鹧鸪麻中环阿尔廷型三萜及制备方法和用途.pdf

本发明提供一种鹧鸪麻总三萜化合物，主要含有五种环阿尔廷型三萜化合物，鹧鸪麻总三萜通过醇提或回流、减压浓缩得浸膏，再将浸膏进行前处理后上大孔树脂进行分离，先后以水及30％醇洗脱除去杂质，再以60-100％醇洗脱，收集这部分洗脱液后浓缩，得鹧胡麻总三萜，再经过多级色谱分离获得五种环阿尔廷型三萜化合物。本发明提供的鹧鸪麻总三萜及五种阿尔廷型三萜化合物，对呋喃妥因诱导的人肝癌细胞株Hep G2细胞毒具有强效保护作用，提示该类化合物具有潜在的保肝价值，可在制备保护肝细胞药物中的应用。本发明首次从鹧胡麻中制备了环阿尔廷型三萜化合物，并提供了一种设计合理，简便实用的制备方法。

权利要求书
1.  一种鹧鸪麻总三萜化合物，主要含有以下1-5种环阿尔廷型三萜化合物，其中化合物1-4的结构式分别为：

化合物1：R＝β-OMe
化合物2：R＝β-OH
化合物3：R＝α-OH
化合物4：

2.  根据权利要求1所述的鹧鸪麻总三萜化合物的制备方法，其特征在于通过以下步骤实现：(1)提取：取鹧鸪麻枝叶，干燥，粉碎后按重量/体积比药材：溶剂为1∶6-10加入醇，室温浸提或回流提取2-3次，至提取物颜色较浅，合并提取液，减压浓缩得浸膏，(2)分离：将步骤(1)获得的浸膏进行前处理后上大孔树脂进行分离，先后以水及30％醇洗脱除去杂质，再以60-100％醇洗脱，收集这部分洗脱液后浓缩，得鹧胡麻总三萜，
所述步骤(2)的前处理方法为将此浸膏用≤30％的低浓度醇溶解后上大孔树脂，其中所用的醇是甲醇或乙醇。

3.  根据权利要求2所述的鹧鸪麻总三萜化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的前处理方法为将减压浓缩得到的浸膏用水混悬溶解，用有机溶剂萃取2-3次，经溶剂回收后，再用≤30％的低浓度醇溶解，上大孔树脂，其中所用的有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、氯仿或正丁醇中的一种，所用的醇是甲醇或乙醇。

4.  根据权利要求2所述的鹧鸪麻总三萜化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的前处理方法为将此浸膏直接与大孔树脂拌样，加入至大孔树脂柱顶端。

5.  根据权利要求1所述的五种环阿尔廷型三萜化合物的制备方法，其特征在于通过以下步骤实现：取权利要求2-4任一所述方法获得的鹧胡麻总三萜，与硅胶或氧化铝拌样，加入装有硅胶或氧化铝的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇系统洗脱，氯仿∶甲醇80∶1极性段洗脱，经重结晶后得到化合物1；以氯仿∶甲醇60∶1极性段洗脱，经MCI柱层析，以水∶甲醇80∶20洗脱后得到化合物2与3的混合物；氯仿∶甲醇50∶1极性段洗脱，洗脱液收集后用Sephadex凝胶色谱纯化，以甲醇为洗脱溶剂，得到化合物4；以氯仿∶甲醇40∶1极性段洗脱，再经过反相硅胶C-18硅胶柱色谱，以水-甲醇梯度洗脱，收集水∶甲醇30∶70洗脱部位得化合物5，化合物5的结构式为：


6.  根据权利要求1所述的鹧鸪麻总三萜化合物及包含的五种阿尔廷型三萜化合物在制备保护肝细胞药物中的应用。

7.  根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物由鹧鸪麻总三萜化合物与药用辅料制成医学上可接受的制剂。

8.  根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物由化合物1-5环阿尔廷型三萜化合物分别与药用辅料制成医学上可接受的制剂。

说明书鹧鸪麻中环阿尔廷型三萜及制备方法和用途
技术领域
本发明属医药领域，具体涉及一种环阿尔廷型总三萜化合物，以及以鹧鸪麻为原料制备总三萜化合物的方法，还涉及该总三萜化合物在制备保肝药物中的应用。
背景技术
鹧鸪麻为常绿高大乔木，主要分布于亚、非、大洋洲热带地区，其叶在我国海南省、台湾省，以及东南亚等地作为民间药治疗疥疮、癣疾、皮疹痒痛、头虱、肝病等(中国植物志，49卷第二分册，142-144；中华本草，第5卷，387-388。)。对该民间药的化学成分研究较少，以前主要发现其化学成分为脂肪酸和黄酮类化合物(Dan，S.；Dan，S.S.Fitoterapia 1988，59，348-349.Siddiqi，I.A.；Osman，S.M.；Subbaram，M.R.；Achaya，K.T.Ind.J.Chem.1971，9，209-210.)。目前尚未见到从该植物中发现环阿尔廷型三萜化合物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鹧鸪麻总三萜化合物，主要含有以下五种环阿尔廷型三萜化合物，化合物1-5的结构如下：

化合物1：R＝β-OMe
化合物2：R＝β-OH
化合物3：R＝α-OH
化合物4：cycloartan-1，24-diene-3，23-dione：

化合物5：栀子花乙酸，gardenolic acid B：

其中化合物1-4为首次发现的新化合物。
本发明的另一个目的是提供所述鹧鸪麻总三萜化合物的制备方法，通过以下步骤实现：(1)提取：取鹧鸪麻枝叶，干燥，粉碎后按重量/体积比药材∶溶剂为1∶6-10倍量加入醇，室温浸提或回流提取2-3次，至提取物颜色较浅，合并提取液，减压浓缩得浸膏，(2)分离：将步骤(1)获得的浸膏进行前处理后上大孔树脂进行分离，先后以水及30％醇洗脱除去杂质，再以60-100％醇洗脱，收集这部分洗脱液后浓缩，得鹧胡麻总三萜。
所述步骤(2)的前处理方法为将此浸膏用低浓度醇(≤30％)溶解后上大孔树脂。其中所用的醇是甲醇或乙醇。
所述步骤(2)的前处理方法为将减压浓缩得到的浸膏用水混悬溶解，用有机溶剂萃取2-3次，经溶剂回收后，再用低浓度醇(≤30％)溶解，上大孔树脂。其中所用的有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、氯仿或正丁醇中的一种；所用的醇是甲醇或乙醇。
所述步骤(2)的前处理方法为将此浸膏直接与大孔树脂拌样，加入至大孔树脂柱顶端。
五种环阿尔廷型三萜化合物的制备通过以下步骤实现：取上述浓缩获得的鹧胡麻总三萜，与硅胶或氧化铝拌样，加入装有硅胶或氧化铝的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇系统洗脱，氯仿∶甲醇80∶1极性段洗脱，经重结晶后得到化合物1；以氯仿∶甲醇60∶1极性段洗脱，经MCI柱层析，以水∶甲醇80∶20洗脱后得到化合物2与3的混合物；氯仿∶甲醇50∶1极性段洗脱，洗脱液收集后用Sephadex凝胶色谱纯化，以甲醇为洗脱溶剂，得到化合物4；以氯仿∶甲醇40∶1极性段洗脱，再经过反相硅胶C-18硅胶柱色谱，以水-甲醇梯度洗脱，收集水∶甲醇30∶70洗脱部位得化合物5。
本发明的再一个目的是提供获得的鹧鸪麻总三萜及五种阿尔廷型三萜化合物在制备保护肝细胞药物中的应用。经实验证实，本发明获得的鹧鸪麻总三萜及阿尔廷型三萜化合物对呋喃妥因(nitrofurantoin)诱导的人肝癌细胞株HepG2细胞毒具有强效保护作用。提示该类化合物具有潜在的保肝价值，可望开发成保肝新药。
本发明制备所得到的鹧鸪麻总三萜及环阿尔廷型三萜化合物，通过添加各种药用辅料制成医学上可接受的各种制剂，包括片剂、胶囊和注射制剂。
在用呋喃妥因(nitrofurantoin)诱导的人肝癌细胞株Hep G2细胞毒模型筛选具有肝保护作用的药物时发现，鹧鸪麻总提取物具有较强的保护肝细胞的活性。经过多级色谱分离(包括硅胶、氧化铝、反相硅胶及凝胶色谱)得到了化合物1-5，通过多种波谱技术测试，包括UV、IR、MS及NMR(1D及2DNMR)，在对波谱信息进行详细的解析后确证结构为含有不饱和共轭体系的环阿尔廷型三萜，经文献检索发现1-4为新化合物。
本发明的有益之处是：(1)首次从鹧胡麻中制备了环阿尔廷型三萜化合物，并提供了一种设计合理，简便实用的鹧胡麻总三萜的制备方法；(2)利用本发明的方法，可从鹧胡麻总三萜中制备出五个环阿尔廷型三萜化合物，其中4个为新化合物；(3)研究证实本发明获得的鹧胡麻总三萜及五个环阿尔廷型三萜化合物，对呋喃妥因诱导的人肝癌细胞株Hep G2细胞毒具有保护作用。提示该类化合物具有潜在的保肝价值，可望开发成保肝新药。
具体实施方式
本发明结合具体实施例作进一步说明。
实施例1.鹧鸪麻总三萜及化合物1-5的制备
鹧鸪麻5kg干燥枝叶粉碎，加入50L乙醇，渗漉提取二次，第一次7天，滤液收集后补加50L乙醇继续渗漉5天。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏700g，将此浸膏与大孔树脂拌样，上D101型大孔树脂，用乙醇水系统洗脱，收集60％-95％乙醇部位，干燥后即得25.8g鹧鸪麻总三萜。
取上述鹧鸪麻总三萜，与15g硅胶拌样，加入装有600g硅胶的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇系统洗脱，氯仿∶甲醇80∶1极性段洗脱，经重结晶后得到化合物1(20mg)，氯仿∶甲醇60∶1极性段洗脱，经MCI柱层析，以水∶甲醇80∶20洗脱后得到化合物2与3的混合物(15mg)，氯仿∶甲醇50∶1极性段洗脱，洗脱液收集后用Sephadex凝胶色谱纯化，以甲醇为洗脱溶剂，得到化合物4(11mg)；氯仿∶甲醇40∶1极性段洗脱，再经过反相硅胶C-18硅胶柱色谱，以水-甲醇梯度洗脱，收集水∶甲醇30∶70洗脱部位得化合物5(12mg)。
化合物1-4的理化及UV、IR、MS波谱数据如下：
化合物1：白色粉末；[α]29D+7.5(c 0.16，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)270(3.76)，214(3.81)nm；IR(KBr disc)νmax3448，2956，1767，1668，1458，1380，1339，1100，948，605cm-1；1H-NMR(CDCl3，400MHz)and 13C NMR(CDCl3，100MHz)，表1和2；ESIMS(positive)m/z 495[M+H]+；HRESIMS(positive)m/z495.3111[M+H]+(calcd for C31H43O5，495.3105).
化合物2&3(约1∶1混合物)：白色粉末；[α]18D-6.8(c 0.8，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(1ogε)266(3.84)，225(3.59)nm；IR(KBr disc)νmax 3443，2944，2872，1769，1667，1604，1463，1129，976cm-1；1H-NMR(CDCl3，400MHz)and13C NMR(CDCl3，100MHz)，表1和2；ESIMS(positive)m/z 503[M+Na]+，481[M+H]+；ESIMS(negative)m/z 479[M-H]-；HRESIMS(negative)m/z 479.2798[M-H]-(calcd for C30H39O5，479.2803).
化合物4：白色粉末；[α]25D-23.1(c 0.36，CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)273(3.43)nm；IR(KBr disc)νmax3420，2974，2949，2872，1740，1689，1664，1617，1598，1465，1378，629cm-1；1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ6.77(1H，d，J＝10.1Hz，H-1)，6.05(1H，s，H-24)，5.93(1H，d，J＝10.1，H-2)，2.49(1H，br d J＝13.4，H-22a)，2.13(3H，s，H3-27)，2.11(2H，m，H2-5)，2.07(1H，m，H-22b)，2.00(1H，m，H-20)，1.99(1H，m，H-8)，1.88(2H，m，H2-11)，1.88(3H，s，H3-26)，1.63(2H，m，H2-12)，1.61(1H，m，H-17)，1.56(1H，m，H-6a)，1.50(1H，m，H-7a)，1.29(2H，m，H2-15)，1.29(1H，d，J＝4.5Hz，H-19a)，1.28(2H，m，H2-16)，1.26(1H，m，H-7b)，1.08(1H，m，H-6b)，1.08(3H，s，H3-28)，0.99(3H，s，H3-18)，0.95(3H，s，H3-29)，0.88(3H，d，J＝5.2，H3-21)，0.88(3H，s，H3-30)，0.74(1H，d，J＝4.5Hz，H-19b)；13C NMR(CDCl3，100MHz)，see Table 2；ESIMS(positive)m/z 459[M+Na]+，437[M+H]+；HRESIMS(positive)m/z 437.3418[M+H]+(calcd for C30H45O2，437.3414).
表1.化合物1-3(400MHz，CDCl3)的核磁共振氢谱数据

表2.化合物1-4(100MHz，CDCl3)的核磁共振碳谱数据


实施例2.鹧鸪麻总三萜制备
鹧鸪麻2kg干燥枝叶粉碎，加入15L乙醇，回流提取二次，每次2小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏，用6L30％醇将此浸膏溶解，上D101型大孔树脂，用乙醇水系统洗脱，收集60％-100％甲醇部位，干燥后即得12.2g鹧鸪麻总三萜。
实施例3.鹧鸪麻总三萜的中试制备
鹧鸪麻100kg干燥枝叶粉碎，加入1000L乙醇，回流提取二次，第一次2小时，滤液收集后补加800L乙醇继续回流提取1小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏，用100L水将此浸膏混悬溶解，用等体积乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层回收溶剂得到提取物。将此粗品以30L30％乙醇溶解，上D101型大孔树脂，用乙醇水系统洗脱，收集80％-90％乙醇部位，干燥后即得705g鹧鸪麻总三萜。
实施例4.鹧鸪麻总三萜及化合物1-5的药理活性研究
4.1.实验材料
人肝癌细胞株Hep G2(ATCC)；Nitrofurantoin；等。
4.2.实验方法
4.2.1.药物配制：将总三萜配制成150μg/ml，90μg/ml和30μg/ml三个浓度，化合物1-5配制成150μM/L，90μM/L和30μM/L三个浓度。
4.2.2.将Hep G2细胞按2×105细胞/孔接种到96孔板中，加入各种浓度药物，在含有RPMI；10％FBS；青霉素G(100IU/ml)；链霉素(100mg/ml)，37摄氏度下，5％CO2和95％空气中培养，培养48小时后，用含1.7mM呋喃妥因和MTT孵育2小时，检测细胞存活率。计算EC50。
4.3.结果参见表3：
表3.鹧鸪麻总三萜及化合物1-5活性数据
  化合物  EC50  Silybin(阳性对照)  75.7±6.5μmol/L  鹧鸪麻总三萜  90±6.2μg/L  化合物1  123.1±15.7μmol/L  化合物2和化合物3  37.9±5.3μmol/L  化合物4  109.1±16.2μmol/L  化合物5  66.4±7.1μmol/L
通过细胞毒实验，可知鹧鸪麻总三萜及化合物1-5对呋喃妥因(nitrofurantoin)诱导的人肝癌细胞株Hep G2细胞毒均具有保护作用，化合物1和4的保护作用比silybin效果稍弱，而化合物2和3，5，比阳性对照化合物silybin效果更强，提示该类化合物具有潜在的保肝价值，可望开发成保肝新药。
实施例5.鹧鸪麻总三萜制剂的制备
5.1.制成片剂
将鹧鸪麻总三萜50g与淀粉30g混匀，加10％淀粉浆10g制成软材，加入硬脂酸镁0.5g，干淀粉8g混匀后压制成1000片，即得。每片含鹧鸪麻总三萜50mg。
5.2.制成注射剂
鹧鸪麻总三萜20g，加入50g甘露醇，加注射用水至2000ml加热溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后每瓶2ml分装于5ml的西林瓶内，每瓶含鹧鸪麻总三萜20mg，放入真空冷动干燥机内冻干，取出后轧盖包装即得。
5.3制成胶囊剂
将鹧鸪麻总三萜10g加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，套入1号空心胶囊中。共装粒1000粒，每粒胶囊含鹧鸪麻总三萜10mg。