从未成熟大麦叶提取物中 分离新的肽并用其抑制 人血小板凝集 发明背景发明领域
本发明涉及分离并鉴定来自未成熟大麦叶提取物中获得的新的肽。更特别地是，本发明涉及分离并鉴定来自未成熟大麦叶提取物中获得的抑制人血小板凝集的新的肽。
现有技术描述
大麦被广泛用作食品原料。在日本和其它一些国家，嫩的未成熟大麦叶的汁及其冻干产品也被广泛用作营养补充。嫩大麦植物的未成熟叶子的提取物富含微生素和微量元素，含有具有多种多样所谓生物活性的大量未确定分子的复杂混合物。
近来研究表明，加热的和未加热的大麦叶提取物含有能增强生长激素(GH)和催乳激素的释放，其超出具有GH释放因子(GRF)或促甲状腺释放激素(TRH)而单独获得的生长激素和催乳激素的释放程度。(GRF和TRH分别是生长激素和催乳激素的天然刺激物。)[Badamchian等人“未成熟大麦叶提取物(BLE)的免疫内分泌活性：催乳激素和白介素-2体外释放的调节”，FASEB J.，5，A567(1991)]。
据报导嫩的未成熟大麦叶含有生物活性物质，和抗氧化剂和抗癌剂。至今也有报导，未成熟大麦叶提取物有多种免疫调节特性，如体外抗炎性和抗白血病活性，以及减少大鼠体内溃疡性损伤的愈合时间。[Osawa等人“从嫩的未成熟大麦叶中分离新的抗氧化剂”，《农业食品化学》(J.Agric.Food Chem.)，40，1135-1138(1992)；Itoh等人”禾本科植物绿汁粉末抗癌活性的研究“(Study on theAnticancer Activity of Green JuicePower of Gramineae Plants)，日本药学会第98届年会(1978)；Kubota等人”“自大麦叶中分离有药效的抗炎蛋白质”，《日本炎症杂志》，(“Isolation of PotentAnti Inflammatory Protein FromBarley Leaves”，JapaneseJ.Inflam.)3，4(1983)]。
Badamchian等人“自未成熟大麦叶提取物中分离刺激催乳激素和自大鼠前垂体细胞体外地生长激素的释放的维生素E类似物”，《营养生物化学》(“Isolation of A Vitamin E AnalogFrom A Green Barleg Leaf ExtractThat Stimulates Release Of BolactinAnd Growth Hormone From Rat AnteriorPituitary Cells In Vitro”，J.Nutr.Biochem.)1994，第5卷，3月，pp.145-150，公开了丁二酸α-生育酚酯作为增强自大鼠前垂体细胞体外的生长激素和/或催乳激素释放的未成熟大麦叶提取物中的活性元素。应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和快原子轰击质谱(FAB-MS)来分离并在化学上鉴定了作为这种神经内分泌活性的来源丁二酸α-生育酚酯分子。
Badamchian等人“丁二酸α-生育酚酯而不是α-生育酚或其它维生素E类似物刺激催乳激素自大鼠前垂体细胞体外释放”，《营养生物化学》(“α-Tocopherol Succinate，But Notα-Tocopherol Or Other Vitamin EAnalogs，Stimulates ProlactinRelease From Rat Anterior PituitaryCells In Vitro”，J.Nutr.Biochem.)，1995，第6卷，6月，pp1-5，公开了只有丁二酸α-生育酚酯引起催乳激素自大鼠前垂体细胞体外释放的明显增强，而其它可商购的形式的α-生育酚(例如，α-生育酚，δ-生育酚，乙酸α-生育酚酯和烟酸α-生育酚酯)或丁二酸(例如丁二酸二钠盐和琥珀酸(丁二酸))则不引起该现象。
本发明以继续努力鉴定自嫩大麦植物提取物中发现的各种分子的生物活性为基础。发明概述
本发明的目的是提供自大麦植物得到的生物活性物质。
在一种实施方案中，本发明提供新五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和Asp-Asp-Ser-Gln-Gln。
在另一种实施方案中，本发明提供一种用于抑制血小板凝集的组合物，该组合物包括所述五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和其药物上可接受的载体。
在其它实施方案中，本发明提供了用于抑制血小板凝集的组合物，该组合物包括五肽Asp-Asp-Ser-Gln-Gln和其药物上可接受的载体。
在又一实施方案中，本发明提供了一种用于抑制需要治疗的患者的血小板凝集的方法，其包括给所述患者施用血小板凝集抑制有效量的五肽Asp-Asp-Asn-Asp-Asn。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于抑制需要治疗的患者的血小板凝板的方法，其包括给所述患者施用血小板凝集抑制有效量的五肽Asp-Asp-Ser-Gln-Gln。
通过参阅本发明的详细说明，本发明的其它方面将变得更清楚。
附图的简要说明附图
图1A是日本大麦叶提取物的反相高效液相色谱。
图1B是加热的日本大麦叶提取物的反相高效液相色谱。
图2是加热的日本大麦叶提取物制备的分离物的反相高效液相色谱。
图3说明级分13(F13)对腺苷二磷酸(ADP)诱导的血小板凝集的影响。
图4说明级分14(F14)对ADP诱导血小板凝集的影响。
图5A是级分13(F13)反相高效液相色谱。
图5B是级分14(F14)反相高效液相色谱。
图6说明级分13(F13)抑制ADP诱导血小板凝集的剂量依赖性。
图7说明级分14(F14)抑制ADP诱导血小板凝集的剂量依赖性。
图8A说明ADP诱导血小板凝集作用。
图8B说明加热的大麦叶提取物(H-BLE)抑制ADP诱导的血小板凝集作用。
图9说明加热的大麦叶提取物(H-BLE)抑制ADP诱导的血小板凝集的剂量依赖性。
图10A说明级分14(F14)肽的UV谱。
图10B说明级分13(F13)肽的UV谱。
图11A说明级分13(F13)肽的高分辨快原子轰击质谱。
图11B说明级分14(F14)肽的高分辨快原子轰击质谱。
图12A说明级分14(F14)肽的高效毛细管电泳。
图12B说明级分13(F13)肽的高效毛细管电泳。
本发明的详细说明
本发明提供自未成熟大麦植物得到的生物活性分子。
发芽后，例如大约两周，立刻收获大麦植物未成熟的叶子。叶子被冻干并接着研磨生成细小而均匀的粉末。(尽管可以使用稍大或稍小粒度的颗粒，但一般情况下将粉末通过2mm筛目。)
将如此制得的粉末悬浮于水(一般情况下每ml水用约50mg粉末)中并在室温至约100℃下搅拌几分钟至几小时(温度越高所需时间越短)。较大粉末粒度或较小相对量的粉末需要相对较长的时间和/或较高温度以从粉末中充分提取物质。
然后将混合物离心和/或过滤，以从中除去固体成分。(如果不是立即使用如此制得的提取物，则可以在低温，例如0℃，优选-20℃下贮存)。
然后，如此制得的提取物进行高效液相色谱(即反相高效液相色谱)，以将提取物分离成递增疏水性的级分(例如洗脱剂A可以是三氟乙酸水溶液，洗脱剂B可以是三氟乙酸有机溶剂(例如乙腈)溶液，线性梯度可以是自0至80％B)。这些级分可以冻干，用水稀释，并测定生物活性(在本发明情况下测定抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导血小板凝集的生物活性)。为了进一步纯化活性物质，可以将具有生物活性的级分再次进行反相高效液相色谱。
然后用本领域定性定量分析已知技术进行活性物质的鉴定。
利用这些技术，已分离出两种五肽，Asp-Asp-Asn-Asp-Asn和Asp-Asp-Ser-Gln-Gln，它们体外抑制ADP诱导的血小板凝集。
以在这些体外研究中具有的活性为基础，相信对需要抑制血小板凝集的患者施用抑制有效量(例如每kg体重0.1-10mg)的这些五肽将会有效抑制这种血小板凝集作用。当然，有效量将随患者年龄和总体健康状况以及其它因素而不同。
通过直接注射或利用静脉滴注可以有效地施用五肽。
与五肽一起使用的药物上可接受的载体包括蒸馏水(无菌)和生理缓冲盐水(无菌)等。
实施例
下述实施例详细说明制备，分离和鉴定本发明的新肽。提取方法
(i)制备来成熟大麦叶粉末
发芽后两周收获未成熟大麦叶。在冷冻干燥器(50-SRC-5型(Virtis公司，Gardner，N.Y.，U.S.A.))中将大麦叶冷冻干燥3天。接着用装有筛(筛目大小2mm)的标准3型Wiley粉磨机(Arthur H.Thomas公司，Philadelphia，Pa.U.S.A.)将冻干的叶子研磨成细小而均匀的粉末以备提取。
(ii)大麦叶提取物(BLE)
将上面制得的未成熟大麦叶粉末悬浮于水(50mg/ml)中，并在室温下搅拌1小时。然后用台式离心机以3,000×g将混合物离心30分钟。弃去片状沉淀物，上清液以30,000×g离心30分钟。接着上清液以30,000×g离心30分钟。然后经0.45μm膜(Millipore公司，Bedford，Mass)过滤并在-20℃贮存以用于高效液相色谱(HPLC)或生物测定。
(iii)加热的大麦叶提取物(H-BLE)
将如上制得的未成熟大麦叶粉末悬浮于水(50mg/ml)中并在室温下搅拌1小时。然后用台式离心器以3,000×g将混合物离心30分钟。弃去片状沉淀物并将上清液以30,000×g离心30分钟。然后将上清液煮沸10分钟，再以30,000×g离心30分钟。然后通过0.45μm膜(Millipore公司，Bedford，Mass.)过滤并在-20℃下贮存以用于高效液相色谱(HPLC)或生物测定。高效液相色谱
在装有490型多波长检测器，在214nm和280nm，及300×3.9mm Delta Pak 30015μm C18柱(Waters，Milford，Mass.U.S.A)的440型HPLC系统(Waters，Milford，Mass.U.S.A.)中进行BLE或H-BLE分级反相色谱最佳条件选择。洗脱剂A是0.1％(重量)三氟乙酸(TFA)水溶液，洗脱剂B是含0.1％(重量)的乙腈。以1ml/min的流速进行60分钟自0至80％B线性梯度洗脱。图1A显示BLE反相HPLC，图1B显示H-BLE反相HPLC。
在装有441型吸光度检测器(Waters)，在214nm，和300×19mm Delta Pak 300，15μm C18柱的600型HPLC系统(Waters)进行H-BLE(300mg)的制备反相色谱。选择该条件用作BBLE或BLE中所有肽/分子分级的最初步骤。洗脱剂A是0.1％(重量)三氟乙酸(TFA)水溶液，洗脱剂B是含0.1％(重量)TFA的乙腈。以5ml/min流速进行60分钟自0至80％B线性梯度洗脱。图2显示H-BLE的制备反相HPLC。
一分钟收集一个级分，冻干并用1ml H2O稀释。试验各级分对腺苷二磷酸(ADP)诱导的血小板凝集的影响。试验结果表明10μl级分14(F14)和级分B(F1)对ADP诱导的血小板凝集具有明显的抑制作用，见图3和4。因此，将F13和F14进行进一步纯化。
在3.9mm×30cm Delta Pak 300，5μm，C18柱上进行F13和F14的分析反相色谱。洗脱剂A是0.1％(重量)TFA水溶液，洗脱剂B是含0.1％(重量)TFA的乙腈。以1ml/min的流速进行20分钟自0至5％B线性梯度洗脱，接着进行5分钟自5至20％B线性梯度洗脱。在214和218nm外检测。每半分钟收集一个级分，并测定其对ADP诱导的血小板凝集的影响。图5A和5B分别显示F13和F14级分的分离结果。表1是以蛋白质浓度和干重表示的肽MB-F13和肽MB-F14的收率。图6和图7分别表明F13和F14对ADP诱导的血小板凝集抑制的剂量依赖性。表1 自1g H-BLE得到的肽MB-F13和MB-F14的蛋白质浓度和干重 样品 干重(mg) 蛋白质 ％产率(干重)MB-F13 7.2 0.11 0.72MB-F14 141.0 8.33 14.1用BSA为标准通过Lowry蛋白质分析来测定蛋白质浓度。血小板凝集分析
在每个实验中，用双注射器技术，从禁食，不吸烟，健康自愿者身上采取9ml血，加到含3.8％(重量)柠檬酸钠的聚丙烯试管中。每个样品用2ml磷酸盐缓冲盐水稀释。将血样在室温下在2000RPM条件下离心3分钟制得富血小板血浆(PRP)。移取PRP后，样品再次以2700RPM离心10分钟制得含血小板少的血浆(PPP)。对于PRP和PPP两者，校准凝集计量计，使PRP给出零而PPP产生100％光透射。在每个实验中，在实验开始、中间和最后做三个对照。对于每个对照，将400μl PRP样品与4μl 1μm CaCl2一起温育1分钟，然后与加入的水(与样品体积等量)温育2分钟。然后向样品中加入5-20μl 1-10μm腺苷二磷酸(ADP)以达到100％凝集。
图8A显示如上表示的ADP(1μmol)对诱导对照样品血小板凝集的影响。注意双相反应(第一凝集作用和第二凝集作用)。图8B显示40μl(2mg)H-BLE对ADP诱导的血小板凝集的影响。
图9说明H-BLE对ADP诱导的血小板凝集抑制的剂量依赖性。
下面表2列出了关于含各种浓度活性成分的H-BLE的各级分对ADP诱导的血小板凝集抑制的附加实验。
表2实验序号血浆来源性别年龄加入的0.1M ADP(μl) H-BLE 级分 Vol(μl) 干重 (μg) 抑制率 (％) 1 M 17 8.2 F13 10 240 106.0 2 M 17 8.2 F13 10 120 98.0 3 M 17 8.2 F13 10 60 92.0 4 M 17 8.2 F13 10 30 47.0 5 M 17 8.2 F13 10 15 0 6 M 17 8.2 F14 10 940 108.0 7 M 17 8.2 F14 10 470 102.0 8 M 17 8.2 F14 10 235 3.0 9 M 17 8.2 F14 10 118 1.0 10(1) M 17 8.2 H2O 10 0 0 11(1) M 17 8.8 H2O 10 0 0 12 M 17 8.8 F14 10 700 104.0 13 M 17 8.8 F14 10 400 94.0 14 M 17 8.8 F14 10 285 69.0 15 M 17 8.8 F14 10 266 6.0 16 M 17 8.8 F14 10 200 0氨基酸分析
(i)氨基酸组成
用Pico-Tag氨基酸分析系统(Waters，Miford，Mass.U.S.A.)进行肽MB-F13和MB-F14的氨基酸分析。本方法以生成蛋白质酸解氨基酸的苯基硫代氨基甲酰衍生物为基础。具体地，肽MB-F13和MB-F14(1-5μg)样品在Pico-Tag工作站于110℃在200μl恒定煮沸的含1％(体积/体积)苯酚的HCl中水解24、48、72和120小时。水解产物在室温下与异硫氰酸苯酯反应20分钟，得到相应的苯基硫代氨基甲酰衍生物。用Pico-Tag氨基酸分析系统分析这些衍生物，该分析系统事先用氨基酸标准混合校正。表3显示肽MB-F13和MB-F14的氨基酸组成。
表3氨基酸 (1) 肽 MB-F13 酸解残基数 序列残基数 肽 MB-14 酸解残基数 序列残基数 Asp(2) 5 3 2 2 Glu(2) - - 2 - Ser - - 1 1 Asn - 2 - - Gln - - - 2(1)其它氨基酸的计算值是零或忽略不计。(2)天冬氨酸和谷氨酸值是它们的酸和酰胺的总和。
(ii)序列测定
在贝克曼LF3400蛋白质/肽序列测定仪(贝克更仪器有限公司，Fullerton，加利弗尼亚，美国)上进行肽MB-F13和MB-F14氨基酸序列分析。用于动埃德曼降解反应中的所有化学品是高敏感性序列测定试剂，其由降低浓度的异硫氰酸苯酯(PITC)(＜1％PITC/庚烷、二异丙基乙胺(DIPEA)碱、粒状三氟乙酸(PFA)、乙酸乙酯和DTT、25％TFA/H2O、PTH氨基酸标准物(Pierce)20pmole/200μl和乙腈/H2O组成，序列测定数据由与HPLC联机的贝克曼LF3400蛋白质/肽序列测定仪获得，所述的HPLC配备有贝克曼126梯度泵系统、贝克曼168二极管阵列检测器、柱加热器、注射器、具有蛋白质序列测定软件的系统Gold软件和2.1×15cm 3μm，Micro PTH柱。
肽MB-F13和MB-14各由5个氨基酸残基组成，并具有下面的氨基酸序列：
MB-F13：Asp-Asp-Asn-Asp-Asn
MB-F14：Asp-Asp-Ser-Gln-GlnUV光谱
图10A是肽MB-F14的UV光谱，图10B是肽MB-F13的UV光谱。正如容易确定的，最大吸收度发生在210-218nm，在260nm没有吸收。在210-218nm的吸收表明有肽键，在260nm无吸收表明肽中不存在芳环或芳香氨基酸。质谱分析
(1)仪器装设
将线性快速扫描质谱仪(TOF101，Comstock，Inc.，Oak Ridge，Tenn.U.S.A)改变调节成两个激光口，一个观测口，高加速电压高达30kv。压力在离子源区持续低于10-8mbar。在探测器顶部上部，1cm加速区紧接着大直径(7.13cm)离子透镜以使透射率最大。透镜要素的联锁设计减小了场透入并提供了极好的场均匀性。在215cm飞行轨迹末端，用两种状态微波板组合件检测离子，偏流至-1800V。因为分析离子的相对低的质量，在该项研究中加速电压保持在10.00kv。即使在高离子流操作期间，两个高稳定性粉末供给(Series 205B，Bertan Associates，Inc.，Hick Sville，N.Y.7)提供无涟波操作。
该系统装有两个激光源：氮激光器以337nm波长发射(VSL-337ND，Laser Scince，Inc.，Newton，Mass.U.S.A.)，和染料激光器(LPD3000，Lambad Physik，Goettingen，德国)。染料激光器(Coumarin 540Adye)双倍输出在275-290n范围内可调谐。快光子二极管被用来测定脉冲强弱并监测激光器的正常操作。用热电焦耳仪记录脉冲能量。在具有最大5％发射与发射间强度振幅的5n FWHM脉冲中氮激光传输高达110μJ。但是，平均128次发射的振幅只在大约1.4％。因此，平均强度振幅的变化可以反映关于解吸过程的信息。当适当调整时，具有12ns脉冲宽度的双倍染料激光的输出超过400μJ。用各种衰减器(935-5-OPT，Newport Corp.，Foantain Valley，Calif.U.S.A.)调节激光辐射度，并通过254mm焦长石英透镜聚焦到45℃的样品探测器上。
用10X快作用预放大器(9305型，EG&GORTEC，OakRidge，Tenn.U.S.A.)，通过用各种增进放大器组件来扩大检测的缓冲范围。经两次扩大状态后，通过快速瞬时数字转换器(TR8828D，Lecroy，Albuquergue，NM，U.S.A)记录离子流。在486D/33MHz个人电脑上用特别编制的软件(TORWARE，Ilys Software，Pittsburgh，Penn.U.S.A.)进行数据获得及分析。
为了提供均匀的离子化作用条件，关键仪器参数-加速电压、激光辐射度、检测器偏移在整个研究中保持恒定不变。激光辐射度调至稍高于最弱响应分析物的临界值并对所有样品保持该值不变。
(ii)样品制备
用3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸(芥子酸，SA，Aldrich，Milwaukee，WI)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB Sigma，St.Louis，MO)作为基质进行试验。DHB必须重结晶两次以除去原产品中存在的过量的钠盐。每天在7∶3(V/V)HPLC级乙腈去离子水混合物中制得新鲜基质溶液。分析物自Sigma(Sigma，St.Louis.MO)购得。
在0.1％三氟乙酸(TFA)中制备肽母液，达到5×10-4M浓度。在该试验中，2μl等份样品与10μl基质溶液在探测器端点(5mm直径)混合，达到高于1000基质对样品的比值(为试验预混的效果，在微离心试管中涡旋混合后进行对照实验。在干燥过程中基质和样品的自发混合和涡旋预混产生相同结果)。用冷空气流除去溶剂并使结晶在探测器端点产生均匀分布。
(iii)结论
五肽的质谱分析分别在592.3和592.8给出肽MB-F13和MB-F14的M+1离子峰。该数据表明分子量是591.3和591.8。由氨基酸组成和序列分析而计算的分子量对于五肽MB-F13和MB-F14分别是591.5和591.7。图11A是肽MB-F13的高分辨率FAB-MS。图11B是肽MB-F14的高分辨率FAB-MS。高效毛细管电泳
在贝克曼P/ACE 5010系统上进行高效毛细管电泳。在室温、电压20Kv、100mM pH8.3硼酸盐缓冲液条件下，在75μmI.D.和375μm O.D.的57cm试管(对检测器50cm)中进行肽MB-F13和MB-F14的分离，并在214nm处检测。图12A是肽MB-F14的电泳图，图12B是肽MB-F13的电泳图。