角质细胞生长因子类似物.pdf

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摘要
申请专利号:

CN95196741.X

申请日:

1995.10.12

公开号:

CN1169732A

公开日:

1998.01.07

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

专利申请的视为撤回公告日:1998.1.7||||||公开

IPC分类号:

C07K14/50; C12N15/12; A61K38/18

主分类号:

C07K14/50; C12N15/12; A61K38/18

申请人:

安姆根有限公司;

发明人:

陈保路; 荒川力

地址:

美国加利福尼亚州

优先权:

1994.10.13 US 08/323,337; 1995.06.07 US 08/487,825

专利代理机构:

中国专利代理(香港)有限公司

代理人:

卢新华;温宏艳

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内容摘要

提供了KGF蛋白的新型类似物,该等类似物包含由图2中41—154氨基酸残基(SEQ ID NO:2 72—185氨基酸)的一个或多个的缺失或取代而引起的电荷变化。这些类似物比对应的KGF母体分子更稳定。

权利要求书

1: 一种天然KGF的多肽类似物,包括有图2(SEQ ID NO:2 中72-185位氨基酸)中所示41-154位氨基酸残基中一至多个氨基 酸残基由缺失或替换而导致的电荷变化。
2: 根据权利要求1的多肽类似物,其中缺失或替换的氨基酸选自 Arg 41 ,Gln 43 ,Lys 55 ,Lys 95 ,Lys 128 ,Asn 137 ,Gln 138 ,Lys 139 ,Arg 144 ,Lys 147 ,Gln 152 , Lys 153 和Thr 154 。
3: 根据权利要求1的多肽类似物,选自R(144)Q,C(1,15)S/R(144)Q, C(1,15)S/R(144)E和ΔN23/R(144)Q。
4: 一种药物制剂,包括治疗有效量的根据权利要求1的一种KGF 多肽类似物和药学上可接受的载体。
5: 一种药物制剂,包括治疗有效量的冷冻干燥的根据权利要求1的 一种KGF多肽类似物。
6: 权利要求4中的药物制剂,还包括药学上可接受的载体。
7: 一种选自DNA和RNA的核苷酸分子,其中该核苷酸编码的一种 天然KGF的多肽类似物,其包括有图2中(SEQ ID NO:2中72 -185位氨基酸)所示41-154位氨基酸残基中一至多个氨基酸由缺失 或替换而导致的电荷变化。
8: 根据权利要求7的一种核苷酸分子,其中缺失或替换的氨基酸选 自Arg 41 ,Gln 43 ,Lys 55 ,Lys 95 ,Lys 128 ,Asn 137 ,Gln 138 ,Lys 139 ,Arg 144 ,Lys 147 Gln 152 ,Lys 153 和Thr 154 。
9: 根据权利要求7的一种核苷酸分子,其中多肽类似物选自R(144)Q, C(1,15)S/R(144)Q,C(1,15)S/R(144)E和ΔN23/R(144)Q。
10: 一种具生物学功能的质粒或病毒载体,包括根据权利要求7的 一种核苷酸分子。
11: 一种用根据权利要求8中具生物学功能载体稳定地转染或转化 的原核或真核宿主细胞。
12: 一种根据权利要求11的原核宿主细胞,其为大肠杆菌。
13: 一种根据权利要求11的真核宿主细胞,其为哺乳动物细胞。
14: 一种根据权利要求11的真核宿主细胞,其为中国仓鼠卵巢细胞。
15: 一种生产KGF多肽类似物的方法,它包括根据权利要求7中的 一种核苷酸分子稳定转化的原核或真核宿主细胞在适当的营养条件下生 长,该方式允许编码多肽类似物的表达,以及分离由此产生的多肽类似 物。
16: 一种刺激非成纤维上皮细胞产生的方法,它包括使这些细胞与 有效剂量的根据权利要求1的KGF多肽类似物接触。

说明书


角质细胞生长因子类似物

                     发明领域

    本发明涉及重组DNA技术及蛋白质工程。具体而言,运用重组DNA方法以产生角质细胞生长因子(KGF)的多肽类似物,它是一种有效的非成纤维上皮细胞生长的有丝分裂原,其中该类似物与亲代KGF相比有改进的稳定性。

                     发明背景

    组织生成及再生的复杂过程是由一系列蛋白质因子介导的,这些因子有时也称为软组织生长因子。这些分子通常由一类细胞所释放并影响其它类型细胞的增殖(Rubin等(1989年)美国国家科学院院刊,86:802-806)。某些软组织生长因子由一些特殊类型细胞所分泌并在多细胞有机体的发育过程中影响效应细胞的增殖、分化和/或成熟(Finch等(1989年),科学,245:752-755)。除了它们在发育的有机体上作用以外,某些软性组织生长因子在持续健康及更成熟的系统中的维护作用中更加重要。例如在哺乳动物体内许多系统中发生快速的细胞转换。这些系统包括皮肤、胃肠道,它们都包括有上皮细胞。这类软组织生长因子所包括的因子是成纤维细胞生长因子(FGFs)的蛋白质家族。

    目前八个已知的FGF家族成员在一级结构上有相关性,它们是:碱性成纤维细胞生长因子,bFGF(Abraham等(1986年),EMBO J.5:2523-2528);酸性成纤维细胞生长因子,aFGF(Jaye等(1986年),科学,233:541-545);int-2基因产物,int-2(Dickson及Peters(1987年),自然,326:833);hst/kFGF(Delli-Bovi等(1987年),细胞,50:729-737和Yoshida等(1987年),美国国家科学院院刊,84:7305-7309);FGF-5(Zhan等(1988年),分子细胞生物学,8:3487-3495);FGF-6(Marics等(1989年),癌基因,4:335-340);角质细胞生长因子(Finch等(1989年)以及富组亲动蛋白(hisactophilin)(Habazzettl等(1992年),自然,359:855-858)。

    在FGF蛋白质家族中,角质细胞生长因子(“KGF”)是起源于间充质组织非成纤维上皮细胞(特别是角质细胞)增殖的唯一效应物。术语“天然KGF”是指一种自然的人类(hKGF)或重组多肽(rKGF)(它带有或不带有信号序列),其氨基酸序列为SEQ ID NO:2中示出的序列或其等位基因变异序列。(除了另外说明,此处所描述分子其氨基酸编号与SEQ ID NO:2中32至194位氨基酸显示的天然分子的成熟形式(例如除去信号序列)中编号相对应。)

    天然KGF可以通过天然人类资源分离得到(hKGF)或通过重组DNA技术生产(rKGF)(Finch等(1989年),Supra;Rubin等(1989年),Supra;Ron等(1993年),生物化学杂志268(4):2984-2988;和Yan等(1991年),体外细胞发育生物学,27A:437-438)。

    众所周知天然KGF在水溶状态相对不稳定并且在处理及贮存过程中发生化学、物理降解导致生物活性的丧失(Chen等(1994年),药学研究,11:1582-1589)。

    天然KGF在温度升高时易于聚集并在酸性条件下失活(Rubin等(1989年),美国国家科学院院刊,86:802-806)。水溶液中天然KGF的聚集也导致蛋白质失活。这一点很不方便,因为失活使得天然KGF蛋白质水溶制剂贮存较长时间及蛋白质使用较长时间无法实现。而且这一点在生产药物制剂时尤其成为问题,因为已知聚集的蛋白质具有免疫原性(Cleland等(1993年),Crit.治疗性药物载体系统鉴定性评论,10:307-377;Robbins等(1987年),糖尿病,36:838-845;Rinckard等(1967年),临床实验免疫学,2:331-340)。

    重组DNA技术已用来修饰各种FGF家族成员的序列。例如,已通过删除或替换一些带正电荷残基来修饰bFGF或aFGF,这些残基对于结合带中性电荷或负电荷的氨基酸的肝素是很重要地。据报道这些修饰分子使肝素结合活性下降。相应地,已知在患者体内被肝素和或其类似物所整合的修饰分子数量可减少,因此随着更多的FGF达到其靶受体而提高其作用(EP 0298723)。

    为了改善或者改变天然KGF的一个或多个特性,可采用蛋白质工程方法。Ron等在生物化学杂志268(4):2984-2988中报道了在N-末端3,8,27,38或49位氨基酸缺失的经修饰的KGF多肽。那些缺失N-末端3,8或27位氨基酸残基的多肽仍然具备肝素结合活性,其余则丧失此活性。而且据报道缺失3、8位残基的多肽保留全部活性,但缺失27位残基的多肽则使有丝分裂原活性下降10-20倍,缺失38位或49位氨基酸的多肽则丧失全部有丝分裂原活性。但修饰的KGF多肽其稳定性未见讨论或报道。

    上文已公开的PCT申请号90/08771,supra也报道一种嵌合蛋白质,它由成熟的天然KGF N-末端前40个氨基酸与aFGF的C末端部分(约140个氨基酸)组合而成。该嵌合物据报道同KGF一样可定位至角质细胞,但对肝素不敏感,这是aFGF而非KGF的特点。而该嵌合物稳定性未见讨论与报道。

    相对天然KGF,其稳定性有显著改进的修饰KGF分子未见有文字报道。而且也无任何文献报道了足够的范例或证据以提供能成功地生产具备期望特征的KGF分子的合理前景。

    目前尚不能仅仅根据其一级结构预测蛋白质的特征。例如,在有肝素时aFGF有丝分裂原活性大大增强,但bFGF活性仅有少量增加,尽管肝素能与bFGF紧密结合[(Burgess和Maciag(1989年),生物化学年鉴,58:575-606;Schreiber等(1985年),美国国家科学院院刊,82:6138-6142;及Gospodarowizc和Cheng(1986年),细胞生理学,128:475-485);和PCT 90/00418)]。相反,在含有KGF及肝素培养基中生长的BALB/MK细胞其胸腺嘧啶核苷脱氧核苷掺入受到抑制。

    通常改变氨基酸对蛋白质生物活性的作用决定于一系列因素,包括蛋白质三维结构以及该修饰是否针对肝素结合域或受体结合域等处蛋白质一级结构序列。鉴于天然KGF的三维结构以及其肝素结合域或受体结合域等处一级结构序列均未见报道,即使在这些通常分类区分的蛋白质,该领域的知识也无法进行基于对天然KGF的氨基酸修饰的效应总结。

    本发明的目的即提供KGF的多肽类似物以及编码该类似物的核苷酸分子,它与天然KGF相比表现提高的稳定性(例如,处于典型pH温度和/或其它贮存条件)。

                     发明概述

    本发明提供新的具生物活性的KGF多肽类似物。在本发明中,术语“KGF”包括天然KGF及一些蛋白质,其特征在于其肽序列与天然KGF的肽序列基本相同,并且保留了天然KGF的部分或全部生物学活性,尤其是非成纤维上皮细胞增殖活性。“其特征在于肽序列与天然KGF的肽序列基本相同”指的是保留有与SEQ ID NO:2中Arg41,Gln43,Lys55,Lys95,Asn137,Gln138,Lys139,Arg144,Lys147,Gln152,Lys153和Thr154相对应的残基,并且由一个能够与SEQ ID NO:1中201至684核苷酸序列杂交的DNA序列所编码,优选控制在严格的杂交条件下。

    为决定两个氨基酸序列之间相应氨基酸位置,应将这两个序列对比排列使之达到最大残基匹配,包含氨基末端和/或羧基末端移位,在待选物中引入适当的间隙和/或删除插入的残基。数据库检索,序列分析及操作可以使用众所周知的常规用以确定序列同源/同一性扫瞄算术程序来进行(例如:Pearson和Lipman(1988年),美国国家科学院院刊,85:2444-2448;Altschul等(1990年),分子生物学杂志,215:403-410;Lipman和Pearson(1985年),科学,222:1435或Devereux等(1984年),核酸研究,12:387-395)。

    杂交时的严格条件指的是盐、温度、有机溶剂及其它在杂交反应中典型的控制参数等综合在一起的严格条件。示范的严格条件为在4×SSC62-67℃杂交,继而0.1×SSC在62-67℃中清洗,时间约为1小时。或者,另一示范的严格条件为在45-55%甲酰胺,4×SSC及40-45℃杂交。(见T.Maniatis等,Molecular Cloning(A LaboratoryManual);Cold Spring Harbor Laboratory(1982年),387-389页)。

    这样,该蛋白质包括天然KGF中氨基酸的等位基因变异,或缺失、替换以及插入,还包括天然KGF分子的片段、嵌合及杂种分子。KGF所包括蛋白质的一个例子是对应于序列SEQ ID NO:2中Cys1和Cys15位被置换或缺失,所得蛋白质与亲代蛋白质相比其稳定性已大大改善(在共同享有的U.S.S.N.08/487,825中加以说明,于1995年7月7日提交)。具体公开的分子包括:C(1,15)S,这种KGF在1位及15位上的氨基酸由丝氨酸替换了半胱氨酸;ΔN15-ΔN24,这种KGF在天然KGF N末端的前15至24个氨基酸中删除任意一个;ΔN3/C(15)S,这种KGF删除天然KGF N末端前3个氨基酸并在15位上由丝氨酸替换半胱氨酸;ΔN3/C(15)-,这种KGF删除天然KGF N末端前3个氨基酸并在15位上删除了半胱氨酸;ΔN8/C(15)S,这种KGF删除了天然KGFN末端前8个氨基酸并在15位上由丝氨酸替换了半胱氨酸;ΔN8/C(15)-,这种KGF删除了天然KGF N末端前8个氨基酸并在15位上删除了半胱氨酸;C(1,15,40)S,这种KGF在1,15,40位上氨基酸由丝氨酸替换半胱氨酸;C(1,15,102)S,这种KGF在1,15,102位上氨基酸由丝氨酸替换半胱氨酸;以及C(1,15,102,106)S,这种KGF在1,15,102,106位上氨基酸由丝氨酸替换半胱氨酸。

    KGF的另一范例包括这些蛋白质,它(们)可由至少一个成环趋势更高的氨基酸替换Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119这个成环区之内至少一个氨基酸而得到(在共同拥有的U.S.S.N.08/323,473中加以说明,于1994年10月13日提交),特别地包括H(116)G,这种KGF在天然KGF的116位上氨基酸由甘氨酸替换组氨酸。

    另一个范例还包括这些蛋白质,它们在天然KGF的123-133区(SEQ ID NO:2中氨基酸154-164)内带有一至多个氨基酸替换,缺失或添加;这些蛋白质可能有激动剂或拮抗剂活性。

    奇怪的是,当一个KGF分子(即,亲代分子)删除或以带正电荷残基替换中性或带负电荷的肽时(即:以中性残基或带正电荷残基替换带负电荷残基,以带正电荷残基替换中性残基),所得KGF类似物较亲代KGF分子有更好的稳定性。优选地,除了稳定性增加之外,本发明还使得这些类似物与天然KGF相比仍表现全部生物学活性(即,至少保留基本相同的受体结合或亲和力)。

    本发明的另一方面,描述了编码多种生物学活性的KGF多肽类似物的核苷酸的分离与纯化。在一个实施方案中,这样的核苷酸组成的DNA分子克隆进入有生物学功能的质粒或病毒载体。在另一个实施方案中,利用核苷酸的构建体稳定地转化原核或真核宿主细胞。在另外一个实施方案中,本发明还包括在适当的培养条件培养以一种核苷酸分子稳定转化原核(优选大肠杆菌)或真核宿主细胞,使之表达KGF类似物。表达之后,所得重组多肽可以分离并提纯。

    本发明的另外一方面涉及包含有疗效量的KGF类似物及药学上可接受的载体的药物制剂。这种制剂可用于治疗上皮疾病及损伤的患者。

    在这种情况下,另一方面还涉及给患者施用有疗效量的KGF类似以刺激上皮细胞生长的方法。在一个实施方案中,非成纤维上皮细胞的增殖被激活。这些上皮细胞包括:附件细胞,胰腺细胞,肝细胞以及呼吸道和消化道粘膜上皮(细胞)。

                     附图简述

    图1示出天然KGF的核苷酸(SEQ ID NO:1)及氨基酸(SEQID NO:2)序列(编码成熟形式的天然KGF的核苷酸序列为SEQ IDNO:1中201至684位碱基所表达;成熟形式天然KGF的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中32至194位氨基酸残基所表达)。

    图2A、2B、2C分别示出质粒pCFM 1156,pCFM 1656和pCFM3102的图谱。

    图3示出构建体RSH-KGF的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)以及氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。

    图4示出质粒KGF中所包括的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)及氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。

    图5示出化学合成的寡核苷酸片段(OLIGO#6至#11;相应为SEQID NO:12-17),它们被用来替换质粒KGF的KpnI和EcoRI位点(SEQ ID NO:6中46至85位氨基酸)之间的DNA序列以得到质粒KGF(dsd)。

    图6示出化学合成的寡核苷酸片段(OLIGO#12至#24;相应为SEQID NO:18-30),它们用以构建KGF(最适密码子)。

    图7示出R(144)Q的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)及氨基酸序列(SEQ ID NO:32),该KGF类似物在天然KGF 144位氨基酸处由谷氨酰胺替换精氨酸。

    图8示出C(1,15)S/R(144)E的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)及氨基酸序列(SEQ ID NO:34),该KGF类似物在天然KGF1位和15位氨基酸处由丝氨酸替换半胱氨酸且144位氨基酸处由谷氨酸替换精氨酸。

    图9示出C(1,15)S/R(144)Q的核苷酸序列(SEQ ID NO:35)及氨基酸序列(SEQ ID NO:36),该KGF类似物在天然KGF的1位和15位氨基酸处由丝氨酸替换半胱氨酸且144位氨基酸处由谷氨酰胺替换精氨酸。

    图10示出ΔN23/R(144)Q的核苷酸序列(SEQ ID NO:37)和氨基酸序列(SEQ ID NO:38),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸且144位氨基酸处由谷氨酰胺替换精氨酸。

    图11示出可溶性蛋白质数量,它由大小排阻高效液相色谱(HPLC)是在37℃温育时间的函数。

    图12示出天然KGF,C(1,15)S/R(144)Q和C(1,15)S/R(144)E的估算融解温度,是pH的函数。

    图13示出R(144)Q的典型有丝分裂原活性曲线,由测定DNA合成时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入量决定,并将它与天然KGF的标准曲线相比较。

    图14示出ΔN23/R(144)Q的典型有丝分裂原活性曲线,由测定DNA合成时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入量决定,并将它与天然KGF的标准曲线相比较。

    图15示出C(1,15)S/R(144)Q的典型有丝分裂原活性曲线,由测定DNA合成时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入量决定,并将它与天然KGF的标准曲线相比较。

    图16示出C(1,15)S/R(144)E的典型有丝分裂原活性曲线,由测定DNA合成时3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入量决定,并将它与天然KGF的标准曲线相比较。

    图17示出ΔN23/N(137)E的核苷酸序列(SEQ ID NO:41)及氨基酸序列(SEQ ID NO:42),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在137位氨基酸处由谷氨酸替换天冬酰胺。

    图18示出ΔN23/K(139)E的核苷酸序列(SEQ ID NO:43)及氨基酸序列(SEQ ID NO:44),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在139位氨基酸处由谷氨酸替换赖氨酸。

    图19示出ΔN23/K(139)Q的核苷酸序列(SEQ ID NO:45)及氨基酸序列(SEQ ID NO:46),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在139位氨基酸处由谷氨酰胺替换赖氨酸。

    图20示出ΔN23/R(144)A的核苷酸序列(SEQ ID NO:47)及氨基酸序列(SEQ ID NO:48),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在144位氨基酸处由丙氨酸替换精氨酸。

    图21示出ΔN23/R(144)L的核苷酸序列(SEQ ID NO:49)及氨基酸序列(SEQ ID NO:50),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在144位氨基酸处由亮氨酸替换精氨酸。

    图22示出ΔN23/K(147)E的核苷酸序列(SEQ ID NO:51)及氨基酸序列(SEQ ID NO:52),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在147位氨基酸处由谷氨酸替换赖氨酸。

    图23示出ΔN23/K(147)Q的核苷酸序列(SEQ ID NO:53)及氨基酸序列(SEQ ID NO:54),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在147位氨基酸处由谷氨酰胺替换赖氨酸。

    图24示出ΔN23/K(153)E的核苷酸序列(SEQ ID NO:55)及氨基酸序列(SEQ ID NO:56),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在153位氨基酸处由谷氨酸替换赖氨酸。

    图25示出ΔN23/K(153)Q的核苷酸序列(SEQ ID NO:57)及氨基酸序列(SEQ ID NO:58),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在153位氨基酸处由谷氨酰胺替换赖氨酸。

    图26示出ΔN23/Q(152)E/K(153)E的核苷酸序列(SEQ ID NO:59)和氨基酸序列(SEQ ID NO:60),该KGF类似物在天然KGF的N末端缺失前23个氨基酸,并在152位氨基酸处及153位氨基酸处分别由谷氨酸替换谷氨酰胺和赖氨酸。

                     发明详述

    根据本发明,提供新的KGF类似物。通过在KGF中一或多个特定的、带正电荷残基处进行缺失或替换生产KGF类似物。

    KGF类似物除其他特性以外,在一系列纯化和/或贮存条件中至少一种条件下具有改善的稳定性。例如,KGF类似物通常以大量的、折叠形式正确的蛋白质来产生。而且,一旦材料纯化以后,与其亲本分子相比在(同等的)pH及温度等条件下更加稳定。在下面实施例部分将描述的([R(144)Q和R(144)E)],分别在144位氨基酸处由谷氨酰胺或谷氨酸替换精氨酸)类似物中表明,与天然KGF相比较,它们(1)在37℃贮存的半衰期由35天提高至37.2天;(2)在热解折迭的过程中其热融解温度升高7.5-9.5%;(3)在一定范围pH值内Tm的升高。

    尽管并不想为理论所束缚,但R(144)Q及R(144)E稳定性提高的可能原因来自总电荷密度中一簇碱性残基的减少,在无肝素的情况下这些残基由电荷排斥而固有不稳定。下面给出的结果显示144位精氨酸残基可能与bFGF中的一个残基相对应,根据X-光结晶学研究报道该残基靠近或在一簇碱性残基内介导肝素的结合(Ago等(1991年),生物化学杂志,110:360-363;和Eriksson等(1993年),蛋白质科学,2:1274-1284)。

    天然KGF共有46个带电荷的残基,其中27个带正电荷。为观察所得KGF类似物的结果,将天然KGF一级结构与bFGF一级结构相比较表明这27个带电荷残基也形成bFGF一级结构中相同的簇。根据这些残基在蛋白质三维结构的位置,以带负电荷或中性氨基酸替换这一簇残基中的一至多个残基可能会改变邻近残基之间的静电作用从而实现提高稳定性。

    除了此处特别提出的优选的R(144)Q之外,本发明还考虑了其它类似物。在本发明中所用的“KGF类似物”或“KGF的多肽类似物”指的是在41-154位氨基酸(SEQ ID NO:2中72-185位氨基酸)之间有一至多个残基发生电荷改变的多肽,特别包括123-133位氨基酸残基(SEQ ID NO:2中154-164位氨基酸)被缺失或选择中性或负电荷残基置换以影响正电荷减少的蛋白质。修饰时优选的残基为Arg41,Gln43,Lys55,Lys95,Lys128,Asnl37,Glnl38,Lys139,Arg144,Lys147,Gln152,Lys153,Thrl54,较优选为Gln138,Lys139,Argl44,Lys147,Gln152,Lys153,最优选为Arg144。用以替换的优选的氨基酸包括谷氨酸,天冬氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丝氨酸及苏氨酸,其中谷氨酸,谷氨酰胺,天冬氨酸,天冬酰胺及丙氨酸是特别优选的。

    任一修饰都应考虑到使该分子的三维结构的电荷排斥减小;最优选类似物与亲本分子相比将使稳定性提高。很明显,缺失与替换不能过多也不能使残基太靠近而使两个负电荷残基之间产生电荷排斥。

    当该KGF类似是由生物学方法生产,如细胞表达的产物而非固相合成产物或天然产生产物的水解或酶解等衍生物时,编码这些多肽的核苷酸与天然KGF的核苷酸序列相比有一至多个碱基不同。这些核苷酸可以表达,所得到多肽可通过一系列为本领域内技术人员熟知的重组技术方法之一纯化。

    编码全部或部分KGF类似物的DNA序列除了其它一些结构以外,还可能包括在选定宿主中表达时整合的“优选”密码子(例如,大肠杆菌表达密码子);限制性内切酶的切割位点;以及便于构建可表达载体的附加起始、终止以及中间的核苷酸序列(例如在大肠杆菌中表达的起始甲硫氨酸残基。)

    本发明还提供用以表达多肽的重组分子或载体。这些载体包括DNA或RNA,其性质可为环形、线状、单链或双链,可以是天然产生的或由一系列天然产生或合成的部分装配而成。

    这类表达载体已知有许多范例。载体的各种成分,例如复制子,选择基因,增强子,启动子等,可通过天然资源或已知步骤合成获得。在每一例中,本发明中所用表达载体至少包括一个与插入的编码KGF类似物核苷酸序列功能相关的表达调控元件。该调控元件可以控制本发明中核苷酸分子表达多肽。有用的调控元件包括,lac系统,trp系统,λ噬菌体的启动子和操纵子,糖酵解酵母启动子,酵母酸性磷酸酶启动子,酵母α接合因子,腺病毒,Epstein-Barr病毒,多瘤病毒及猿猴病毒等的启动子,以及各种逆转录病毒的启动子。当然,其它多种本领域所知的适合于原核或真核细胞表达的载体及控制元件都可在此发明的实施中加以运用。

    适当的原核克隆载体的实施例包括来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322,colE1,pUC及F因子),优选为pCFM 1156(ATCC 69702),pCFM1656(ATCC 69576)及pCFM 3102(在下面的实施例部分加以说明)等质粒。其它适当的表达载体如在哺乳类、昆虫、酵母、真菌和细菌中表达的众所周知的类型也可用以实现此目的。以这些载体转染适当的宿主细胞可以使得KGF类似物多肽表达。

    本发明中有用的宿主微生物可为原核或真核生物。适当的原核宿主包括各种大肠杆菌(例如FM5,HB101,DH5α,DH10和MC1061),假单胞菌,芽孢杆菌,及链霉菌菌株,其中优选大肠杆菌。适当的真核宿主细胞包括酵母和其它真菌,昆虫细胞、植物细胞、动物细胞例如COS(COS-1及COS-7)细胞和CV-1猴细胞株,来自Swiss细胞株,Balb-c或NIH的3T3细胞系,HeLa和L-929小鼠细胞及CHO,BHK或Hak仓鼠细胞。根据所选用宿主,由它所产生的重组多肽可能被哺乳类或其它真核细胞的碳水化合物糖基化或不发生糖基化。

    优选的生产方法根据不同的因素和考虑而有变化;对某一特定条件的最适生产步骤通过少量实验后对本领域熟练人员来说是显而易见的。运用本领域已知方法可使所得表达产物纯化至近于均质。一个典型由原核细胞生产的纯化步骤包括以高压或其他方法破碎细胞壁,离心或过滤除去细胞碎片,接着让上清或滤液过离子交换层析,最后经过疏水作用层析。如果表达产物是不溶形式,提纯的步骤则包括溶解含有类似物的包涵体及随后的离子交换色谱层析,蛋白质重折叠以及疏水作用层析。纯化技术的实施范例在共同享有,于1994年10月13日提交的U.S.S.N.08/323,339中加以说明。概括而言,U.S.S.N.08/323,339说明了包括如下步骤的纯化角质细胞生长因子的方法:(a)获得含有KGF的溶液;(b)将(a)中所得溶液中的KGF结合至阳离子交换树脂上;(c)以洗脱液从阳离子树脂上洗脱KGF;(d)将(c)中所得溶液通过适当的分子量排阻介质或进行疏水作用色谱层析;(e)由分子量排阻介质或疏水作用色谱层析回收KGF。

    当然,这些类似物可经过快速筛选来评估它们的物理特性。尽管用来检测类似物的特定的实验并不重要,实施例中仍给出了各种众所周知的稳定性测定。另外,生物学活性水平(例如受体结合和/或亲和性,有丝分裂原活性,细胞增殖和/或体内活性)也可通过使用多种测定检测,在实施例中提出了其中一些(方法)。已知有多种方法可以用来快速筛选KGF类似物来确定它们是否具有可接受的生物学活性。这类实验中一个特定的实验可以检测KGF类似物与125I-KGF标记物竞争结合KGF受体(KGFR)的活性(Bottaro等(1990年),生物化学杂志,256:12767-12770;Ron等(1993年),生物化学杂志,268.:2984-2988)。检测KGFR/KGF类似物相互作用的另一个方法涉及使用所谓实时生物特异性相互作用分析(BIA)技术(Felder等(1993年),分子和细胞生物学,13:1449-1455)。而且有丝分裂原实验可用来测定KGF类似物刺激DNA合成的能力(Rubin等(1989),上文)。最后,细胞增殖实验可用来检测KGF类似物刺激细胞增殖的能力(Falco等(1988年),癌基因,2:573-578)。使用上述任何一个实验体系,均能快速筛选KGF类似物的生物学活性。

    KGF类似物还可进一步修饰含有正常多肽所没有的附加的化学成分。这些衍生的成分可能改善它的溶解性,吸附性及生物学半衰期等。这些成分可能消除或减轻蛋白质等的不期望的副作用。能够介导这些作用的(化学)成分在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18版,Mack出版公司,Easton,PA(1990年)。使用能够与选定的侧链及末端残基反应的有机衍生试剂与肽上的靶氨基酸残基进行可在分子中引入共价修饰(T.E.Creighton(1983年),蛋白质:结构和分子特征,W.H.Freeman & Co.,圣弗兰西斯科,79-86页)。聚乙二醇(PEG)是用来制备治疗性蛋白产品的化学成分之一。在某些蛋白质中,附加的聚乙二醇可防止蛋白水解,Sada等(1991)发酵生物工程杂志,71:137-139,而且添加某种聚乙二醇成分的方法有效可用。见美国专利号,4,179,337,Davis等“免疫原性多肽”,1979年12月18日发行;以及美国专利号4,002,531,Royer“聚乙二醇修饰酶及由此产生的产物”,1977年1月11日发行。见Abuchowski等在Enzymes asdrugs(Holcerberg和Roberts,367-383页(1981年))中的综述。对于聚乙二醇,可以使用多种方法添加它至蛋白质上。概括地说,聚乙二醇可以通过蛋白质上的反应基团连接至蛋白质上。例如赖氨酸及N-末端残基上的氨基是此类添加很方便的基团。例如,Royor(美国专利号4,002,531)说明还原烷基化可用来添加聚乙二醇至酶。EP 0539167,1993年4月28日出版,Wright的“Peg亚胺酸酯(imidate)及其蛋白质衍生物”说明带有自由氨基基团的肽及有机化合物可由聚乙醇或其它水溶性有机多聚物的亚胺酸衍生物进行修饰。美国专利号4,904,584,Shaw于1990年2月27日提交,涉及通过自由氨基基团添加聚乙二醇分子至蛋白质中修饰赖氨酸的数量。

    在另一实施方案中,本发明针对单剂量服药单位的药物制剂,它能够通过胃肠道外给药及口服给药安全地治疗温血动物的疾病(例如人)。这种药物制剂是干粉形式或其他脱水形式的治疗制剂或诊断制剂,它能通过添加生理上可接受的溶剂而重建。该溶剂可以是无菌水,生理盐水,葡萄糖溶液或其它碳水化合物液体(例如甘露醇,木糖醇及甘油等多元醇)等能够溶解干的组合物的任意介质,它能够与所选择的给药途径相匹配并对于有效成分及使用的重建稳定剂无负性干扰作用。在一特定的实施方案中,本发明针对产生单剂量给药单位的试剂盒。该试剂包括两个容器,第一个容器中为蛋白质干粉,第二容器中为含有重建稳定剂的液体制剂。至于溶液中蛋白质浓度,每一容器中盛有溶液的体积及容器的体积(这些相关的参数可以根据有效成分最终剂量单位所需的浓度适当加以调整),这些可能在很大范围内变动并为本领域技术人员所熟知。

    根据本发明的KGF类似物可以用作治疗制剂,诊断制剂和研究制剂。这些KGF类似物可用于体外或体内诊断实验以定量测量组织或器官样品中KGF的数量和/或测定分离表达KGFR的细胞。(Bottaro等(1990年),生物化学杂志,256:12767-12770;Ron等(1993年),生物化学杂志,268:2984-2988)。在组织或器官的实验中125I-KGF类似物与KGFR结合的放射活性较标准的125I-KGF类似物放射活性的标准曲线要低,其原因在于未标记的天然KGF与KGFR也结合。同样,125I-KGF类似物也可用于检测各种不同类型细胞中KGFR的存在情况。

    本发明还考虑到利用KGF类似物以产生针对该肽的抗体,这种抗体也与天然KGF结合。在本实施方案中,抗体性质可分为单克隆与多克隆抗体并由KGF类似物产生。所得抗体优先与天然KGF结合,尤其是该蛋白质处于天然构象(生物学活性)时。这些抗体可用于检测或纯化KGF。

    另外,本发明还考虑利用KGF类似物发现有治疗应用价值的高亲和力或低亲和力KGF结合分子,例如使用它作为有效地KGF给药方法或KGF活性抑制剂。KGF类似物的热稳定性对于在生理条件下(例如37℃)鉴定这类结合分子很重要,因为它们对KGF的亲和性具很强的温度依赖性,而在4℃时则无法从亲和性上加以预测。

    在体内使用时,KGF类似物配方时需要添加剂。这些添加剂包括:缓冲剂,载体,稳定剂,赋形剂,防腐剂,张力调节剂及抗氧化剂等(例如粘度调节剂及填充剂)。特定添加剂的选择依赖于贮存形式(例如液体或干粉)及KGF类似物的给药方式。本领域所周知的适当配方可来自REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(最新版),Mack出版公司,Easton,PA。

    KGF类似物可以有效治疗剂量特异性地应用于组织中,其特征在于该组织有损伤或临床无足够数量的非成纤维上皮细胞。因为KGF与肝素结合,故有可能肝素,硫酸肝素,肝素类glycosaminglycans和肝素类糖胺聚糖类化合物等存在胞外环境的分子也可与KGF在体内结合。这样与肝素结合活性降低的KGF类似物将有增强的效用,因为有更多的KGF将达到其靶受体而不被胞外环境的肝素或类肝素化合物所螯合。这些类似物在治疗更加有效,因为每次治疗所需的特定的KGF剂量较低。

    KGF类似物可以有效治疗剂量应用于组织中,该组织其特征在于有损伤或临床上无足够数量的非成纤维上皮细胞。KGF类似物可以成功地使用包括但不局限的区域有:烧伤及浅度、深度受伤患者的毛囊、汗腺、皮脂腺等附件结构的刺激、增生和分化;加速由表皮松解泡(Dullosa)造成伤口的上皮再生,这种表皮松解泡是表皮与其下层真皮粘附缺陷,可导致有严重发病率的开放性、疼痛性水疱;防止化疗诱发的脱发症及治疗男性秃顶(症)及男性或女性进行性脱发;治疗胃及十二指肠溃疡;治疗诸如Crohn′s病(主要感染小肠)和溃疡性结肠炎(主要感染大肠)等肠炎;通过治疗(例如治疗前和/或治疗后)来防止或减轻放射及化学治疗的内脏毒性,诱导细胞保护和/或细胞再生;刺激全部胃肠道产生粘液;诱导II型肺细胞的增生与分化,可辅助治疗或防止早产儿的透明膜疾病(例如婴儿呼吸衰竭综合症及肺支气管发育异常);刺激急性或慢性肺损伤或吸入性损伤(包括高氧水平)导致的肺功能不全,肺气肿,使用损伤肺的化学治疗,通风器创伤或其他肺损伤情况下细支气管/呼吸上皮细胞的产生与分化;提高肝功能以治疗或防止肝硬化,暴发性肝衰竭,急性病毒性肝炎引起的损伤和/或中毒性肝的损害;诱导角膜细胞再生,例如治疗角膜擦伤;诱导上皮细胞再生以治疗进行性牙龈疾病;诱导鼓室上皮细胞再生以治疗耳鼓损伤和治疗与防止糖尿病发作或作为胰岛细胞移植时辅助制剂。

    需要增生非成纤维上皮细胞的患者将服用有效剂量的KGF类似物。“有效剂量”指的是在被治疗患者可激发预期效应所需的KGF类似物剂量,并通常由主治医师决定。影响KGF类似物施用剂量的因素通常包括患者的年龄及一般状况,治疗的疾病等。典型的剂量为0.001mg/公斤体重~500mg/公斤体重。

    KGF类似物能够胃肠道外(例如通过静脉滴注、气管吸入、肌肉注射、皮下注射或腹腔注射等途径)、口服或表面使用等安全地施用于温血动物(例如人)。KGF类似物可使用一次或多次施用,主要是根据病情与患者状况。在某些病例中,KGF类似物可用于其他治疗的辅助剂和与其他药物制剂共同使用。

    下列实施例包括在对本发明更全面的说明中。可以理解下面提出的操作步骤可以修饰而不背离本发明的宗旨。

                     实施例

    在下述实施例中描述的许多操作步骤的标准方法或适当的替换操作步骤,可由广泛认可的分子生物学操作手册提供,它们包括分子克隆,第二版,Sambrook等,冷泉港实验室出版社(1987年)和现代分子生物学方法,Ausabel等,Greene Publishing Associates/WileyInterscience,New York(1990年)。

    实施例1:制备编码KGF及KGF类似物的DNA

    使用来自动物细胞RNA及化学合成(大肠杆菌最适密码子)寡核苷酸(OLIGOS)通过聚合酶链式反应(PCR)方法来克隆人KGF基因全长片段(编码天然KGF序列的多肽)。两个方法叙述如下:

    使用由已知产生该多肽的细胞中提取RNA进行PCR扩增。首先,人成纤维细胞株AG 1523A(由Human Genetic Mutant Cell CultureRepository Institute For Medical Research获得,Camden,NewJersey)细胞由硫氰酸胍破碎,随后抽提(根据Chomyzinski等(1987年)生物化学年鉴,172:156中的方法)。使用对全部RNA的标准化逆转录操作步骤,得到KGF的cDNA。使用KGF cDNA作为模板及编码KGF基因紧邻5′和3′端的DNA序列的引物1(OLIGO#1)和引物2(OLIGO#2)进行PCR扩增(PCR#1)[9600型热循环器(Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT);28个循环;每个循环包括94℃下1分钟变性,60℃下2分钟退火,72℃下3分钟延伸]。PCR#1的产物中取1小等份作为模板进行第二次PCR扩增(PCR#2),循环条件除50℃退火温度外,其余均同上所述。为表达克隆的KGF基因,使用嵌套引物以便于在KGF基因两端产生限制性酶切位点。使用OLIGO#3和OLIGO#4修饰PCR#2中的KGF DNA产物,使它分别在5′端、3′端带有MluI及BamHI的限制酶切位点[PCR#3;30个循环;每一循环包括94℃下1分钟变性,60℃下2分钟退火以及72℃下3分钟延伸]。该DNA随后以MluI及BamHI切割,苯酚抽提,乙醇沉淀。重新悬浮后与含有“RSH”信号序列的pCFM 1156质粒(图2A)连接(使用T4连接酶)构建RSH-KGF(图3)。

    连接产物转化(根据Hanahan(1983年),分子生物学杂志,166:557页中的方法)进入大肠杆菌FM5菌株(ATCC:53911)并在28℃下铺于LB+卡那霉素平板。选择一些转化体使之在含20μg/ml卡那霉素的液体培养基中生长。由每个培养物细胞中分离RSH-KGF质粒并测序。由于KGF基因内部有一个NdeI位点,所以不能将天然KGF基因直接克隆进入所得所表达质粒的NdeI和BamHI位点之间。这可由三段(three-way)连接来完成。以仅有单一限制性酶切点的BsmI和SstI切割质粒RSH-KGF,通过1%琼脂糖凝胶电泳分离得到3kbp DNA片段(含有KGF基因3′端)。以OLIGO#5代替OLIGO#3如上所述再次进行PCR(PCR#4)。PCR产物以NdeI和BsmI切割后由4%琼脂糖凝胶电泳分离得到331bp的DNA片段。用来连接的第三段是质粒pCFM 1156由NdeI和SstI切割后由1%琼脂糖凝胶电泳分离得到的1.8kbp DNA片段。连接后(用T4连接酶),如上进行转化、卡那霉素选择和DNA测序,一个选出的克隆含有图4中所示结构,该质粒称为KGF。由于一个内部的核糖体结合位点会产生截短产物,在单一的KpnI和EcoRI之间的KGF  DNA序列用化学合成的寡核苷酸所取代(OLIGO#6~OLIGO#11)以减少内部起始位点的使用(图5)。

    寡核苷酸#1(SEQ ID NO:7):5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'

    寡核苷酸#2(SEQ ID NO:8):5'-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3'

    寡核苷酸#3(SEQ ID NO:9):5'-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3'

    寡核苷酸#4(SEQ ID NO:10):

               5'-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'

    寡核苷酸#5(SEQ ID NO:11):

               5'-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'

    寡核苷酸#6(SEQ ID NO:12):

               5'-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'

    寡核苷酸#7(SEQ ID NO:13):

               5'-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3'

    寡核苷酸#8(SEQ ID NO:14):

               5'-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'

    寡核苷酸#9(SEQ ID NO:15):

               5'-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3'

    寡核苷酸#10(SEQ ID NO:16):

               5'-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3'

    寡核苷酸#11(SEQ ID NO:17):

               5'-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'

    这些寡核苷酸以T4多核苷酸激酶磷酸化后加热变性。温度缓慢降至室温使单链寡核苷酸形成双链片段。使用T4连接酶共价连接寡核苷酸内部粘性末端及双链寡核苷酸片段至KpnI和EcoRI切割的KGF质粒。新质粒称为KGF(dsd)。

    使用化学合成OLIGO#12~24通过PCR扩增构建完整的大肠杆菌最适密码子的KGF基因。

    寡核苷酸#12(SEQ ID NO:18):5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3'

    寡核苷酸#13(SEQ ID NO:19):5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3'

    寡核苷酸#14(SEQ ID NO:20):

                5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATG-

                ACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'

    寡核苷酸#15(SEQ ID NO:21):

                5'-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT-

                GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3'

    寡核苷酸#16(SEQ ID NO:22):

                5'-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATC-

                ATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3'

    寡核苷酸#17(SEQ ID NO:23):

                5'-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACT-

                GTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3'

    寡核苷酸#18(SEQ ID NO:24):

                5'-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGAC-

                CCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAAGGT-3'

    寡核苷酸#19(SEQ ID NO:25):

                5'-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTC-

                ACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'

    寡核苷酸#20(SEQ ID NO:26):5'-TACGGGTGTGACGTTCCGGGG-3'

    寡核苷酸#21(SEQ ID NO:27):5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3'

    寡核苷酸#22(SEQ ID NO:28):5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3'

    寡核苷酸#23(SEQ ID NO:29):5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3'

    寡核苷酸#24(SEQ ID NO:30):5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'

    OLIGO#12~OLIGO#24是这样来设计的,即编码天然KGF全长的DNA序列分别由“Waston”链或“Crick”链代表,经过PCR扩增就能获得期望的双链DNA序列(图6)。[PCR#5,Model 9600热循环器,Perkin-Elmer Cetus];21个循环,每个循环包括在94℃下31秒变性,50℃下31秒退火以及73℃下31秒延伸;在21个循环完毕以后最后的延伸步骤仍然进行7分钟]。PCR扩增后,DNA片段以XbaI和BamHI切割得到521bp片段与以相同酶切割的表达质粒pCFM 1156连接。PCR#5利用外部引物(100pmoles/100μl rxn)寡核苷酸#12(OLIGO#12)和寡核苷酸#13(OLIGO#13)及1μl/100μl rxn的KGF模板,同时使用OLIGO#20~OLIGO#24作为辅助寡核苷酸带(Jayaraman等,(1992年),Biotechniques,12:392)来连接OLIGO#14~OLIGO#19(OLIGO#15~OLIGO#18由T4多核苷酸激酶磷酸化)。最终的质粒称为KGF(最适密码子)。

    这里所描述的所有KGF类似物其DNA序列部分来自KGF(dsd)或KGF(最适密码子),或者两者的复合。这些序列进一步通过插入适当的限制性酶切位点至一类DNA序列中进行修饰,该类DNA序列编码特定的KGF类似物的氨基酸且是利用一种至多种上述合成DNA片段技术制造出来。任何类似物都可由上述技术完整地获得。尽管最适大肠杆菌密码子作为通用寡核苷酸设计的一部分在适当地方加以运用,它的一部分或全部在任何被检测基因中的存在并不能显著地提高由这些培养的细菌细胞中蛋白质的产量。图7-10和图17-26提出了特定的KGF类似物核苷酸序列和氨基酸序列结构一适当的实施例:R(144)Q(图7);C(1,15)S/R(144)E(图8);C(1,15)S/R(144)Q(图9);ΔN23/R(144)Q(图10);ΔN23/N(137)E(图17);ΔN23/K(139)E(图18);ΔN23/K(139)Q(图19);ΔN23/R(144)A(图20);ΔN23/R(144)L(图21);ΔN23/K(147)E(图22);ΔN23/K(147)Q(图23);ΔN23/K(153)E(图24);ΔN23/K(153)Q(图25);ΔN23/Q(152)E/K(153)E(图26)。所有此处描述KGF类似物质粒其DNA序列都已验证。

    实施例2:大肠杆菌中的生产

    克隆KGF类似物基因时使用三种不同的表达质粒。它们是pCFM1156(ATCC#69702),pCFM1656(ATCC#69576)和pCFM3102(分别为图2A,2B和2C)。使用PCR重叠寡核苷酸突变法对质粒pCFM1656进行一系列定点碱基变换可得到质粒p3102。由紧邻5′的BglII位点(pCFM1656质粒碱基号#180)至质粒复制启动子PcopB,向着质粒复制基因,碱基对变换如下所示:pCFM 1656碱基号  pCFM 1656中碱基对  改为pCFM 3102中碱基对

    #  204              T/A                  C/G

    #  428              A/T                  G/C

    #  509              G/C                  A/T

    #  617              --             插入两个G/C碱基对

    #  677              G/C                  T/A

    #  978              T/A                  C/G

    #  992              G/C                  A/T

    # 1002              A/T                  C/G

    # 1005              C/G                  T/A

    # 1026              A/T                  T/A

    # 1045              C/G                  T/A

    # 1176              G/C                  T/A

    # 1464              G/C                  T/A

    # 2026              G/C               碱基对缺失

    # 2186              C/G                  T/A

    # 2479              A/T                  T/A# 2498-2501             AGTG                 GTCA

                        TCAC                 CAGT# 2641-2647           TCCGAGC             碱基对缺失

                      AGGCTCG# 3441                  G/C                   A/T# 3452                  G/C                   A/T# 3649                  A/T                   T/A# 4556                  --                 插入碱基对

    (SEQ ID NO:39)5′-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3′

    (SEQ ID NO:40)3′-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5′

    如上所见,pCFM 1156,pCFM 1656及pCFM 3102非常相似且含有多个相同的限制性位点。质粒的选择是为方便,载体DNA的组成可以随新质粒而简便地交换。用来克隆的宿主细胞是大肠杆菌FM5菌株(ATCC:53911),其转化方法参照(Hanahan(1983年),上文中方法)或参照生产商说明使用Gene PulserTM转染装置(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA)进行电洗脱。

    首先,由甘油冻存的适当菌株贮存管内取出0.1ml至含有500ml Luria肉汤的2升烧瓶中,开始小量新鲜的接种培养,这种期望的大肠杆菌重组克隆带有三个期望的pCFM载体所构建质粒的任一种。该培养物在30℃下振荡16小时,随后转移至盛有8L灭菌批量培养基(Tsai等(1987年),工业微生物杂志,2:181-187)的15L发酵罐中。

    以Feed#1培养基中配料成分给批量培养配料(Tsai等(1987年),supra)。当OD 600达到35时,将培养温度快速提至37℃2小时以诱导期望KGF的表达,然后升至42℃以使CI阻遏物变性。终止Feed1的添加而改为Feed 2,起始的加料速率为300ml/hr。Feed 2包括175g/l胰酶解蛋白胨,87.5g/l酵母浸出物和260g/l葡萄糖。在42℃1小时后,培养温度降至36℃,此后该培养温度维持6小时。

    停止发酵,将放入1L的细胞离心管内通过离心收集到塑料袋中。在400 rpm离心60分钟沉淀细胞,去上清将细胞膏状物置-90℃冷冻。

    在大肠杆菌中表达了各种KGF类似物之后,使用下列操作步骤纯化天然KGF,R(144)Q,C(1,15)S/R(144)E,C(1,15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q蛋白。由高密度细胞发酵所得细胞膏状物在4℃以0.2MNaCl,20mM NaPO4,pH 7.5溶液中由适当的高速剪切混合器制成10-20%悬浮溶液(质量体积比)。悬液细胞在均浆器(APV Gaulin,Inc.,Everett,MA)中通过三次以裂解。使用适当的热交换器将流出的均浆冷却至4-8℃。使用JS 4.2转头将裂解物置J-6BTM离心机(BeckmanInstruments,Inc.,Bera,CA)在4℃4,200rpm离心30-60分钟除去细胞残渣。将上清小心地倾注入预先制备450ml(5em×23cm)并以0.2MNaCl,20mM NaPO4,pH 7.5溶液在4℃平衡的S-Sepharoes FastFlowTM树脂柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)。在4℃以5倍柱体积(2250ml)的0.4M NaCl,20mM NaPO4,pH 7.5溶液洗柱,以5L 0.5MNaCl,20mM NaPO4,pH7.5在4℃洗脱所期望蛋白质。分部收集50ml在监测流出液的A280值。由A280鉴定含有洗脱材料的分部收集样品进行14%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳以确认期望多肽的存在。

    合并含有感兴趣蛋白的分部收集液,随后加入等体积的蒸馏水。稀释的样品再倾注入预先制备450ml(5cm×23cm)并以0.4M NaCl,20mM NaPO4,pH 6.8溶液在4℃平衡的S-Sepharose Fast Flow树脂柱。在4℃以5倍体积(2250ml)的0.4M NaCl,20mM NaPO4,pH6.8溶液洗柱,用20倍柱体积0.4M NaCl,20mM NaPO4,pH6.8至0.6M NaCl,20mM NaPO4,pH6.8的线性梯度洗脱蛋白质。同样,在A280处持续监测流出液时分部收集50ml液体。那些含有蛋白质的分部收集液合并后在350cc搅拌容器内(Amicon,Inc.,Mayberry,MA)通过YM-10膜(隔离分子量为10,000)使浓缩体积至30-40ml。

    浓缩液上样至1,300ml (4.4cm×85cm)以含有1×PBS(Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液,“D-PBS”,无Ca++和Mg++)或0.15MNaCl,20mM NaPO4,pH7.0的柱缓冲液预平衡的Superdex-75TM树脂(Pharmacia)柱。待样品完全进入柱中,使用柱缓冲液由凝胶过滤介质中洗脱蛋白质。此后,分部回收10ml并合并那些含有类似物的收集液(由14%SDS-PAGE方法确定)。上述操作如非另外特指,均在4-8℃下进行。

                      分析

    分析源自大肠杆菌的天然KGF;R(144)Q,C(1,15)S/R(144)E;C(1,15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q。

                  构象稳定性

    这些蛋白质在贮存稳定性、热解折叠变换温度(Tm)及宽的pH值范围内的稳定性等进行比较。

    天然KGF,R(144)Q,C(1,15)S/R(144)E,C(1,15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q在升高温度防聚集的作用也进行检测。以D-PBS制备含0.5mg/ml蛋白质的样品。每0.5ml样品分别加至3cc type-1玻璃瓶中。玻璃瓶加上橡胶塞后并封上13mm(flip-off)铝质包口。将瓶子置37℃温箱中。放置预定的时间后取出瓶子分析丧失的可溶性蛋白。通过0.22μM Spin-X滤器(Costar,Cambridge,MA)离心除去每个250μl样品中可见的沉淀。随后对滤过溶液中可溶性蛋白进行大小排阻高效液相色谱。对于高效液相色谱中所得峰面积求积分并以它的结果对37℃时的温育时间为函数作图。

    据此动力学曲线可估算出这种丧失了可溶性的单体蛋白的半衰期。表1示出这些蛋白质在37℃贮存时仍保持可溶状态KGF的半衰期。

                            表1

                丧失可溶性单体蛋白的半衰期    蛋白质    半衰期(天)天然KGFR(144)QC(1,15)S/R(144)QΔN23/R(144)QC(1,15)S/R(144)E    0.6    4.1    13.3    22.3    38.0

    如上面表1及图11所见,天然KGF聚集最快,半衰期为0.6天。R(144)Q提高半衰期至4.1天。C(1,15)S/R(144)Q,ΔN23/R(144)Q及C(1,15)S/R(144)E则显示相当大的提高,半衰期分别为13.3、22.3、38天。

                      热解折叠

    热解折叠由配有PTC-343 Peltier-型温度控制系统的J-720TM旋光分光计(Jasco,Inc.,Easton,MD)在230nm处监测其园二色性(CD)。进行CD分析时,用来分析的含有0.1mg/ml多肽的单个样品由D-PBS(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)制备。每个样品约2.5ml装入光路长为10mm的直角SuprailTM石英(HeraeusQuarzschmelze,GmbH,Hanau,Germany)荧光杯(Hellma Cells,Inc.,Jamaica,NY)。然后将该杯置旋光分光计的Peltier型温度控制系统中。热解折叠速度为50℃/小时。在230nm处监测椭圆率变化表明解折叠情况。通过鉴定在某一温度下溶液中有50%的蛋白质解折叠来估算每一个样品的Tm值(Biophysical Chemistry,Cantor and Schimmel(eds),W.H.Freeman and Co. San Francisco(1980年))。三种蛋白质的估算Tm值在表2中列出。

                            表2

                      估算的融解温度    蛋白质  融解温度(℃)天然KGFR(144)QC(1,15)S/R(144)QΔN23/R(144)QC(1,15)S/R(144)E    54.0    61.5    62.5    63.0    63.5

    如结果所示,R(144)Q与天然KGF相比其Tm值要高7℃多。如果将R(144)Q替换成C(1,15)S/R(144)Q或ΔN23则Tm值至少升高1℃而比天然KGF要高8℃多。而且C(1,15)S/R(144)E则比天然KGF稳定温度高9℃多。因此,将144位氨基酸由带正电荷残基变为中性或负电荷残基能大大增强多肽稳定性。

                            pH

    加浓盐酸或浓氢氧化钠调D-PBS至不同pH范围,比较C(1,15)S/R(144)Q和C(1,15)S/R(144)E与天然KGF的酸稳定性。约2.35ml不同pH值的D-PBS与100μl 2.45mg/ml KGF蛋白质在石英杯中混合。这些样品以50℃/小时速度进行热解折叠并在230nm处监测园二色性。图12示出了天然KGF、C(1,15)S/R(144)Q和C(1,15)S/R(144)E的Tm对pH的函数。在所测试的pH范围内,C(1,15)S/R(144)Q和C(1,15)S/R(144)E的Tm值均高于KGF。

                      体外生物学活性

    通过Balb/MK细胞摄取[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷的半最高浓度与蛋白质浓度的函数检测了R(144)Q,ΔN23/R(144)Q,C(1,15)S/R(144)Q和C(1,15)S/R(144)E体外有丝分裂原活性(参照Rubin等(1989年),上文中的方法)。

    通常每一个与已知天然KGF相关的KGF类似物其浓度可使用体外生物分析测定。每一个KGF类似物稀释后使用Balb/MK有丝分裂原实验来检测其生物学活性。每一样品首先用生物分析培养基稀释,该培养基包括50%定做的Eagle′s MEM,50%定做的Eagle′s MEM,5μG/ml转铁蛋白,5ng/ml亚硒酸钠,0.0005% HSA和0.005%吐温20。KGF样品随后加进接种有Balb/MK细胞的Falcon primeria 96孔板中。测定DNA合成时[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入并参照天然KGF标准曲线转换算成加入的天然KGF浓度。结果在13-16中示出。如图13-16所见,每种KGF类似物都有有丝分裂原活性。

    尽管本发明以上描述是概括性及优化实施方案,可以理解根据上述描述本领域技术人员仍可进行其他变化与改进。

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提供了KGF蛋白的新型类似物,该等类似物包含由图2中41154氨基酸残基(SEQ ID NO:2 72185氨基酸)的一个或多个的缺失或取代而引起的电荷变化。这些类似物比对应的KGF母体分子更稳定。。

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