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1、(10)申请公布号 CN 103374597 A (43)申请公布日 2013.10.30 CN 103374597 A *CN103374597A* (21)申请号 201210125655.2 (22)申请日 2012.04.26 C12Q 1/26(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 北京和信非凡生物技术有限公司 地址 102200 北京市昌平区超前路 37 号中 关村兴业创业园 6 号楼 4 层 (72)发明人 安祺 (54) 发明名称 一种 NADH-Q 还原酶酶活性检测方法和试剂 (57) 摘要 本发明提供一种 NADH-Q 还原酶 （EC1.。
2、6.5.3） （线粒体呼吸链复合物 I） 酶活力检测的方法， 同 时本发明还提供了测定 NADH-Q 还原酶酶活性的 试剂， 上述方法和试剂可用于分析测定待测样本 中的 NADH-Q 还原酶酶活力， 从而可以用于临床 疾病的分析、 检验和诊断。本发明的原理是 ： 利 用 NADH-Q 还原酶可以将氧化型的荧光染料还原 后产生还原型的荧光染料分子， 还原型的荧光染 料分子可以在特定的激发光下发射荧光， 其反应 的速率与产生荧光染料分子的荧光强度成正比， 通过检测荧光值的变化就可以计算待测样本中的 NADH-Q 还原酶酶活力。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 1 。
3、页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103374597 A CN 103374597 A *CN103374597A* 1/2 页 2 1. 一种 NADH-Q 还原酶活性测定方法， 其特征在于它的原理如下 ： NADH-Q 还原酶在特定条件下能够将 NADH 中的电子转移给氧化型辅酶 Q（CoQ） 生成还 原型 CoQ， 还原型 CoQ 进一步将电子转移给电子受体 R 生成还原型的 R ； 还原型的 R 在特定 的激发波长下可以发射出特异波长的荧光， 因此在特定的条件下可检测到还原型 R 的荧光 值，。
4、 由于 NADH-Q 还原酶催化底物反应的速率与还原型 R 的生产量成正比， 因此检测在特定 波长下的还原型 R 的荧光值的变化， 就可以计算出 NADH-Q 还原酶的酶活力。 2.如权利要求书1所述的电子受体R， 其特征在于 ： 它是一种在物理和化学领域普遍被 接受的任何能在氧化还原反应中被还原的荧光染料分子， 氧化型R被NADH-Q还原酶还原后 产生还原型的荧光分子 R， 还原型荧光分子 R 可以在特定激发光下发射荧光。 3.如权利要求书1-2所述的电子受体R， 其特征在于， 它是刃天青 （Resazurin） ， 它的结 构式为 ： 一种 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 。
5、： 它是根据权利要求书 1 所述的原理和 方法来开发配制的， 它主要用于 NADH-Q 还原酶的酶活性的分析和检测。 4. 如权利要求书 4 所述的 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 其主要成分包括 如权利要求书 1-3 所述的电子受体 R， 这种检测试剂主要用于 NADH-Q 还原酶的酶活性的分 析和检测。 5. 如权利要求书 4-5 所述的 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 其主要成 分还可以包括电子供体 NADH ； 而且还可以包括如权利要求书 1 所述的辅酶 Q（CoQ） ， 即 ubiquinone， 它可以是辅酶 Q 的母体分子， 也可以是 Co。
6、Q 母体分子的各种衍生物或修饰物， 如 CoQ1、 CoQ2、 CoQ10、 Decylubiquinone 等醌类化合物。 6. 如权利要求书 4-6 所述的 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 其成分中还可 以包括抑制剂， 这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制 NADH-Q 还原酶酶活力 的试剂或分子。 7.如权利要求书4-6所述的NADH-Q还原酶活性检测试剂， 其特征在于其成分还可以包 括缓冲液和稳定剂， 所述的稳定剂是被物理、 化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活 性剂 ； 所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、 化学和酶学上普遍接受的能将体系的 pH 值缓 冲。
7、或稳定 5.09.0 的范围中的试剂。 8. 一种 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 它是基于权利要求书 1-8 所述的原 理、 方法和试剂的基础上开发配制的， 其主要成分包括 ： 如权利要求书 8 所述的缓冲液 101000mmol/L pH 范围 5.09.0 如权利要求书 8 所述的稳定剂 0.01%10% 如权利要求书 6 所述的 CoQ 0.0052mmol/L NADH 0.0110mmol/L 如权利要求书 7 所述的抑制剂 020mmol/L 权 利 要 求 书 CN 103374597 A 2 2/2 页 3 如权利要求书 1-3 所述的电子受体 R 0.0。
8、0210mmol/L 这种检测试剂主要用于 NADH-Q 还原酶的酶活性分析和检测。 9. 根据权利要求 9 所述 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 由缓冲液、 稳定剂、 CoQ、 NADH、 抑制剂、 R 组成双剂试剂 ； 试剂 1， 由缓冲液、 稳定剂、 CoQ、 NADH、 R 组成 ； 试剂 2， 由抑制剂组成。 10. 根据权利要求 9 所述 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 由缓冲液、 稳定 剂、 CoQ、 NADH、 抑制剂、 R 组成组成三剂试剂 ； 试剂 1， 由缓冲液、 稳定剂、 CoQ、 NADH 组成 ； 试 剂 2， 由缓冲液、 稳。
9、定剂、 R 组成 ； 试剂 3， 由抑制剂组成。 11.如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂， 其 特征在于， 这种检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的 NADH-Q 还原酶的 酶活力。 12.如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂， 其 特征在于， 这种检测方法和试剂可以用于分析和检测人体各种体液、 组织和细胞样本中的 NADH-Q 还原酶的酶活力。 13.如权利要求书1-11所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂， 其 特征在于， 这种检测方法和试剂可以用于分析和检测完整细胞、 已破。
10、碎细胞、 完整线粒体和 已破碎线粒体中的 NADH-Q 还原酶的酶活力。 14.如权利要求书1-14所述的NADH-Q还原酶活性测定的方法和酶活性检测的试剂， 其 特征在于， 这种检测方法和试剂可以用于分析、 检测和诊断与 NADH-Q 还原酶的酶活力异常 导致的各种疾病， 特别是由 NADH-Q 还原酶的酶活力异常导致的各种遗传和代谢疾病。 权 利 要 求 书 CN 103374597 A 3 1/8 页 4 一种 NADH-Q 还原酶酶活性检测方法和试剂 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具 体而言本发明提供了一种测定 NADH-Q 。
11、还原酶 （NADH:ubiquinone reductase， EC1.6.5.3） 酶活力的方法， 同时本发明还提供了作为 NADH-Q 还原酶 （NADH:ubiquinone reductase， EC1.6.5.3） 的酶活性分析和检测的试剂。 背景技术 0002 线粒体是真核细胞中的一种细胞器， 由两层膜包被 , 外膜平滑 , 内膜向内折叠形 成嵴 , 两层膜之间有腔 , 称为膜间隙， 线粒体中央是基质。线粒体内膜上具有呼吸链酶系 及 ATP 酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成 ATP 的主要场所 , 有细胞 “ 动力工厂 “ (power plant) 之称。另外 , 线粒体。
12、有自身的 DNA 和遗传体系 , 但线粒体基因组的基因 数量有限 , 因此 , 线粒体是一种半自主性的细胞器。 0003 线粒体病(Mitochondrial disorders)是因遗传基因异常引起线粒体代谢酶的缺 陷而出现的一组多系统疾病， 也称为线粒体细胞病。 0004 线粒体病可由核基因 （nDNA） 缺陷或线粒体基因 （mtDNA） 缺陷造成， 因此这类疾病 可有多种遗传模式， 如母系遗传、 孟德尔遗传， 或者两者均有。 0005 几乎人体内所有细胞的直接能量来源都是线粒体， 因此 , 线粒体病可以说是一种 导致多系统紊乱的疾病， 它能损伤不止一种体细胞、 组织或器官。 由于线粒体病。
13、患者体内正 常和病变线粒体的组成都不径相同， 所以其导致的症状也因人而异。 0006 首先， 线粒体病表型多样且可相互重叠。同样的 mtDNA 突变可以产生不同的表现 型， 不同的 mtDNA 突变可以产生相似的表现型。 0007 第二， 除少数线粒体病仅影响单一器官外， 绝大多数可影响多器官系统。 线粒体呼 吸链是有氧代谢必需的和最终的通路， 因而往往那些依赖于有氧代谢的组织和器官如心、 脑和肌肉最先受累， 而且症状突出。 0008 第三， 任何年龄都可发生线粒体病。一般来说， 由 nDNA 异常所致者发病于幼年时 期， 由 mtDNA 异常所致者则发病于童年和成年以后。 0009 因为肌细。
14、胞和神经细胞对能量的需求特别大， 因此神经肌肉方面的问题比如 肌肉无力、 运动障碍、 听力丧失、 平衡协调能力减退、 惊厥和学习不能都是线粒体病的 主要特征。该病其他普遍的并发症包括白内障、 心肌无力， 糖尿病以及发育不良等。一般情 况下， 线粒体病患者会有以上的二个至多个病症， 其中的一些往往同时发生， 以至于我们把 它们归类为某综合征。 能造成明显肌肉问题的线粒体病称为线粒体肌病 （mitochondrial myopathy） ， 而同时造成明显的肌肉和神经症状的则称为线粒体脑肌病 （mitochondrial encephalomyopathy） 。 0010 因线粒体是细胞内进行有氧。
15、呼吸的主要场所， 所以把线粒体内进行有氧呼吸的酶 系称为线粒体呼吸链。线粒体呼吸链由一组复合物组成， 包括 I、 II、 III、 IV、 V。复合物 I、 II、 III、 IV 的作用是在装配线上来回运输电子， 因此我们称之为电子传递链， V 号复合体的 说 明 书 CN 103374597 A 4 2/8 页 5 作用是 “合成” ATP， 因此又称为 ATP 合成酶。 0011 线粒体呼吸链复合物中任一种或几种酶功能低下或缺陷均会导致上述线粒体病 的发生。 0012 线粒体 NADH-Q 还原酶 （又称为 NADH 脱氢酶） ， 简称为复合物 I（Complex I） 是线 粒体呼吸链。
16、复合物中结构最大、 最复杂的复合物， 由 45 个不同的蛋白亚基组成。复合物 I 的功能是将电子从 NADH 传递给辅酶 Q， 在传递电子的同时向线粒体膜间隙释放 2 个质子， 在内膜两侧形成质子梯度， 将能量以电化学势能的形式储存在线粒体内膜上。复合物 I 的 编码基因包括核基因和线粒体基因两种， 其中线粒体基因编码复合物I的7个蛋白亚基， 分 别为 ND1、 ND2、 ND3、 ND4、 ND4L、 ND5、 ND6。这 7 个蛋白亚基共同参与组成复合物 I 的一部分 结构， 其中任意一个亚基功能异常均会导致线粒体病的发生， 如 LHON（Leber hereditary optic ne。
17、uropathy） 、 MELAS（mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes syndrome） 、 AD-MT （Alzheimer disease mitochondrial） 、 LDYT （Leber hereditary optic neuropathy with dystonia） 、 LS（Leigh syndrome） 、 MT-C1D （mitochondrial complex I deficiency） 等。 0013 国外研究证实线粒体呼吸链复合物 I 功能。
18、缺陷是导致线粒体病的主要原因， 约占 氧化磷酸化障碍性疾病的1/3。 然而目前对于线粒体病的研究手段基本以临床为基础， 但因 该病是多系统疾病， 涉及遗传、 神经、 肌肉、 血液、 骨骼、 眼睛等器官或系统， 症状表现复杂， 并且与多种常见疾病有相似的临床表现， 因此医生很难从症状表现上积累诊断经验， 因此 漏诊、 误诊及延误诊断的发生是普遍存在的问题。 实验室检测手段也多是间接方式， 如检测 乳酸 / 丙酮酸比例、 血清 CK 水平等。有个别实验室可做基因检测和肌肉病理检测， 但因单 核苷酸序列多态性的存在， 可能某些突变就是正常的， 不会引发疾病， 因此给分析带来不确 定性， 而且线粒体基。
19、因突变还表现为达到某一定值后才会发病， 因此基因检测同样不能作 为诊断的可靠依据。而肌肉病理检测可造成一定的创伤。 0014 但是导致线粒体病产生的直接因素就是患者体内相关酶活性降低或完全缺失， 而 且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关， 因此判断患者线粒体相关酶的活性是 否正常， 同时结合患者的临床症状表现， 就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。 因此线 粒体相关酶尤其是线粒体呼吸链复合物酶活性检测作为线粒体病的诊断依据具有其他方 法不能比拟的优势， 临床上通过对疑似线粒体病的患者进行相关酶活性检测， 可以实现早 诊断、 早治疗， 对线粒体病预后， 减少疾病给家庭及社会带来的影响及。
20、隐患具有重要意义。 国内外临床实践证明检测线粒体相关酶活性是辅助确诊该病的最佳手段。 但目前采用线粒 体呼吸链复合物酶活性的检测方法都是比色法， 即通过分光光度计检测线粒体呼吸链复合 物的酶活性， 这种方法的缺点是灵敏度低， 准确度差， 对样品的需求量大。与分光比色法相 比， 荧光法检测酶活具有蛋白用量少， 检测灵敏度高， 特异性高， 准确度高的优点。 0015 本发明就是基于这些技术背景和临床诊断的现实需求， 根据 NADH-Q 还原酶 （线粒 体呼吸链复合物 I） 的酶催化活性的特点， 利用含荧光基团的氧化型染料作为酶催化反应的 底物， 可以快速灵敏的测定待测样本中的 NADH-Q 还原酶。
21、酶活力。待测样本中的 NADH-Q 还 原酶可以将含荧光基团的氧化型染料还原后生成还原型荧光分子， 还原型荧光分子在特定 的激发光下可发生荧光， 且 NADH-Q 还原酶催化 NADH 与氧化型荧光染料反应的速率与释放 荧光分子的荧光强度成正比， 这样就可以计算待测样本中的 NADH-Q 还原酶酶活力。采用本 说 明 书 CN 103374597 A 5 3/8 页 6 方法制备的测定试剂具有方便、 快捷和灵敏度高的特点， 便于推广应用。 发明内容 0016 本 发 明 解 决 的 技 术 问 题 是 ： 提 供 一 种 快 速、 准 确 可 靠 的 NADH-Q 还 原 酶 （NADH:ub。
22、iquinone reductase， EC1.6.5.3） 酶活力的荧光检测法， 同时本发明还提供用于 荧光法测定 NADH-Q 还原酶活性的检测试剂， 采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的 荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用， 而且检测灵敏度高， 特异性高， 操作简便， 因 而可以得到切实的推广使用。 0017 为解决技术问题， 本发明提供的技术方案如下 ： 本发明的 NADH-Q 还原酶酶活性测定方法原理如下 ： NADH-Q 还原酶在特定条件下能够将 NADH 中的电子转移给氧化型辅酶 Q（CoQ） 生成还 原型辅酶 Q， 还原型 CoQ 进一步将电子转移给电子受体 R 生成还原。
23、型的 R ； 还原型的 R 在特 定的激发波长下可以发射出特异波长的荧光， 因此在特定的条件下可检测到还原型 R 的荧 光值， 由于 NADH-Q 还原酶催化底物反应的速率与还原型 R 的生产量成正比， 因此检测在特 定波长下的还原型 R 的荧光值的变化， 就可以计算出 NADH-Q 还原酶的酶活力。 0018 上述反应原理也可以用以下反应方程式来简单表示 ： NADH + CoQNAD+ + CoQ（还原型） CoQ（还原型） + R（氧化型） CoQ+ R（还原型） 。 0019 本发明提供的电子受体 R， 其特征在于 ： 它是一种在物理和化学领域普遍被接受 的任何能在氧化还原反应中被还原。
24、的荧光染料分子， 氧化型R被NADH-Q还原酶还原后产生 还原型的荧光分子R， 还原型荧光分子R可以在特定激发光下发射荧光。 它常见的代表分子 是刃天青 （Resazurin） ， 它的结构式为 ： 刃天青经还原后生成试卤灵 （Resorufin） ， 试卤灵为还原型荧光染料分子， 用一般的荧 光检测设备可在530-580nm激发波长， 560-620nm的发射波长 （最适发射波长为590nm） 下检 测到特异的荧光。试卤灵的结构式为 ： 需要注意的是， 上述刃天青 （Resazurin）应用于本发明提供的 NADH-Q 还原酶 （NADH:ubiquinone reductase， EC1.。
25、6.5.3） 酶活力的检测方法和试剂只是本发明的一部 分， 也是一个在物理和化学领域普遍被接受的任何能在氧化还原反应中被还原的荧光染料 分子中的一个典型代表， 这虽然也是本发明的权利要求书的一部分， 但它不代表本发明所 有的涵盖内容， 此举例不是意图限制本发明的涵盖内容。 0020 本发明提供的一种 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 它是根据权利要求 书1所述的原理和方法来开发配制的， 它主要用于NADH-Q还原酶的酶活性的分析和检测。 0021 本发明提供的 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 其主要成分包括如权利 说 明 书 CN 103374597 A 。
26、6 4/8 页 7 要求书 1-3 所述的电子受体 R， 这种检测试剂主要用于 NADH-Q 还原酶的酶活性的分析和检 测。 0022 本发明提供的 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于 ： 其主要成分还可以包括 电子供体 NADH ； 而且还可以包括如权利要求书 1 所述的辅酶 Q（CoQ） ， 即 ubiquinone， 它可 以是辅酶 Q 的母体分子， 也可以是 CoQ 母体分子的各种衍生物或修饰物。辅酶 Q 母体分子 的结构式为 ： 碳氢 链连接在母体分子的 6 位 C 上， 因连接的基团不同形成 CoQ 母体分子的各种衍生物或修饰 物， 如 CoQ1、 CoQ2、 CoQ1。
27、0、 Decylubiquinone（DB） 等醌类化合物， 其结构式如所示 ： 本发明提供的用荧光法检测 NADH-Q 还原酶活性的试剂， 其特征在于 ： 它是基于权利要 求书 1-8 所述的原理、 方法和试剂的基础上开发配制的， 其主要成分包括 ： 缓冲液 101000mmol/L pH 范围 5.09.0 稳定剂 0.01%10% CoQ 0.0052mmol/L NADH 0.0110mmol/L 抑制剂 020mmol/L 氧化型底物 R 0.00210mmol/L 这种检测试剂主要用于 NADH-Q 还原酶的酶活性分析和检测。 0023 实验表明， 从测定结果的准确性和配制成本的经。
28、济性两方面综合考虑， 无论是双 剂还是三剂， 如下成分关系的本发明 NADH-Q 还原酶检测试剂较为理想 ： 缓冲液 25 100mmol/L pH 范围 6.58.0 稳定剂 0.10.5% CoQ 0.050.5mmol/L NADH 0.050.2mmol/L 抑制剂 0.0010.01mmol/L 底物 R 0.0050.02mmol/L 本 发 明 的 NADH-Q 还 原 酶 酶 活 力 检 测 试 剂 可 以 配 成 如 下 双 剂 试 剂 ： 试剂 1 缓冲液， 稳定剂， CoQ， NADH， R 试剂 2 说 明 书 CN 103374597 A 7 5/8 页 8 抑制剂 。
29、试剂可以是制成干粉， 溶解后使用， 或是配成液体试剂， 可以直接使用。 0024 也可以将上述双剂试剂配成如下三剂试剂 ： 试剂 1 缓冲液， 稳定剂， CoQ， NADH 试剂 2 缓冲液， 稳定剂， R 试剂 3 抑制剂 试剂可以是制成干粉， 溶解后使用， 或是配成液体试剂， 可以直接使用。 0025 本发明提供的一种 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 其特征在于其主要成分包括抑 制剂， 这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制 NADH-Q 还原酶酶活性的试剂或 分子。NADH-Q 还原酶的特异酶活性可以通过计算 NADH-Q 还原酶的总活性 （不加抑制剂） 与 NADH-Q 还原。
30、酶的非特异活性 （加入一定浓度的抑制剂） 的差值得到。这种检测试剂主要用 于 NADH-Q 还原酶的酶活性的分析和检测。它包括但不限于以下实例 ： 鱼藤酮、 安密妥。 0026 本发明提供的 NADH-Q 还原酶活性检测试剂， 所述的稳定剂主要包括被物理、 化学 和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂 （detergent） ， 它主要用于 NADH-Q 还原酶的酶 活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例 ： Triton x-100、 Tween20、 NP40、 Brij-35 本发明提供的 NADH-Q 还原酶酶活性检测试剂中所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物 理、 化学和酶学上普。
31、遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.09.0的范围中的试剂， 它主 要用于 NADH-Q 还原酶的酶活性的分析和检测。它包括以下实例但不限于这些实例 ： 乙酸钠 / 乙酸 ： pH 2.6-5.8 柠檬酸 / 柠檬酸钠 ： pH 3.0-6.6 磷酸氢盐 / 柠檬酸 （盐） ： pH 2.2-8.0 磷酸盐 ： pH 4.9-8.2 柠檬酸 / 氢氧化钠 / 盐酸 ： pH 2.2-6.5 Tris- 盐酸 ： pH 7.1-8.9 硼酸 - 硼砂缓冲液 ： pH7.4-9.0 本发明提供的 NADH-Q 还原酶酶活性检测方法和试剂， 可以用于分析和检测各种待测 样本中的NADH-Q 还原酶。
32、的酶活力， 特别是检测人体各种体液、 组织或细胞样本中NADH-Q还 原酶的酶活力。 这些被检测的样本包括但不限于脑组织、 肝组织、 肌组织、 白细胞、 成纤维细 胞， 提取的线粒体、 提取的各种纯度的 NADH-Q 还原酶样品等。 0027 本发明提供的 NADH-Q 还原酶酶活性检测方法和试剂， 可以用于分析和检测完整 细胞、 已破碎细胞、 完整线粒体和已破碎线粒体中的 NADH-Q 还原酶的酶活力。 0028 本发明提供的 NADH-Q 还原酶活性检测方法和试剂， 可以用于分析、 检测和诊断待 测样本中的 NADH-Q 还原酶的酶活力异常导致的各种疾病， 特别是由 NADH-Q 还原酶的。
33、酶活 力异常导致的各种遗传和代谢疾病。从而可以广泛应用到临床检测或诊断与 NADH-Q 还原 酶的酶活力相关的疾病。 说 明 书 CN 103374597 A 8 6/8 页 9 0029 附图说明 ： 图 1 ： 线粒体呼吸链复合物 I 总活性与非特异性活性检测结果。1. 表示线粒体呼吸 链复合物 I 总活性检测 ： 检测体系中不添加鱼藤酮， 曲线线性方程为 ： y=561.06x + 180.93 （R2=0.9991） （n=3） 。2. 表示线粒体呼吸链复合物 I 非特异性活性检测 ： 检测体系中加入 鱼藤酮， 浓度为 0.02mmol/L。曲线线性方程为 ： y=171.82x + 。
34、121.62 （R2=0.9979） （n=3） 。 0030 具体实施方式 0031 为了更全面地理解和应用本发明， 下文将参考实施例详细描述本发明， 所述实施 例仅是意图举例说明本发明， 而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由本发明的权 利要求书具体限定。 0032 实施例一 本实施例的 NADH-Q 还原酶检测试剂为双剂试剂， 包括 试剂 1 磷酸缓冲液 （pH7.2） 50mmol/L Tween 20 0.1% CoQ 0.2mmol/L NADH 0.1mmol/L 刃天青钠 0.01mmol/L 试剂 2 鱼藤酮 0.02mmol/L 被测 NADH-Q 还原酶的样品为分离的。
35、人体白细胞中线粒体， 经破碎处理后， 总蛋白用量 为 0.02ug/ul。本检测方法采用酶动力学测定方法检测线粒体呼吸链复合物 I 酶活性。 0033 总活性测定 ： 将试剂 1 提前置于 30环境中温浴 3 分钟， 然后将试剂 1 加入到酶 标仪中， 在激发波长为 530nm， 发射波长为 590nm， 30 度条件下进行基线扫描 1 分钟， 加入蛋 白样品启动反应， 扫描 590nm 下荧光值的变化， 扫描时间为 10 分钟， 记录曲线变化， 计算反 应的斜率。 0034 非特异活性测定 ： 将试剂1与试剂2提前混合均匀后置于30环境中温浴3分钟， 然后将试剂混合液加入到酶标仪中， 在激发。
36、波长为 530nm， 发射波长为 590nm， 30 度条件下 进行基线扫描 1 分钟， 加入蛋白样品启动反应， 扫描 590nm 下荧光值的变化， 扫描时间为 10 分钟， 记录曲线变化， 计算反应的斜率。 0035 NADH-Q 还原酶特异性活性 = 总活性 - 非特异性活性 根据试卤灵的标准曲线计算出 NADH-Q 还原酶特异性活性。 0036 试剂 1 空白荧光读值平均为 650， 加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反 应， 检测 10 分钟测定复合物 I 总活性， 总活性斜率为 561（见图 1 所示） ， 试剂 1 与试剂 2 混合后的空白荧光读值平均为 990， 加入正常人分。
37、离破碎后的白细胞线粒体启动反应， 检测 10 分钟测定复合物 I 的非特异活性， 非特异活性的斜率为 171（见图 1 所示） 。 0037 复合物 I 的特异活性斜率 = 总活性斜率 - 非特异活性斜率 =390。通过荧光标准曲 说 明 书 CN 103374597 A 9 7/8 页 10 线， 计算出 NADH-Q 还原酶的酶活力。 0038 实验结果表明， 本发明的检测 NADH-Q 还原酶酶活力的方法和试剂可以有效检测 出样本中的 NADH-Q 还原酶酶活力， 可应用于临床检测与 NADH-Q 还原酶酶活力异常相关的 疾病。 0039 实施例二 本实施例的 NADH-Q 还原酶检测试。
38、剂为双剂试剂， 包括 试剂 1 磷酸缓冲液 （pH7.2） 50mmol/L Tween 20 0.1% CoQ 0.2mmol/L NADH 0.1mmol/L 刃天青钠 0.01mmol/L 试剂 2 鱼藤酮 0.02mmol/L 被测 NADH-Q 还原酶的样品为分离的人体白细胞中线粒体， 经破碎处理后， 总蛋白用量 为 0.02ug/ul。本检测方法采用终点法检测线粒体呼吸链复合物 I 酶活性。 0040 总活性测定 ： 将试剂 1 与线粒体蛋白混合后置于 30环境中温浴 10 分钟， 然后将 反应终止， 取终止后的混合液加入到酶标仪中， 在激发波长为 530nm， 发射波长为 590。
39、nm 条 件下检测产物的荧光值， 记为 F总。 0041 非特异活性测定 ： 将试剂 1 与试剂 2、 线粒体蛋白混合均匀后置于 30环境中温 浴 10 分钟， 然后将反应终止， 取终止后的混合液加入到酶标仪中， 在激发波长为 530nm， 发 射波长为 590nm 条件下检测产物的荧光值， 记为 F非。 0042 NADH-Q 还原酶特异性活性 = 总活性 - 非特异性活性 根据标准曲线计算 NADH-Q 还原酶的反应速率。 0043 试剂 1 空白荧光读值平均为 650， 加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反 应， 检测10分钟测定复合物I总活性， 总活性荧光读值 （扣除试剂空白） 为。
40、5280， 试剂1与试 剂 2 混合后的空白荧光读值平均为 990， 加入正常人分离破碎后的白细胞线粒体启动反应， 检测 10 分钟测定复合物 I 的非特异活性， 非特异活性的荧光读值 （扣除试剂空白） 为 1671 （见表 1 所示） 。 0044 复合物 I 的特异活性 = 总活性 - 非特异活性。通过荧光标准曲线， 计算出 NADH-Q 还原酶的酶活力。 0045 表 1 线粒体呼吸链复合物 I 总活性与非特异性活性检测结果 说 明 书 CN 103374597 A 10 8/8 页 11 实验结果表明， 本发明的检测 NADH-Q 还原酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出样 本中的NAD。
41、H-Q还原酶酶活力且测定稳定 （n=3， CV3%） ， 可应用于临床检测与NADH-Q还原酶 酶活力异常相关的疾病。 0046 总之， 实践证明， 采用本发明的检测 NADH-Q 还原酶酶活力的方法和试剂完全可以通过 一般的荧光检测设备检测得出所需的测定结果， 并且灵敏度高， 精确度好， 特异性高， 不受 内外源物质的污染和干扰， 便于推广应用于临床检测与 NADH-Q 还原酶酶活力异常相关的 疾病。 0047 参考文献 Acin-Perez R, Bayona-Bafaluy MP, Fernandez-Silva P, et al. Respiratory complex III is 。
42、required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Mol Cell, 2004,13(6):8805-815. Birch-Machin MA, Turbull DM. Assaying mitochondrial respiratory complex activity in mitochondria isolated from human cells and tissues. Methods Cell Biol, 2001,65:97-117. Cameron JM, Levandovskiy V, Mackay N, et。
43、 al. Respiratory chain analysis of skin fibroblasts in mitochondrial disease. Mitochondrion, 2004, 4(5-6):387-394. Carroll J, Fearnley IM, Skehel JM, et al. Bovin complex I is a complex of 45 different subunits. J Biol Chem, 2006, 281(43):32724-32727. Chretien D, Rustin P, Bourgeron T, et al. Refere。
44、nce charts for respiratory chain activities in human tissues. Clin Chim Acta, 1994, 228(1):53-70. Kirby DM, Crawford MA, et al. Respirtory chain complex I deficiency: an underdiagnosed energy generation disorder. Neurology, 1999,52(6):1255-1264. Morris AA, Leonard JV, Brown GK, et al. Deficiency of 。
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