细胞凋亡相关基因 【发明领域】
本发明涉及一种细胞凋亡相关基因以及，更具体地说，一种新的在细胞凋亡早期高水平表达的nbl基因。本发明还涉及利用特定的细胞凋亡基因检测细胞凋亡相关基因表达的方法，控制细胞凋亡的方法和细胞凋亡中的应用。
现有技术和问题
细胞凋亡被定义为导致细胞死亡的一种过程并且可在各种生理条件下发生，可观察到在细胞的发育、分化和成熟之中或者细胞在各种条件的诱导之下的细胞编程化死亡〔英国癌症杂志，265.，P，239(1972)〕。形态学上，细胞凋亡其特征在于细胞与周围的细胞脱离，质膜皱缩，可能与核酸内切酶活性增强相关的染色质凝集和固缩，以及核片段化。进一步地，还可观察到细胞表面微绒毛消失，膜出泡和其它现象。由于核酸内切酶活性增强，可观察到DNA的片段化以及周围细胞对作为细胞最终片段的细胞凋亡小体的细胞吞噬作用，这已被作为参与其过程的机制进行了讨论〔今日免疫，7(4)：115-119(1986)；科学，245，301-305(1989)〕。
已表明细胞凋亡参与了各种疾病并且在其中起了重要作用。因此，最近几年，特别注重了诱导或抑制细胞凋亡对这类疾病的诊断和预防和治疗这类疾病的潜在价值。
在这些需要诱导细胞凋亡的疾病中有如白血病和骨髓瘤等癌症，自身免疫病，和与细胞死亡不相关的病毒性疾病。需要抑制细胞凋亡的疾病包括由神经细胞死亡引起的神经病，如早老性痴呆症，HIV感染(无症状期)，和伴有细胞死亡的病毒性感染等。
如果可提供一种细胞凋亡相关基因并且该基因可通过该基因或基因产物的表达控制细胞凋亡的话，就有可能以通过分析该基因在各种细胞的表达水平及其结构和功能或分析其表达产物所得到的结果为基础，去澄清上述细胞凋亡或相关疾病的病理学方面，并且可建立一些或其它诊断和治疗该疾病的方法。
但是，由于细胞凋亡相关基因尚未有详细的研究，现在还很难做此类详细的细胞凋亡相关的分析调查。
发明公开
根据本发明，参与细胞凋亡过程的特异基因被揭示。现已发现在此类基因的暂时表达之后观察到了细胞凋亡的特征标记，即DNA的片段化并且发现暂时性的增强和随后的表达停顿参与了细胞凋亡过程。
从而，本发明提供了这样的特异的细胞凋亡相关基因。本发明还涉及所说基因在各种细胞凋亡相关疾病的诊断和此类疾病的生物医学研究以及细胞凋亡的诱导或抑制中的应用，这是通过检测所说基因或相应的表达产物或其人工操作产物而进行的。
本发明提供了一种特异的属于细胞凋亡相关基因的基因(以后称作nbl基因)，它包含编码SEQ ID NO：1之氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供了下面的作为细胞凋亡相关基因的nbl的同源物：fte-1基因，RPS 3a基因，MFT-i基因，Cyc 07基因，TU-11基因，和KRP-A基因，它们都是与由编码上述SEQ ID NO：1的氨基酸序列之核苷酸序列所详细说明的nbl基因高度同源的。
以后，在本说明书中，根据IUPAC-IUB规则，“对含核苷酸序列或氨基酸序列的制备说明等的指南”(日本专利局编)和相关研究领域的常规实践，氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸等以缩写术语表示。
本发明提供的基因其特征在于其在细胞凋亡过程中的表达变化。一个此类基因的具体实例具有SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列，它含有SEQ ID NO：3中所示的cDNA克隆的核苷酸序列，并且该克隆具有由编码284个氨基酸残基的792个核苷酸组成的开放阅读框。
在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中，所出示的本发明的基因是单链DNA序列。不过，本发明也包括与该单链DNA序列互补的DNA序列并且因此包括包含这二者的成分。SEQ ID NO：2所示的本发明的基因序列仅是对应的氨基酸残基的可能的密码子组合的一个实例，理所当然对本发明的基因不仅具有所说的序列，而且不具有这样一个DNA序列，如果可能，可组合地为每个氨基酸残基任意选择一个密码子。所说的密码子选择可按常规方式进行，例如可基于所用宿主中密码子频率模式进行选择〔(核酸研究，9，43-74(1981)〕。
而且，本发明的基因包括那些编码与原始的基因具有相同功能的等价多肽的DNA序列。此类修饰可通过时SEO ID NO：1所示的部分氨基酸和/或氨基酸序列的取代，缺失和/或添加而进行。尽管这些多肽的产生，修饰(突变)等可自发地发生，它们可按如下方法产生：翻译后修饰或通过遗传基因工程技术，如定点突变修饰天然基因(本发明的基因)〔酶学方法，154，p，350-382(1987)；ibid.，100.，p，468(1983)；核酸研究，12，p，9441(1984)；Zoku SeikagukuJikken Koza 1，“Idenshi Kenkyuho(基因研究方法)II”，日本生物化学学会编，p，105(1986)〕，或者通过磷酸三酯法或磷酰亚胺方法等化学合成方法合成突变的DNA〔美国化学学会杂志.，89，p.4801(1967)；ibid.，91，p.3350(1969)；科学，150，p，178(1968)；Tetrahedron Letter.，22，p，1859(1981)；ibid.，24.，p，245(1983)〕，或者应用这些技术的组合。
实际上，对应于大鼠fie-1基因〔美国国家科学院院刊，89，2200-2204(1992)〕的人fte-1基因，也被称为v-fos-转化效应子基因，在SEQ ID NO：3的核苷酸序列的第620位核苷酸为(A)，因此对应的第196位氨基酸为Asp，活性相等。从而，所说的基因被包括在本发明的细胞凋亡相关基因的范围之内。
因此，编码一种核糖体蛋白的人RPS 3a基因(Metspalu，A.，等.，基因，119，313-316(1992))与nbl基因仅在196位氨基酸残基不同，它也在本发明的细胞凋亡相关基因的范围之内。
而且，与将蛋白向线拉体转运有关的酵母MFT-1基因，与nbl基因在氨基酸水平上有58％的同源性〔Garrett，J.M.，等.，分子遗传学和普通遗传学。225，483-491(1991)〕，从而，这基因也在本发明的细胞凋亡相关基因的范围之内。
而且，nbl基因与调节(控制)高等植物细胞周期的Cyc 07基因在氨基酸水平上有62％的同源性〔Ito，M.，等.，欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Letters)，301，29-33(1992)〕，从而，该Cyc 07基因也在本发明的细胞凋亡相关基因的范围之内。
另外，小鼠TU-11基因〔Gordon，H.M.，等.，免疫学杂志.，148，4021-4027(1992)〕与nbl基因只有4个氨基酸残基的差别并且与后者在氨基酸水平上有98％的同源性，并且海兔KRP-A基因〔海兔；加利福利亚海兔；Auclair，O.，等.，欧洲生物化学杂志.，220_，997-1003(1994)与nbl-基因在氨基酸水平上有78％的同源性，它也在本发明的细胞凋亡相关基因的范畴之内。
可利用本发明的基因以稳定的方式产生上述的细胞凋亡相关蛋白，例如可将其插入一个微生物载体中并培养所转化的微生物。
利用本发明的基因得到的细胞凋亡相关蛋白还可被用于产生特异的抗体。此处用做抗原的成分可以是用上述的基因工程技术大量生产的蛋白并且所获得的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。例如，这些抗体可优选被用于纯化，分析或鉴定细胞凋亡相关蛋白。
更具体地说，本发明的基因其特征在于其部分或整个核苷酸序列特别适于检测各种人组织或细胞中细胞凋亡相关基因的表达。
基于本文所公开的本发明的基因的序列信息利用常规的基因工程技术可以很方便地制备本发明的基因〔分子克隆，第二版.，冷泉港实验室出版社(1989)；日本生物化学学会编Zoku Seikagaku Jikken Koza“Idenshi Kenkyuho I、II和III”及其它〕。
这一点可以实现，例如，可通过用对本发明的基因特异的合适的探针或多个探针或抗体从人cDNA文库中选择所需要的克隆(用常规方法在其中表达细胞凋亡相关基因的合适的来源细胞中制备)〔美国国家科学院院刊，18，6613(1981)；科学，222，778(1983)及其它〕。
在上述的方法中，来源细胞包括这些，例如，其中有细胞凋亡相关基因表达的各种细胞，组织或培养细胞。可用常规方法从这些来源中进行总RNA的分离，mRNA的分离和纯化，向cDNA的转变(合成)及其克隆和其它步骤。还可得到商业供应的cDNA文库。那些cDNA文库，例如从Clontech Lab公司购得的不同cDNA文库也可使用。
可用上述的常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些筛选方法包括，例如，包括用对细胞凋亡相关蛋白特异之抗体进行免疫分析而检测这些cDNA克隆所产生的蛋白的方法，应用与所需DNA序列选择性的结合探针的噬菌斑或菌落杂交方法，及这些方法的结合。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用做探针。
而且，应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法〔科学，230，1350-1354(1985)〕可被优先用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE：cDNA末端快速扩增法；Jikken Igaku(实验医学)，12(6)，35-38(1994)〕。在上述PCR方面中所用的引物可根据本文所公开的本发明基因的序列信息可适当地选择，并可用常规方法合成。
如上所述，可用常规方法例如，通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法，如，双脱氧法〔美国国家科学院院刊，74，5463-5467(1977)〕或Maxam-Gilbert法〔酶学方法，65.，490(1980)〕进行。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等方便地进行。
根据普通的重组DNA技术，利用本发明的基因可以获得重组的细胞凋亡相关蛋白〔参见例如，科学，224，P，1431(1984)；生物化学与生物物理研究通讯.，130，P，602(1985)；美国国家科学院院刊，80，P，5990(1983)及上文引用的参考文献〕。更具体地说，所说细胞凋亡蛋白可按如下方法产生：制备可在宿主细胞中表达的重组DNA，将其导入宿主细胞中进行转化并培养所得到的转化子。
此处所用的宿主细胞可以是真核细胞或者原核细胞。所说的真核细胞包括脊椎动物细胞、酵母细胞等。脊椎动物细胞包括但不仅限于，这些常用的，如它属于猿细胞的COS细胞〔细胞，23，175-182(1981)〕，中国仓鼠卵巢细胞及其二氢叶酸还原酶缺陷突变体〔美国国家科学院院刊，77.，4216-4220(1980)〕。
用于脊椎动物细胞的表达载体可以是这样一种载体，它含有：通常位于所要表达基因上游的启动子，RNA剪切位点，多聚腺苷酸化位点，转录终止序列等，如果需要，它还可以带有复制起点。做为所说表达载体的实例，可以提到具有SV40早期启动子的pSV2dhfr等〔分子细胞生物学.，1，854-764〕。作为真核微生物，一般常使用酵母，在酵母中，优先使用属于酿酒酵母属的酵母。例如，在真核微生物如酵母中，表达载体可使用pAM82〔美国国家科学院院刊，80，1-5(1983)〕。该载体含有酸性磷酸酶基因的启动子等。
一般经常用作原核宿主的是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。当其之任一被在本发明的实践中用作宿主时，可使用从可在所说宿主微生物复制的质粒载体衍生而来的表达质粒。该载体含有启动子，位于本发明的基因上游的SD(Shine Dalgarno)序列和对蛋白质合成启始必须的以便使所说基因能在宿主微生物中表达的启始密码子(例如ATG)。大肠杆菌K12菌株等通常被用作宿主大肠杆菌，而pBR322及其修饰体通常被用作载体。但是，这些并不是排除其它选择。其它各种已知的菌株和载体也可使用。可用的启动子有，例如，色氨酸(trp)启动子，1pp启动子，lac启动子，PL/PR启动子等。
为了用这样得到的所需的重组DNA转化宿主细胞，可应用各种常规方法。获得的转化子可以用常规方法培养，并且培养导致了所需要的由本发明的基因所编码的细胞凋亡相关蛋白的表达和生产。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
在上面的方法中，所需的重组细胞凋亡相关蛋白被于细胞内，细胞外或在细胞膜上表达，产生和积聚或分泌。
如果需要，可利用其物理的、化学和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的细胞凋亡相关蛋白〔参见，“Seikagaku(生物化学)数据书II”，1175-1259页，第1版，第1次印刷，1980年6月23日由Tokyo Kagaku Dojin出版；生物化学，25(25)，8274-8277(1986)；欧洲生物化学杂志.，163，313-321(1987)等其它〕。此类方法的实例，更具体地说，可以提到，常规的重建处理，用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)，离心，渗透打击方法，超声处理，超离心，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术，透析和这些方法的结合。
本发明揭示了一种通过表达参与细胞凋亡过程的特异的基因并且足以阐明其新的功能的作用为基础的。
因此，本发明的基因在诊断和制药领域特别有用。
例如，以本发明所揭示的本发明的基因序列信息为基础，可用所说基因的部分或全部核苷酸序列对细胞凋亡相关基因在各种人组织的表达进行检测。这可用常规方法成功地进行实现，例如用RT-PCR进行RNA扩增〔Kawasaki，E.S.RNA的扩增。在PCR方法中，方法和应用指南，学术出版社公司，圣地亚哥，21-27(1991)〕或Northern印迹分析〔分子克隆，冷泉港实验室(1989)〕。
在各种细胞所诱导的细胞凋亡中细胞形态的变化可如下确定：通过例如细胞表面的凸起，显微检测台盼蓝染色的培养物可观察到的皱缩和光折射进行确定。另一方面，细胞凋亡中细胞内的变化可如下确定：通过观察涂片细胞的核膜周围染色质的凝集，核片段化等可在涂片上观察到的进行，涂片可用离心甩片法(Cytospin)，接着用其它细胞染色技术制备。
而且，细胞凋亡的诱导和抑制都可通过分析由核酸内切酶活性所产生的DNA片段化而确定。典型的该分析技术通常包括：在合适的含Tris-HCl，EDTA，SDS等的缓冲溶液中对组织匀浆，在蛋白酶K存在下温育匀浆物，用合适的溶剂提取得到的DNA。然后将DNA进行琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段化的存在。而且，可用合适的定量分析仪对片段化的DNA定量。
在使用PCR方法时，只要引物是与本发明的基因特异的并可专一特异性扩增本发明的基因，该引物可不限于任何具体的实例。因此，可以以本文公开的信息为基础对它们进行适当的选择。通常，按常规方法，它们具有长约20～30核苷酸长度的部分序列。
从而，本发明还提供了可用于检测细胞凋亡相关基因的引物和/或探针。
而且，可通过控制本发明基因的表达或相应的基因产物的活性而调节细胞凋亡，并且此类控制可用于治疗各种细胞凋亡相关的疾病。
在本发明的基因(产物)在参与或与各种病理状态或病理因素相关的组织和/或细胞中高水平表达的情况下，可通过抑制所述基因而诱导细胞凋亡。例如，在高水平表达本发明的基因的肿瘤中，可通过抑制该表达或者抑制基因产物的活性而在所说肿瘤中诱导预期的细胞凋亡。另一方面，在细胞凋亡可导致病理状态或作为致病因素，并且从而抑制细胞凋亡即意味着对病理状态的治疗时，可通过诱导或增强本发明基因的表达，或者通过维持基因产物的活性而阻止了本发明基因(产物)水平的降低，从而抑制了细胞凋亡。
作为上述细胞凋亡诱导更特异的事件，可以提到这样一件事，它包括在细胞和组织(靶细胞)中增强细胞凋亡相关基因的水平使之达一定的诱导阈值水平或达到一个转折点，在该点时本发明的细胞凋亡基因表达量为最大值，并且接着抑制该基因的表达水平使之低于阈值水平，从而可得到对细胞凋亡的有效的诱导。
在靶细胞中刺激细胞凋亡基因表达的因子可以是可以增强靶基因表达的任何药物并且其中包括类固醇。
作为抑制已是高水平表达的细胞凋亡相关基因时，可使用细胞凋亡相关基因的反义核苷酸序列。特定的实例是nbl基因的反义寡核苷酸。
可根据靶细胞类型分别选定目标细胞凋亡相关基因的诱导阈值表达水平，但当用下文提供的实例作为参考时，优选不低于其在正常组织细胞中mRNA表达水平的大约5倍。而且，优选对进行诱导用之细胞凋亡相关基因表达之抑制比其正常组织水平要低。
为了抑制上述的细胞凋亡相关基因的表达可使用细胞凋亡相关基因表达的蛋白之抗体或抗体片段。
可用任一种常规的方法对本发明基因的表达进行此类的抑制和诱导或增强。由于靶基因已被鉴定，本领域的技术人员可以方便地选择一个适当的方法。对于基因抑制可使用，例如，反义核苷酸方法，例如抑制mRNA翻译的方法〔科学，261.，1004-1012(1993)〕或抑制从DNA向RNA转录的三链螺旋方法〔生物技术动向.，10.，132-136(1992)〕等方法。对于本发明基因表达之诱导或增强，可应用通过病毒载体进行基因转移等〔科学，260，928-932(1993)〕。对于基因产物的活性抑制，优选使用上述的特异的抗体。
本发明因此进一步提供了控制细胞凋亡的方法，方法包括人工调节本发明的基因。
另一方面，本发明提供了细胞凋亡相关疾病的治疗剂或组合物以及治疗方法，该方法应用了细胞凋亡相关基因反义核苷酸或由细胞凋亡相关基因表达的蛋白质或者由细胞凋亡相关基因表面蛋白的抗体，或者所说抗体的片段。
根据本发明，提供了细胞凋亡相关基因并且该基因的使用使在各种组织中检测细胞凋亡相关基因的表达，或者应用基因工程技术产生细胞凋亡相关蛋白成为可能，从而所说基因和蛋白质可被用于诊断各种细胞凋亡相关疾病以及筛选和评价细胞凋亡诱导剂或抑制剂，并有很好的结果。
而且，有可能通过控制本发明基因的表达而诱导或抑制细胞凋亡。这在预防和治疗各种细胞凋亡相关疾病中是有用的。
附图简述
图1是实施例1-(5)-1)中通过研究地塞米松诱导的细胞凋亡中DNA片段化，nbl mRNA表达水平和myc mRNA表达水平而得到的结果的图示。
图2是本发明实施例1-(6)-4)中用ActD处理的HL-60细胞随时间的细胞存活率与细胞凋亡诱导的关系的图示。
图3是如在本发明的实施例1-(6)-5)中所研究的在ActD处理6和24小时后ActD对细胞存活率的影响的图示。
图4是根据本发明的实施例1-(6)-6)，在各种人细胞系中通过研究nbl mRNA组成性表达的水平与ActD处理诱导的DNA片段化之间的关系所得到的结果的图示。
图5是根据本发明的实施例1-(6)-7)通过研究各种人细胞系中在加入ActD 6小时之后残留的nbl mRNA的表达水平与DNA片段之间的关系而所得的结果的图示。
图6是根据本发明的实施例1-(6)-7)在各种人细胞系中nbl与myc mRNA半衰期比较结果的图示。
图7是根据实施例1-(6)-8)研究nbl反义寡聚物对HL-60细胞细胞凋亡和成活率的影响而得到结果之图示。
图8是在本发明的实施例1-(6)-8)nbl反义寡聚物对HL-60细胞细胞凋亡和存活率的温育时间及浓度依赖性作用的结果之图示。
图9是在本发明的实施例1-(6)-8)中nbl反义寡聚物所诱导的细胞凋亡形态和DNA片段化的图示。
实施本发明的最佳方式
下面的实施例将进一步说明本发明。实施例I(1)nbl cDNA的克隆
1)用胍-氯化铯法从Namalwa Burkit淋巴瘤细胞中提取了总RNA，并通过寡聚(T)-纤维素柱层析制备了poly(A+)RNA(分子克隆，pp.196-198，冷泉港实验室，1982)。
用反转录酶和DNA聚合酶I以寡聚(dT)为引物，从上面的poly(A)+RNA中制备了双链cDNA，并通过dC和dG加尾法进行cDNA克隆(分子克隆，pp.239-242，冷泉港实验室，1982)。
即，应用末端脱氧核苷酸转移酶在双链cDNA的3′端进行dC加尾。个别地，用限制酶Pst I切割质粒载体pBR322并用末端脱氧核酸转移酶在3′端进行dG加尾。由此得到的dC加尾的cDNA和dG加尾的pBR322进行退火并且退火的混合物被用于转化感受态大肠杆菌HB 101以产生1,700个四环素抗性克隆。
随机选择149个cDNA长度不小于0.3kb的克隆并用限制酶Hinf I切割。根据切割的片段带型为基础，选择最常见的cDNA克隆(从149克隆中选8个)并命名为“nbl”。在nbl克隆中，其长约为880bp的一个cDNA被命名为“Na 880”。
可确证所说Na 880克隆具有SEQ ID NO：3核苷酸序列中从65位核苷酸到3′末端的序列。
2)以寡聚(dT)为引物，用2μg上述的poly(A)+RNA合成了464ngcDNA〔cDNA Synthesis System Plus(Amersham)〕。
用商业试剂盒〔cDNA克隆系统λgt10衔接头法(Amersham)和Gigapack II Gold(Stratagene)〕从37ng cDNA中构建了λgt10cDNA文库。
应用该文库的110,000克隆，以大肠杆菌NM 154为宿主产生了噬菌斑并固定在Hybond N+滤膜(Amersham)上，接着在溶液中进行在65℃预杂交20小时，该溶液包含5×SSC〔SSC：150mM NaCl-15mM柠檬酸钠(pH7.0)〕，10×Denhardt’s液(Denhardt’s液：0.02％牛血清白蛋白-0.02％Ficoll-0.02％聚乙烯吡咯烷酮)，0.1％SDS和鲑精DNA。
进一步，在含5×SSC，10×Denhardt’s液，0.1％SDS，100μg/ml鲑精DNA和探针的溶液中于65℃杂交20小时。
所用探针是用Multi引物标记试剂盒(Amersham)标记的40ng的Na 880 DNA片段。
杂交之后，将滤膜在含2×SSC和0.1％SDS的溶液中室温15分钟漂洗2次并且在含0.1×SSC和0.1％SDS的溶液中于65℃30分钟再洗2次。
空气干燥后，将X光胶片(XAR-5；Kodak)对滤膜曝光。每个对应于胶片上阳性信号位置的噬菌斑区域被刮下来并悬在SM溶液中。应用该噬菌体溶液，在上述同样的条件下再次进行噬菌斑杂交。
用这种方法，分离了38个阳性克隆。这38个阳性克隆的每一个的一部分被于沸水浴中保温2分钟并且用λgt10引物和LA-PCR试剂盒(Takara Shuzo)进行总共30个循环的PCR，PCR操作条件为：94℃-30秒，55℃-30秒和72℃-30秒(在每个循环中延伸时间为4秒)。
将PCR产物进行氯仿抽提并且接着上1％琼脂糖凝胶电泳。挑选具有最长的cDNA的克隆，将插入的cDNA亚克隆到pUC 118的EcoRI位点中并且该插入cDNA的部分核苷酸序列由测序酶DNA测序试剂盒(USB)确定。
通过确定由此得到的对应于Na 880的全长克隆“nbl-8”的5′-和3′-区域，而得到了SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
(2)DNA片段化的分析：
在裂解缓冲液中〔50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，0.5％SDS〕将组织匀浆，接着在200μg/ml蛋白酶K的存在下在50℃温育过夜。在苯酚和氯仿抽提后，用乙醇沉淀DNA，RNase A去除RNA后，进行DNA片段化的分析。
将10μg DNA在含40mM Tris-乙酸(pH 7.8)和1mM EDTA的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳。用激光光密度测定来分析电泳后凝胶图片的负片对DNA片段化的程度进行定量。
(3)Northern印迹分析：
用一步提取法制备总RNA〔Anal.Biochem.，162，156-159(1987)〕，该法包括酸性硫氰酸胍苯酚，氯仿抽提。
即，用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)并将混合物摇荡离心。向离心得到的水相中加入异丙醇(1体积)并将混合物离心以得到RNA沉淀。
将得到的RNA沉淀用80％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。
用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％之琼脂糖凝胶进行总RNA的琼脂糖凝电泳。电泳之后，将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上。
用32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH 7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。
用〔α-32P〕脱氧腺苷三磷酸通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针如下：
nbl探针：Na 880的0.9kb Pst I片段；
myc探针：衍生自9kb人myc基因组克隆(Oncor Inc.)的1.3kbCla I-EcoR I片段；
杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于65℃漂洗30分钟，然后接着在0.1×SSC-0.1％SDS中于65℃洗30分钟。然后，使用增感屏在-70℃进行放射自显影。用杂交信号的相对强度激光光密度测定法定量，并且也可用Phosphor Imager分析进行定量。
(4)小鼠组织的细胞凋亡和nbl基因的表达
通过上述的DNA片段化分析法对各种正常小鼠组织和小鼠肿瘤组织进行检测。
获自4周龄小鼠(Balb/c，雄性)的小脑，胸腺，肺和肝脏组织被用做正常组织。
来源于用突变的人C-H-ras基因转化的小鼠NIH 3T3细胞的1-6和1-5个纤维肉瘤以及淋巴瘤细胞系AKR-2被用作肿瘤组织。
1-6和1-5纤维肉瘤被皮下接种在雄性裸鼠中。AKR-2腹膜内接种在AKR小鼠中。
在正常组织中没有观察到DNA片段化，但是在1-6纤维肉瘤肿瘤生长晚期和，在接种的多数结节中，还有生长早期都观察到了DNA片段化。在1-5纤维肉瘤中观察到了，较少，但仍清晰可见的DNA片段化。在AKR-2中也观察到了DNA片段化。
上述在(3)nbl基因在各种组织中的表达中描述的Northern印迹分析揭示了nbl基因在正常组织(小脑、肝脏、胸腺、肺)中表达水平低。相反的是，在纤维肉瘤1-5和AKR-2以及1-6的小结节中nblmRNA的表达是高的，其中细胞凋亡被诱导，并且在1-6的生长晚期nbl mRNA的表达有提高。
从以上的发现出发，可以认为nbl基因的表达与细胞凋亡过程相关，尽管nbl基因表达与DNA片段化之间的关系并不严格成比例。
(5)糖皮质激素诱导的细胞凋亡与nbl基因表达
1)将地塞米松(250μg)溶于PBS中并腹膜内给药给4周龄的雄性Balb/c小鼠。在给药之前(0小时)以及注射之后3、6、9、12、18、24和48小时，用前述的方法切除胸腺并进行DNA片段化分析。
还用上述的方法作了Northern印迹分析以检验nbl和myc mRNA的表达。
由此得到的结果总结于图1中。在图中，实心圆圈指DNA片段化的程度(％)，空心圆圈指nbl mRNA的水平，并且实心三角指mycmRNA的水平。
在地塞米松用药后9小时DNA片段化达到峰值，然后下降，并且在24小时之后几乎观察不到了。在地塞米松给药之后，nbl mRNA的表达显著增加，6小时时达到峰值，然后在接下来的3个小时中快速下降并且24小时时回复到未处理的小鼠胸腺中可观察到的水平。mycmRNA的表达在地塞米松用药之后下降，并且然后(9小时及以后)随DNA的片段化的减少而增加。
2)体内施用的放线菌素D立刻被特异的器官和肾脏吸收并排泄到尿中。结果是，放线菌素D的浓度很快就在给药之后下降到了有效水平之下。这表明在体内放线菌素D可被用作短期的有效的脉冲抑制剂。
因此，放线菌素D被用于检验是否上述和nbl mRNA的瞬时表达与地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡相关。
这样，将放线菌素D溶于水中，并且在地塞米松用药之前15分钟或者之后3小时，5.75小时，或8小时以1.5μg/克体重的剂量腹膜内给药。给与地塞米松后9小时切取胸腺，进行DNA片段化分析。
在地塞米松用药之后，5.5小时放线菌素D的施用导致对DNA片段化的强烈抑制。
另一方面，将放线菌素D与地塞米松同时给药或在地塞米松用药之后5.5小时施用放线菌素D。在地塞米松用药之后6小时，切除胸腺并分析nbl mRNA的表达。
地塞米松用药之后5.5小时施用放线菌素D抑制了nbl mRNA的表达。因此，可以认为nbl基因的瞬时表达与糖皮质激素诱导的体内胸腺细胞凋亡相关。
3)上面的发现表明如下：
因此，在类固醇药物地塞米松用药所诱导的小鼠胸腺细胞凋亡中，可在nbl基因的瞬时表达(瞬时快速增加和随后的减弱)之后看到细胞凋亡的特征标记即DNA片段化。该结果提示在导致细胞凋亡的过程中需要nbl基因(基因产物)的暂时性的参与。
在正常组织中，nbl基因的表达水平很低，其中在许多肿瘤组织和肿瘤细胞中，所说基因的表达水平是高的。这提示表明有高水平nbl基因表达的肿瘤组织和细胞处于一种上述瞬时nbl基因表达在导致细胞凋亡的过程中处于其峰值时的状态，并且如果维持该基因的高表达，即不能引起对细胞凋亡的诱导。因此，可以预料可通过在肿瘤组织和细胞中抑制nhl基因的高表达而在肿瘤组织和细胞中诱导细胞凋亡，正如胸腺细胞凋亡的情形一样。(6)各种细胞系中细胞凋亡的诱导和组成性nbl表达水平之间的关系1)人组织和细胞培养
早幼粒白血病细胞系HL-60〔Collins，S.I.，等.，自然，270.，347-349(1979)〕，组织细胞样白血病细胞系U937〔Sundstrom，C.，等.，国际癌症杂志，17，565-577(1976)〕，和浆细胞瘤细胞系HS-Sultan。〔Harris，N.S.，自然，250，507-509(1974)〕被分别于37℃培养在1640培养基中〔Gibco.BRL；Gaithersburg，MD，USA〕，其中培养基中含有10％FCS(胎牛血清；CSL；Melborune，澳大利亚)，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素，和100μg/ml链霉素。
另外，T-淋巴母细胞白血病细胞系Jurkat〔Gillis，S.和Watson，J.，实验医学杂志。152.，1709-1719(1980)〕被于37℃培养在添加有0.05M β-巯基乙醇的上述培养基中。
膀胱癌细胞系5637〔Welto，K，等.，美国国家科学院院刊，82，1526-1530(1985)〕和肝癌细胞系HepG2〔Aden，D.P.，等.，自然，282，615-616(1979)〕被分别于37℃培养在添加有20％FCS，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和修饰的氨基酸和修饰的维生素(ICN悉尼，澳大利亚)的MEM中。
WISH羊膜细胞系〔Hayflick，L.，实验细胞研究.，23，14(1961)〕和Chang肝细胞系〔Chang，R.S.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，87，440(1954)〕被于37℃培养在含有10％FCS，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，和100μg/ml链霉素的MEM中。
在用于这些实验之前，将悬浮细胞以5×105细胞/ml悬于新鲜培养基中。对于贴壁细胞，在细胞汇合至70-80％时加入新鲜培养基。
将放线菌素D(以后称为ActD，Sigma，圣路易斯，MO，美国)溶于水中至200μg/ml的浓度并以下文所出现的实施例中所示的浓度加入到培养物中。在用ActD或不用ActD培养之后，离心收集悬浮细胞，而从用胰蛋白酶处理贴壁细胞和培养基中收获贴壁细胞。以排出台盼蓝的能力评价细胞的存活率。通过显微检验台盼蓝处理的细胞培养物以及或者常规的吉姆萨染色涂片样品或者由细胞离心甩片而得到的涂片样品而进行细胞形态学的评价。
人胎盘组织获自澳大利亚堪培拉，Woden Valley医院。2)cDNA探针
除了实施例1-(3)中所述的nbl知myc探针之外，还使用了下面的探针。
18S核糖体DNA探针：
一种源自质粒Pxlr14F(Maden，B.E.H.，自然，288.，293-296(1980)的0.97kb Pst I片段。
遍在蛋白探针：
一种人UbB基因〔Baker，R.T和Board，P.G.，核酸研究.，15，443(1987)〕的1.04kb Dra I-BamH I片段。
而且，从Clonetech(Palo Alto CA，美国)购买了1.0kb的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA。
人β-肌动蛋白是源自质粒pHFβA-3′UT-HT〔Ponte，P.，等，分子细胞生物学，3，1783-1791(1983)〕的0.4kb EcoR I片段。3)RNA和DNA的分离和分析
以上文(3)中所说同样的方式进行RNA的分离和Northern印迹分析〔Naora，H.，等.，免疫学杂志.，152.，5691-5702(1994)〕。
用Phosphor Imager分析(Molecular Dynamic；Sunny Valley，CA，USA)对Northern印迹上杂交信号的相对程度进行定量。
用上文(2)中所述的技术〔Naora，H.，等.，免疫学，85，63-68(1995)〕在琼脂糖凝胶上进行染色体DNA的分离和DNA片段化的定量。4)用ActD在HL-60细胞系中诱导细胞凋亡
HL-60细胞系是用作研究由抑制基因表达而诱导之细胞凋亡的模型系统。
在该模型系统中，细胞凋亡被转录抑制剂ActD强烈地诱导〔Martin，S.J.等.，免疫学杂志.，145，1859-1867(1990)；Naora，H.，B.B.R.C.，211，491-496(1995)〕。
在预实验中，通过对台盼蓝染色的培养物的显微检验而探索了诱导细胞凋亡的最佳条件。在用1μg/ml ActD处理6小时之后，大约一半的HL-60细胞有显著的皱缩，形成了相当的突起或有相当的折光率。这些细胞在相当晚的时期保持膜的完整性，并可外排台盼蓝染料，这是细胞凋亡细胞所要求的特征之一〔Wyllie，B.H.等.，Int.Rev.Cytol.，68，251-306(1980)〕。
而且，正如以前所报道的一样，在细胞表面出现了显示典型的细胞凋亡因素的过程〔Tanaka，Y.，等，实验细胞学研究.，213，242-252(1994)〕。
细胞凋亡形态学的评定方法得到了在上述几个系统中所得到的证据的支持。如Matsubara及其同事所报道的〔Matsubara，K.，等.，实验细胞学研究.，213，412-417(1994)〕，在吉姆萨染色的细胞样品中在核膜附近或者细胞内物质中观察到了染色质浓集。细胞凋亡形态学的时间进程与核小体间DNA片段化的时间进程高度相关。当细胞被培养了3、6、9、12和18小时之后，用1μg/ml ActD处理6小时后核小体间DNA片段化的诱导达最大值。延长处理时间超过6小时导致“DNA梯子”带型和细胞存活率的减小。0.5-10μg/ml浓度ActD的培养可以有节制地增加在6小时时有细胞凋亡形态的细胞的比例以及“DNA梯子”形成的程度。
这些结果在图2中进行了图示说明。
图2是通过用ActD HL-60细胞中诱导细胞凋亡所得到的结果的图示，其中空心圆圈表示处理的HL-60细胞，实心圆圈指在ActD(1μg/ml)的存在下培养的HL-60细胞，并且实心三角形表示这些在ActD(5μg/ml)的存在下培养的细胞。该图示凋亡细胞的比例和细胞的存活率(％)(纵轴)对达24小时的培养时间(横轴)的作图。通过外排台盼蓝染料的能力评估细胞的存活率(存活比例)并且凋亡细胞的比例是根据表明有为凋亡细胞形态之一的表面凸起，细胞皱缩和高折射率的细胞对无此类特征的细胞的比例而评估的。
在图2中还表明，在1-5μg/ml之内ActD浓度的增加对凋亡形态学的诱导的时间进程没有任何显著性的影响。在“DNA梯子”形成的时间进程中也未发现有变化。
因此，在测试条件中，使用了在1μg/ml ActD的存在下培养6小时。除非特别指出，在后续的试验中使用上述的条件。5)ActD在其它细胞系中诱导细胞凋亡
研究了ActD在其它人细胞系中诱导细胞凋亡的能力被调研，在用(+)或不用(-)ActD(1μg/ml)培养6小时和24小时之后评价了培养物中细胞的存活率(数据示于图3中)。而且，分别分析了从每个用或不用1μg/ml或10μg/ml ActD培养0、6和24小时之后所分离的DNA和RNA。
研究所用细胞存活率得到的结果示于图3中，如人细胞系HL-60，HS-Sultan，Jurkat，U937，5637，Chang，WISH和HepG2。在图中，培养6小时之后培养物中细胞的存活率如左柱所示，而培养24小时后细胞的存活率如右柱所示。实心和点状棒图分别代表在存在和不存在ActD时所获得的结果。
ActD处理T淋巴母细胞白血病细胞Jurkat和组织细胞白血病细胞系U937可基本上在这些细胞中诱导核小体间的DNA片段化。但是，诱导的程度低于在HL-60细胞所诱导的。而且，对细胞存活率没有发现有显著的影响。
在HS-Sultan中，在同样的条件下，尽管较少，但仍诱导了相当程度的“DNA梯子”的形成。在这些细胞中“DNA梯子”的形成与细胞皱缩，折射率特征，以及台盼蓝的外排相关。延长处理达24小时使这些细胞的存活率下降。
细胞对ActD诱导的细胞凋亡的敏感性不局限于来源于造血系统的细胞和悬浮细胞培养物。在使用人贴壁细胞的试验中，对从胰蛋白酶处理的单层和培养基中收集的细胞之DNA进行了分析。
用不同于悬浮细胞所用的标准对细胞凋亡形态学进行了研究。
其它的研究说明了在贴壁细胞类型中早期的细胞凋亡包括逐渐变圆和细胞彼此之间脱离，但并不从瓶壁脱离并且报道了23-50kb的大的DNA片段的出现〔Desjardins，L.M.和MacManus，J.P.，Exp.Cell.Res.，216.，380-387(1984)〕。
随着细胞凋亡进展，细胞开始皱缩并从培养瓶上脱离下来并且含有“DNA梯子”〔Desjardins，L.M.和MacManus，J.P.，Exp.Cell.Res.，216，380-387(1984)；Kanter.P.，等.，B.B.R.C.，118，392-399(1984)〕。
膀胱癌细胞系5637在ActD的存在下培养6小时表明有相当量的核小体间DNA片段化。
这发现与漂浮细胞的出现相关。仍与培养瓶壁相粘连的5637细胞，表现出“变圆”的表型并且彼此之间是分离的。
Chang肝细胞含较少程度的“DNA梯子”。
相反，即使用，例如10倍高浓度的ActD处理6小时，WISH猿细胞和肝癌HepG2细胞都没有核小体间DNA片段化出现。对这二种细胞系，与其未处理的对照相比，较少看到其形态学上的变化。
在用ActD处理24小时之后，WISH表明基本丧失了存活性(图3)并且几乎所有的细胞都是漂浮的，如在5637细胞和Chang细胞培养中所见到的一样。
但是，WISH细胞表现出与“DNA梯子”不同的“涂片”样DNA带型。这带型提示这些细胞可能以一种不同于已在5637和Chang细胞和其它贴壁细胞系中观察的死亡过程的过程死亡〔Desjardins，L.M.和MacManus，J.P.，Exp.Cell.Res.，216，380-387(1985)；Kanter，P.，等.，生物化学与生物物理研究通信.，118.，392-399(1984)〕。
同样地，大多数HepG 2细胞在用ActD处理24小时之后是自由漂浮的，并且表明为“涂片”DNA带型而不是“DNA梯子”。但是，漂浮的HepG2细胞更“圆”并且这些细胞比WISH细胞存活性更强(图3)。6)组成性nbl表达水平和细胞凋亡诱导
通过PhosphorImager分析对各种人细胞系中组成性nbl表达水平进行了测定。
如实施例1-(4)所证明的，正常小鼠组织例如小脑、肝脏和肺具有低水平的nbl mRNA。
在该试验中，正常人胎盘中的nbl mRNA的水平被用作比较各种细胞系中相对的nbl mRNA水平的标准。
结果如图4所示。在该图中，对每个细胞系上DNA片段化的程度(％)为横轴对组成性nbl mRNA表达水平为纵轴进行作图。
每个细胞系中nbl mRNA的水平代表相对于人胎盘中nbl mRNA水平的表达量并且该值用RNA含量进行校正。例如，在给定的细胞系(C)中组成性nbl mRNA的水平计算自(Nc/Np)×(Rp/Rc)。Nc和Np分别代表测试细胞系C和胎盘中nbl杂交信号的强度，并且Rc和Rp分别代表测试细胞系C和胎盘中18sr RNA杂交信号的强度。
如方法所述对用ActD(1μg/ml)处理6小时之后的DNA的片段化程度进行定量，并且以在未处理细胞中所检测到的低基础水平DNA片段化上的增加表示。
组成性nbl mRNA水平被以3-4重复试验的平均值±SD的形式表达，并且将值对DNA片段化的增加值作图。
如点线所示表明当nbl在阈值水平之上组成性表达时发生了ActD诱导的细胞凋亡。
从上面的图中可以显而易见在未处理的HL-60和HS-Sultan细胞系中组成性nhl mRNA水平分别是在人胎盘中所检测水平的26和57倍高。
在Chang，U937，5637和Jurkat细胞系中，组成性nbl mRNA的水平也相对较高，大约是胎盘水平的8～14倍。
在WISH细胞系中，nbl mRNA的水平很低并且HepG 2细胞系中其水平比胎盘水平低。
一般说来，有较高水平的组成性nbl表达的细胞倾向于更大程度对ActD反应而显示典型的细胞凋亡形态学和核小体间DNA片段化。
在图4中还可看到有相对低的组成性nbl表达水平的细胞，例如WISH和HepG 2细胞系，不显示任何程度的典型的细胞凋亡形态或“DNA梯子”形成只是仅在延长ActDP处理时表现出“涂片”DNA带型。
组成性nbl表达水平和细胞凋亡诱导之间不是严格成比例的但是细胞对ActD诱导的细胞凋亡的敏感性看来在启始时包含一定阈值之上的高的组成性的nbl表达水平。阈值mRNA水平看来是人胎盘nbl mRNA水平的约5到6倍。7)细胞诱导凋亡和nbl表达的抑制
在该试验中，用PhosphorImager分析对加入ActD(1μg/ml)6小时之后细胞中残留的nbl mRNA的水平进行测定并且该值以相对于人胎盘nbl mRNA水平的形式表达。结果如图5所示。
应该指出，如图4中的情况，将上述的残留值用RNA含量校正并且，然后，对加入ActD 6小时后所诱导的DNA片段化的增加作图。残留的nbl mRNA水平以3-4次重复试验的平均值±标准差值表示。在该图中，点线代表统计学上计算的回归曲线并且Δ代表由外推(0.12)当在凋亡细胞中所有的DNA都片段化时，所得到的nbl mRNA的水平。
从图5中可以看到在ActD处理6小时之后，几乎检测不到nbl的转录。尽管比HL-60细胞系中的程度较低，在HS-Sultan，Chang，U937，和Jurkat细胞系中也观察到了对ActD反应而引起的nbl表达的下降。在WISH细胞中，nbl mRNA水平的变化几乎可以忽略不计。
另一方面，甚至在高浓度ActD时也未发现在HepG 2细胞中有nbl表达的显著下降。更且，在WISH细胞和HepG 2细胞系中，只在延长ActD处理时(长达24小时)才发现有nbl的表达。但是，该减少跟稳定的mRNA例如β-肌动蛋白〔Naora，H.，生物化学与生物物理研究通讯.，211，491-496(1995)〕和甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA的水平下降是一致的。
一般说来，有高的组成性nbl表达水平的细胞不仅表现出很高程度的对ActD反应的典型地细胞凋亡形态和“DNA梯子”形成，而且倾向于表现为ActD对nbl表达较大的抑制。
但是，作为对该关系的明显例外，有高水平组成性nbl表达的HS-Sultan细胞系在加入ActD之后表明有相对大的nbl mRNA水平的下降。但是，当与在Jurkat，U937和其它细胞系中所观察到的“DNA梯子”形成的量比较时，ActD在HS-Sultan细胞中诱导的核小体间DNA片段化程度不高，其它Jurkat，U937和其它细胞系表明其组成性的nbl表达水平和nbl抑制的程度比在HS-Sultan细胞系中所观察到的组成性nbl表达水平和nbl抑制程度较低。
当与表明有更大量的“DNA梯子”形成的HL-60，Jurkat，U937，和其它细胞系中残留的nbl mRNA水平比较时，在用ActD处理6小时之后在HS-Sultan细胞系中所检测的残留的nbl mRNA水平仍然很高(图5)。ActD所诱导的nbl表达水平从高的启始的组成性nbl表达水平的下降被认为是核小体间DNA片段现象中的一个重要因素。
上述的结果表明了对高的组成性nbl表达的抑制和ActD诱导的细胞凋亡诱导之间的关系。ActD对各种细胞系的不同作用并不是因为ActD有效穿透或者在不同细胞类型中抑制转录的能力不同而引起的可能的变化。
首先，不仅在悬浮细胞而且在贴壁细胞中诱导了不同程度的细胞凋亡和nbl表达的改变。
其次，在ActD处理之后所观察到的myc mRNA水平的下降在不同的细胞系之间并无显著变化，这些细胞系表明在nbl表达变化和DNA片段化程度上基本上不同。
图6是HL-60，Chang和WISH细胞系中nbl.和myc mRNA的半衰期的图示，这是从通过对RNA的Northern印迹上nbl和myc mRNA杂交信号的PhosphorImger分析所计算的回归曲线估测而来的。这些RNA分离自用ActD(5μg/ml)温育0、1、2、3、4.5和6小时的细胞。
在这些细胞中所测定的myc mRNA的半衰期与所报道其它细胞类型中的数值一致〔Rabbitts，P.H.，等.，欧洲分子生物学联合会杂志，4，3727-3733(1985)〕。
在对ActD处理只表现最低的细胞凋亡诱导的HepG 2细胞系的情况下，极低的myc mRNA水平使之很难测定ActD诱导的对myc mRNA水平的抑制。因此，检测了在这些细胞系中是否myc之外的其它基因的表达被ActD抑制。
发现在HepG 2细胞系中ActD诱导的对主要的遍在蛋白转录水平的抑制程度几乎与HL-60细胞系中相同。表明ActD对HepG 2细胞系中也一样有效。8)nbl反义寡核苷酸对细胞凋亡诱导的特定作用
为了分析是否在高的nbl表达抑制和细胞凋亡诱导之间是否有特定的因果关系和是否nbl表达的抑制只与细胞凋亡诱导相关或者是所诱导的细胞凋亡的结果，在其它研究常用的浓度和时间范围之内用nbl反义寡聚物温育HL-60细胞〔Shi，Y.，等.，科学，257，212-214(1992)；Kimura，S.，等.，癌症研究.，55，1379-1384(1995)〕。
使用了生物分子原料实验室(澳大利亚国立大学，堪培拉)合成并以反相HPLC纯化的硫代硝酸酯寡核苷酸。
nhl反义寡聚物的序列与如SEQ ID NO：4中所示的nbl mRNA的ATG起始密码子和下游的四个密码子互补。
作为对照，使用了SEQ ID NO：5的寡聚物，它包含作为反义nbl寡聚物同样寡核苷酸组成的随机序列。
另外，试验中还使用了含有nbl mRNA起始密码子和下游4个密码子的序列的nbl正义寡聚物。
将寡聚物溶于水中，并以20μM的终浓度向96孔微量滴定板中的以1×105细胞/ml重悬在新鲜培养基中的细胞中加入寡聚物，并将板温育2小时。
结果如图7所示。
图7是nbl反义寡聚物的对HL-60细胞细胞凋亡和存活率的作用的图示，其中空心棒图代表不存在任何寡聚物时的HL-60细胞实心棒图代表存在20μM nbl反义寡聚物时的同样的细胞，而点状棒图代表在20mM随机寡聚物存在下的同样的细胞。
对表明有凸起、皱缩和外表看来可折射的凋亡细胞数(a)和非存活细胞数(b)进行计数。两个试验的结果以平均值±SD来表示。
在nbl反义寡聚物的存在下培养的HL-60细胞是皱缩和可折射的并且带有许多前述的细胞凋亡特征的凸起特征。还观察到了对应的非存活细胞的增加。
而且，凋亡细胞和非存活细胞被以一种时间和nbl反义寡聚物浓度依赖的方式诱导出现。
图8示上述的发现。
图8a)示当在不存在任何的寡聚物时以图6同样的条件培养1、2、3天HL-60细胞非存活细胞加上凋亡细胞的总数(A)，20μM nbl反义寡聚物(实心圆圈)存在时的总数，或者20μM随机寡聚存在时(空心圆圈)的总数。
图8b)分别表示nbl反义寡聚物(实心圆圈)或随机寡聚物(空心圆圈)存在下培养2天后，凋亡和非存活的HL-60细胞的总数。
从图8a)和b)明显看见，凋亡细胞和非存活细胞被nbl反义寡聚物以浓度和时间依赖的方式诱导出现。
相反，在具有与nhl反义寡聚物同样的核苷酸组成的随机序列的存在下培养的HL-60细胞，在形态学和存活率上与不存在任何寡聚物时培养的HL-60细胞没有显著性差异。
在含有ATG起始密码子和下游4个密码子的nbl正义寡聚物的存在下进行培养得到与使用随机序列寡聚物时所观察到的结果相似。
另外对当HL-60细胞在nbl反义寡聚物存在下培养时，是否可在HL-60细胞中诱导DNA片段化进行了进一步的研究，对该研究，考虑到寡聚物试验的小细胞群体，根据Kimura及其合作者通过用末端脱氧核苷酸转移酶对DNA的游离3′-OH末端进行标记而对DNA断裂进行检测的方法〔Kimura，S.，等.，癌症研究.，55，1379-1384(1995)〕。
用冷的10％三氯乙酸在硝酸纤维素滤膜上沉淀和收集带有标记DNA的细胞。通过闪烁计数测定DNA片段的程度。在不存在任何寡聚物或在20μM nbl反义寡聚物的存在下或20μM随机寡聚物的存在下将HL-60细胞培养2天。然后用Groezyca等的方法将细胞固定在甲醛中〔Gorczyca，W.，等.，癌症研究.，53，1945-1951(1993)〕。
分离的染色体DNA游离的3′-OH末端也用3′-端DNA标记试剂盒进行了标记(Boehringer-Mannheim，Germany)、将标记的DNA在6％聚丙烯酰/8M尿素凝胶上进行电泳并且通过用PhosphorImager对于胶上放射性标记的DNA带型分析而确定片段化的程度。
结果显示：在不存在寡聚物和在随机寡聚物的存在下培养的HL-60细胞中所检测的DNA片段化的量之间没有显著性差异。相反，在nbl反义寡聚物的存在下，HL-60细胞在培养2天之后，DNA片段化的程度增加4倍。通过标记分离的染色体DNA中的片段所观察到的DNA片段化与通过原位标记固定的细胞所得到的结果相似。因此，这提示nbl反义寡聚物特异性地诱导凋亡形态和DNA片段化的出现并且导致HL-60细胞存活性的丧失。
上述的结论见于图9，表示由nbl反义寡聚物诱导的DNA片段化。图9是在不存在任何寡聚物(空心棒)或在20μM反义寡聚物(实心棒)存在时或在20μM随机寡聚物(点状棒)存在下，将HL-60细胞培养2天的凋亡细胞和非存活细胞的合并总数。用末端脱氧核苷酸转移酶放射性标记的分离的染色体DNA的片段化程度如图9-b所示。结果以平均值±SD表示。
工业应用性
本发明的细胞凋亡相关基因可通过对其表达的适当调节而能够诱导或抑制对细胞凋亡的诱导并且从而能够被有效地用于其它申请中的癌症治疗。
序列表(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：264个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)SEQ ID NO：1序列描述：Met Ala Val Gly Lys Asn Lys Arg Leu Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly 1 5 10 15Ala Lys Lys Lys Val Val Asp Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp
20 25 30Val Lys Ala Pro Ala Met Phe Asn Ile Arg Asn Ile Gly Lys Thr Leu
35 40 45Val Thr Arg Thr Gln Gly Thr Lys Ile Ala Ser Asp Gly Leu Lys Gly
50 55 60Arg Val Phe Glu Val Ser Leu Ala Asp Leu Gln Asn Asp Glu Val Ala 65 70 75 80Phe Arg Lys Phe Lys Leu Ile Thr Glu Asp Val Gln Gly Lys Asn Cys
85 90 95Leu Thr Asn Phe His Gly Met Asp Leu Thr Arg Asp Lys Met Cys Ser
100 105 110Met Val Lys Lys Trp Gln Thr Met Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys
115 120 125Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Leu Phe Cys Val Gly Phe Thr Lys
130 135 140Lys Arg Asn Asn Gln Ile Arg Lys Thr Ser Tyr Ala Gln His Gln Gln145 150 155 160Val Arg Gln Ile Arg Lys Lys Met Met Glu Ile Met Thr Arg Glu Val
165 170 175Gln Thr Asn Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp Ser
180 185 190Ile Gly Lys Gly Ile Glu Lys Ala Cys Gln Ser Ile Tyr Pro Leu His
195 200 205Asp Val Phe Val Arg Lys Val Lys Met Leu Lys Lys Pro Lys Phe Glu
210 215 220Leu Gly Lys Leu Met Glu Leu His Gly Glu Gly Ser Ser Ser Gly Lys225 230 235 240Ala Thr Gly Asp Glu Thr Gly Ala Lys Val Glu Arg Ala Asp Gly Tyr
245 250 255Glu Pro Pro Val Gln Glu Ser Val
260(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：792碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：CDS
(xi)SEQ ID NO：2序列描述：ATGGCGGTTG GCAAGAACAA GCGCCTTACG AAAGGCGGCA AAAAGGGAGC CAAGAAGAAA 60GTGGTTGATC CATTTTCTAA GAAAGATTGG TATGATGTGA AAGCACCTGC TATGTTCAAT 120ATAAGAAATA TTGGAAAGAC GCTCGTCACC AGGACCCAAG GAACCAAAAT TGCATCTGAT 180GGTCTCAAGG GTCGTGTGTT TGAAGTGAGT CTTGCTGATT TGCAGAATGA TGAAGTTGCA 240TTTAGAAAAT TCAAGCTGAT TACTGAAGAT GTTCAGGGTA AAAACTGCCT GACTAACTTC 300CATGGCATGG ATCTTACCCG TGACAAAATG TGTTCCATGG TCAAAAAATG GCAGACAATG 360ATTGAAGCTC ACGTTGATGT CAAGACTACC GATGGTTACT TGCTTCGTCT GTTCTGTGTT 420GGTTTTACTA AAAAACGCAA CAATCAGATA CGGAAGACCT CTTATGCTCA GCACCAACAG 480GTCCGCCAAA TCCGGAAGAA GATGATGGAA ATCATGACCC GAGAGGTGCA GACAAATGAC 540TTGAAAGAAG TGGTCAATAA ATTGATTCCA GACAGCATTG GAAAAGGCAT AGAAAAGGCT 600TGCCAATCTA TTTATCCTCT CCATGATGTC TTCGTTAGAA AAGTAAAAAT GCTGAAGAAG 660CCCAAGTTTG AATTGGGAAA GCTCATGGAG CTTCATGGTG AAGGCAGTAG TTCTGGAAAA 720GCCACTGGGG ACGAGACAGG TGCTAAAGTT GAACGAGCTG ATGGATATGA ACCACCAGTC 780CAAGAATCTG TT 792(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：898碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vii)直接来源：
(A)文库：人cDNA
(B)克隆：nbl
(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：34..825(xi)SEQ ID NO：3序列描述：TTTTTTTTTT TTTTTGGCTC TCTGACCAGC ACC ATG GCG GTT GGC AAG AAC AAG 54
Met Ala Val Gly Lys Asn Lys
1 5CGC CTT ACG AAA GGC GGC AAA AAG GGA GCC AAG AAG AAA GTG GTT GAT 102Arg Leu Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly Ala Lys Lys Lys Val Val Asp
10 15 20CCA TTT TCT AAG AAA GAT TGG TAT GAT GTG AAA GCA CCT GCT ATG TTC 150Pro Phe Ser Lys Lys Asp Trp Tyr Asp Val Lys Ala Pro Ala Met Phe
25 30 35AAT ATA AGA AAT ATT GGA AAG ACG CTC GTC ACC AGG ACC CAA GGA ACC 198Asn Ile Arg Asn Ile Gly Lys Thr Leu Val Thr Arg Thr Gln Gly Thr 40 45 50 55AAA ATT GCA TCT GAT GGT CTC AAG GGT CGT GTG TTT GAA GTG AGT CTT 246Lys Ile Ala Ser Asp Gly Leu Lys Gly Arg Val Phe Glu Val Ser Leu
60 65 70GCT GAT TTG CAG AAT GAT GAA GTT GCA TTT AGA AAA TTC AAG CTG ATT 294Ala Asp Leu Gln Asn Asp Glu Val Ala Phe Arg Lys Phe Lys Leu Ile
75 80 85ACT GAA GAT GTT CAG GGT AAA AAC TGC CTG ACT AAC TTC CAT GGC ATG 342Thr Glu Asp Val Gln Gly Lys Asn Cys Leu Thr Asn Phe His Gly Met
90 95 100GAT CTT ACC CGT GAC AAA ATG TGT TCC ATG GTC AAA AAA TGG CAG ACA 390Asp Leu Thr Arg Asp Lys Met Cys Ser Met Val Lys Lys Trp Gln Thr
105 110 115ATG ATT GAA GCT CAC GTT GAT GTC AAG ACT ACC GAT GGT TAC TTG CTT 438Met Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu120 125 130 135CGT CTG TTC TGT GTT GGT TTT ACT AAA AAA CGC AAC AAT CAG ATA CGG 486Arg Leu Phe Cys Val Gly Phe Thr Lys Lys Arg Asn Asn Gln Ile Arg
140 145 150AAG ACC TCT TAT GCT CAG CAC CAA CAG GTC CGC CAA ATC CGG AAG AAG 534Lys Thr Ser Tyr Ala Gln His Gln Gln Val Arg Gln Ile Arg Lys Lys
155 160 165ATG ATG GAA ATC ATG ACC CGA GAG GTG CAG ACA AAT GAC TTG AAA GAA 582Met Met Glu Ile Met Thr Arg Glu Val Gln Thr Asn Asp Leu Lys Glu
170 175 180GTG GTC AAT AAA TTG ATT CCA GAC AGC ATT GGA AAA GGC ATA GAA AAG 630Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp Ser Ile Gly Lys Gly Ile Glu Lys
185 190 195GCT TGC CAA TCT ATT TAT CCT CTC CAT GAT GTC TTC GTT AGA AAA GTA 678Ala Cys Gln Ser Ile Tyr Pro Leu His Asp Val Phe Val Arg Lys Val200 205 210 215AAA ATG CTG AAG AAG CCC AAG TTT GAA TTG GGA AAG CTC ATG GAG CTT 726Lys Met Leu Lys Lys Pro Lys Phe Glu Leu Gly Lys Leu Met Glu Leu
220 225 230CAT GGT GAA GGC AGT AGT TCT GGA AAA GCC ACT GGG GAC GAG ACA GGT 774His Gly Glu Gly Ser Ser Ser Gly Lys Ala Thr Gly Asp Glu Thr Gly
235 240 245GCT AAA GTT GAA CGA GCT GAT GGA TAT GAA CCA CCA GTC CAA GAA TCT 822Ala Lys Val Glu Arg Ala Asp Gly Tyr Glu Pro Pro Val Gln Glu Ser
250 255 260GTT TAAAGTTCAG ACTTCAAATA GTGGCAAATA AAAAGTGCTA TTTGTGAAAA 875ValAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 898(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：15个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：CDS
(xi)SEQ ID NO：4序列描述：
CTTGCCAACC GCCAT 15(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：15个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：CDS
(xi)SEQ ID NO：5序列描述：
TCCAAGCCTT ACGCC 15