《喉癌易感基因无创检测试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《喉癌易感基因无创检测试剂盒.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103374617 A (43)申请公布日 2013.10.30 CN 103374617 A *CN103374617A* (21)申请号 201210126380.4 (22)申请日 2012.04.27 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 解码(上海)生物医药科技有限公司 地址 201203 上海市浦东新区张江镇建中路 126 弄 6 栋 103 室 (72)发明人 潘加奎 姜丽 (54) 发明名称 喉癌易感基因无创检测试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了一种检测喉癌易感基因无创检 测试剂盒。该试剂盒包括检测三个基因的 4 个单 核苷酸多态性位。
2、点基因型的特异性引物与 DNA 测 序引物、 PCR 反应组件、 PCR 产物纯化组件、 DNA 测 序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与喉癌 发生密切相关的 4 个单核苷酸多态性位点的基因 型来评估受检者喉癌患病的风险级别， 并最终根 据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导 受检者有针对性的预防喉癌的发生， 降低喉癌的 发病几率。 本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样， 无痛、 无创、 避免了交叉感染。 测序检测结果准确， 可靠， 不必购置价格昂贵的进口专用仪器， 方法易 普及推广。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103374617 A CN 103374617 A *CN103374617A* 1/1 页 2 1. 一种检测喉癌易感基因无创检测试剂盒， 其特征在于 ： 检测本发明提供了一种检测 喉癌易感基因无创检测试剂盒， 该试剂盒包括检测 CYP1A1 基因上 Ile462Val 位点及 MspI 位点多态性， CYP2D6 基因上 C188T 位点多态性， XRCC1 基因上 Arg399Gln 位点的 4 个单核苷 酸多态性位点基因型的特异性引物与 DNA 测序引物、 Taq 酶、 dNTP 混合液、 反应缓冲液、 SAP 酶、。
4、 ExoI 酶、 BigDye mix、 EDTA 溶液、 70% 乙醇溶液、 100% 乙醇溶液、 HIDI 溶液、 ddH2O 等。 2. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述的特异性引物对是指针对本 发明提供了一种检测喉癌易感基因无创检测试剂盒， 该试剂盒包括检测 CYP1A1 基因上 Ile462Val 位点及 MspI 位点多态性， CYP2D6 基因上 C188T 位点多态性， XRCC1 基因上 Arg399Gln 位点的 4 个单核苷酸多态性位点， 能特异性扩增出包含这 4 个 SNPs 位点的 DNA 片段的引物对。 3. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 。
5、其特征在于 ： 所述的 DNA 测序引物是针对本发明提 供了一种检测喉癌易感基因无创检测试剂盒,该试剂盒包括检测CYP1A1基因上Ile462Val 位点及 MspI 位点多态性， CYP2D6 基因上 C188T 位点多态性， XRCC1 基因上 Arg399Gln 位点 的 4 个单核苷酸多态性位点而设计， 能通过 DNA 测序技术特异性检测出上述 4 个 SNPs 位点 基因型的 DNA 测序引物。 4. 根据权利要求 1 所示的试剂盒， 其特征在于， 所含的 4 对特异性引物序列如下 ： （1） CYP1A1（Ile462Val） 正向引物 :5CTTGCCTGTCCTCTATCCTT。
6、TG3 CYP1A1（Ile462Val） 反向引物 :5CAGGCTGAACCTTAGACCACA3 （2） CYP1A1（MspI） 正向引物 ： 5GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 CYP1A1（MspI） 反向引物 ： 5AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 （3） CYP2D6（C188T） 正向引物 ： 5AACACAGCAGGTTCACTCACAG3 CYP2D6（C188T） 反向引物 ： 5ATCCATGTTTGCTTCTGGTAGG3 （4） XRCC1（Arg399Gln） 正向引物 ： 5TGACCTTGCGGGACCTTAG3 XRCC1（Arg3。
7、99Gln） 反向引物 :5CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3。 5. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于， 所含的 4 条 DNA 测序引物序列如下 ： （1） CYP1A1（Ile462Val） 测序引物 ： 5 CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3 （2） CYP1A1（MspI） 测序引物 ： 5 GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 （3） CYP2D6（C188T） 测序引物 ： 5 AACACAGCAGGTTCACTCACAG 3 （4） XRCC1（Arg399Gln） 测序引物 ： 5 TGACCTTGCGGGACCTTAG 3。 。
8、6. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于试剂盒的组分和含量包括 ： （1） PCR 反应体系 ： 10PCR 反应缓冲液 2.5ul， 25mM dNTP 混合液 0.2ul， 5U ul Taq DNA 聚合酶 0.125ul， 20uM 特异性引物对， 每条引物各 0.25ul， ddH2O 19.175ul （2） PCR 产物纯化体系 ： 1 U ul SAP 酶 0.75ul， 10 U ul ExoI 酶 0.375ul， ddH2O 3.875ul （3） 测序反应体系 ： 25% BigDye mix1ul， 3.2uM DNA测序引物1ul， 125mM EDTA溶。
9、液1ul， 100% 乙醇溶液 15ul， 70% 乙醇溶液 30ul， HIDI 溶液 8ul， ddH2O 2ul 本试剂盒供一人份检测应用， 试剂盒的保存温度为 -20。 权 利 要 求 书 CN 103374617 A 2 1/3 页 3 喉癌易感基因无创检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及医学和生物技术， 具体涉及一种喉癌易感基因 检测试剂盒， 根据检测结果从基因层面评估喉癌发病的风险级别， 并作为预防和治疗喉癌 的方向指导。 背景技术 0002 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤， 约占全身癌肿的 1.2%-1.6%， 每年的死亡率为 4-10 人 / 万人。流。
10、行病学调查表明， 喉癌死亡率以中国为最高， 尤其是我国南方， 它是严重 威胁我国人民生命健康的肿瘤之一。 0003 研究表明， 喉癌的发生、 发展及临床预后与环境因素有密切关系， 如吸烟、 汽车尾 气等。 但在临床工作中发现， 在同样的环境暴露条件下许多人终生不患癌， 即使患了喉癌经 治疗后也无肿瘤复发， 而分期、 分级相同的患者也可表现出截然不同的预后。 其原因与遗传 有关， 如代谢酶基因失活与癌基因激活而致癌。 0004 众多研究表明， 环境中致癌因素诱导抑癌基因失活与癌基因激活而致癌。已知大 多数化学致癌物原型并不具有致癌活性， 必须经过代谢酶代谢活化后才能与生物大分子作 用而致癌。已知。
11、绝大多数化学致癌物原型并不具有致癌活性， 必须经过代谢酶代谢活化后 才能与生物大分子作用而致癌。外源性物质在体内代谢过程中需要有 I 相代谢酶， 主要是 细胞色素 P450（CYP1A1） ， 这种酶对解毒多环芳烃类致癌物有很强的特异性， 因此多环芳烃 类致癌物能否引起靶细胞癌变， 很大程度上取决于CYP1A1以及CYP2D6基因编码的酶活性。 研究表明， CYP1A1 基因上 Ile462Val 位点及 MspI 位点多态性、 CYP2D6 基因上 C188T 位点多 态性都与其编码的酶活性密切相关。 0005 人类 X 射线交错互补修复基因 1（XRCC1） 在碱基切除修复系统中起着整体作。
12、用， 是编码碱基损伤修复联合序列的一种重要的蛋白。研究表明， XRCC 基因上 Arg399Gln AG/ GG 多态性会导致 DNA 错配修复能力下降， 使 DNA 的稳定性降低， 增加喉癌的发病风险。 0006 综上所述， 鉴于CYP1A1基因、 CYP2D6基因、 XRCC1基因在喉癌变过程中有着不可忽 视的作用， 可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在喉癌发生相关的基因单核 苷酸位点基因型， 及时筛查出易患喉癌的高危人群， 从而有针对性的预防和治疗喉癌， 这对 于降低喉癌的发病率有非常重要的意义。 发明内容 0007 基于本发明提供了一种检测喉癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒。
13、包括检测 CYP1A1基因上Ile462Val位点及MspI位点多态性， CYP2D6基因上C188T位点多态性， XRCC1 基因上Arg399Gln位点的4个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估喉癌发病的危险因子 的基础上， 本发明提供一种喉癌易感基因检测试剂盒。 0008 该试剂盒包括 ： 检测本发明提供了一种检测喉癌易感基因无创检测试剂盒。 该试剂盒包括检测CYP1A1 说 明 书 CN 103374617 A 3 2/3 页 4 基因上 Ile462Val 位点及 MspI 位点多态性， CYP2D6 基因上 C188T 位点多态性， XRCC1 基因 上 Arg399Gln 位点的 。
14、4 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及 DNA 测序引物 ； PCR 反应组件 （包括 Taq 酶、 dNTP 混合液、 反应缓冲液、 ddH2O 等） ； PCR 产物纯化组件 （包括 SAP 酶、 ExoI 酶、 ddH2O 等） ； DNA 测序反应组件 （包括 BigDye mix， EDTA 溶液、 100% 乙醇溶液、 70% 乙醇溶液、 HIDI 溶 液、 ddH2O 等） 。 0009 本发明试剂盒的组分和含量包括 ： PCR 反应体系 ： 10PCR 反应缓冲液 2.5ul ； 25mM dNTP 混合液 0.2ul ； 5U/ul Taq DNA 聚合酶 0.125。
15、ul ； 20uM 特异性引物对 （每条引物各 0.25ul） ； ddH2O 19.175ul。 0010 PCR 产 物 纯 化 体 系 ： 1U/ul SAP 酶 0.75ul ； 10U/ul ExoI 酶 0.375ul ； ddH2O 3.875ul。 0011 测序反应体系 ： 25%BigDye mix 1ul ； 3.2uM DNA 测序引物 1ul ； 125mM EDTA 溶液 1ul ； 100% 乙醇溶液 15ul ； 70% 乙醇溶液 30ul ； HIDI 溶液 8ul ； ddH2O 2ul。 0012 本试剂盒供一人份检测应用， 试剂盒的保存温度为 -20。 。
16、0013 具体实施方式 0014 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 或按照制造厂商 所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 0015 除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 0016 实施例 1. 检测试剂盒的使用 1、 抽提 DNA 模板 刮取受检者口腔黏膜上皮细胞， 用酚氯仿法抽提基因组 DNA。 0017 。
17、2、 PCR 扩增反应 使用检测试剂盒中的 PCR 反应组件， 其中， 含有下列引物对 ： （1） CYP1A1（Ile462Val） 正向引物 ： 5CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3 CYP1A1（Ile462Val） 反向引物 ： 5CAGGCTGAACCTTAGACCACA3 （2） CYP1A1（MspI） 正向引物 ： 5GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 CYP1A1（MspI） 反向引物 ： 5AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 （3） CYP2D6（C188T） 正向引物 ： 5AACACAGCAGGTTCACTCACAG3 CYP2D6（C1。
18、88T） 反向引物 ： 5ATCCATGTTTGCTTCTGGTAGG3 （4） XRCC1（Arg399Gln） 正向引物 ： 5TGACCTTGCGGGACCTTAG3 XRCC1（Arg399Gln） 反向引物 ： 5CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3 PCR 扩增的反应体系为 ： 10PCR 反应缓冲液 2.5ml ； 25mM 的 dNTP 混合液 0.2ml、 5U/ ul Taq 酶 0.125ml、 DNA 模板 1ml(12-15ng 左右 )、 20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、 ddH2O 说 明 书 CN 103374617 A 4 3/3 页 5。
19、 19.175ml ； 反应条件为 ： 94 4分钟变性和酶激活， 94 30秒变性， 55 30秒退火， 72 1分钟 延长， 循环 28 次， 最后 72延长 5 分钟以上。 0018 3、 PCR 扩增产物纯化 使用检测试剂盒中的 PCR 产物纯化组件， 反应体系为总体积 25ul， 包含 PCR 产物 20ul， 1U/ul SAP 酶 0.75ul， 10U/ul ExoI 酶 0.375ul， 去离子水 3.875ul。 0019 在 ABI2720 型 PCR 扩增仪上进行反应， 反应条件为 37、 15min， 72、 20min。 0020 4、 DNA 测序反应 使用检测试。
20、剂盒中的测序反应组件， 其中， 含有下列 DNA 测序引物 ： （1） CYP1A1（Ile462Val） 测序引物 ： 5 CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG 3 （2） CYP1A1（MspI） 测序引物 ： 5 GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 （3） CYP2D6（C188T） 测序引物 ： 5 AACACAGCAGGTTCACTCACAG 3 （4） XRCC1（Arg399Gln） 测序引物 ： 5 TGACCTTGCGGGACCTTAG 3 反应的体系为总体积 5ul， 包含 PCR 纯化产物 1ul， 25%Bigdye mix1ul,3.2uM DNA。
21、 测序 引物 1ul， 去离子水 2ul。 0021 在 ABI2720 型 PCR 扩增仪上进行反应， 反应条件为 98 2min， 进行 25 个循环的 96 30s， 55 30s,60 4min。 0022 反应结束后加入 125mM EDTA 溶液 1ul 和 100% 乙醇溶液 15ul， 于室温下沉淀 15min ； 在 4 ,3600rpm/min 的转速离心 30min， 轻轻倒去上清液 ； 加入 70% 乙醇溶液 30ul， 3600rpm/min 离心 15min， 轻轻倒去上清液 ； 室温放置 20min 后加入 HIDI 溶液 8ul， 放入测 序仪中。 0023 5。
22、、 基因型分析 熟悉 DNA 测序技术的本领域技术人员能够通过辨识 DNA 测序图谱确定所检测的 SNP 位 点的基因型。 0024 实施例 2. 对人们进行预防喉癌发病的基因无创检测的服务 1. 采样及抽提 DNA 由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样， 采用酚氯仿法 进行口腔上皮细胞的 DNA 抽提 2. 基因型检测 使用本发明提供的试剂盒， 对受检者基因组 DNA 的本发明提供了一种检测喉癌易感基 因无创检测试剂盒。 该试剂盒包括检测CYP1A1基因上Ile462Val位点及MspI位点多态性， CYP2D6 基因上 C188T 位点多态性， XRCC1 基因上 。
23、Arg399Gln 位点的 4 个单核苷酸多态性位 点分别进行 DNA 测序， 确定这 4 个 SNPs 位点的基因型。 0025 3. 喉癌发病高危人群风险评估 通过对受检者 SNPs 基因型的分析， 出具喉癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详 细说明了本发明提供了一种检测喉癌易感基因无创检测试剂盒。 该试剂盒包括检测CYP1A1 基因上Ile462Val位点及MspI位点多态性， CYP2D6基因上C188T位点多态性， XRCC1基因上 Arg399Gln位点的4个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。 除此之外， 根 据受检者的风险级别， 并由医师向受检者详细说明和解读喉癌易感基因无创检测报告单。 说 明 书 CN 103374617 A 5 。