物选择使BHK细胞(BHK-CNTF)在体外维持几个月，经用Northern印迹分析，生物测定或ELISA评价时，显示出CNTF表达没有损失，由生物测定和ELISA确定时，CNTF的产生水平约为1.0ng/103细胞/小时。实施例15：在人腰蛛网膜下隙适应过并重新植入人体中的BHK-
CNTF细胞可治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化细胞包裹
基本上按实施例1所述包裹实施例14中可分泌CNTF的BHK细胞(BHK-CNTF)，不同之处在于使用了长度适于植入人腰蛛网膜下隙的较长的系绳。用密度为2×105转染细胞/μl的胶原溶液(Zyderm)装满装置。通过将胶囊放入2ml新鲜PC1培养基中浸30分钟可测量每个胶囊释放的CNTF。然后使用Rd D ELISA系统在收集培养基上进行CNTF测定。选择胶囊以鞘内传递剂量为1μ/天的CNTF。每个病人接受一个装置。经包被的BHK-CTNF细胞在腰蛛网膜下隙内体内适应
经包被的BHK-CNTF细胞已植入人受试者腰蛛网膜下隙内1个月。其他的胶囊将在体内适应6个月以上。在第一个月外植时，如实施例12所述测定了每个胶囊释放CNTF的速率。进行了CNTF测定之后，在4％低聚甲醛中固定胶囊并进行形态学分析。
从胶囊中取出在体内适应的BHK-CNTF细胞，合并并立即在经选择与受试者蛛网膜下隙环境最密切吻合的低氧和葡萄糖限制性条件下，通过在PC1培养基中生长以培养细胞。在环境条件下培养BHK-CNTF细胞以作为并列的对照。鉴定适应过的细胞，并使此细胞进一步适应其他限制性条件。
在一套实验中，在体外于环境或限制性条件下培养的已在体内适应过的BHK-CNTF细胞需经重新包裹(基本上与第一次包裹所用方法相同)并植入宿主受试者。
在另一套实验中，植入人宿主的适应细胞首先应在非人灵长类动物受体的体外限制性条件下适应。
受试者是被诊断为ALS的病人，此病是由上肢运动神经元和下肢运动神经元在多种水平上短缺；阐明了3肢或2肢和延髓肌肉系统的活性和慢性去神经法的起确定作用的电生理学研究；在随意运动系统外部没有神经病学的介入；没有能导致神经病短缺，尤其是浆细胞恶液质的颈椎关节强硬的原发性疾病的迹象联合证实的。病人相对强壮，即无需帮助即可行走并处于病程的早期。本专利强迫进入时的生存能力＞正常情况下的75％。
在第一周每天、从第二周至第四周每周一次，以后每月一次监测病人特别的副反应，如发烧、口炎、咳嗽和疱疹的复能。每月进行一次下列试验以评价效能；丛定量神经病学测验(TQNE)；延髓协调；强制呼吸功能的存活能力、呼吸流量。前四周每周一次，以后每月一次抽取血液以检测血浆CNTF、CNTF的潜在抗体、C-反应性蛋白、血纤蛋白原。外科步骤
植入经包被的BHK-CNTF细胞的外科步骤如下所述。建立了IV通道并服用了预防性抗生素(头孢唑啉钠，1g IV)之后，将病人固定在手术台上，病人通常采取腰椎前屈的侧卧位或膝胸位。手术区域经消毒处理，并用帷帘挡住，暴露出从S-1水平至L-1水平的中线背面的腰区域，并允许用C-臂荧光检查使腰脊骨内部手术成像。用1.0％利多卡因局部浸润以确保麻醉皮肤以及骨膜和其下方的其他深层结缔组织结构，包括黄韧带。
使用电烙术止血，在中线右或左1-2cm处的旁矢状面切开皮肤3-5cm并延伸至腰背筋膜以下。使用包括髂嵴和腰棘突起的传统骨界标以及荧光镜指导，通过斜正中旁接近在L-3和L-4之间将18孔径的Touhy针引入蛛网膜下隙。引入针以使它能以浅的向上的不超过30-50°的引入角进入下隙，所述进入角在矢状平面或者横截面上与脊髓相关。通过取出nml脑脊髓液(CSF)以供植入前儿茶酚胺、脑啡肽、萄萄糖、人CNTF和蛋白质水平分析和细胞计数从而可证实针头的适当位置。
重新检查Touhy针冲头以证实针头的开口向上定位)针冲头上的封闭器指向刻痕标示出开口方向)、一根引线穿到针腔下方直至它延伸到蛛网膜下隙内4-5cm(经预测量确定)。在穿线过程中需注意的是：对脱出针的线的推进没有阻力，病人没有诉说他们有神经性综合症的痛苦，这些观察结果中的任一个都可表明引线的方向错误和可能逼近神经根或脊髓损伤处。
引线似乎已适当放置在蛛网膜下隙之后，从引线上分别取下并取出Touhy针。然后用荧光检查法证实在脊髓管中线中的引线位置在马尾预期位置的前方，并没有纽结或无法解释的弯曲。取出Touhy针之后，引线应该能够自由移进和移出下隙，由于引线粗糙的表面穿过密集的和纤维状的黄韧带前进，因而仅有很轻微的阻力。
然后在引线上放一个7 French扩张器，当引线沿着朝向蛛网膜下隙之引线路径，轻轻地但有力地穿过筋膜、旁棘肌和黄韧带推进时，即可用来引导扩张器。停止推进7 French扩张器，一旦穿过黄韧带之后引导的阻力消失即从引线上取下扩张器。这样做是为了避免在任何显著的程度上在蛛网膜下隙内推进和操作这个相对坚硬的扩张器。
当引线路径被7 French扩张器“过度扩张”之后，可装配一个6French扩张器和套管壳并将它们放在引线上。仔细地将6 French扩张器和套管推进蛛网膜下隙直至套管的开口滴头位于下隙内7cm处。对7 French扩张器而言，装配的6 French扩张器和套管被扩张器腔内的引线引导。通过预先侧量此装置以确定蛛网膜下隙内的位置并通过荧光检查法粗略地证实此位置。在蛛网膜下隙内操作扩张器和套管应加倍小心以避免方向错误和可能的神经性损伤。
当确证套管的定位适当时，按顺序从套管腔中轻轻取下引线和6 French扩张器。根据病人在手术台上的位置，在此点穿过套管的CSF流量应该可以注意得到，并且可能很活跃，需要给套管加帽或很快速地放入植入胶囊以防止过量的CSF损耗。
无菌双外壳容器提供了经包被的适应过的BHK-CNTF细胞，所述细胞在转运介质中清洗过，并被完整地装配，它包括管形硅氧烷系绳。通过套管植入蛛网膜下隙之前，将胶囊转移到插入试剂盒盘中，其定位的位置允许胶囊在其被粗略检查损坏或主要的欠缺之处时可维持在转运介质中。
通过将推进器的小直径引线部分插到装置的膜部分可使胶囊的系绳部分装备到不锈钢推进器上，并仔细地引入套管中。推进胶囊直至膜前端到达蛛网膜下隙内的套管头部顶端由2-10mm的点处。这种放置是通过预先测量套管和胶囊—系绳—推进器装置而得到的，它可以确保胶囊的膜部分在推进至位置的完整时间进程中被套管保护。
胶囊在套管内定位之后，使用推进器将胶囊维持在蛛网膜下隙内的原有位置(不推进或取下)，下并从胶囊和推进器上完全取下套管。然后通过从硅氧烷系绳上滑下其引线部分以从胶囊上取下推进器。使用此方法，胶囊最终的放置位置是：装置的膜部分完全平放在马尾下方的含CSF的蛛网膜下隙内。使用粗长度为1-2cm的硅氧烷系绳在其尾端固定胶囊，所述系绳在通过硬脑膜和黄韧带退出之前在蛛网膜下隙内穿行。系绳由穿过旁棘肌的水平在外部延伸，并从腰背筋膜处出现，一般留出系牢装置可以使用的10-12cm自由的系绳材料。
通过在被旁棘肌中系绳占据的通道中注射血纤蛋白胶(Tissel)并通过钱袋绳缝合紧紧关闭通道的表浅筋膜开口即可使CSF渗漏减至最少量。然后用非吸收性的缝线固定系绳的自由端，并用皮肤和皮下组织的2层封闭物完全覆盖。
然后将病人转移到神经外科恢复区，手术后24小时严格卧床休息，不能活动。植入步骤之后，抗生素预防也需持续24小时。