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1、(10)申请公布号 CN 103361351 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103361351 A *CN103361351A* (21)申请号 201310323599.8 (22)申请日 2013.07.29 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学第一 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 郭政军 卞修武 杨浪 任勇 刘强 姬成东 崔巍 王强 崔有宏 (74)。
2、专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (54) 发明名称 人 RUNX2 基因的 shRNA 及其重组干扰载体和 应用 (57) 摘要 本发明公开了人 RUNX2 基因的 shRNA 及其重 组干扰载体和应用， shRNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 第 5 位至第 52 位所示， 该序列能够干扰 RUNX2 基因表达， 降低细胞成球能力、 降低细胞克 隆形成能力和降低细胞侵袭能力等， 本发明公开 的 shRNA 干扰 RUNX2 基因表达后还能降低转录因 子 Sox2， 转录因子 Oct4 和转录因子 Bmi1 等干性 转录因子表达， 能延缓。
3、胃癌细胞侵袭转移， 可以用 于治疗胃癌的药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103361351 A CN 103361351 A *CN103361351A* 1/1 页 2 1. 人 RUNX2 基因的 shRNA， 其特征在于 ： 所述 shRNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 第 5 位至第 52 位所示。 2. 含有权利要求 1 所述人 RUNX2 基因的 shRNA 的重组干扰载。
4、体。 3. 根据权利要求 2 所述的重组干扰载体， 其特征在于 ： 所述重组干扰载体由如 SEQ ID NO.2 所示序列连入经 AgeI 和 EcoRI 酶切的 pLKO.1-TRC 克隆载体制得。 4. 权利要求 1 所述 shRNA 在制备降低 RUNX2 基因表达的试剂中的应用。 5. 权利要求 1 所述 shRNA 在制备降低细胞的成球能力的试剂中的应用。 6. 权利要求 1 所述 shRNA 在制备降低细胞克隆形成能力的试剂中的应用。 7. 权利要求 1 所述 shRNA 在制备降低细胞侵袭能力的试剂中的应用。 8. 权利要求 1 所述 shRNA 在制备降低干性基因表达的试剂中的。
5、应用， 其特征在于 ： 所 述干性基因为转录因子 Sox2， 转录因子 Oct4 或转录因子 Bmi1。 权 利 要 求 书 CN 103361351 A 2 1/5 页 3 人 RUNX2 基因的 shRNA 及其重组干扰载体和应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 特别涉及人 RUNX2 基因的 shRNA， 还涉及表达该 shRNA 的重组干扰载体和应用。 背景技术 0002 全球范围内， 胃癌是位居癌症死因第三位的恶性肿瘤。 在亚洲地区， 胃癌是发病率 和死亡率居首的消化道恶性肿瘤。 尽管目前已有包括消化内镜在内的多种早期检查诊断方 法， 但胃癌的早期诊断率仍然偏低， 首诊。
6、即发现已有远处扩散与转移的胃癌患者比例高达 60%。目前胃癌治疗所采用的方法主要为外科手术切除结合多种化疗药物治疗， 近年来， 随 着诊断手段革新和治疗方法提高， 胃癌的治疗效果得到一定程度的提升， 但胃癌患者 5 年 生存率在 20% 左右的较低水平。随着肿瘤发生、 发展、 侵袭和转移过程中分子生物学， 分子 病理学研究的深入， 分子靶向治疗已成为继手术、 化疗和放疗之后的一种新的治疗手段， 具 有靶向、 高效和低毒等特点。 0003 转录因子 RUNX2 为转录因子家族 RUNX 成员之一， 具有一段家族成员共有的由 128 个氨基酸组成的 DNA 结合区Runt 结构域。RUNX2 转录。
7、因子可与核心结合因子 （Core Binding Factor， Cbf） 结合形成异二聚体， 并因此获得更强的与 DNA 结合能力。研究 发现， 转录因子 RUNX2 在成骨细胞和成骨样肉瘤细胞中表达， 是调控成骨分化发育的特异 性转录因子， 并证实 RUNX2 突变与锁骨颅骨发育异常综合症密切相关。近年来研究还发现， RUNX2 在与人肿瘤相关， 在易于发生骨转移的肿瘤， 如乳腺癌， 前列腺癌和骨肉瘤中发挥着 促进骨转移和溶骨作用。此外， 在乳腺癌中， RUNX2 与 ERa 的促增殖作用相互拮抗。2011 年 向春香等人报道了胃癌细胞 SGC7901 中存在 RUNX2 的表达， siR。
8、NA 抑制 RUNX2 表达可抑制 胃癌细胞的增殖， 促进凋亡。但是目前并未见 RUNX2 与胃癌侵袭转移相关的报道。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供一种人 RUNX2 基因的 shRNA ； 本发明的目的 之二在于提供含有上述 shRNA 的重组干扰载体 ； 本发明的目的之三在于提供上述 shRNA 在 制备降低 RUNX2 基因表达的试剂中的应用 ； 本发明的目的之四在于提供上述 shRNA 在制备 降 低细胞成球能力的试剂中的应用 ； 本发明的目的之五在于提供上述 shRNA 在制备降低 细胞克隆形成能力的试剂中的应用 ； 本发明的目的之六在于提供上述 shRN。
9、A 在制备降低细 胞侵袭能力的试剂中的应用 ； 本发明的目的之七在于提供 shRNA 在制备降低转录因子表达 的试剂中的应用。 0005 为实现上述发明目的， 技术方案为 ： 0006 1. 人 RUNX2 基因的 shRNA， 所述 shRNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 第 5 位至第 52 位所示。 0007 2. 含有所述人 RUNX2 基因的 shRNA 的重组干扰载体。 0008 优选的， 所述重组干扰载体由如 SEQ ID NO.2 所示序列连入经 AgeI 和 EcoRI 酶切 说 明 书 CN 103361351 A 3 2/5 页 4 pLKO.1-TRC 克隆。
10、载体制得。 0009 3. 所述 shRNA 在制备降低 RUNX2 基因表达的试剂中的应用。 0010 4. 所述 shRNA 在制备降低细胞的成球能力的试剂中的应用。 0011 5. 所述 shRNA 在制备降低细胞克隆形成能力的试剂中的应用。 0012 6. 所述 shRNA 在制备降低细胞侵袭能力的试剂中的应用。 0013 7. 所述 shRNA 在制备降低转录因子表达的试剂中的应用， 所述转录因子为转录因 子 Sox2， 转录因子 Oct4 或转录因子 Bmi1。 0014 本发明的有益效果在于 ： 本发明公开了 RUNX2 基因的 shRNA， 该 shRNA 分子能够特 异干扰靶。
11、位点， 将RUNX2基因的shRNA与骨架载体连接构建重组干扰载体， 经慢病毒包装后 转染胃癌细胞株 MGC803， 获得了稳定下调 RUNX2 基因表达的胃癌细胞株 MGC803-shRUNX2， 降低胃癌细胞株中 RUNX2 基因表达后， 胃癌细胞株的干性特性受损， 因此干性基因表达下 调 ； 同时该细胞还具有细胞成球能力、 细胞克隆形成能力和细胞侵袭能力均低的特性， 利用 此特性可以将 RUNX2 基因的 shRNA 用于制备降低细胞的成球能力、 细胞克隆形成能力和细 胞侵袭能力的试剂， 并以此治疗胃癌， 降低胃癌细胞的成球能力、 克隆形成能力和细胞侵袭 能力。 附图说明 0015 为了。
12、使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 本发明提供如下附图 ： 0016 图 1 为经过嘌呤霉素筛选后， Real-Time PCR 检测 RUNX2 表达结果图。 0017 图2为MGC803-shRUNX2的成球能力和克隆形成能力结果图 （A ： 成球能力 ； B ： 克隆 形成能力） 。 0018 图 3 为 MGC803-shRUNX2 细胞侵袭能力检测结果。 0019 图 4 为 MGC803-shRUNX2 细胞相关转录因子 Sox2， Oct4， Bmi1 和 Nanog 表达结果 图。 具体实施方式 0020 下面将结合附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例。
13、中未注明具体 条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如分子克隆实验指南 （第三版， J. 萨姆布鲁克等著） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0021 一、 靶向人 RUNX2 基因特异性干扰序列的获得 0022 根据 NCBI 公开的人 RUNX2 基因序列 （Genbank ： NM_001024630）设计 shRNA 序 列， 具体设计方法是利用美国 Invitrogen 公司网站 （其网址为 http:/rnaidesigner. 供 的 RNAi 在 线 设 计 软 件， 根 据 人 RUNX2 基因序列筛干扰的靶序列， 经过比对筛选获得含 21 个碱基的靶序列， 。
14、具体序列为 ： 5 -gtggtcctatgaccagtca-3 （SEQ ID NO.1） ， 然后利用靶序列设计 shRNA 序列， 设计的序 列交由上海英骏生物技术有限公司合成， shRNA 序列具体如下 ： 0023 RUNX2-Sh2 正向 ： 5 -ccgggtggtcctatgaccagtcacgggatccaatgactggtcataggacca cttttttg-3 （SEQ ID NO.2） ； RUNX2-Sh2 反向 ： 5 -aattcaaaaaagtggtcctatgaccagtcattgg atcccgtgactggtcataggaccac-3 （SEQ ID N。
15、O.3） ； 其中黑体表示与靶序列结合区， 下划线为 说 明 书 CN 103361351 A 4 3/5 页 5 双链退火后形成的粘性末端， 这两粘性末端分别能与AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切的粘 性末端连接。 0024 二、 重组干扰载体的获得 0025 将浓度为 1mol/L 的如 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.3 所示的序列， 在 95条件 下解链 4 分钟， 然后在 75条件下退火 10 分钟， 将单链序列退火形成带粘性末端的双 链序列， 然后将获得的 4 序列连接入经 AgeI 和 EcoRI 的 pLKO.1-TRC 克隆载体 （质粒图 谱 见 http:。
16、/www.addgene.org/10878/） ， 得 重 组 干 扰 载 体 pLKO.1-puro-shRUNX2。 将 pLKO.1-puro-shRUNX2 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 经扩大培养后抽提质粒， 并控制质 粒浓度大于 800ng/uL。 0026 三 . 慢病毒载体病毒包装 0027 取生长良好的293T细胞， 经消化、 洗涤， 并用Opti-MEM选择培养基制成细胞悬液， 然后分传到不同的培养皿中继续培养， 备用 ； 然后使用脂质体 2000 转染试剂转染以质量比 计 pRRE、 pRev、 pMD2.G 和 pLKO.1-puro-shRUNX2 为 1 ：。
17、 1.5 ： 0.75 ： 2 的转染质粒， 转染步 骤 按说明书操作， 转染后 48-72 小时， 收集 293T 培养上清， 过滤后提纯病毒原液， 即得干扰 shRUNX2 的慢病毒液。 0028 四、 稳定下调 RUNX2 基因表达的人胃癌细胞株的获得 0029 将人胃癌细胞株 MGC803（高表达 RUNX2）接种在 6 孔板中， 培养至 30%-50% 细 胞汇合度 ； 加入浓度为 5106MOI 的干扰 shRUNX2 的慢病毒液， 并向培养基中按质量比 为 1:1000 添加聚凝胺 （polybrene） 以增加转染效率， 然后用无血清 1640 培养基培养 ； 培 养时间为 8。
18、-12 小时， 培养后换上含血清的 1640 培养基继续培养， 3 天后， 在培养基中加 入浓度为 300g/L 的嘌呤霉素 （puromycine）进行筛选， 每天观察细胞活力状态， 得 MGC803-shRUNX2 细胞。 0030 同时用含无意序列的pLKO.1-TRC克隆载体质粒为阴性对照， 记为mock质粒， 其中 无意序列识别的靶序列为 ： 5 -cctaaggttaagtcgccctc-3 （SEQ ID NO.4） ， 无意正向序列 为 ： 5 -ccggcctaaggttaagtcgccctccgggatccaagagggcgacttaaccttaggttttttg-3（SE。
19、Q ID NO.5） ； 无意反向序列为 ： 5 -ccgggagggcgacttaaccttaggcgggatccaacctaaggttaagtcgccct cttttttg-3（SEQ ID NO.6） 。然后依前述方法， 将此 mock 质粒包装为慢病毒， 并对 MGC803 细胞进行转染， 得到 MGC803-mock 细胞株， 作为对照组细胞。 0031 1. 检测获得的 MGC803-shRUNX2 细胞的干扰效率， 具体使用 Real-Time PCR 检测， 并以 MGC803-mock 细胞作阴性对照， 具体检测方法如下 ： 0032 将制备的 MGC803-shRUNX2 。
20、细胞提取总 RNA（裂解液为 Trizol， Takara 公司， 货号 为 ： Takara Code:9109） ， 然后对获得的RNA反转录合成cDNA （反转录试剂盒购自Fermentas 公司， 货号为 ： K1621） ， 最后用进行荧光定量检测 （荧光定量试剂盒购自 Takara 公司， 货号 为 ： DRR081A） ， 同时以 GAPDH 作内参， 具有引物如下 ： 0033 RUNX2 上游检测引物 ： 5-gtttgttctctgaccgcctc-3（SEQ ID NO.7） ； 0034 RUNX2 下游检测引物 ： 5-ccagttctgaagcacctga-3（SE。
21、Q ID NO.8） ； 0035 GAPDH 上游检测引物 ： 5 -aaggtgaaggtcggagtcaac-3 （SEQ ID NO.9） ； 0036 GAPDH 下游检测引物 ： 5 -ggggtcattgatggcaacaata-3 （SEQ ID NO.10） 。 0037 并按如下条件进行检测 ： 预变性 95预变性 30s ； 95变性 5 秒， 61退货 30 秒， 说 明 书 CN 103361351 A 5 4/5 页 6 72延伸 30 秒 20， 重复 40 个循环 ； 最后进行溶解曲线分析， 结果如图 1 所示。由图 1 可 知， 转染干扰 shRUNX2 的慢。
22、病毒液的细胞中 RUNX2 基因的表达量明显下降， 表达下调大于 80%， 表明干扰 shRUNX2 的慢病毒液能够干扰 RUNX2 表达。 0038 2. 检测 MGC803-shRUNX2 细胞的成球能力和克隆形成能力， 具体方法如下 ： 0039 配制胃癌细胞成球培养基 DMEM/F12+2%B27+5ng/mL EGF， 然后将 MGC803-mock 与 MGC803-shRUNX2 两组细胞分别以 104 个 / 皿接种入低粘附细胞培养皿 （培养皿购自 Corning 公司， 货号为 ： 3262） ， 连续培养， 同时在电镜下观察细胞球大小及个数， 在培养 至 15-20 天时统。
23、计细胞的成球能力， 结果如图 2 中 A 所示。结果显示干扰 RUNX2 表达的 MGC803-shRUNX2 细胞株成球能力下降， 表明干扰 RUNX2 表达后细胞的自我更新能力显著受 抑制。 0040 将 MGC803-mock 与 MGC803-shRUNX2 两组细胞分别以 200 个 / 孔的密度接种入 6 孔板， 连续培养 ； 培养期间在电镜下观察， 观察细胞集落克隆生长情况， 然后统计统计克隆 个数， 分析结果， 结果如图 2 中 B 所示。结果显示与 MGC803-mock 组相比， 干扰 RUNX2 表达 的 MGC803-shRUNX2 细胞株克隆形成能力下降。 0041 。
24、3. 检测 MGC803-shRUNX2 细胞的侵袭能力， 具体方法如下 ： 0042 将预冷 （冰浴） 的 Matrigel 基质胶 （购自 BD 公司） 与无血清 1640 培养基以体积 比为 1:1 配置成工作液状态 ； 然后取 10L 的工作液小心加入 transwell 中， 铺满底部， 在 37培养箱中静置 15 分钟 ； 分别消化培养的 MGC803-mock 细胞和 MGC803-shRUNX2 细 胞， 再以 104个细胞 /200L*transwell 的比例加入 transwell 上室， 下室加入 600L 含 血清的细胞培养基 （血清为人小牛血清， 购自兰州民海生物工。
25、程有限公司） ， 37培养 24 小 时 ； 取出 transwell 小室， 在质量分数为 4% 的多聚甲醛中固定 15 分钟 ； 使用结晶紫燃料对 transwell 小室进行染色， 染色时间为 10 分钟 ； 然后在显微镜下采图， 并统计穿到下室的细 胞个数， 分析结果如图 3 所示。结果显示， 干扰人 RUNX2 后， 与对照组 MGC803-mock 细胞相 比， MGC803-shRUNX2 细胞侵袭转移能力显著下降了， 穿过基质胶到达下室的细胞数目显著 减少。 0043 4. 检测 MGC803-shRUNX2 细胞相关转录因子表达情况， 具体方法如下 ： 0044 分别取 MG。
26、C803-mock 细胞和 MGC803-shRUNX2 细胞， 然后提取总 RNA（裂解液为 Trizol， 购自Takara公司的， 货号为 ： Takara Code:9109） ， 然后对获得的RNA进行反转录合 成 cDNA （反转录试剂盒购自 Fermentas 公司， 货号为 ： K1621） ， 最后进行荧光定量检测 （荧光 定量试剂盒购自 Takara 公司， 货号为 ： DRR081A） ， 同时以 GAPDH 作内参， 内参引物如 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.7 所示。同时设计检测干性基因的引物， 干性基因包括转录因子 Sox2， 转录因子 Oct4，。
27、 转录因子 Nanog 和转录因子 Bmi1 的荧光定量引物， 具体如下 ： 0045 检测 Sox2 的上游引物 :5 -gcgactatgcacaacga-3 (EQ ID NO.11） ； 0046 检测 Sox2 的下游引物 :5 -ccagagtggtgacggagaca-3 （SEQ ID NO.12） ； 0047 检测 Oct4 的上游引物 :5 -gcagcgactatgcacaacga-3 （SEQ ID NO.13） ； 0048 检测 Oct4 的下游引物 :5 -ccagagtggtgacggagaca-3 （SEQ ID NO.14） ； 0049 检测 Nanog。
28、 的上游引物 :5 -tttgtgggcctgaagaaaact-3 （SEQ ID NO.15） ； 0050 检测 Nanog 的下游引物 :5 -agggctgtcctgaataagcag-3 （SEQ ID NO.16） ； 0051 检测 Bmi1 的上游引物 :5 -tcgttcttgttattacgctgtttt-3 （SEQ ID NO.17） ； 说 明 书 CN 103361351 A 6 5/5 页 7 0052 检测 Bmi1 的下游引物 :5 -cggtagtacccgcttttaggc-3 （SEQ ID NO.18） ； 0053 并按如下条件进行检测 ： 预变性。
29、 95预变性 30s ； 95变性 5 秒， 61退货 30 秒， 72延伸 30 秒 20， 重复 40 个循环 ； 最后溶解曲线分析， 结果如图 4 所示。由图 4 可知， 干 扰RUNX2表达后， 干性基因转录因子Sox2， 转录因子Oct4， 转录因子Nanog和转录因子Bmi1 表达均下调。 0054 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说 明 书 CN 103361351 A 7 。
30、1/6 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103361351 A 8 2/6 页 9 0003 序 列 表 CN 103361351 A 9 3/6 页 10 0004 序 列 表 CN 103361351 A 10 4/6 页 11 0005 序 列 表 CN 103361351 A 11 5/6 页 12 0006 序 列 表 CN 103361351 A 12 6/6 页 13 序 列 表 CN 103361351 A 13 1/2 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103361351 A 14 2/2 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103361351 A 15 。